KR101465842B1 - Ｐｅｃｔｉｎｅｘ ｕｌｔｒａ ｓｐ-ｌ을 이용한 안토시아닌계 색소를 포함하는 베리류 또는 컬러감자의 추출물의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펙티넥스 효소를 전처리하여 안토시아닌계 색소 함량이 증대된 베리류 또는 컬러감자의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 a) 베리류 또는 컬러 감자에 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리하는 단계; 및 b) 상기 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리한 원료를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계를 포함하는, 베리류 또는 컬러 감자의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＥＣＴＩＮＥＸ ＵＬＴＲＡ ＳＰ-Ｌ을 이용한 안토시아닌계 색소를 포함하는 베리류 또는 컬러감자의 추출물의 제조 방법{Method for preparation of extracts of berries and colored potatos comprising anthocyanin-based pigments using Pectinex Ultra SP-L}
본 발명은 펙티넥스 효소를 전처리하여 안토시아닌계 색소 함량이 증대된 베리류 또는 컬러감자의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 a) 베리류 또는 컬러 감자에 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리하는 단계; 및 b) 상기 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리한 원료를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계를 포함하는, 베리류 또는 컬러 감자의 추출물을 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 추출물; 또는 이를 포함하는 조성물 및 상기 방법으로 제조된 추출물로부터 안토시아닌을 분리하는 방법에 관한 것이다.
천연 색소는 천연의 동식물에 함유되거나 혹은 미생물이 생산하는 색소로서, 인공색소와 달리 생체 내 안정성이 높아 신뢰도가 높은 장점을 지닌다. 천연 색소는 천연의 색조를 가지고 있기 때문에 다양하게 조합할 수 있는 장점이 있으며, 또한 가식(可食)할 수 있는 식품의 성분이므로 다양한 분야에서 안전하게 이용할 수 있다. 또한, 착색 효과가 뛰어나며 생산 및 정제 기술이 인공색소에 비해 간단하여 제조 원가 절감 효과 역시 지닌다. 상기 장점 외에도 천연 색소는 원료 및 색상에 따라 다양한 생리활성 기능을 가지고 있어, 기능적, 영양학적 가치도 매우 높은 것으로 평가되고 있다.
안토시아닌(Anthocyanin)은 대표적인 천연 색소 중 하나로서, 각종 식물의 잎, 꽃, 과실 등에서 적색에서 청색에 이르는 다양한 색을 발현하는 색소이며, 화청소(花靑素)로도 불린다. 식물에서 600 여종 이상이 발견되고 있는 안토시아닌은 모두 안토시아닌 배당체로서 플라빌룸(flavilium, 2-phenylbenzopyrilim)의 기본구조에 히드록시기 또는 메톡시기가 치환되어 있는 구조를 가지고 있다.
안토시아닌계 색소의 주요 특징은 비교적 물에 잘 용해되지만, 비-히드록시 용매에는 용해가 되지 않는 특징이 있으며, pH 변화에 매우 민감한 전위차적 성질을 가지고 있다. 특히, 안토시아닌계 색소는 항산화 효능 및 미백효과가 있어 화장품 산업에서 원료로 사용되고 있으며, 심혈관질환 등의 만성 질환이나 암과 같은 악성질환에 대해 예방 효과를 가지고 있다. 또한, 식품에 있어서는 강한 항산화 활성을 가지고 있어서 식품의 건강 기능성을 향상시킬 수 있다.
최근 LOHAS(Life Style of Health and Sustainability) 시대를 맞이하여 안토시아닌계 색소를 천연 원료로부터 분리해내려는 노력이 이루어지고 있다. 안토시아닌계 천연색소의 대표적인 원료로는 오디, 복분자와 같은 베리류, 자주색고구마, 컬러감자 등이 있으나, 이들 작물들은 대부분 기후의 영향을 받는 작물로서 국내에는 그 생산량이 크지 않다. 특히, 안토시아닌계 색소는 식물체에 따라 존재하는 종류 및 함량이 다양하고 수확 후, 압축, 살균, 건조 등의 가공처리과정에서 함량 및 생리활성능이 달라지게 된다. 또한, 컬러감자, 오디 등은 포도에 비하여 안토시아닌의 함량이 높아 그 안토시아닌계 색소의 분리에 있어 활용가치가 매우 높은 것으로 평가되고 있다. 그러나, 국내에서는 안토시아닌계 색소를 분리할 수 있는 작물이 희소하여 대부분 수입에 의존하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 국내산 기능성 작물인 컬러감자(자영 및 홍영), 베리류(오디 및 복분자)로부터 안토시아닌계 색소를 다량 분리해낼 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 컬러감자, 베리류가 안토시아닌계 색소를 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라, 추출 전 펙티넥스 효소를 처리하여 추출하는 경우 안토시아닌계 색소의 추출 효율을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 베리류 또는 컬러감자에 펙티넥스 효소를 전처리하는 단계를 포함하는, 안토시아닌계 색소 함량이 증대된 베리류 또는 컬러감자의 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 베리류 또는 컬러감자의 추출물; 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 안토시아닌을 포함하는 베리류 또는 컬러감자 추출물로부터 안토시아닌을 분리하는 단계를 포함하는, 안토시아닌의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 베리류 또는 컬러감자에 펙티넥스 효소를 전처리하는 단계를 포함하는, 안토시아닌계 색소 함량이 증대된 베리류 또는 컬러감자 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 바람직하게는, a) 베리류 또는 컬러감자에 펙티넥스(Pectinex) 효소를 20℃ 내지 60℃의 온도에서 2시간 내지 8시간 처리하는 단계; 및 b) 상기 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리한 원료를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 a)는 베리류 또는 컬러감자 추출물 제조 시 안토시아닌계 색소 추출 수율을 증진시키기 위하여 펙티넥스 효소를 처리하는 단계이다. 상기 펙티넥스 효소의 처리는 pH 4로 조절한 베리류 또는 컬러감자의 현탁액에 Pectinex Ultra SP-L을 첨가하여 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "베리류"는 딸기류의 관목 등의 작은 열매를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 베리류는 안토시아닌을 포함하고 있어 안토시아닌 추출에 이용될 수 있는 베리류를 의미하며, 그 예로 스트로베리, 복분자(blackberry), 오디(mulberry), 블루베리, 라즈베리, 커런트(currant), 크랜베리, 체리, 구스베리, 아세롤라, 엘더베리 등이 있으며, 바람직하게는 복분자 또는 오디이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 복분자는 장미과에 속하는 야생 나무딸기의 생약명으로서, 열매 안에 폴리페놀을 다량으로 함유하고 있으며, 항암 효과, 노화 억제, 동맥경화 예방 등의 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 복분자는 펙티넥스 효소의 전처리를 통하여 추출시 안토시아닌계 색소의 추출을 증가시킬 수 있는 열매를 의미한다. 또한, 상기 오디는 뽕나무 과에 속하는 낙엽교목인 뽕나무(Morus alba L.)의 열매로서, 플라보노이드(flavonoids), 스틸벤(stilbenes), 프레닐플라보노이드(prenylflavonoids), 코마린(coumarin), 디옥시노이지리마이신(deoxynoijirimycin) 및 루틴(rutin)과 같은 다양한 생리활성물질을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 오디는 일반 과실과 달리 과피 뿐만 아니라 과육에도 색소를 함유하고 있다.
본 발명에서 용어, "컬러감자"는 자색과 같은 색을 띄는 감자로서, 그 예로 자영 또는 홍영 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 자영은 컬러감자의 일종으로, 2007년 대한민국 농촌진흥청 고령지농업연구센터에서 개발한 감자를 의미한다. 자영은 겉과 속이 모두 자색으로서, 기존의 흰색 감자에는 없는 안토시아닌 성분이 다량 함유되어 전립선암과 노화, 통풍, 고혈압 등에 효과가 탁월하다. 또한, 상기 홍영은 컬러감자의 일종으로, 2007년 대한민국 농촌진흥청 고령지농업연구센터에서 개발한, 기존의 흰색 감자에는 없는 안토시아닌 성분이 다량 함유되어 있는 감자를 의미한다. 홍영은 겉과 속이 모두 홍색이며 항암 활성, 미백 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
상기 복분자 또는 오디와 같은 베리류 및 자영 또는 홍영과 같은 컬러감자는 안토시아닌계 색소를 포함하여, 안토시아닌계 색소 추출에 원료로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서는 추출 전에 상기 복분자 또는 오디와 같은 베리류 또는 자영 또는 홍영과 같은 컬러감자에 펙티넥스 효소를 이용하여 전처리하는 과정을 거쳐 안토시아닌계 색소의 함량을 증가시킨다.
본 발명에서 용어, "안토시아닌계 색소"는 각종 식물의 잎, 꽃, 과실 등에서 적색에서 청색에 이르는 다양한 색을 발현하는 색소로서, 플라빌리움(flavilium, 2-phenylbenzopyrilim)의 기본 구조에 히드록시기 또는 메톡시기가 치환되어 있는 구조를 가지는 화합물로서 식물에서 600종 이상 존재한다. 상기 안토시아닌계 색소의 예로, 페랄고니딘(Pelargonidin), 시아니딘(Cyanidin), 델피니딘(Delphinidin), 페오니딘(Peonidin), 페투니딘(Petunidin), 말리이딘(Malyidin) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 안토시아닌 색소는 항산화 효능 및 미백효과가 있어 화장품 산업에 원료로서 이용될 수 있으며, 심혈관 질환 등의 만성질환 및 암 등에 있어 예방 및 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 여러 안토시아닌 색소들은 강한 항산화 활성을 가지고 있어 식품의 건강 기능성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 요구에도 불구하고 식물체 내에 상기 안토시아닌 색소의 함량이 낮아 높은 수율로 추출할 수 있는 방법이 필요하였다. 본 발명의 방법은 안토시아닌 색소의 함량 및 추출 수율을 획기적으로 개선한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "펙티넥스(Pectinex) 효소"는 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제를 포함하는 효소 제제(enzyme preparation)로서, 바람직하게는 Novozyme 사의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L, Novozyme) 효소이다. 본 발명의 일 실시예에서는 복분자, 오디, 자영 또는 홍영으로부터 안토시아닌계 색소를 고함량으로 추출하기 위하여, 상기 펙티넥스 울트라 SP-L의 최적화된 처리 조건을 규명하였다.
구체적으로, 복분자에 펙티넥스 효소를 추출 전 처리하는 경우에 있어, 효소 활성을 감안한 농도보다 처리 온도 및 처리 시간이 안토시아닌 함량에 큰 영향을 미친다. 따라서, 상기 Pectinex Ultra SP-L 효소의 처리는 바람직하게는 20℃ 내지 60℃ 온도에서 2시간 내지 8시간동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 50℃ 온도에서 2시간 내지 3시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Pectinex Ultra SP-L 효소를 복분자에 1.5mL/100L의 효소 농도, 효소 처리 온도 40℃ 및 효소 처리시간 2시간으로 처리한 경우, 대조군에 비하여 8.7배 이상의 안토시아닌 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 2-3 및 표 9). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 1.0mL/100L의 효소농도, 효소 처리 온도 40℃, 및 효소 처리시간 5시간으로 수행한 경우 대조군에 비하여 폴리페놀의 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 2-6 및 표 12). 플라보노이드의 경우, 1.0mL/100L의 효소 농도, 효소처리온도 20℃ 및 효소처리시간 8시간의 조건에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다. 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 복분자 추출 전에 전처리한 경우, DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성이 증대된 결과를 나타내어, 항산화활성이 필요한 추출물의 제조 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하였다(표 13 참조).
또한, 오디에 펙티넥스 효소를 추출 전 처리하는 경우에 있어, 효소 활성을 감안한 농도 및 처리 시간보다는 처리 온도가 안토시아닌 함량에 큰 영향을 미친다. 따라서, 상기 펙티넥스 효소의 처리는 바람직하게는 20℃ 내지 60℃ 온도, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃ 온도에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 펙티넥스 효소의 처리는 바람직하게는 20℃ 내지 60℃ 온도 및 2시간 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃ 온도 및 2시간 내지 5시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 Pectinex Ultra SP-L 효소를 오디에 1.0mL/100L의 효소 농도, 효소 처리 온도 20℃ 및 효소 처리시간 2시간으로 처리한 경우, 대조군에 비하여 약 7배 이상의 안토시아닌 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 3-3 및 표 16). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 1.0mL/100L의 효소농도, 효소 처리 온도 20℃, 및 효소 처리시간 2시간으로 수행한 경우 대조군에 비하여 폴리페놀의 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 플라보노이드의 경우, 1.0mL/100L의 효소 농도, 효소처리온도 40℃ 및 효소처리시간 5시간의 조건에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다(실험예 3-6 및 표 20). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 오디 추출 전에 전처리한 경우, DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성이 증대된 결과를 나타내어, 항산화활성이 필요한 추출물의 제조 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하였다(표 21 참조).
또한, 자영에 펙티넥스 효소를 추출 전 처리하는 경우에 있어, 효소 활성을 감안한 농도보다 처리 온도 및 처리 시간이 안토시아닌 함량에 큰 영향을 미친다. 따라서, 상기 Pectinex Ultra SP-L 효소의 처리는 바람직하게는 20℃ 내지 60℃ 온도에서 2시간 내지 8시간 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 40℃ 온도에서 2시간 내지 3시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Pectinex Ultra SP-L 효소를 자영에 0.5mL/100L의 효소 농도, 효소 처리 온도 20℃ 및 효소 처리시간 5시간으로 처리한 경우, 대조군에 비하여 약 3.1배 이상의 안토시아닌 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 4-3 및 표 24). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 0.5mL/100L의 효소농도, 효소 처리 온도 40℃, 및 효소 처리시간 2시간으로 수행한 경우 대조군에 비하여 폴리페놀의 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 플라보노이드의 경우, 1.5mL/100L의 효소 농도, 효소처리온도 60℃ 및 효소처리시간 5시간의 조건에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다(실험예 4-6 및 표 28). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 자영 추출 전에 전처리한 경우, SOD-like 활성이 증대된 결과를 나타내어, 항산화활성이 필요한 추출물의 제조 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하였다(표 29 참조).
또한, 홍영에 펙티넥스 효소를 추출 전 처리하는 경우에 있어, 효소 활성을 감안한 농도보다 처리 온도 및 처리 시간이 안토시아닌 함량에 큰 영향을 미친다. 따라서, 상기 Pectinex Ultra SP-L 효소의 처리는 바람직하게는 20℃ 내지 60℃ 온도에서 2시간 내지 8시간 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 50℃ 온도에서 6시간 내지 8시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Pectinex Ultra SP-L 효소를 홍영에 0.5mL/100L의 효소 농도, 효소 처리 온도 40℃ 및 효소 처리시간 8시간으로 처리한 경우, 대조군에 비하여 약 3.7배 이상의 안토시아닌 함량을 증진시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 5-3 및 표 32). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 1.5mL/100L의 효소농도, 효소 처리 온도 60℃, 및 효소 처리시간 5시간으로 수행한 경우 대조군에 비하여 플라보노이드의 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 5-6 및 표 36). 또한, Pectinex Ultra SP-L 효소를 홍영 추출 전에 전처리한 경우, SOD-like 활성이 증대된 결과를 나타내어, 항산화활성이 필요한 추출물의 제조 등에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하였다(표 37 참조).
상기 b) 단계는 펙티넥스 효소로 전처리한 베리류 또는 컬러감자를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여, 안토시아닌계 색소 함량이 증대된 베리류 또는 컬러감자의 추출물을 제조하는 단계이다. 상기 펙티넥스 효소가 전처리된 원료를 b) 단계에서 추출하는 경우 전처리하지 않은 원료에 비하여 안토시아닌계 색소의 추출 수율이 증진된 결과를 나타낸다.
상기 베리류 또는 컬러감자의 추출물은 베리류 또는 컬러감자를 추출하여 수득한 추출물로서, 베리류 또는 컬러감자의 분쇄물에 물; 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 6의 알코올 극성 용매, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 급성 용매, 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출용매로서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올로서, 에탄올의 농도가 80% 내지 90%인 것이 바람직하다.
상기 베리류 또는 컬러감자의 에탄올 추출 공정은 특별히 이에 제한되지 않으나, 시료 대 용매비율 10%(w/v) 내지 20%(w/v), 30℃ 내지 70℃의 온도에서 1시간 내지 5시간 동안 수행될 수 있다.
특히, 복분자의 에탄올 추출은 바람직하게는 시료 대 용매비율 10%(w/v) 내지 15%(w/v), 30℃ 내지 50℃의 온도에서 3시간 내지 5시간 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 범위에 속하는 대표적인 조건인 시료 대 용매비율 15%(w/v), 추출온도 30℃ 및 추출시간 1시간의 조건에서 가장 큰 안토시아닌 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 홍영의 에탄올 추출은 바람직하게는 시료 대 용매비율 15%(w/v) 내지 20%(w/v), 40℃ 내지 60℃의 온도에서 3시간 내지 5시간 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 범위에 속하는 대표적인 조건인 시료 대 용매비율 20%(w/v), 추출온도 50℃ 및 추출시간 5시간의 조건에서 가장 큰 안토시아닌 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 베리류 또는 컬러감자 추출물; 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법에 의하여 제조된 추출물은 높은 안토시아닌계 색소 및 항산화 활성을 포함하고 있어, 안토시아닌계 색소의 분리 공정뿐만 아니라, 안토시아닌계 색소가 필요한 다양한 의약, 건강식품, 화장품 분야 등에 이용될 수 있다. 상기 의약, 건강식품, 화장품 등의 제형 등은 당업계의 통상적인 방법을 통하여 제조될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 안토시아닌을 포함하는 베리류 또는 컬러감자 추출물로부터 안토시아닌을 분리하는 단계를 포함하는, 안토시아닌의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 베리류 또는 컬러감자 추출물로부터 안토시아닌을 분리하는 방법은, 당업계의 통상적인 분리정제 방법을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명의 추출물의 제조방법은 안토시아닌 함량이 증대된 추출물을 제조하는 방법이므로, 이로부터 안토시아닌을 고수득할 수 있다.
본 발명의 펙티넥스 효소를 전처리하여 베리류 또는 컬러감자의 추출물을 제조하는 방법은 추출물의 제조시 안토시아닌계 천연색소의 함량을 현저히 증가시키는 결과를 가져오므로, 안토시아닌계 천연 색소가 필요한 분야, 예컨대 의약, 식품 또는 화장품 분야에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 복분자, 오디 및 컬러감자(자영, 홍영)의 외형을 나타낸 도로서, 오디가 복분자보다 색상이 짙었으며 컬러감자는 육질보다는 껍질에 색소가 진하게 나타났으며 자영은 보라색 계통을 띄었고 홍영은 자색 계통을 띄었다.
도 2는, 복분자, 오디 및 컬러감자(자영, 홍영)의 60% 에탄올 조추출물 외형을 나타낸 도로서, 60% 에탄올을 이용한 조추출물의 외관에서는 오디가 가장 짙은 색상을 나타내었으며 복분자, 홍영, 자영 순으로 옅게 나타나는 결과를 보였다.
도 3은, 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
도 4는, 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
도 5는, 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
도 6은, 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
도 7은, 복분자의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
도 8은, 홍영의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 안토시아닌계 천연색소의 원료선별
실시예 1-1: 재료 및 시약의 준비
본 실험에 사용한 컬러감자(자영, 홍영)는 옥션에서 구입하였고 오디는 전남 영광, 복분자는 전북 완주에서 수확한 것을 제공받아 사용하였으며 분석에 사용한 시약은 모두 시그마 사(St. Louis, USA)의 특급시약을 사용하였다.
실시예 1-2: 조추출물 제조
조추출물의 제조시 컬러감자(자영, 홍영), 오디, 복분자를 동결 건조하여 사용하였고, 추출은 시료 1g(dry basis)에 60% 에탄올 200㎖를 용매로 사용하였으며 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 40℃에서 1시간 추출한 후 Wattman No 2로 여과한 후 얻은 여과액을 진공회전농축기로 40℃에서 농축하여 조추출물을 제조하였다.
실시예 1-3: 총 안토시아닌함량 측정
총 안토시아닌함량은 람베르트-베르 법칙(Lambert-beer law)에 따라 분자흡광계수 65.1을 사용하여 하기와 같이 측정하였다.
동결건조한 오디, 복분자, 컬러감자(자영, 홍영) 분말 2g에 1.5N HCl-95% EtOH(15:85,v/v) 50㎖를 가하고 초음파 분쇄기로 1시간 동안 추출한 후, 원심분리하여 얻어진 상층액을 같은 용매 100mL로 정용한 후 실온에서 2시간 암소에 방치한 다음 상등액을 20배 희석하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-4: 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 약간 변형하여 측정하였다. 즉 추출물 2㎖에 2% Na2CO3용액 2㎖을 가한 후 실온에서 3분간 반응시킨 다음 50% Folin-ciocalteu 용액 0.4㎖을 가하여 실온에서 30분간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀함량을 구하기 위한 표준물질로는 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 작성한 표준 검량곡선으로부터 함량을 구하였다.
실시예 1-5: 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 추출액 0.5㎖에 10% Al(NO3)3용액 1㎖와 1M 아세트산칼륨(potassium acetate)용액 0.1㎖를 첨가하고, 증류수 4.3㎖를 추가로 더 첨가하였다. 그 다음, 시료액을 실온에서 40분간 반응시킨 후 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드함량을 구하기 위한 표준물질인 퀘르세틴(quercetin)을 이용하여 작성한 표준 검량 곡선으로부터 플라보노이드 함량을 측정하였다.
실시예 1-6: DPPH 라디칼 소거능 측정
시료 1㎖를 시험관에 넣고 4.0㎖의 95%(v/v)의 에틸 알코올(ethyl alcohol)을 가하여 실험용액을 제조하였다. 이 용액에 0.2mM DPPH용액 1.0㎖을 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 U.V. visible spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군의 경우, 시료 대신 증류수를 이용하여 실험군과 동일한 방법으로 수행하였고, 각 시료에 대한 자유라디칼 DPPH radical의 소거능(%)은 하기 식을 이용하여 산출하였다.
DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity, %) = (1-A/B) X 100
A: Absorbance of sample, B: Absorbance of blank
실시예 1-7: 히드록시 라디칼 ( Hydroxy radical ) 소거능
2.8mM 2-디옥시-D-리보오스(2-deoxy-D-ribose) 및 1.4mM H2O2를 함유하는 10mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.4) 일정량에, 증류수에 녹인 각각의 시료와 전혼합된 EDTA/FeCl2(100uM EDTA pH 7.0, 20uM FeCl2)를 첨가하여, 최종반응액이 2.0mL가 되게 한 후, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 10% TCA(trichloroacetic acid)로 반응을 중지시키고 1% TBA(thiobarbituronic acid)와 잘 혼합하여 95℃에서 20분간 반응시킨 후 실온에서 냉각하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-8: 히드록시 과산화물( Hydroxy peroxide ) 소거능
96웰 마이크로 플레이트에 PBS 100㎕, 증류수에 녹인 시료 20㎕을 넣고 1mM H2O2를 가하여 5분간 방치한 다음, 1.25nM ABTS 30㎕와 PBS에 녹인 1U/㎖ 퍼옥세다제(peroxidase) 30㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-9: SOD - like ( superoxide dismutase - like ) 활성 측정
일정농도의 시료 0.2㎖, Tris-HCl 완충액(50mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane + 10mM EDTA, pH 8.5로 보정) 3㎖, 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.2㎖을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시키고 1N HCl 1㎖를 가하여 반응을 정지시켰다.
반응액 중 산화된 피로갈롤의 양은 420nm에서 흡광도를 측정하였으며, 또한 SOD 유사활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다. SOD-like 활성능은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
SOD-like 활성능(%) = (1-(시료 첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도)) X 100
실시예 1-10: 엘라스타제 ( Elastase ) 저해활성
James 등의 방법에 따라 시료를 0.2M Tris-Cl 완충액(pH 8.0)으로 희석배수에 따라 희석하고(10 내지 1,000㎍/㎖), 희석된 시료 20㎕에 0.2M Tris-Cl 완충액(pH 8.0) 200㎕를 가한 다음, 0.8mM N-숙시닐-(알라)3-p-니트로아닐라이드(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide) 20㎕씩을 첨가하였다. 반응혼합물은 다시 25℃에서 10분간 배양한 다음 1.0㎍/㎖의 PPE(porcine pancreatic elastase)를 20㎕씩 첨가하였다.
반응혼합물은 다시 25℃에서 20분간 배양한 후 냉침으로 반응을 정지시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 증류수를 가해 효소의 활성을 측정하였다. 엘라스타제 저해활성은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
엘라스타제 저해활성(%) = [1-(B-C)/(A-D)] X 100
여기서, A: 시료 대신 증류수를 넣고 효소를 첨가하여 반응한 후의 흡광도, B: 효소를 첨가하여 반응한 후의 시료의 흡광도, C: 효소 대신 증류수를 첨가하여 반응한 후의 시료의 흡광도, D: 시료와 효소 대신 각각 증류수를 첨가해 반응한 후의 흡광도
실시예 2: 효소를 이용한 추출 전처리 공정 기술 개발
실시예 2-1: 효소 전처리 공정의 실험설계
본 발명에서는, 안토시아닌 추출시 수율을 향상시키기 위하여, 에탄올을 이용하여 안토시아닌을 추출하기 전에 전처리 과정으로서 Novozyme 사(Bagsvaerd, Denmark)의 Pectinex Ultra SP-L을 사용하였다. 구체적으로, Pectinex Ultra SP-L은, Novozyme 사의 아스퍼길러스 아쿨레투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)에 대한 효소 제제(enzyme preparation)이다.
Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 공정은 동결건조한 복분자, 오디, 자영, 홍영에 8배의 물을 첨가하여 현탁시킨 후 pH 4로 조정하고 효소활성을 감안한 농도로 Pectinex Ultra SP-L를 첨가하여 250rpm으로 진탕 배양기(Si-900R, Jeio Tech, Korea)에서 처리온도(X2)로는 20-60℃, 처리시간(X3)으로는 2-8시간으로 반응하였다. 효소처리 후 원리분리기(UNION 55R, Hanil. Korea)로 4000rpm, 10분간 원심분리하여 효소는 제거하였다.
구체적으로 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 공정의 처리조건은 시료에 대한 효소활성을 감안한 농도(X1)로는 0.5-1.5(mL/100L), 처리온도(X2)로는 20-60℃, 처리시간(X3)으로는 2-8시간을 흥미 수준으로 정하였다(표 1). 이들 독립변수들은 3수준(-1, 0, 1)으로 부호화하여 중심합성계획법에 따라 설정하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수로는 총 안토시아닌함량, 총 폴리페놀함량, 총 플라보노이드함량, DPPH radical 소거능, SOD-like 활성, 효소전처리 후 수율, 동결건조수율 등으로 설정하였다. 효소 전처리 공정의 처리조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 MINITAB statistical software를 사용하였다.
Independent variables Symbol Levels
-1 0 1
Conc. of enzymatic activity(mL/100L) X1 0.5 1 1.5
Temperature(℃) X2 20 40 60
Time(hr) X3 2 5 8
효소전처리를 거친 각 시료 1 g(dry basis)에 60% 에탄올(95% 식음용 곡물주정, 대한주정라이프, KOREA) 200 mL를 넣은 다음 초음파세척기(Power Sonic 420, Hwashintech, KOREA)를 이용하여 40℃에서 1시간 정치추출한 후 Whatman No.1로 여과 후 얻은 여과액을 진공회전농축기(Buchi R-114, SWISS)로 40℃에서 감압농축한 다음 동결건조(Ilshin Biobase, KOREA)하여 사용하였다. 또한, 분석 방법의 경우 상기 실시예 1에 기술한 방법에 준하여 측정하였다.
실험예 1: 안토시아닌계 천연 색소의 원료 선별 및 함량 분석
실시예 1에 기술된 방법으로 안토시아닌계 천연 색소를 추출할 원료를 선별하기 위하여, 복분자, 오디, 자영 및 홍영을 분석하였다.
그 결과, 외형의 경우, 오디가 복분자보다 색상이 짙었으며, 컬러감자인 자영, 홍영의 경우 육질보다는 껍질에 색소가 진하게 나타났으며 자영은 보라색 계통을 띄었고 홍영은 자색 계통을 띄었다(도 1). 또한, 복분자, 오디 및 컬러감자의 60% 에탄올 조추출물의 외형을 확인하였을 때, 오디가 가장 짙은 색상을 나타내었으며 복분자, 홍영, 자영 순으로 색상이 옅게 나타났다(도 2).
60% 에탄올 추출물의 총 안토시아닌 함량과 색상에 대해서는 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표에서 a는 붉은 색(redness)을 나타내며, b는 황색도(yellowness)를 나타낸다.
　 Total anthocyanin
(%, dry weight)		 Hunter value
L a b
복분자 1.10±0.01a 45.49±0.01c 72.53±0.01a 39.81±0.09a
오디 0.92±0.00b 42.40±0.08d 68.03±0.02b 23.04±0.10c
자영 0.56±0.04c 56.55±0.21b 65.47±0.21c -14.70±0.17d
홍영 0.61±0.02d 67.03±0.09a 50.73±0.32d 31.78±0.53b
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 전체 안토시아닌 및 붉은색 값은 복분자, 오디, 홍영, 자영순으로 나타났으며, 황색도의 경우 보라색을 띄는 자영이 -14.70의 값을 나타내는 결과를 보였다
60% 에탄올추출물의 a) 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, b) DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성, 및 c) 히드록시 라디칼, 과산화수소 소거능 및 엘라스타제 억제 활성에 대한 결과를 하기 표 3 내지 5에 각각 나타내었다.
　 Total polyphenol contents(mg/g) Total flavonoid contents(mg/ml)
복분자 8.25±0.04a 4.42±0.01a
오디 5.64±1.40b 3.08±0.11b
자영 3.74±0.05b 2.26±0.00d
홍영 3.83±0.05b 2.47±0.04c
　 DPPH radical scavenging activity(%) SOD-like activity (%)
복분자 11.76±0.34d 1.10±0.93NS
오디 34.17±2.59c 0.88±0.00NS
자영 50.55±0.01b 0.66±0.31NS
홍영 57.90±0.40a 0.88±0.62NS
　 Hydroxyl radical scavenging activity(%) Hydrogen peroxide scavenging activity (%) Elastase inhibitory activity (%)
복분자 80.52±0.73a 88.40±0.09a 4.26±0.01c
오디 73.45±0.59b 76.65±0.78a 2.88±0.14d
자영 14.09±1.56d 35.65±1.25b 5.97±0.02a
홍영 21.78±1.42c 40.47±8.63b 4.69±0.01b
그 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 경우 컬러감자인 자영이나 홍영에 비하여 오디 및 복분자가 더 높은 함량을 가지는 결과를 나타내었다. 또한, DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성의 경우, 표 4에 나타낸 바와 같이 DPPH 라디칼 소거능의 경우 컬러감자인 자영 및 홍영이 복분자나 오디에 비하여 높게 나타났으며, 5% 수준에서 유의성 차이를 나타내었다. 또한, SOD-like 활성의 경우 복분자가 가장 높은 결과를 보였으며, 5% 수준에서 유의성 차이를 나타내지 않았다. 히드록시 라디칼, 과산화수소 소거능 및 엘라스타제 억제 활성의 경우, 표 5에 나타난 바와 같이 소거능의 경우 복분자 및 오디가 컬러감자인 자영 및 홍영에 비하여 월등히 높은 결과를 보였으며, 엘라스타제 억제 활성을 컬러감자가 복분자나 오디에 비하여 높게 나타났다.
실험예 2: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L 효소 전처리에 의한 효과 확인
실험예 2-1: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 공정의 실험 설계
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 효과 확인을 하여 최적 조건의 공정을 도출하기 위하여, 하기 표 6과 같은 공정의 실험을 설계하였다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 공정의 실험 설계
Experiment number X 1 X 2 X 3 Conc. of enzymatic activity(mL/100L) Temperature (℃) Time(hr)
1 0 -1 1 1.0 20 8
2 0 1 -1 1.0 60 2
3 0 0 0 1.0 40 5
4 0 -1 -1 1.0 20 2
5 -1 0 1 0.5 40 8
6 -1 -1 0 0.5 20 5
7 -1 0 -1 0.5 40 2
8 0 0 0 1.0 40 5
9 1 1 0 1.5 60 5
10 0 0 0 1.0 40 5
11 1 0 -1 1.5 40 2
12 1 0 1 1.5 40 8
13 1 -1 0 1.5 20 5
14 0 1 1 1.0 60 8
15 -1 1 0 0.5 60 5
실험예 2-2: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율 측정
상기 실험 설계에 기초하여 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율
Experiment number X 1 X 2 X 3 Yield after enzyme pre - treatment (%) Yield after freeze dehydration treatment (%)
1 0 -1 1 30.63 6.36
2 0 1 -1 31.76 4.93
3 0 0 0 29.46 5.77
4 0 -1 -1 28.71 5.26
5 -1 0 1 28.01 5.95
6 -1 -1 0 30.06 5.09
7 -1 0 -1 33.15 6.05
8 0 0 0 28.56 6.18
9 1 1 0 29.64 4.55
10 0 0 0 32.63 6.32
11 1 0 -1 32.09 4.66
12 1 0 1 28.67 5.32
13 1 -1 0 26.83 5.85
14 0 1 1 25.93 4.04
15 -1 1 0 29.12 4.34
그 결과, 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 효소처리 후 수율은 25.93 내지 33.15%의 수준을 나타내었으며, 동결 건조 후에는 4.04 내지 6.36%의 수준을 나타내었다.
실험예 2-3: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량 측정
Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 5.29±0.08
2 0 1 -1 5.77±0.18
3 0 0 0 3.43±0.09
4 0 -1 -1 3.98±0.09
5 -1 0 1 2.93±0.04
6 -1 -1 0 6.61±0.16
7 -1 0 -1 4.50±0.20
8 0 0 0 4.40±0.02
9 1 1 0 6.08±0.01
10 0 0 0 3.30±0.01
11 1 0 -1 8.77±0.27
12 1 0 1 3.81±0.03
13 1 -1 0 5.08±0.12
14 0 1 1 4.49±0.14
15 -1 1 0 5.51±0.12
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이, 총 안토시아닌 함량이 가장 높은 효소의 처리 조건은 1.5mL/100L의 효소(Pectinex Ultra SP-L)농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 2시간이었으며 공정에서의 총 안토시아닌 함량은 8.77% 수준이었다. 효소처리조건에 따라서 총 안토시아닌 함량의 범위는 2.93% 내지 8.77%로 다소 크게 나타났으며 무처리 시에는 1.10%에 불과한 결과를 나타내어(표 2), 본 발명의 전처리 공정을 이용하는 경우 안토시아닌 함량을 최대 8.7배 가량의 증진효과를 나타낼 수 있음을 시사하였다.
실험예 2-4: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표 9 내지 11에 각각 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
Factor 복분자
F value Pr > F
Conc. of enzymatic activity(mL/100L) 2.97 0.0446
Temperature(℃) 4.88 0.0065
Time(hr) 4.52 0.0092
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 3 요인 중에서 처리온도, 처리시간 및 효소 활성을 감안한 농도 순으로 효소 전처리시 안토시아닌의 추출 함량에 영향을 미친 결과를 나타내어, 특히 온도 및 처리시간이 효소활성을 감안한 농도에 비하여 안토시아닌 함량에 있어 큰 영향을 미치는 결과를 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항 회귀곡선의 회귀계수
Parameter Estimate
복분자
Intercept 3.710000
X1 1 ) 0.525000
X2 2 ) 0.109375
X3 3 ) -0.813125
X1*X1 1.113750
X2*X1 0.526250
X2*X2 0.997500
X3*X1 -0.848750
X3*X2 -0.647500
X3*X3 0.177500
1)Conc. of enzymatic activity(mL/100L)
2)Temperature(℃)
3)Time(hr)
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항 회귀식의 적합도 검정
Regression 복분자
R 2 F value Pr > F
Linear 0.2375 4.59 0.0134
Quadratic 0.244 4.64 0.0128
Cross product 0.1773 3.42 0.0369
Total regress 0.6548 4.22 0.0035
실험예 2-5: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소처리 후 반응표면 등고선 조사
상기 분석 외에도 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 반응표면분석법에 의한 반응표면 곡선에서 효소 활성을 감안한 농도(X1)보다는 처리온도(X2) 및 처리시간(X3)이 안토시아닌 추출 시 수율향상에 영향을 미치는 것을 나타내었다. 또한, 영향력에서는 처리온도, 처리시간, 효소활성을 감안한 농도 순으로 그 영향력이 미침을 나타내었다.
실험예 2-6: 복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량; 및 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD - like 활성 조사
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total polyphenol contents( mg /g) Total flavonoid contents( mg / mL )
1 0 -1 1 8.81±0.01 4.97±0.21
2 0 1 -1 9.96±0.04 4.17±0.22
3 0 0 0 8.51±0.02 4.27±0.61
4 0 -1 -1 8.49±0.03 3.79±0.24
5 -1 0 1 9.49±0.02 4.26±0.52
6 -1 -1 0 7.89±0.03 3.92±0.16
7 -1 0 -1 8.44±0.03 4.09±0.21
8 0 0 0 12.34±0.02 4.45±0.47
9 1 1 0 8.08±0.01 3.90±0.14
10 0 0 0 8.36±0.01 4.38±0.42
11 1 0 -1 7.47±0.00 4.17±0.10
12 1 0 1 6.33±0.00 3.19±0.17
13 1 -1 0 7.94±0.00 4.02±0.31
14 0 1 1 6.30±0.00 3.34±0.11
15 -1 1 0 9.38±0.14 4.48±0.04
그 결과, 상기 표 12에 나타낸 바와 같이, 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 효소전처리공정은 1.0mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 5시간이었으며, 공정에서의 총 폴리페놀 함량 평균값은 10.47mg/g 수준을 나타내었다. 반면, 총 플라보노이드 가장 높은 효소 전처리 공정은 1.0mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 20℃, 효소처리시간 8시간이었으며, 공정에서의 총 플라보노이드 함량은 4.97mg/mL이었다. 이때 무처리한 경우, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 8.25mg/g과 4.42mg/mL을 나타내었으므로(표 3), 본 발명의 효소 전처리를 통하여 폴리페놀 및 플라보노이드를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성을 측정한 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
복분자를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성
Experiment number X 1 X 2 X 3 DPPH radical scavenging activity (%) SOD - like activity (%)
1 0 -1 1 33.10±4.49 9.03±0.65
2 0 1 -1 51.52±4.09 8.77±0.65
3 0 0 0 48.88±1.06 8.25±1.75
4 0 -1 -1 51.39±2.85 9.16±0.46
5 -1 0 1 49.50±0.18 10.32±0.09
6 -1 -1 0 55.27±2.70 12.90±0.61
7 -1 0 -1 51.14±2.49 38.32±0.56
8 0 0 0 42.74±1.54 9.03±0.65
9 1 1 0 56.52±2.00 10.19±0.82
10 0 0 0 46.23±1.62 8.51±0.65
11 1 0 -1 61.16±2.91 8.90±1.20
12 1 0 1 60.27±1.52 9.68±0.46
13 1 -1 0 52.14±3.91 8.26±0.29
14 0 1 1 65.17±2.23 12.00±0.80
15 -1 1 0 49.50±1.59 10.32±0.27
상기 표에 나타낸 바와 같이, 무처리시 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성은 각각 11.76%와 1.10% 이었으나(표 4), 본 발명의 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능을 33.10-65.17%로 최대 6배 가량 증가되었고, SOD-like 활성의 경우 8.26% 내지 38.32%로 최대 38배가량 증가되었다. 따라서, 상기와 같은 결과는 본 발명의 효소 전처리 공정은 안토시아닌계 천연색소 추출에 있어서 그 효율을 현저히 증가시킬 수 있는 공정임을 시사하는 결과이다.
실험예 3: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L 효소 전처리에 의한 효과 확인
실험예 3-1: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 공정의 실험 설계
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 효과 확인을 하여 최적 조건의 공정을 도출하기 위하여, 하기 표와 같은 공정의 실험을 설계하였다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 공정의 실험 설계
Experiment number X 1 X 2 X 3 Conc . of enzymatic activity( mL /100L) Temperature (℃) Time( hr )
1 0 -1 1 1.0 20 8
2 0 1 -1 1.0 60 2
3 0 0 0 1.0 40 5
4 0 -1 -1 1.0 20 2
5 -1 0 1 0.5 40 8
6 -1 -1 0 0.5 20 5
7 -1 0 -1 0.5 40 2
8 0 0 0 1.0 40 5
9 1 1 0 1.5 60 5
10 0 0 0 1.0 40 5
11 1 0 -1 1.5 40 2
12 1 0 1 1.5 40 8
13 1 -1 0 1.5 20 5
14 0 1 1 1.0 60 8
15 -1 1 0 0.5 60 5
실험예 3-2: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율 측정
상기 실험 설계에 기초하여 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율
Experiment number X 1 X 2 X 3 Yield after enzyme pre - treatment (%) Yield after freeze dehydration treatment (%)
1 0 -1 1 29.69 8.89
2 0 1 -1 30.57 5.74
3 0 0 0 29.19 8.97
4 0 -1 -1 27.15 8.52
5 -1 0 1 25.97 7.16
6 -1 -1 0 27.94 8.40
7 -1 0 -1 31.33 8.80
8 0 0 0 28.34 7.98
9 1 1 0 24.02 7.55
10 0 0 0 31.27 8.78
11 1 0 -1 31.25 8.86
12 1 0 1 29.36 8.61
13 1 -1 0 26.91 8.72
14 0 1 1 27.66 7.59
15 -1 1 0 23.61 7.42
상기 표에 나타난 바와 같이, Pectinex Ultra SP-L 효소를 오디에 처리한 경우, 수율은 23.61-31.33%, 동결건조 후의 수율은 5.74-8.89%를 나타내었다. 상기 실험예 2에 나타낸 바와 같이 복분자에 Pectinex Ultra SP-L 효소를 처리한 경우 수율은 25.93-32.63% 수준을 보여, 오디와 큰 차이가 없었다. 다만, 복분자의 경우 동결건조 후에 4.04-6.36% 값을 나타내어 다소 작은 값을 나타내었다(표 8).
실험예 3-3: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량 측정
오디에 Pectinex Ultra SP-L 효소를 전처리한 다음, 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 5.76±0.32
2 0 1 -1 3.43±0.14
3 0 0 0 6.23±0.39
4 0 -1 -1 6.51±0.61
5 -1 0 1 4.42±0.55
6 -1 -1 0 5.94±0.86
7 -1 0 -1 5.41±0.35
8 0 0 0 3.01±0.42
9 1 1 0 2.55±0.20
10 0 0 0 5.38±0.40
11 1 0 -1 3.46±0.29
12 1 0 1 3.26±0.15
13 1 -1 0 3.80±0.02
14 0 1 1 2.82±0.17
15 -1 1 0 2.74±0.04
상기 표에 나타난 바와 같이 총 안토시아닌 함량이 가장 높은 효소 처리 조건은 1.0mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 20℃, 효소처리시간 2시간의 조건이었으며, 이 공정에서의 총 안토시아닌 함량은 6.51% 가량을 나타내었다. 상기 표에 나타난 바와 같이 효소처리조건에 따라서 총 안토시아닌 함량의 범위는 2.74-6.51%로 그 차이가 다소 크게 나타났다. 반면, 오디에 Pectinex Ultra SP-L를 무처리한 경우 총 안토시아닌 함량은 처리한 경우와 달리 매우 낮은 0.92%이었다(표 2). 따라서, 오디에 Pectinex Ultra SP-L를 처리하는 본 발명의 전처리 공정은 총 안토시아닌 함량을 7.1배 가량 증진시킬 수 있음을 시사하는 결과로서, 본 발명의 전처리 공정이 베리류 또는 컬러감자의 총 안토시아닌 함량을 증진시키는 데 매우 유용하게 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
실험예 3-4: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표에 각각 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
Factor 오디
F value Pr > F
Conc. of enzymatic activity(mL/100L) 0.70 0.6036
Temperature(℃) 10.62 <.0001
Time(hr) 5.06 0.0056
상기 표에 나타난 바와 같이, 3가지 요인 중에서 처리온도, 처리시간, 효소활성을 감안한 농도 순으로 효소 전처리시 안토시아닌 추출 함량에 영향력을 미치는 결과를 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항회귀곡선의 회귀계수
Parameter Estimate
오디
Intercept 4.870000
X1 1 ) -0.678750
X2 2 ) -1.311250
X3 3 ) -0.317500
X1*X1 -0.801875
X2*X1 0.488750
X2*X2 -0.309375
X3*X1 0.198750
X3*X2 0.033750
X3*X3 0.070625
1)Conc. of enzymatic activity(mL/100L)
2)Temperature(℃)
3)Time(hr)
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 적합성 검정
Regression 오디
R 2 F value Pr > F
Linear 0.6261 17.15 <.0001
Quadratic 0.0922 2.52 0.0867
Cross product 0.0384 1.05 0.3919
Total regress 0.7566 6.91 0.0002
실험예 3-5: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소처리 후 반응표면 등고선 조사
상기 분석 외에도 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 오디의 경우 반응표면분석법에 의한 반응표면곡선에서 효소활성을 감안한 농도(X1)와 처리시간(X3)보다는 처리온도(X2)가 안토시아닌 추출 시 수율 향상에 영향을 미친다는 것을 시사하였다.
실험예 3-6: 오디를 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량; 및 DPPH radical 소거능 및 SOD - like activity 조사
오디에 Pectinex Ultra SP-L 효소를 전처리한 다음, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total polyphenol contents( mg /g) Total flavonoid contents( mg / ml )
1 0 -1 1 4.67±0.13 3.05±0.10
2 0 1 -1 4.74±0.13 3.43±0.05
3 0 0 0 5.92±0.32 3.50±0.16
4 0 -1 -1 5.15±0.47 3.17±0.25
5 -1 0 1 5.13±0.17 3.21±0.15
6 -1 -1 0 5.51±0.41 3.39±0.24
7 -1 0 -1 5.79±0.63 3.23±0.31
8 0 0 0 4.26±0.03 3.22±0.02
9 1 1 0 5.71±0.32 3.44±0.01
10 0 0 0 5.74±0.14 3.64±0.21
11 1 0 -1 5.38±0.04 3.28±0.30
12 1 0 1 5.35±0.20 3.22±0.16
13 1 -1 0 4.38±0.03 2.97±0.26
14 0 1 1 4.26±0.04 3.44±0.04
15 -1 1 0 5.48±0.32 3.59±0.02
상기 표에 나타난 바와 같이, 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 효소 전처리공정은 1.0mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 20℃, 효소처리시간 2.0시간이었으며 공정에서의 총 폴리페놀 함량의 평균값은 5.83mg/g 가량이었다. 또한, 총 플라보노이드 가장 높은 효소 전처리공정은 1.0mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 5.0시간이었으며 공정에서의 총 플라보노이드 함량은 3.64mg/mL이었다. 무처리 시의 폴리페놀 함량 및 플라보이드 함량이 각각 5.64mg/g와 3.08mg/mL이었다(표 3).
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성을 측정한 결과를 하기 표에 나타내었다.
오디를 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity
Experiment number X 1 X 2 X 3 DPPH radical scavenging activity (%) SOD - like activity (%)
1 0 -1 1 52.50±2.29 21.54±1.08
2 0 1 -1 45.99±1.27 16.26±0.58
3 0 0 0 52.00±0.52 18.45±1.11
4 0 -1 -1 52.25±0.52 18.71±0.74
5 -1 0 1 47.86±3.56 19.48±0.37
6 -1 -1 0 51.00±1.23 19.35±0.55
7 -1 0 -1 52.13±0.34 20.25±0.73
8 0 0 0 48.23±3.38 19.61±0.55
9 1 1 0 46.97±5.16 14.45±0.50
10 0 0 0 49.25±0.88 22.32±0.71
11 1 0 -1 48.74±2.31 19.61±0.55
12 1 0 1 51.87±1.76 18.19±0.75
13 1 -1 0 52.62±3.17 18.58±0.20
14 0 1 1 40.09±3.26 20.00±0.36
15 -1 1 0 38.83±3.62 18.19±1.11
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 Pectinex Ultra SP-L를 오디에 처리한 경우, DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity는 각각 34.17%와 0.88%이었으나(표 4) 효소전처리 후 각각 38.83-52.62% 및 16.26-22.32%로 증가한 결과를 나타내었다.
실험예 4: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L 효소 전처리 효과 확인
실험예 4-1: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 공정의 실험 설계
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 효과 확인을 하여 최적 조건의 공정을 도출하기 위하여, 하기 표와 같은 공정의 실험을 설계하였다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 공정의 실험 설계
Experiment number X 1 X 2 X 3 Conc . of enzymatic activity( mL /100L) Temperature (℃) Time( hr )
1 0 -1 1 1.0 20 8
2 0 1 -1 1.0 60 2
3 0 0 0 1.0 40 5
4 0 -1 -1 1.0 20 2
5 -1 0 1 0.5 40 8
6 -1 -1 0 0.5 20 5
7 -1 0 -1 0.5 40 2
8 0 0 0 1.0 40 5
9 1 1 0 1.5 60 5
10 0 0 0 1.0 40 5
11 1 0 -1 1.5 40 2
12 1 0 1 1.5 40 8
13 1 -1 0 1.5 20 5
14 0 1 1 1.0 60 8
15 -1 1 0 0.5 60 5
실험예 4-2: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율 측정
상기 실험 설계에 기초하여 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율
Experiment number X 1 X 2 X 3 Yield after enzyme pre - treatment (%) Yield after freeze dehydration treatment (%)
1 0 -1 1 21.33 1.71
2 0 1 -1 16.86 2.10
3 0 0 0 18.92 2.37
4 0 -1 -1 19.39 1.47
5 -1 0 1 16.79 1.53
6 -1 -1 0 21.50 2.10
7 -1 0 -1 21.40 2.04
8 0 0 0 18.66 1.81
9 1 1 0 10.42 0.26
10 0 0 0 20.42 2.21
11 1 0 -1 19.95 1.92
12 1 0 1 18.44 2.67
13 1 -1 0 21.14 2.33
14 0 1 1 16.56 1.45
15 -1 1 0 19.90 1.70
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 효소처리 후 수율은 10.42-21.50% 수준이었으며 동결건조 후에는 0.26-2.37% 수준을 나타내었다.
실험예 4-3: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량 측정
효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 1.39±0.26
2 0 1 -1 1.28±0.07
3 0 0 0 1.38±0.09
4 0 -1 -1 1.51±0.09
5 -1 0 1 0.89±0.06
6 -1 -1 0 1.72±0.05
7 -1 0 -1 1.23±0.04
8 0 0 0 1.06±0.01
9 1 1 0 0.75±0.01
10 0 0 0 1.15±0.08
11 1 0 -1 0.96±0.05
12 1 0 1 0.71±0.00
13 1 -1 0 0.96±0.07
14 0 1 1 1.14±0.03
15 -1 1 0 1.39±0.04
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 총 안토시아닌 함량이 가장 높은 효소처리조건은 0.5mL/100L의 효소(Pectinex Ultra SP-L)농도, 효소처리온도 20℃, 효소처리시간 5시간이었으며, 이때 공정에서의 총 안토시아닌 함량은 1.72% 수준을 나타내었다. 무처리시 자영의 총 안토시아닌 함량은 0.56%에 불과하여(표 2), 자영에 Pectinex Ultra SP-L 효소를 전처리하는 경우 총 안토시아닌 함량을 3배 이상으로 현저히 증가시킬 수 있음을 시사하였다.
실험예 4-4: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표에 각각 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
Factor 자영
F value Pr > F
Conc. of enzymatic activity(mL/100L) 2.30 0.0945
Temperature(℃) 11.61 <.0001
Time(hr) 5.70 0.0032
그 결과, 3가지 요인 중에서 처리온도, 처리시간, 효소활성을 감안한 농도 순으로 효소 전처리시 안토시아닌 추출함량에 영향력을 미친 결과를 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항회귀곡선의 회귀계수
Parameter Estimate
자영
Intercept 1.195000
X1 1 ) 0.230625
X2 2 ) -0.126250
X3 3 ) -0.108125
X1*X1 -0.185000
X2*X1 0.028750
X2*X2 0.196250
X3*X1 0.022500
X3*X2 -0.008750
X3*X3 -0.062500
1)Conc. of enzymatic activity(mL/100L)
2)Temperature(℃)
3)Time(hr)
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 적합성 검정
Regression 자영
R 2 F value Pr > F
Linear 0.5397 17.97 <.0001
Quadratic 0.2553 8.50 0.0008
Cross product 0.0047 0.16 0.9242
Total regress 0.7997 8.87 <.0001
실험예 4-5: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소처리 후 반응표면 등고선 조사
상기 분석 외에도 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 반응표면분석법에 의한 반응표면곡선에서 효소활성을 감안한 농도(X1)보다는 추출온도(X2)와 추출시간(X3)이 안토시아닌 추출시 수율 향상에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 또한, 영향력에서는 처리온도, 처리시간, 효소활성을 감안한 농도 순으로 나타났다.
실험예 4-6: 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량; 및 DPPH radical 소거능 및 SOD - like activity 조사
또한, 자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total polyphenol contents( mg /g) Total flavonoid contents( mg / ml )
1 0 -1 1 3.50±0.23 2.59±9.85
2 0 1 -1 3.41±0.01 2.66±0.02
3 0 0 0 3.12±0.01 2.65±0.04
4 0 -1 -1 3.14±0.00 2.82±0.07
5 -1 0 1 3.24±0.02 2.95±7.45
6 -1 -1 0 3.49±0.02 3.08±0.10
7 -1 0 -1 4.08±0.06 3.16±0.14
8 0 0 0 3.09±0.20 2.80±0.20
9 1 1 0 4.07±0.18 3.17±0.15
10 0 0 0 3.06±0.05 2.82±0.10
11 1 0 -1 3.16±0.06 2.86±0.07
12 1 0 1 3.34±0.18 2.75±0.05
13 1 -1 0 3.07±0.12 2.81±0.16
14 0 1 1 2.37±0.01 2.44±0.01
15 -1 1 0 2.69±0.01 2.65±0.21
상기 표에 나타난 바와 같이, 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 효소 전처리 공정은 0.5mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 2시간이었으며, 이 경우 공정에서의 총 폴리페놀 함량은 4.08mg/g 수준을 나타내었다. 반면 총 플라보노이드 가장 높은 효소 전처리공정은 1.5mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 60℃, 효소처리시간 5시간이었으며 이 경우 공정에서의 총 플라보노이드 함량은 3.17mg/mL을 나타내었다. 무처리의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 3.74mg/g과 2.26mg/mL임을 고려할 때(표 3), 상기와 같은 결과는 자영에 Pectinex Ultra SP-L을 처리하는 본 발명의 공정은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시킬 수 있는 공정임을 나타낸다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성을 측정한 결과를 하기 표에 나타내었다.
자영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소전처리 후 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity
Experiment number X 1 X 2 X 3 DPPH radical scavenging activity (%) SOD - like activity (%)
1 0 -1 1 31.06±4.74 7.93±0.53
2 0 1 -1 36.70±4.88 8.69±0.53
3 0 0 0 28.44±2.46 9.57±0.36
4 0 -1 -1 30.43±4.92 8.56±0.71
5 -1 0 1 28.67±8.13 10.20±0.18
6 -1 -1 0 28.31±1.93 7.93±0.18
7 -1 0 -1 28.93±5.29 8.19±0.53
8 0 0 0 26.56±3.00 10.71±0.18
9 1 1 0 36.71±2.40 6.93±0.53
10 0 0 0 24.93±2.13 7.56±0.36
11 1 0 -1 36.97±1.15 9.32±0.71
12 1 0 1 35.59±0.61 9.07±0.71
13 1 -1 0 31.85±4.48 9.95±0.89
14 0 1 1 24.67±4.96 10.20±0.89
15 -1 1 0 25.43±1.06 12.47±0.18
그 결과, 무처리시 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity는 각각 50.55%와 0.66%이었으나(표 4), 상기 표에 나타난 바와 같이 효소전처리 후 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity는 각각 24.67-36.97% 및 6.93-12.47%로 나타나 특히 SOD-like activity를 증가시키는 결과를 나타내었다.
실험예 5: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L 효소 전처리 효과 확인
실험예 5-1: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 공정의 실험 설계
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 효과 확인을 하여 최적 조건의 공정을 도출하기 위하여, 하기 표와 같은 공정의 실험을 설계하였다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 공정의 실험 설계
Experiment number X 1 X 2 X 3 Conc . of enzymatic activity( mL /100L) Temperature (℃) Time( hr )
1 0 -1 1 1 20 8
2 0 1 -1 1 60 2
3 0 0 0 1 40 5
4 0 -1 -1 1 20 2
5 -1 0 1 0.5 40 8
6 -1 -1 0 0.5 20 5
7 -1 0 -1 0.5 40 2
8 0 0 0 1 40 5
9 1 1 0 1.5 60 5
10 0 0 0 1 40 5
11 1 0 -1 1.5 40 2
12 1 0 1 1.5 40 8
13 1 -1 0 1.5 20 5
14 0 1 1 1 60 8
15 -1 1 0 0.5 60 5
실험예 5-2: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율 측정
상기 실험 설계에 기초하여 효소전처리 후 수율 및 동결건조 수율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 수율 및 동결건조 수율
Experiment number X 1 X 2 X 3 Yield after enzyme pre - treatment (%) Yield after freeze dehydration treatment (%)
1 0 -1 1 21.24 2.18
2 0 1 -1 28.35 2.55
3 0 0 0 32.58 2.74
4 0 -1 -1 19.11 2.70
5 -1 0 1 16.06 2.39
6 -1 -1 0 21.22 2.64
7 -1 0 -1 18.39 2.06
8 0 0 0 18.29 2.75
9 1 1 0 16.03 3.17
10 0 0 0 20.98 3.17
11 1 0 -1 19.91 1.98
12 1 0 1 18.81 2.74
13 1 -1 0 20.33 2.74
14 0 1 1 13.66 2.31
15 -1 1 0 10.14 2.56
그 결과, 효소처리 후 수율은 10.14-32.58% 수준을 나타내었고, 동결건조 후에는 1.98-3.17% 수준을 나타내었다.
실험예 5-3: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량 측정
홍영에 Pectinex Ultra SP-L 효소를 전처리한 다음, 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 1.79±0.04
2 0 1 -1 1.95±0.12
3 0 0 0 1.42±0.17
4 0 -1 -1 1.65±0.36
5 -1 0 1 2.28±0.04
6 -1 -1 0 1.52±0.15
7 -1 0 -1 1.95±0.03
8 0 0 0 2.10±0.11
9 1 1 0 1.42±0.09
10 0 0 0 2.11±0.07
11 1 0 -1 2.09±0.28
12 1 0 1 2.15±0.10
13 1 -1 0 1.46±0.16
14 0 1 1 1.66±0.09
15 -1 1 0 1.44±0.05
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 총 안토시아닌 함량이 가장 높은 효소처리조건은 0.5mL/100L의 효소(Pectinex Ultra SP-L)농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 8시간이었으며 이때 공정에서의 총 안토시아닌 함량은 2.28% 수준을 나타내었다. 반면, 무처리시 총 안토시아닌 함량은 0.61%를 나타내어(표 2), 홍영에 Pectinex Ultra SP-L를 처리하는 경우 총 안토시아닌 함량을 3.7배가량 현저히 증가시킬 수 있음을 나타내었다.
실험예 5-4: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표에 각각 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 분산분석
Factor 홍영
F value Pr > F
Conc. of enzymatic activity(mL/100L) 0.23 0.9182
Temperature(℃) 5.59 0.0035
Time(hr) 3.19 0.0351
상기 표에 나타난 바와 같이, 3가지 요인 중에서 처리시간, 처리온도, 효소활성을 감안한 농도 순으로 효소전처리 시 안토시안 추출함량에 영향력을 미친 결과를 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항회귀곡선의 회귀계수
Parameter Estimate
홍영
Intercept 1.878333
X1 1 ) -0.009375
X2 2 ) 0.008125
X3 3 ) 0.027500
X1*X1 -0.031042
X2*X1 0.013750
X2*X2 -0.386042
X3*X1 -0.070000
X3*X2 -0.107500
X3*X3 0.270208
1)Conc. of enzymatic activity(mL/100L)
2)Temperature(℃)
3)Time(hr)
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소처리 후 총 안토시아닌 함량의 적합성 검정
Regression 홍영
R 2 F value Pr > F
Linear 0.0049 0.09 0.9643
Quadratic 0.5929 11.05 0.0002
Cross product 0.0445 0.83 0.4929
Total regress 0.6423 3.99 0.0048
실험예 5-5: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소처리 후 반응표면 등고선 조사
상기 분석 외에도 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 처리 후 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 반응표면분석법에 의한 반응표면곡선에서 효소활성을 감안한 농도(X1)보다는 온도(X2) 및 시간(X3)이 안토시아닌 추출시 수율향상에 영향을 미친다는 것을 나타내었다.
실험예 5-6: 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP -L의 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량; 및 DPPH radical 소거능 및 SOD - like activity 조사
또한, 홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소전처리 후 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total polyphenol contents( mg /g) Total flavonoid contents( mg / mL )
1 0 -1 1 3.48±0.06 2.88±0.09
2 0 1 -1 3.52±0.21 2.84±0.12
3 0 0 0 3.34±0.07 2.63±0.05
4 0 -1 -1 3.48±0.12 3.00±0.16
5 -1 0 1 3.46±0.01 2.76±0.06
6 -1 -1 0 3.87±0.10 3.00±0.07
7 -1 0 -1 3.31±0.01 2.88±0.06
8 0 0 0 3.57±0.09 3.22±0.19
9 1 1 0 3.29±0.14 2.97±0.24
10 0 0 0 3.44±0.17 2.81±0.09
11 1 0 -1 3.15±0.02 2.71±0.09
12 1 0 1 4.33±0.09 3.06±0.14
13 1 -1 0 3.90±0.13 2.91±0.12
14 0 1 1 4.09±0.03 2.77±0.05
15 -1 1 0 3.28±0.03 2.67±0.06
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 총 폴리페놀 함량이 가장 높은 효소전처리공정은 1.5mL/100L의 효소농도, 효소처리온도 40℃, 효소처리시간 8시간이었으며 공정에서의 총 폴리페놀 함량은 4.33mg/g 수준을 나타낸 반면, 무처리시에는 3.83mg/g을 나타내었다(표 3).
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소 전처리 후 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD-like 활성을 측정한 결과를 하기 표에 나타내었다.
홍영을 이용한 Pectinex Ultra SP-L 효소전처리 후 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity
Experiment number X 1 X 2 X 3 DPPH radical scavenging activity (%) SOD - like activity (%)
1 0 -1 1 44.61±0.75 13.48±0.53
2 0 1 -1 42.47±2.71 13.10±0.00
3 0 0 0 40.47±2.37 14.74±0.18
4 0 -1 -1 38.58±4.33 14.99±0.18
5 -1 0 1 38.70±4.87 12.47±0.18
6 -1 -1 0 42.47±4.48 13.98±0.53
7 -1 0 -1 40.59±3.26 12.47±0.18
8 0 0 0 29.68±4.57 13.48±0.53
9 1 1 0 38.60±0.08 15.11±0.36
10 0 0 0 35.84±0.10 9.19±0.18
11 1 0 -1 37.08±4.70 12.47±0.18
12 1 0 1 37.58±3.99 14.36±0.36
13 1 -1 0 40.23±0.11 11.21±1.25
14 0 1 1 51.49±3.00 15.99±0.18
15 -1 1 0 28.06±1.57 5.67±0.18
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 효소전처리 후 DPPH radical 소거능 및 SOD-like activity는 각각 28.06-51.49% 및 5.67-15.99%로서, 무처리시(표 4)에 비하여 특히 SOD-like activity가 증가된 결과를 나타내었다.
실험예 6: 안토시아닌계 천연 색소의 최적 추출 공정의 개발
실험예 6-1: 에탄올 추출 공정의 실험 설계
본 발명에서 추출 전 효소처리로서 펙티나아제는 Novozyme사(Bagsvaerd, Denmark)의 Pectinex Ultra SP-L을 사용하였고 에탄올을 용매로 이용하였다. 선별된 시료인 복분자와 홍영에 대하여 에탄올추출공정의 최적화를 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 사용하였다. 추출공정의 처리조건에 대한 실험계획은 중심합성계획(central composite design)을 사용하였으며, 반응표면분석을 위해 MINITAB statistical software를 사용하였다. 이때 에탄올추출공정의 요인과 수준은 각각 원료/용매 비율(X1) 10-20% 추출온도(X2) 30-70℃, 추출시간(X3) 1-5시간이었다(표 38). 이들 독립변수들은 3단위(-1,0,1)로 부호화하여 중심합성계획에 따라 설정하였다(표 39). 분석방법은 상기 실시예 1의 안토시아닌계 천연색소의 원료선별의 방법에 준하여 측정하였다.
Independent variables Symbol Levels
-1 0 1
Ratio of sample to solvent(%) X1 10 15 20
Temperature(℃) X2 30 50 70
Time(hr) X3 1 3 5
Experiment number X 1 X 2 X 3 Ratio of sample to solvent (%) Temperature (℃) Time( hr )
1 0 -1 1 15 30 5
2 0 1 -1 15 70 1
3 0 0 0 15 50 3
4 0 -1 -1 15 30 1
5 -1 0 1 10 50 5
6 -1 -1 0 10 30 3
7 -1 0 -1 10 50 1
8 0 0 0 15 50 3
9 1 1 0 20 70 3
10 0 0 0 15 50 3
11 1 0 -1 20 50 1
12 1 0 1 20 50 5
13 1 -1 0 20 30 3
14 0 1 1 15 70 5
15 -1 1 0 10 70 3
실험예 6-2: 복분자의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량 측정
복분자의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
복분자의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 5.20±0.02
2 0 1 -1 2.68±0.02
3 0 0 0 4.10±0.01
4 0 -1 -1 5.24±0.04
5 -1 0 1 3.34±0.04
6 -1 -1 0 4.04±0.02
7 -1 0 -1 3.23±0.05
8 0 0 0 3.80±0.02
9 1 1 0 3.11±0.00
10 0 0 0 4.14±0.04
11 1 0 -1 3.46±0.00
12 1 0 1 4.23±0.04
13 1 -1 0 2.81±0.01
14 0 1 1 3.55±0.05
15 -1 1 0 3.27±0.01
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이, 15개의 실험점 가운데 에탄올 추출 시 안토시아닌 함량이 가장 큰 조건은 시료 대 용매비율 15%(w/v), 추출온도 30, 추출시간 1시간의 조건이었다.
실험예 6-3: 복분자 에탄올 추출의 총 안토시아닌 함량의 분산분석
복분자로부터 에탄올 추출을 수행한 후, 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표에 각각 나타내었다.
복분자의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 분산 분석
Factor 복분자
F value Pr > F
Ratio of sample to solvent(%) 3.77 0.0192
Temperature(℃) 6.24 0.0020
Time(hr) 1.61 0.2104
상기 표에 나타난 바와 같이 3가지 요인 중에서, 추출온도, 시료 대 용매비율, 추출시간 순으로 에탄올 추출 시 안토시아닌 함량에 영향력을 미친 결과를 보였다.
복분자의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항회귀곡선의 회귀 계수
Parameter Estimate
복분자
Intercept 4.011777
X1 1 ) -0.032162
X2 2 ) -0.585637
X3 3 ) 0.214574
X1*X1 -0.650762
X2*X1 0.266897
X2*X2 -0.052643
X3*X1 0.162250
X3*X2 0.228495
X3*X3 0.205613
1)Ratio of sample to solvent(%)
2)Temperature(℃)
3))Time(hr)
복분자 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 적합성 검정
Regression 복분자
R 2 F value Pr > F
Linear 0.3838 7.99 0.0011
Quadratic 0.2224 4.63 0.0129
Cross product 0.0737 1.53 0.2363
Total regress 0.6799 4.72 0.0019
실험예 6-4: 복분자 에탄올 추출 후 반응표면 등고선 조사
복분자 에탄올 추출 후, 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 반응표면분석법에 의한 추정결과 최적의 추출조건으로서 시료 대 용매비율 14.6%(w/v), 추출온도 30℃, 추출시간 1시간을 나타내었다. 본 추출조건에서의 안토시아닌함량은 4.80(%, dry weight)로 나타나, 상기 조건이 우수한 추출 조건임을 시사하였다.
실험예 6-5: 홍영의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량 측정
홍영의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
홍영의 에탄올 추출조건에 따른 총 안토시아닌 함량
Experiment number X 1 X 2 X 3 Total anthocyanin(%, dry weight )
1 0 -1 1 1.85±0.05
2 0 1 -1 1.48±0.05
3 0 0 0 1.85±0.00
4 0 -1 -1 1.72±0.01
5 -1 0 1 1.38±0.07
6 -1 -1 0 2.02±0.02
7 -1 0 -1 1.54±0.01
8 0 0 0 1.86±0.02
9 1 1 0 1.55±0.01
10 0 0 0 1.51±0.02
11 1 0 -1 2.01±0.00
12 1 0 1 2.17±0.05
13 1 -1 0 1.41±0.00
14 0 1 1 1.63±0.01
15 -1 1 0 1.65±0.01
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이, 15개의 실험점 가운데 에탄올추출 시 안토시아닌 함량이 가장 큰 조건은 시료 대 용매비율 20%(w/v), 추출온도 50℃, 추출시간 5시간으로 나타났다.
실험예 6-6: 홍영 에탄올 추출의 총 안토시아닌 함량의 분산분석
홍영으로부터 에탄올 추출을 수행한 후, 총 안토시아닌 함량의 분산분석, 이차다항 회귀 곡선의 회귀계수 및 이차다항회귀식의 적합도 검정을 수행하였고, 그 결과를 하기 표에 각각 나타내었다.
홍영의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 분산 분석
Factor 홍영
F value Pr > F
Ratio of sample to solvent(%) 2.72 0.0399
Temperature(℃) 3.37 0.0161
Time(hr) 0.82 0.5177
그 결과, 상기 표에 나타난 바와 같이 3가지 요인 중에서, 추출온도, 시료 대 용매비율, 추출시간 순으로 에탄올 추출 시 안토시아닌 함량에 영향력을 미친 결과를 보였다.
홍영의 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 이차다항회귀곡선의 회귀 계수
Parameter Estimate
홍영
Intercept 1.737056
X1 1 ) 0.067497
X2 2 ) -0.083939
X3 3 ) 0.034512
X1*X1 0.014264
X2*X1 0.125814
X2*X2 -0.097837
X3*X1 0.078543
X3*X2 0.008178
X3*X3 0.030157
1)Ratio of sample to solvent(%)
2))Temperature(℃)
3))Time(hr)
홍영 에탄올 추출 후 총 안토시아닌 함량의 적합성 검정
Regression 홍영
R 2 F value Pr > F
Linear 0.1266 2.96 0.0409
Quadratic 0.0519 1.22 0.3139
Cross product 0.1092 2.56 0.0657
Total regress 0.2877 2.24 0.034
실험예 6-4: 홍영 에탄올 추출 후 반응표면 등고선 조사
홍영 에탄올 추출 후, 총 안토시아닌 함량의 반응표면 등고선을 조사하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 반응표면분석법에 의한 추정결과 최적의 추출조건으로서 시료 대 용매비율 20%(w/v), 추출온도 55.4℃, 추출시간 5시간을 나타내었다. 본 추출조건에서의 안토시아닌함량은 1.97(%, dry weight)로 나타나, 상기 조건이 우수한 추출 조건임을 시사하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. a) 복분자, 오디 또는 컬러감자에 펙티넥스(Pectinex) 효소를 20℃ 내지 60℃의 온도에서 2시간 내지 8시간 처리하는 단계; 및
    b) 상기 펙티넥스(Pectinex) 효소를 처리한 원료를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계를 포함하는, 복분자, 오디 또는 컬러감자 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 컬러감자는 자영 또는 홍영인 것인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펙티넥스 효소는 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L, Novozyme) 효소인 것인 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 복분자에 대한 펙티넥스 효소의 처리는 30℃ 내지 50 ℃ 온도에서 2시간 내지 3시간 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 오디에 대한 펙티넥스 효소의 처리는 20℃ 내지 40℃ 온도에서 2시간 내지 5시간 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 자영에 대한 펙티넥스 효소의 처리는 20℃ 내지 40℃ 온도에서 2시간 내지 3시간 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 홍영에 대한 펙티넥스 효소의 처리는 30℃ 내지 50℃ 온도에서 6시간 내지 8시간 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 복분자의 추출은 에탄올을 추출 용매로 사용하고, 시료 대 용매비율 10%(w/v) 내지 15%(w/v), 30℃ 내지 50℃의 온도에서 3시간 내지 5시간 동안 수행되는 것인 제조방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 b) 단계에서 홍영의 에탄올 추출은 에탄올을 추출 용매로 사용하고, 시료 대 용매비율 15%(w/v) 내지 20%(w/v), 40℃ 내지 60℃의 온도에서 3시간 내지 5시간 동안 수행되는 것인 제조방법.
  13. 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 안토시아닌을 포함하는 복분자, 오디 또는 컬러감자 추출물로부터 안토시아닌을 분리하는 단계를 포함하는, 안토시아닌의 제조방법.
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