KR101457636B1 - 심비디움 형질전환체 선발방법 및 그 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아그로박테리움이나 유전자 총 방법을 이용한 제초제 저항성 형질전환 심비디움 식물체 생산에 있어서 필수적인 선발과정에서 빈번하게 사용되는 고가의 PPT (Phosphinothricin) 대신 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 Basta 제초제 용액을 여과 살균 후, 선발배지에 첨가하여 동일한 선발 효과를 나타내어 향후 경제적이고 효율적인 심비디움 형질전환 식물체를 선발하는 방법에 관한 것이다.

Description

심비디움 형질전환체 선발방법 및 그 조성물{Method of selection of herbicide-resistant transgenic cymbidium plants and the composition}
본 발명은 심비디움 형질전환체 선발방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 제초제 저항성 심비디움 식물체 개발목적 또는 유용 형질 유전자의 선발목적으로 동일한 벡터에 포함되어 형질전환 개체의 효율적 선발에 사용되는 제초제 저항성을 가지는 bar 유전자 형질발현 확인을 통한 형질전환체 선발과정에 적용되는 고가의 PPT (Phosphinothricin) 약제 대신 저렴하게 대체되어 사용되어 질 수 있는 Basta 제초제 용액을 이용한 선발방법에 관한 것이다.
제초제 저항성은 1996년 몬산토가 라운드업 레이디 (Round-up ready) 콩을 시장에 출시하면서 본격적으로 시판되기 시작하였다. 그후로 많은 연구가 진전되어 유채 (캐놀라), 면화, 옥수수, 콩 및 벼 심지어 크리핑벤트그라스 같은 잔디에까지 제초제 저항성 작물개발이 실용화되어 있다. 주로 비선택성 제초제 (글라이포세이트, Glyphosate)를 중심으로 한 제초제 성분인데 이러한 제초제 저항성 작물을 개발하기 위하여 방선균의 일종인 스트렙토마이세스 하이그로스포피쿠스 (Stereptomyces hygroscopicus)에서 클로닝 된 포스피노트리신 아세틸트렌스퍼라제 (Phosphinothricin acetyltransferase, PAT) 유전자를 목적 작물에 형질전환 시켜 제초제 저항성 형질전환 식물체를 개발했는데 이 PAT 유전자는 'bar'(Bialaphos 저항성) 유전자라고도 불리어지며, PPT (Phosphinothricin)의 NH2를 아세틸화시켜 글루타민을 생성하는 기관에 암모니아 독성물질 축적을 방지하여 결과적으로 Basta 제초제에 저항성을 갖게 된다. 이 PPT 제초제가 식물에 살포되게 되면 글루타민 합성을 억제하여 암모니아가 세포에 축적됨과 동시에 광합성도 억제되어 식물세포가 사멸하게 된다. 이러한 원리로 얻어지는 제초제의 효과를 잡초 방제에 이용하여 왔다. 이렇게 효과적인 PPT 제초제의 효과를 이용하여 많은 작물에서 형질전환 기술을 이용하여 제초제 저항성 작물개발 또는 목적 벡터 내에 다른 유용 유전자와 결합시켜 형질전환 세포, 조직 및 기관들을 효율적으로 선발하는데 이용해 왔다. 형질전환 작물 개발과정에서 형질전환 세포나 조직의 선발과정에서 kanamycin 같은 항생제도 널리 사용되나, 이 kanamycin은 주로 쌍자엽 형질전환 개체 선발에 효과적이고 단자엽 형질전환 개체선발에서는 선발효율이 저하되어 잘 사용되지 않는다. 따라서 식물 종류나 품종에 큰 영향을 받지 않고 형질전환 식물체 개발에서 효율적인 형질전환체 선발이 가능한 bar 유전자를 유용 형질을 발현하는 목적유전자와 같이 벡터로 클로닝 시켜 형질전환 작물개발에 널리 사용되고 있다.
그러나 초기에 대량의 식물세포나 조직을 선발하기 위해서 작물의 종류나 품종에 따라 대량의 PPT 성분이 선발배지에 첨가되는 경우가 있는데 이런 경우, 1 g에 1,000 $에 육박하거나 오히려 넘는 고가의 시약가격이 상업적으로 형질전환 식물체를 개발하고자 하는 중소기업이나 소규모 농장 및 학교 연구실에서는 경제적으로 부담이 될 수밖에 없다.
본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여 고가의 PPT 선발약제 대신 상업적으로 어디서나 쉽게 구입이 가능한 Basta 제초제를 무균조건에서 여과살균하여 선발배지에 첨가하여 PPT 선발약제를 이용하여 선발하는 것과 동일하거나 오히려 더 나은 선발효과를 나타내는 방법을 개발하는 것을 이루고자 한다.
관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020040084189호는 제초제 저항성 고추 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 제초제 바스타(Basta) 저항성 bar 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계와, 상기 제조된 발현벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시켜 형질전환된 아그로박테리움을 얻는 단계와, 상기 형질전환된 아그로박테리움을 고추 식물체의 자엽과 공동배양하는 단계와, 상기 공동배양된 고추 식물체의 자엽으로부터 형질전환된 신초를 선발하고 신장시키는 단계와, 상기 선발·신장된 형질전환 신초에서 뿌리를 유기하는 단계를 포함하여 구성되고,그 방법에 의하여 제초제 저항성을 가지는 신품종의 고추를 용이하게 획득할 수 있게 된다고 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기존 형질전환 제초제 저항성 작물개발 또는 유용 유전자가 삽입된 형질전환체 선발을 위해 첨가되는 PPT 선발약제 대신 보다 경제적이고 동일한 형질전환 효율을 보여주는 기존의 PPT 약제첨가와 동일하거나 더 효과적인 형질전환 세포 및 조직의 선발이 가능한 대체 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아그로박테리움 또는 유전자 총을 이용한 심비디움 형질전환의 선발과정에 있어서, Glufosinate 암모늄(Basta®)을 선발 배지에 첨가하여 선발하는 단계를 포함하는 심비디움 형질전환체 선발방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 여과하여 선발 배지에 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 여과한 후 배지에 희석하여 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 배지는 액체 또는 고체 배지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 1.0% 농도로 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 Glufosinate 암모늄(Basta®)을 유효성분으로 포함하는 아그로박테리움 또는 유전자 총을 이용한 심비디움 형질전환 선발용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 심비디움 작물에서 아그로박테리움 또는 유전자총을 이용한 제초제 저항성 또는 목적 유전자와 bar(Bialaphos 저항성) 유전자가 같이 삽입된 벡터를 형질전환시키는 방법에 있어서, Glufosinate 암모늄(Basta®)용액을 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 심비디움 작물의 형질전환 선발방법을 제공한다.
또 본 발명은 Glufosinate 암모늄(Basta®)을 유효성분으로 포함하는 심비디움 형질전환 선발용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 유전자 총이나 아그로박테리움을 이용한 심비디움 형질전환 방법에 있어서, 기존의 PPT 선발약제를 첨가하는 과정 대신 시중에서 저렴하게 구입 가능한 Basta 제초제를 여과살균 후, 희석시켜 선발배지에 첨가하는 단계를 포함하는 형질전환 작물개발에 있어서 보다 경제적인 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 형질전환방법은 아그로박테리움이나 유전자총이 주로 사용되고, 선발배지는 HCa 배지 사용이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 심비디움의 생장점조직으로부터 생성된 PLB (protocorm-like bodies) 조직을 절편체로 하는 아그로박테리움 및 유전자총을 이용하여 형질전환 후, 형질전환 추정 조직이나 개체를 선발하는 단계에 있어서, 기존의 고가의 PPT 약제 첨가 대신, 경제적인 Basta 제초제를 여과살균 하여 선발배지에 첨가하는 경제적이고 효율적인 방법을 제공한다.
본 발명은 아그로박테리움 및 유전자 총을 이용하여 심비디움 형질전환 식물생산 체계에서 제초제 저항성 또는 다른 유용 형질의 형질전환 과정에 사용되는 벡터에 자주 사용되는 bar 유전자의 발현여부를 여과 살균 후, 희석시킨 Basta 용액을 첨가한 선발배지 상에서 형질전환 추정 세포집단이나 신초 재분화 및 뿌리발생 개체 등의 생존여부를 통해 경제적이고 효과적인 선발에 기여한다.
상세하게는 심비디움 작물에서 아그로박테리움 및 유전자총을 이용한 제초제 저항성 또는 목적 유전자와 bar 유전자가 같이 삽입된 벡터를 형질전환시키는 실험과정에서 필수적인 선발배지에서의 선발과정에서, 기존에는 고가의 PPT 약제를 0.1 - 30 mg/l 범위 내에서 첨가하여 선발과정을 수행하지만, 본 발명에서는 이 PPT 약제 대신 1/20 이하의 저가이면서 효율은 비슷하거나 더 높은 선발약제로 사용 가능한 Basta 제초제 용액을 사용하여 경제적이고 효율적인 선발방법을 제공한다.
본 발명은 제초제 저항성 또는 유용 유전자의 효율적 선발을 위해 유용 형질발현 유전자와 같은 벡터에 삽입된 bar 유전자를 아그로박테리움 및 유전자총을 이용하여 형질전환된 심비디움 식물체를 생산하는 과정에 있어서 형질전환 세포 및 조직의 효과적인 선발을 위해 선발배지에 주로 첨가되어 사용되는 고가의 PPT 선발약제 대신 Basta 제초제를 여과살균 후, 선발배지에 희석해서 첨가하여 이를 통하여 동일하거나 더 우수한 선발효율을 나타내고자 하고, 이를 통하여 궁극적으로 경제적이고 효율적인 형질전환 심비디움 식물체를 선발하는 과정으로 이루어진 것에 특징이 있다.
본 발명의 효과는 심비디움 작물에 있어서 제초제 저항성 작물개발 또는 유용 유전자와 동일한 벡터에 삽입되는 선발목적 유전자로 많이 사용되는 bar 유전자를 사용하여 아그로박테리움 및 유전자총을 이용한 형질전환 실험 수행 시, 형질전환 원괴체유사체 (PLB) 선발을 효과적으로 하는 과정에 있어서, 기존처럼 고가의 PPT 선발약제를 선발배지에 첨가하여 선발하는 것이 아니라 주위에서 쉽게 구입할 수 있는 Basta 제초제를 여과살균 처리하여 선발배지에 희석하여 첨가한 후, 형질전환 심비디움 식물체를 보다 경제적으로 그리고 효율적으로 선발하는데 기여할 수 있으며, 이러한 방법들은 다른 주요 양란인 팔레놉시스, 카틀레야 및 덴드로비움 등의 형질전환 식물체 생산과정에서 필수적인 형질전환 개체 선발과정에 있어서 경제적이고 효율적인 방법으로 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 Basta 1.0%와 PPT 10 mg/l와 무처리인 대조구에서 고체배지 처리 2주 경과한 후에 대조구와 선발약제로 사용되는 PPT와 Basta 처리구들 간의 PLB 생육차이를 보여주는 사진이고,
도 2는 Basta 1.0%를 0-20 ml 액체배지에 첨가하여 배양 20일 후에 PLB 고사가 진행되는 과정이고,
도 3은 고체배지에서 생육단계가 진전된 PLB에서 복수의 신초가 형성된 후에도 제초제 피해효과가 동일하게 PPT와 Basta가 나타나는지 배양 4주 후에 신초 생육을 비교한 사진임.
이하 비한정적인 실시예를 통항여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 경제적이며 효율적 bar 유전자 형질전환 위한 원괴체 상구체 증식
본 발명에 사용된 심비디움 식물체는 농촌진흥청 산하 국립원예특작과학원에서 분양 받은 4가지 계통[97-0773-93, 97-0773-107, 97-0773-300, 융플라워X마사코] 중 가장 조직배양 반응성이 우수한 융플라워X마사코 계통을 선택하여 사용하였다. 심비디움 원괴체 상구체(protocorm-like body;PLB)를 증식하기 위해 줄기 없이 PLB만 일정크기(가로세로 0.5 cm)로 자른 후에 PLB 증식배지 [HCa배지: Hyponex 3 g/l, trypton 1.5 g/l, CaNO3 0.5 g/l, sucrose 20 g/l, 활성탄 1 g/l, Agar는 7.5 g/l]인 HCa배지에 이식하였다. 모든 배지의 pH는 5.2로 맞추었다.
실시예 2: 심비디움 식물체 재분화
PLB로부터 식물체로 재분화하기 위해 심비디움 증식배지인 HCa 기본배지로 옮겨 소식물체의 재분화를 유도하였다. 재분화된 소식물체는 같은 HCa 배지로 한 달에 한 번씩 옮겨주고, 25℃, 광주기 16/8(명/암)시간 조건을 통하여 신장과 뿌리발달을 통한 정상적인 식물체 재분화가 이루어졌다. 고체 배지 상에서 신초 형성과 발근이 완료된 식물체는 남아 있는 agar 조각을 제거한 다음 원예용 수태를 이용하여 화분으로 이식하였다. 본 발명에서 위의 모든 배양은 25℃, 16시간 조건의 광주기를 주었다.
실시예 3: 선발배지에 PPT 및 PPT 대신 첨가한 Basta 제초제 희석액 제조
본 발명에 사용된 Basta 제초제(Bayer Crop Science, 순도 Glufosinate amonium 18%)를 0.22 ㎛ 여과필터를 10 ml 용량의 1회용 주사기에 끼워 제초제를 여과한 후, HCa 배지에 1.0% 농도로 희석하여 첨가하였다. PPT (DL-Phosphinothricin, Duchefa chemical B.V., Haarlem, The Netherlands)는 3차 증류수에 용해한 후, 위와 같은 방법으로 여과 작업을 수행하고 나서, 1 mg/l 농도의 저장용액을 제조한 후, 선발배지에 10 mg/l 농도로 정량하여 첨가하였다.
실시예 4: 형질전환체 선발과정에서 선발배지에 첨가되는 PPT 와 Basta 제초제 용액에 따른 차이가 고체배지와 액체배지에서의 심비디움 PLB 생육 및 신초 생육에
미치는 영향
본 발명에 사용된 Basta 약제가 PPT와 동일한 선발효과를 나타내는지 알아보기 위하여 고체배지와 액체배지에 배양되는 PLB를 대상으로 고사정도를 관찰하기 위하여 실험을 수행하였다. 먼저 고체배지에서의 PLB 생육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 PPT (phosphinothricin) 10 mg/l이 첨가된 HCa배지 (Hyponex 3 g/l, trypton 1.5 g/l, CaNO3 0.5 g/l, sucrose 20 g/l, 활성탄 1 g/l, agar는 7.5 g/l, pH 5.2]와 여과살균 처리된 1% Basta 제초제 용액이 포함된 액체 HCa 배지 (상기 고체배지와 조성은 동일하고 활성탄과 agar만 첨가되지 않음)로 PLB를 옮겼다. 그 결과 2주 후에 PPT 처리구와 Basta 처리구 모두 PLB 고사가 뚜렷하게 진행되었으나, 대조구는 정상 생육이 관찰되었다 (도 1). 또한 액체배지에서 Basta 처리가 PLB 생육을 억제하는지에 대해서도 실험한 결과, 도 2에서처럼 최초 처리 (A) 후, 20일이 경과한 후에 PLB 생육을 관찰한 결과 (B), 거의 고사하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과는 PPT와 Basta 제초제 모두 동일하게 형질전환 심비디움 식물체 생산에 필수적인 선발과정에서 사용되는 배지인 고체배지와 액체배지 모두에 있어서 효율적인 선발약제로 사용이 가능함을 보여 주었고, 유사한 선발효율 하에서 경제적 비용을 고려하면 Basta 제초제의 여과살균 후, 선발배지에 첨가하는 것이 더 효율적임을 보여준다.
실시예 5: 형질전환체 선발과정에서 PPT 와 Basta 용액 차이가 신초 생육에 미치는 영향
실시 예 4에서 PLB 생육에 PPT와 Basta 제초제 처리 시 어떠한 차이가 있는지 실험 했다면 좀 더 식물체 생장이 진행된 신초가 형성된 이후의 생육에도 미치는 영향을 알아보기 위해 PLB를 HCa배지에서 증식 후, 생장을 유도하여 신초를 형성시킨 후, 2-3회의 4주 간격으로 계대배양을 실시한 후에 실시 예 4와 동일하게 PPT 10 mg/l 또는 Basta 1.0% 첨가된 HCa 배지로 옮겨 선발을 계속 수행하였다. 그 결과, 도 3의 A에서처럼 최초 정상 생육을 보이던 개체들이 4주 경과 후에 대조구를 제외한 PPT와 Basta 처리구들은 제초효과를 나타나면서 고사함을 알 수 있었다 (도 3B).

Claims (10)

  1. 유전자 총을 이용한 심비디움 형질전환의 선발과정에 있어서, Glufosinate 암모늄(Basta®)을 선발 배지에 첨가하여 선발하는 단계를 포함하는 심비디움 형질전환체 선발방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 여과하여 선발 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 심비디움 형질전환체 선발방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 여과한 후 배지에 희석하여 첨가하는 것을 특징으로 하는 심비디움 형질전환체 선발방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지는 액체 또는 고체 배지인 것을 특징으로 하는 심비디움 형질전환체 선발방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 1.0%(v/v) 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 심비디움 형질전환체 선발방법.
  6. Glufosinate 암모늄(Basta®)을 유효성분으로 포함하는 유전자 총을 이용한 심비디움 형질전환 선발용 조성물.
  7. 심비디움 작물에서 유전자총을 이용한 제초제 저항성 또는 목적 유전자와 bar(Bialaphos 저항성) 유전자가 같이 삽입된 벡터를 형질전환시키는 방법에 있어서, Glufosinate 암모늄(Basta®)용액을 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 심비디움 작물의 형질전환 선발방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Glufosinate 암모늄(Basta®)은 1.0%(v/v) 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 심비디움 작물의 형질전환 선발방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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