KR101465547B1 - 피타아제를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001균주 및 이를 이용한 발효현미 제조방법 - Google Patents

피타아제를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001균주 및 이를 이용한 발효현미 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피타아제(phytase)를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001균주(Lactobacillus sakei Wikim001)와 이를 곡류의 피틴산 분해에 적용하는 방법에 관한 것으로, 상기 기술을 적용하면 피탄산 함량을 획기적으로 낮춘 발효현미를 생산할 수 있다.

Description

피타아제를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001균주 및 이를 이용한 발효현미 제조방법 {Lactobacillus sakei Wikim001 capable of producing phytase and method of fermenting brown rice using the same}
본 발명은 피타아제(phytase)를 대량 생산하는 신규한 락토바실러스 사케이 Wikim001균주와 이를 곡류의 피틴산 분해에 적용하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 김치로부터 피타아제 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리하고, 분리균주를 현미에 적용하여 피틴산 함량을 낮춘 발효현미를 생산하는 최적 조건을 확립하는 방법에 관한 것이다.
피틴산(Phytic acid, myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)는 곡류와 콩과식물의 씨앗 중에 인과 이노시톨(inositol)의 중요한 저장물질이다. 곡류 중에서 총 인의 70-80%가 피틴산 상태로 존재하며, 구조적으로는 단백질과 결합된 마그네슘염 또는 칼슘염의 형태로 존재한다. 현재 가축과 양어용 사료의 식물성 단백질원으로 사용되고 있는 옥수수, 대두 및 쌀겨 중에는 다량의 인을 함유하는 피틴산이 단백질과 결합된 피틴 상태로 존재하며, 전제 중량의 1-10%에 달한다. 이러한 인산염의 형태는 단위동물의 소화관에서 분해되지 않아서 인체와 가축의 무기질 결핍을 유발하고, 또한 분뇨로서 배출되어 가축 사육 밀집지역의 하천이나 호수를 부영양화시켜 수질오염을 야기시킨다.
피틴산을 분해시키기 위한 방법으로 화학적인 처리가 시도되었으나, 공존하는 영양소를 파괴시키기 때문에 실용화되지 못하는 실정이다. 식품이나 사료에 대한 영양적인 악영향이 없이 피틴산을 분해시키기 위한 수단으로 피타아제가 가장 효과적이라고 입증된 후, 피타아제를 생산하는 미생물을 검색하기 위한 연구가 1960년대부터 진행되었으며, 유산균 및 효모의 피타아제 활성에 대해서는 국외에서는 꾸준히 연구되어 왔다. 특히 통 밀가루(whole wheat flour)로 빵을 부풀리는 데 사용하는 유산균과 효모의 공생 배양물인 사워도우(Sourdough)를 제조하여 빵을 만드는 경우, 유산균 배양으로 반죽의 pH가 낮아지고 밀에 존재하는 피타아제의 활성화로 밀가루에 함유된 피틴산이 효과적으로 분해되는 것으로 보고되어 있으며, 자돈분변에서 분리한 락토바실러스 파라카제이 서브시피시즈 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)는 우수한 피틴산 분해력을 가지고 있으며, 분리 균주를 비육돈 사료에 첨가하여 급여한 결과 사료효율 개선효과를 얻었다고 하였으며, 인 함량이 낮은 사료를 급여한 쥐에 있어 사카로마이세스 세레비시에 효모 제제(Saccharomyces cerevisiae yeast culture) 4~6% 첨가시 피틴산의 인산기(Phytate-P)의 이용성이 높아졌다고 하였다. 뿐만 아니라 산란계에 있어 인 함량이 낮은(0.25%) 사료급여시 유산균의 첨가에 의해 P 축적율이 개선되었는데, 이는 함유된 피타아제 및 장내 pH 저하에 따른 결과라고 하였다.
예를 들어, 대한민국 특허등록 제10-1042124호(출원공개일자: 2005.03.11)에서는 치어용(稚魚用) 사료 및 여기에 사용하는 저(低) 피틴식물성 단백질 가수분해물의 제조법을 보고한 바 있으며, 대한민국 출원공개 제10-2000-0036143호(출원공개일자: 2000.06.26)에서는 신규 피틴산 분해효소 및 그의 제조방법을 보고하여 동물사료 중 피틴산을 저감시키고자 하는 연구를 보고한 바 있다.
그러나, 아직까지 식품 중 피틴산 분해에 대한 연구는 대부분 밀가루를 재료로 사용하는 빵 제품에 집중되어 있으며, 쌀 제품의 피틴산 분해에 대한 연구는 미미한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 최근 웰빙(well-being)과 함께 건강식품으로 알려진 현미의 영양학적 가치를 높이기 위한 방법으로, 현미에 김치에서 분리한 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주 첨가를 통한 발효에 의한 피틴산 분해 및 이를 위한 최적 발효 조건을 제공함에 있다.
본 발명은 김치로부터 분리되고 피타아제 활성이 뛰어난 락토바실러스 사케이 Wikim001을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명 락토바실러스 사케이 Wikim001를 이용한 옥수수, 대두 및 쌀겨, 현미의 피틴산 저감의 최적 발효 조건을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 사케이 wikim001를 이용한 발효방법에 의하여 제조된 발효현미를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의하면 김치로부터 분리되고 피타아제 활성이 뛰어난 락토바실러스 사케이 Wikim001을 분리하여 현미의 피틴산 저감의 최적 발효 조건을 제공하며, 또한 상기 발효방법에 의하여 제조된 발효현미를 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 김치로부터 피타아제 활성을 나타내는 신규한 균주를 분리하고, 분리균주를 현미에 적용하여 피틴산 함량을 낮춘 발효현미를 생산하는 최적 조건을 확립하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주에 의한 현미의 피틴산 함량 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주의 pH에 따른 피틴산 분해능 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주의 최적반응 온도를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
피타아제 활성 우수 균주의 분리
<1-1> 김치로부터 유산균의 분리
김치시료를 균의 분리가 가능한 농도로 생리식염수로 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 30℃, 미호기 조건에서 48시간 배양하였다. 배지에서 생장한 150여개의 집락들 중 외관상 색깔과 모양이 차이가 나는 집락을 순수분리하였다. 유산균주들은 MRS 액체배지(Difco, USA)를 사용하여 배양한 후 대수기에 있는 배양액에 글리세롤 25%(v/v)가 되게 첨가하여 -70℃에서 보관하였으며 실험에 사용할 경우 5 mL MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 MRS 액체배지에 1차 계대배양하고 다시 MRS 액체배지에 2차 계대하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 피타아제의 활성도는 Quan과 Shimizu의 방법을 변형하여 분석하였으며, 세포내 피타아제 활성(intracellular phytase activity)은 배양액을 원심분리하여 균체를 수확한 후 0.85% NaCl 용액으로 2-3회 세척하고 0.2M 아세테이트(acetate) 완충용액(pH 3.5)에서 유산균체의 피타아제 활성을 측정하여 피타아제 활성이 우수한 균주를 선발하였다. 세포내 피타아제 활성은 단위 배양액이 함유하는 세포의 효소활성을 용량을 기준으로 한 세포내 효소활성의 합으로 나타내었다. 기질로 사용한 2mM의 피틴산나트륨(sodium phytate) 활성은 세포외 활성과 용량을 기준으로 한 세포내 효소활성의 합으로 나타내었다. 기질로 사용한 2mM의 피틴산나트륨 용액 0.9ml를 37℃에서 충분히 예열시킨 후 0.1ml의 조효소액 또는 균체 현탁액을 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 10% TCA 1ml를 첨가하여 효소활성을 중지시켰다. 이 반응완료액에 발색시약 1.5ml(5.5% H2SO4에 1.5%가 되도록 몰리브덴산암모늄(ammonium molybdate)를 녹인 용액과 2.7% 황산제일철(ferrous sulfate)를 증류수에 녹인 용액을 4:1로 혼합하여 조제한 용액)를 첨가하여 10분간 발색시킨 후 유리된 인산의 양을 700nm에서 측정하여 피타아제의 활성도로 나타냈다. 효소활성도는 1unit는 1분 동안에 피틴산에서 1μ몰의 PO4 -3 로 전환시키는 효소량으로 정의하였다.
<1-2> 선별된 유산균의 동정
a. API 시스템을 이용한 분석
상기 균주는 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 각각 취한 후 멸균 증류수에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5Ｌ에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃ 에서 48 시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다. 그 결과, 상기 실시예 <1-1>에서 선별된 유산균은 하기 표 1의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는 락토바실러스 속에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.
본 발명에 따른 유산균의 탄수화물 발효패턴 분석 결과
대조군 - D-만노즈 + 살리신 - 겐티오비오즈 -
글리세롤 - L-솔보즈 - 셀로비즈 + D-튜라노즈 -
에리쓰로톨 - 람노즈 - 말토즈 + D-리조즈 -
D-아라비노즈 - 둘시톨 - 락토즈 - D-타가토즈 -
L-아라비노즈 + 이노시톨 - 멜리비오즈 + D-퓨코즈 -
리보오즈 + 만니톨 - 사카로즈 + L-퓨코즈 -
D-자일로즈 - 솔비톨 - 트레할로즈 + D-아라비톨 -
L-자일로즈 - D-만노시드 - 이눌린 - L-아라비톨 -
아도니톨 - D-글루코시드 - 멜레지토즈 - 글루코네이트 -
자일로시드 - 글루코사민 + D-라피노즈 - 2-세토-글루코네이트 -
갈락토즈 + 아미그달린 - 아미돈 - 5-세토-글루코네이트 -
D-글루코즈 + 알부틴 - 글리코겐 -
D-프록토즈 + 에스큘린 + 자일리톨 -
b. 16S rRNA 염기서열 분석
당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균들의 16S rRNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 Wikim001 유산균의 16S rRNA 염기서열은 락토바실러스 사케이의 16S rRNA 염기서열과 99 % 동일함을 알 수 있었고, 그 결과를 도 2 에 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 Wikim001 유산균을 "락토바실러스 사케이 Wikim001(Lactobacillus sakei Wikim001)"으로 명명하고 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 2012년 10월 24일자로 기탁하였다 (KFCC11542P).
<실시예 2>
현미에 피타아제 활성 우수 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주 적용
<1-1> 락토바실러스 사케이 wikim001 균주의 피틴산 저감 효과
옥수수, 대두, 쌀겨, 현미 등의 피틴산 저감 효과가 탁월했으며, 특히 현미200g을 피타아제 생성균주와 반응시켜 30℃ 인큐베이터에 24시간, 48시간 배양한 후, 5g을 채취하여 증류수 30ml을 첨가한 후, 그라인더에 1분 동안 마쇄하여 10배 희석하였다. 증류수로 10배 희석한 시료 3mL에 Wade시약(증류수에 0.03% FeCl3H2O와 0.3% sulfosalicylic acid 용해) 1mL을 가한 후 볼텍스믹서(vortex mixer)로 10초간 혼합하고 0.45μm 시린지필터(syringe filter)로 여과하여 500nm에서 여과액의 흡광도를 측정하였다. 피틴산 함량은 Na-phytate 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 표준 기질에서의 반응 패턴을 기반으로 실제 식품에서의 기질인 현미에 락토바실러스 사케이 Wikim001균주를 처리하고 그 반응 양상을 관찰하였다. 현미에 김치유산균을 접종하여 24시간 동안 배양한 결과 락토바실러스 사케이 Wikim001 김치유산균주는 현미의 피틴산 함량을 현저히 감소시켰다(도 1).
<실시예 3>
현미의 피틴산 분해를 위한 최적 발효조건
<1-1> 현미의 피틴산 분해를 위한 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주의 최적 발효 조건
락토바실러스 사케이 Wikim001의 pH 영역별 피틴산 저감능을 확인하였다(도 2). 피틴산 함량 변화로 추론한 락토바실러스 사케이 Wikim001 최적 피타아제 활성을 가지는 최적반응 pH는 5.0~6.5로 나타났으며, pH 4.0 이하에서는 락토바실러스 사케이 Wikim001의 피타아제에 의해 현미의 피틴산은 거의 분해되지 않았다. 본 발명에서 사용한 락토바실러스 사케이 Wikim001 균주는 pH는 6.0~6.5 범위에서 가장 우수한 피틴산 분해능을 보였으며, 최적반응 온도는 비교적 낮은 30~40℃로 나타났다(도 3).
한국미생물보존센터(국내) KFCC11542P 20121024

Claims (4)

  1. 김치로부터 분리되고 피타아제 활성이 뛰어난 락토바실러스 사케이 wikim001 균주(Lactobacillus sakei Wikim001 KFCC11542P)
  2. 삭제
  3. 락토바실러스 사케이 wikim001 (KFCC11542P) 균주를 이용하여 pH 6.0 ~ 6.5의 범위에서 30~40℃로 발효시킴을 특징으로 하는 현미의 발효방법

  4. 삭제
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