KR101432078B1

KR101432078B1 - 항병원성 활성을 갖는 7-벤질옥시인돌 화합물의 신규한 용도

Info

Publication number: KR101432078B1
Application number: KR1020130044378A
Authority: KR
Inventors: 이진형; 이진태; 조무환; 김정애; 조현섭
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2014-08-21

Abstract

본 발명은 항 병원성 활성을 갖는 7-벤질옥시인돌(7-benzyloxyindole) 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 7-벤질옥시인돌 화합물은 병원성 세균, 특히 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)의 병원성 물질인 스타필로잔틴의 생성을 효과적으로 억제하고, 스타필로코쿠스 아루레우스에 의한 인간 적혈구의 용혈작용을 억제할 수 있으며, 나아가 병원성 유전자인 α-hemolysin hla 및 엔테로톡신 seb 유전자, 단백질 분해효소 유전자인 splA 및 sspA 유전자, 조절 유전자인 sarA 및 agrA 유전자의 발현 조절을 통해 항 병원성 활성을 갖는다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 상기 화합물은 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료를 위한 의약품의 제조에 용이하게 사용될 수 있으며, 나아가 항생제 내성을 가지거나 항생제 처리 시 독성을 가지는 세균의 억제용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

항병원성 활성을 갖는 7-벤질옥시인돌 화합물의 신규한 용도{Use of 7-benzyloxyindole compound having anti-virulence activity}

본 발명은 항병원성 활성을 갖는 7-벤질옥시인돌 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다.

항생제(antibiotics)는 미생물이 생산하는 대사산물로 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질로서, 병원균에 의한 감염증을 치료하는 약물로서 감염 증세에 뛰어난 효능을 보이기 때문에 전 세계적으로 사용되고 있다. 항생제는 일반적으로 곰팡이류에서 추출된 항생물질로서는 페니실린계, 세팔로스포린계 등의 항균성 항생제와 griseofulvin, fucidin과 같은 항진균성 항생제가 있으며, 세균류에서 추출한 항생물질로서는 macrolide, aminoglycoside, tetracycline류 및 chloramphenicol 등의 mycin류가 존재한다. 페니실린의 경우 다른 항생제에 비하여 부작용이 적으나 어떤 세균은 페니실린을 분해하는 효소를 생산하기도 하여, 인공적으로 합성한 메티실린(methicillin)이나 옥사실린(oxacillin)등이 함께 사용되고 있다.

현재까지 개발된 항생제 가운데 세계에서 가장 강력한 항생제는 반코마이신(vancomycin)으로, 페니실린의 대체약인 메티실린(methicillin)에 내성이 생긴 황색포도상구균이 퍼지자 1950년대에 개발하여 황색 포도상구균의 중증 감염증을 치료하는 데 사용해 왔다.

그러나, 항생제의 남용으로 인하여 병원균 스스로 저항할 수 있는 힘을 길러 그 내성이 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 된 일명 슈퍼박테리아(super bacteria)가 1996년 일본에서 처음 등장함에 따라 항생제의 효과적인 사용에 문제가 발생하였다. 세균은 항생제를 극복할 수 있는 자연적인 돌연변이체가 될 수 있으며, 이 내성균들은 내성 유전자를 다른 세균들에게 전달시켜 주어 내성균의 확대는 신속하게 이루어질 수 있다. 슈퍼박테리아는 대표적으로 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)와 더욱 강한 항생제 내성을 가진 VRSA(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) 및 VRE(Vancomycin-resistant Enterococci)를 들 수 있고, 항생제 내성 박테리아의 경우 항생제에 내성을 가지고, 내성은 점차로 강해져 어떤 항생제에도 저항할 수 있게 되며, 미국에서만 한 해 약 1만9000명이 슈퍼박테리아라는 항생제 내성균에 의해 사망하고 있는 등 슈퍼박테리아에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다.

또한 슈퍼박테리아의 경우 병원체가 신체 한 부분의 1차 병소에서 2차적으로 혈액 속으로 이동하는 증세인 균혈증에 의한 감염질환의 확대 또는 패혈증 등의 중증감염질환으로 악화될 수 있기 때문에 슈퍼 박테리아 항생제의 개발이 필요하다.

현재 슈퍼박테리아 항생제인 자이복스(Zyvox)등이 시판되고 있으나, 자이복스(Zyvox)등의 슈퍼박테리아 항생제는 부작용을 가지고 있으며 MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 균이 내성이 생기기 시작하여약효가 급격히 떨어지고 있는 현실이며, 반코마이신, 페니실린, 메티실린 내성 균주 등 수퍼박테리아에 대해 두루 효과를 가지는 슈퍼박테리아 항생제의 개발이 시급한 실정이다.

미국등록특허 제8153652호

따라서 본 발명의 목적은 인돌유도체인 7BOI(7-benzyloxyindole) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 항균용 조성물을 포함하는 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 약학 제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 조성물 내에 0.001~1.0mM의 농도로 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항균은 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균활성일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 병원성 물질인 스타필로잔틴(staphyloxanthin)의 생성을 억제하고, 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 인간 적혈구 용혈 작용을 억제하는 작용을 통해 항 병원성 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 병원성 유전자인 α-hemolysin hla 및 엔테로톡신 seb 유전자의 발현을 억제하고; 단백질 분해효소 유전자인 splA 및 sspA의 유전자 발현을 억제하며; 및 조절 유전자인 sarA 및 agrA 유전자의 발현 조절을 통해 항 병원성 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 약학 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 7-벤질옥시인돌 화합물은 병원성 세균, 특히 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)의 병원성 물질인 스타필로잔틴의 생성을 효과적으로 억제하고, 스타필로코쿠스 아루레우스에 의한 인간 적혈구의 용혈작용을 억제할 수 있으며, 나아가 병원성 유전자인 α-hemolysin hla 및 엔테로톡신 seb 유전자, 단백질 분해효소 유전자인 splA 및 sspA 유전자, 조절 유전자인 sarA 및 agrA 유전자의 발현 조절을 통해 항 병원성 활성을 갖는다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 상기 화합물은 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료를 위한 의약품의 제조에 용이하게 사용될 수 있으며, 나아가 항생제 내성을 가지거나 항생제 처리 시 독성을 가지는 세균의 억제용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 인돌 또는 다양한 인돌유도체를 대상으로 스타필로크산틴 분석을 하여 세포의 사이즈, 색상 및 스타필로크산틴 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 2 인돌 또는 다양한 인돌유도체에서의 S. aureus 구균의 용혈작용, 과산화수소 억제정도 및 세포성장을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 전혈에서의 인돌과 7BOI 처리에 따른 S. aureus 구균의 생존을 나타낸 그래프이다.
도 4는 전혈살균분석을 통해서 인돌과 7BOI 처리에 따른 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 억제 정도를 나타낸 결과이다.
도 5는 인돌 또는 7BOI를 0, 0.01, 0.05 또는 0.1 mM의 농도로 처리했을 때의 선충 살충 분석(C. elegans killing assay)을 한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 qRT-PCR를 수행하여 인돌 또는 7BOI 처리에 따른 병독성 요소 유전자, 프로테아제 유전자 및 조절유전자를 조절할 수 있는지를 조사하였다.
도 7은 동물세포와 P. aeruginosa 및 S. aureus에서 인돌과 인돌유사체 처리에 따른 생리학적 기능을 도식화한 결과이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 7BOI(7-benzyloxyindole)화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

[화학식 1]

본 발명자들은 항 병원성 활성을 갖는 새로운 약제를 개발하기 위해 연구하던 중, 상기 화합물이 병원성 세균에 대해 효과적인 항병원성 활성을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 화합물인 7BOI(7-benzyloxyindole)는 병원성 물질로 알려진 스타필로잔틴의 생성을 억제시킬 수 있는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 인간 전혈과 병원성 세균 접촉 시 본 발명의 화합물을 처리할 경우, 병원성 세균의 세포사멸이 증가하고 병원성이 억제됨을 확인할 수 있었다.

나아가, 본 발명자들은 7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물이 어떠한 기작을 통해 항 병원성 활성을 갖는지 확인하기 위해 qRT-PCR을 수행하여 병원성 유전자의 발현에 미치는 본 발명의 화합물 영향을 분석한 결과, 병독성 요소 유전자, 프로테아제 유전자 및 조절 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.

이 외 본 발명의 7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물이 항병원성 활성이 있음은 하기 기재된 실시예의 실험 결과들을 통해 확인할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 약학 제제를 제공할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 7BOI(7-benzyloxyindole)는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로 함유되는 7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능함 염은 병원성 세균에 대해 우수한 항균활성을 가지고 있는데, 바람직하게 상기 항균은 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)균에 대한 항균 활성일 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 인돌유도체인 7BOI(7-benzyloxyindole) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 임상투여 시에 수행할 수 있는 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 인돌유도체인 7BOI(7-benzyloxyindole)를 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 인돌유도체인 7BOI(7-benzyloxyindole) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.01 ~ 1,000㎎/일이며, 바람직하게는 0.1 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실험 준비 및 분석 방법>

재료, 균주배양

S. aureus (ATCC 25923)와 S. aureus MW2 균주(community-acquired [CA] methicillin-resistant [MRSA] isolate (ATCC BAA-1707)) (Kim and Mylonakis 2012)는 Trypticase soy broth(TSB)를 사용하여 배양하였고, 모든 실험은 37℃에서 수행하였다. 32가지의 인돌유사체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)와 Combi-Blocks, Inc. (San Diego, USA)에서 구입하였으며, 32가지 인돌유사체의 화학 구조식은 도 1에 나타내었다. 모든 인돌유사체 화합물들은 DMSO에서 녹여서 사용하였고, 화합물이 첨가되지 않은 DMSO만 첨가한 군은 대조군으로 사용하였다.

S. aureus 균주는 LB 플레이트에 스트레킹하여 최초 배양한 후, 단일 콜로니를 선택하여 250 mL 플라스크에 TSB (25 mL)를 첨가한 후, 37°C에서 250 rpm로 배양하였다. 배양된 배양액은 1:100(균주 배양액: TSB 배지)의 혼합비로 TSB 배지에서 다시 배양시켰다. 이후 세포성장 측정은 인돌 화합물을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군을 대상으로 분광광도계(UV-160, Shimadzu, Japan)를 사용하여 600nm의 흡광도에서 광학 밀도를 측정하였고, 구체적인 성장률은 시간 대비 선형 흡광 로그 그래프(600nm에서 0.2~0.7까지의 광학밀도 측정)를 사용하여 결정하였고, 이들 각 실험은 최소 3번 이상 수행하였다.

스타필로잔틴 ( Staphyloxanthin ) 분석

본 분석은 병원성(독성; virulence) 요소가 밝은 금색 칼라를 띈다는 특성을 이용하여 항독성 여부를 스크리닝할 수 있는 간단한 방법이다. 간략히 설명하면, 세포들은 TSB 배지(2 mL)에서 1:100 농도로 희석하여 다시 배양한 다음, 인돌 또는 인돌유사체를 각각 첨가하고 37℃에서 16시간 250rpm으로 배양하였다. 이후, 세포들을 16,600 x g에서 10분간 원심 분리하여 모은 뒤, 각 세포 펠렛들에 대해 스타필로잔틴 생성물에 대한 색상 여부를 확인하여 인돌 화합물에 대한 독성 감소 작용을 측정하였다.

용혈작용 분석

용혈작용 분석은 Larzabal 등에 의해 공지된 방법을 변형하여 수행하였는데, 인간 적혈구 세포의 용해 정도를 인돌 유사체들의 존재하에 S. aureus 구균 성장 배양물 전체를 사용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, S. aureus 구균을 1:100의 농도로 희석을 한 뒤 TSB 배지에 0.5 mM 인돌 유사체를 각각 첨가한 군과 인돌 유사체 화합물을 첨가하지 않은 군을 16시간 동안 250rmp으로 배양하였다. 이후 세포 배양물(25ul의 ATCC 25923, 50ul의 KRSA)에 PBS 버퍼로 희석된 인간 적혈구 세포(900 x g로 5분동안 원심분리하고, 분리한 세포를 PBS 버퍼로 3회 세척한 세포)를 첨가하고, 세포의 용혈활성을 측정하기 위해 적혈구 세포와 S. aureus 구균 혼합물을 37℃에서 1시간 250 rpm으로 배양하였으며, 상층액을 543nm의 흡광도로 측정하였다.

S. aureus 구균은 α-hemolysin(용혈작용을 일으키는 세포 독성)을 생성할 수 있기 때문에 S. aureus 구균에서의 인간 용혈작용에 의한 인돌 효과를 조사하였다.

과산화수소 저항성 분석

과산화수소에 대한 저항성 분석(세포 생존율 분석)은 Liu et al의 방법을 사용하여 수행하였다. TSB 배지에서 S. aureus 구균을 16시간 동안 배양한 뒤, 0.2 또는 0.5mM의 인돌 유도체를 첨가한 군 및 첨가하지 않은 군을 TSB(turbidity at 600nm of 1)에서 mid-log phase까지 재배양하였다. 이후 각 배양물의 일부(0.1ml)에 최종 농도 1.5% (v/v)의 과산화수소를 첨가하고 250 rpm으로 60분간 교반하면서 배양하였다. 세포 생존율은 과산화수소 처리에 따른 스트레스 처리 후, 집락형성단위의 수(CFU)/mL를 최초 CFU/mL로 나눈 수로 계산하였다. 이러한 실험은 3번 반복 수행하였다.

전혈 살균 분석( Whole blood killing assay )

S. aureus 구균을 25 mL TSB 배지에 접종(균 : 배지= 1: 100)한 뒤 37℃에서 250 mL 플라스크에 넣어 밤새 배양하였으며, 이후 인돌 유사체를 첨가한 군과 첨가하지 않은 군을 6시간 동안 250rpm으로 교반하였다. 전혈(human whole blood, 0.5 mL)과 S. aureus(62.5 )을 혼합한 혼합물을 37 °C에서 2시간 동안 250rpm으로 교반하면서 배양한 후, S. aureus 구균의 생존을 집락형성단위의 수(CFU)로 측정하였다.

선충 살충 분석( C. elegans killing assay )

선충 살충 분석은 (C. elegans killing assay) 기존의 Kim 및 Mylonakis이 공지한 방법에 따라 수행하였는데, 10ul의 S. aureus 배양액을 인돌 및 7BOI(0, 0.01, 0.05, or 0.1 mM)가 함유되어 있는 tryptic soy agar 배지에 접종하고, 선충(L4/young adult fer-15;fem-1) 30마리를 천(lawn) 상에 처리하고 25°C에서 키웠으며, 백금침(platinum wire)를 가지고 가볍게 건들이는 방식으로 매일 생존 여부를 확인하였다. 배양 플레이트의 벽을 기어오르는 선충들은 분석 결과에서 제외시켰고, 3번 반복 실험을 수행하였다.

RNA 분리 및 실시간 qRT - PCR 분석

인돌 또는 7BOI 처리에 따른 S. aureus 세포 내의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 OD₆₀₀에서 흡광값이 1이 될 때까지 S. aureus를 배양한 후, 0.5 mM의 인돌 또는 7BOI를 첨가하고 1, 2 또는 5시간째 세포를 용해시키고 RNase 억제제(RNAlater, Ambion, TX, USA)를 첨가한 다음, 세포들을 30초간 드라이아이스와 95% 에탄올로 차갑게 한 뒤 16,600 g으로 2분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 즉시 드라이아이스로 얼렸으며, 80°C에 보관하였다. 이후 총 RNA는 Qiagen RNeasy mini Kit (Valencia, CA, USA)를 사용하여 분리하였으며, 모든 DNA를 제거하고 정제된 RNA를 15분간 30 Units of DNase I으로 처리하였다. qRT-PCR를 이용하여 hla (α-hemolysin gene), sae(aglobalregulator), agrA (quorum-sensing gene), sar(accessoryregulatorA), sigB(RNApolymerasesigmafactor), andseb (enterotoxin), hla(hemolysin) 및 proteases genes(aur,clp, scpA, splA, sspA)의 전사 발현물을 분석하였다.

qRT-PCR에 사용한 프라이머 세트는 표 1에 나타냈으며, qRT-PCR는 StepOne^TM Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 수행하였다. 또한 이때 PCR 반응조건에 대한 대조군으로 16s rRNA housekeeping gene을 사용하였다.

크리스탈 - 바이올랫 바이오필름 분석

고정형 바이오필름 형성 분석은 0.5mM의 인돌 화합물이 함유된 TBS 배지 또는 인돌 화합물이 함유되지 않은 TBS 배지를 포함하는 96웰 폴리스티렌 플레이트(SPL Life science, korea)로 수행하였다.

통계 분석

C. elegans의 생존율은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 측정하였고, 유의미한 생존 정도의 차이는 log-rank test(STATA6; STATA, College station, TX)를 이용하여 분석하였으며, 통계적으로 유의미한 값은 p value <0.05인 것으로 하였다.

< 실시예 1>

S. aureus 내에서 인돌 유사체 화합물들에 의한 스타필로잔틴 생성물의 억제 정도 분석

인돌유사체 화합물들이 0.5mM의 농도에서 스타필로크산틴을 감소시킬 수 있는지를 상기 기술된 스타필로잔틴(Staphyloxanthin) 분석 방법을 통해 확인하였다. 여기서 S. aureus 구균에 노란색이 나타난다는 의미는 세포 안에 스타필로크산틴이 있다는 것을 나타내는 것이다. 실험에 사용한 인돌유사체 화합물은 도 1에 기재된 화합물들을 사용하였다.

분석 결과, 인돌유사체 화합물 중 5-fluoroindole, 5-iodoindole, 6-fluoroindole, 7-benzyloxyindole (7BOI), 7-chloroindole 및 7-bromoindole 모두 S. aureus에서 스타필로잔틴의 생성이 억제된 것으로 나타났다.

한편, 5-iodoindole 및 7-bromoindole은 세포의 크기가 감소된 것으로 나타났으며, 이외 인돌 유도체들은 스타필로잔틴의 생성 억제에 큰 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. 참고로, S.aureus 구균에서 어두운 노란색은 인돌-3-아세트 알데하이드와 3,3’-dimethylene bisindole 자체의 오렌지 색상의 영향을 받아서 나타난 결과이다.

또한, 이들 인돌 유사체 화합물의 모체 화합물인 인돌 화합물의 경우, 화합물의 처리 농도의존적으로(1.0mM 까지) 스타필로잔틴의 생성을 억제시키는 것을 확인할 수 있었고, 특히 7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물은 모든 농도에서 세포의 크기 감소를 유도하지 않은 채 스타필로잔틴의 생성만을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났으며, 특히, 0.1mM의 적은 농도에서도 스타필로잔틴의 생성이 억제되는 것으로 확인되었으며, S. aureus 세포의 펠렛 색이 무색인 것으로 나타났다(도 1b 참조).

< 실시예 2>

7 BOI 화합물의 S. aureus 에 대한 용혈억제활성 및 과산화수소 저항성 분석

S. aureus는 용혈작용을 유발시킬 수 있는 포어-형성 사이톡신(pore-forming cytotoxin)을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 인돌 및 인돌 유사체 화합물이 S. aureus의 용혈작용을 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위해, 상기 기술된 용혈작용 분석 방법에 따라 분석을 수행하였고, 과산화수소에 대한 저항성 영향 분석을 위해 상기 기술된 과산화수소 저항성 분석 방법으로 실험을 수행하였다.

분석 결과, 식물 유래의 항암 활성이 있다고 알려진 indole-3-carbinol(I3C)가 가장 우수한 용혈 억제 활성이 있는 것으로 나타났고, 그 뒤로 7BOI, 6-fluoroindole(6FI) 및 Indole(Ind)가 항용혈 효과가 우수한 것으로 확인되었다(도 2a 참조). 특히 인돌과 인돌 유도체인 7BOI 화합물은 스타필로잔틴 생성억제 및 용혈 작용 억제 효과가 우수하여 본 발명자들은 이 후 실험에 이 두 가지 화합물에 포커스를 두고 실험을 수행하였다.

한편, 스타필로잔틴은 산소 라디칼과 과산화수소와 같은 활성산소종(ROS)을 해독할 수 있는 항산화제로 작용한다. 이에 본 발명자들은 과산화수소 처리에서 S. aureus 구균의 생존에 인돌과 7BOI 화합물이 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과, 인돌과 7BOI 화합물은 처리 농도 의존적으로 과산화수소에 대한 민감도가 증가하는 것으로 나타났다(도 2b 참조). 특히 또한, 7BOI 화합물의 경우, 0.2mM의 농도에서 과산화수소에 대한 세포 민감도가 우수한 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 앞서 확인한 인돌 유사체 화합물들의 스타필로잔틴 생성 억제 활성 결과와도 일맥 상통하다.

또한, 화합물 처리에 따른 세포 성장 정도를 분석한 결과, 최대 0.5 mM까지 처리하였을 경우, 인돌 또는 7BOI 화합물 처리로 인해 세포의 성장에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되었다. 구체적으로 S. aureus 구균의 성장은 0.5 mM의 인돌을 처리하였을 때 1.13 ± 0.05/h, 0.5 mM 7BOI를 처리하였을 때 1.12 ± 0.11/h 으로 나타났고, 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 0.91 ± 0.04/h의 성장률을 보임을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 통해 인돌의 S. aureus 구균에 대한 최소억제농도(MIC)는 대략 7mM인 반면에 7BOI의 최소억제농도는 50mM 이상의 농도임을 알 수 있었다(도 2c~2e 참조).

따라서 궁극적으로 상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 7BOI 화합물이 S. aureus로 인한 적혈구의 용혈작용을 억제하는 활성이 있고, 과산화수소에 S. aureus 구균의 민감성을 증진시킬 수 있는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다. 더불어 7BOI 화합물의 경우 화합물 처리에 따른 세포 성장이 크게 저해되지 않는다는 사실을 통해 7BOI 화합물은 살균(bactericidal activity) 활성이 아닌 항-병원성(anti-virulence) 활성을 갖는 물질임을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

인간 전혈(human whole blood)과 S. aureus 와의 접촉시 7 BOI 화합물에 따른 S. aureus 생존율 감소 효과 분석

상기 실시예들을 통해 인돌 유사체 화합물들이 병원성 인자의 생성을 감소시키는 활성이 있음을 확인하였고, 나아가 본 발명자들은 S. aureus 구균이 인간의 혈액 내에서 접촉 시 인돌 유사체 화합물에 의해 생존율에 영향을 받는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실험은 상기 기술된 전혈 살균분석법으로 수행하였다.

분석 결과, 인돌 화합물과 7BOI 화합물은 처리 농도 의존적으로 혈액 내에서 S. aureus 구균의 생존율을 효과적으로 억제하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 실험에 사용한 화합물들이 선천성 면역 시스템에 대한 S. aureus 구균의 저항 시스템을 약화시켜 S. aureus 구균의 생존율이 감소된 것임을 알 수 있었다. 또한 인돌 또는 7BOI 화합물을 0.1mM의 농도로 단독 처리한 경우, 인간 혈액 세포에는 독성을 유도하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

MRSA 의 스타필로잔틴 생성 및 인간 전혈 내에서 MRSA 의 세포 생존에 대한 7 BOI 의 영향분석

페니실린이나 세팔로스포린 등 거의 모든 항생제에 강한 내성을 지닌 악성 세균으로 알려진 MRSA(ATCC BAA-1707) 균에 대해 7B0I 화합물이 S. aureus 구균과 같이 스타필로잔틴 생성억제, 전혈 내에서 세포 생존 감소 등의 효과를 유도하는 활성이 있는지 분석하였는데, 분석은 상기에서 S. aureus 구균을 대상으로 실험한 방법과 동일한 방법으로 수행하였고, S. aureus 구균 대신 MRSA을 사용하였다는 차이가 있다.

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 7BOI는 세포 pellet의 크기에는 영향을 미치지 않으면서 농도 의존적으로 스타필로잔틴의 생성을 감소시키는 활성이 있는 것으로 나타났다. 반면, 인돌 화합물은 MRSA에서의 스타필로크산틴 생성억제에는 영향을 주지 못하는 것을 알 수 있었다. 또한, 7BOI는 혈액 내에서 MRSA의 생존율을 현저하게 감소시키는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

C. elegans 모델에서 S. aureus 의 생존율에 미치는 7 BOI 의 영향분석

S. aureus 는 선충인 C. elegans을 살해하는 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 7BOI 화합물의 S. aureus 억제 활성을 C. elegans 모델을 통해 확인하였는데, 구체적으로 상기 기재된 선충 살충 분석 실험을 통해 확인하였다. 또한, 먼저 S. aureus 없는 조건 하에서 C. elegans의 생존에 영향을 줄 수 있는 인돌 및 7BOI 화합물의 최소 농도 분석을 수행하였다.

분석 결과, Oh et al. 2012의 선행 실험으로 인돌 또는 7BOI의 농도가 0.5 mM 이상일 때 C. elegans 선충에는 독성이 나타났으나 인돌 또는 7BOI의 농도가 0.1 mM일 때는 독성이 나타나지 않는다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 인돌 또는 7BOI를 0, 0.01, 0.05 또는 0.1 mM의 농도로 처리하고 S. aureus 존재 하에 선충 의 살충 정도를 확인한 결과, 0.1 mM 농도의 인돌을 처리한 경우에는 S. aureus 의 독성이 그대로 작용하여 C. elegans이 모두 사멸하는 것으로 나타난 반면, 7BOI를 처리한 선충은 S. aureus 구균의 병원성을 감소시켜 C. elegans의 사멸정도를 억제시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 5a 및 5b 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 인돌과 달리 본 발명에 따른 화합물인 7BOI 화합물은 S. aureus 구균의 병원성을 효과적으로 감소시켜 C. elegans의 S. aureus에 대한 민감성을 억제하여 C. elegans의 사멸정도를 유의적으로 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

병원성 유전자의 발현에 미치는 7 BOI 의 영향

이상의 실험 결과를 통해 본 발명자들은 7BOI 화합물이 S. aureus의 병원성을 감소시킬 수 있는 활성이 있다는 사실을 확인하였고, 나아가 7BOI 화합물이 어떠한 유전인자들의 조절을 통해 비병원성 활성을 유도하는지를 조사하였고, 상기 조사는 앞서 기술된 실시간 qRT-PCR 방법을 통해 확인하였다.

분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인돌 및 7BOI 화합물은 α-hemolysin hla 및 엔테로톡신 seb의 유전자 발현을 헌저하게 억제하는 것으로 나타났으며, splA 및 sspA의 단백질 가수 분해효소 유전자 역시 인돌 및 7BOI 화합물에 의해 발현이 저해되는 것으로 나타났고 센서 키나아제 유전자인 saeS도 유전자 발현이 저해되는 것으로 나타났다. 한편, 조절 유전자인 sarA, agrA 및 sigB는 인돌 및 7BOI에 의해 유전자 발현이 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 인돌 및 7BOI 화합물은 병원성 인자 유전자, 프로테아제 유전자 및 조절유전자의 발현을 조절하는 기작을 통해 항병원성 활성을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었고, 궁극적으로 특히 7BOI 화합물을 항병원성 제제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

7BOI(7-benzyloxyindole) 화합물을 유효성분으로 포함하는 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항병원성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항병원성 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 조성물 내에 0.001~1.0mM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 화합물은 병원성 물질인 스타필로잔틴(staphyloxanthin)의 생성을 억제하고, 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 인간 적혈구 용혈 작용을 억제하는 작용을 통해 항 병원성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 병원성 유전자인 α-hemolysin hla 및 엔테로톡신 seb 유전자의 발현을 억제하고; 단백질 분해효소 유전자인 splA 및 sspA의 유전자 발현을 억제하며; 및 조절 유전자인 sarA 및 agrA 유전자의 발현 조절을 통해 항 병원성 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제2항 및 제4항 내지 제5항으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 한 항의 조성물을 포함하는 스타필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 감염성 질병의 예방 및 치료용 약학 제제.