KR101426573B1 - 소맥 내재성 ｄｎａ의 검출·정량법 및 피검 시료에 있어서의 유전자 재조합 소맥의 혼입율의 결정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 a) 소맥 품종으로 보편적으로 존재하고, b) 소맥 품종에 의해 존재량(검출량)이 편중되지 않으며, c) 다른 곡물이 존재하여도 교차성 없이 빵 소맥만 검출 가능하고, d) PCR 반응에서 정량적으로 증폭된다는 조건을 만족시키는 소맥 내재성 서열을 발견하여, 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 보다 정확하게 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 검출 또는 정량하는 방법이며, 상기 피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역에 포함되는 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정 및 상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
유전자 재조합 소맥, 소맥 내재성 DNA
Description
본 발명은 피검 시료 중 소맥 내재성 유전자를 검출, 정량하는 방법에 관한 것이다. 특히 식품 소재, 가공 식품 중에 포함되는 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정할 때에 이용하는 소맥 내재성 DNA의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
일본에서는 현재까지 옥수수, 대두, 고구마 등에 대해서 50종 이상의 유전자재조합 농작물(이하 "GMO"라 함)이 안전성 심사를 거쳐 수입이나 판매를 인정받고 있다. 이에 따라, GMO 함유 식품은 "유전자 재조합에 관한 표시에 다른 가공 식품 품질 표시 기준 제7조 제1항 및 생선 식품 품질 표시 기준 제7조 제1항의 규정에 기초하는 농림수산 장관이 정하는 기준"(2000년 3월 31일 농림수산부 고시 제517호) 및 "식품 위생법 시행 규칙 및 우유 및 유제품의 성분 규격 등에 관한 성령의 일부를 개정하는 성령 등의 시행에 대해서"(2001년 3월 15일 후생노동부 식발 제79호)에 기초하고, 그 표시가 의무화되어 있다.
그러나 해외에서는 한번 안전성 평가가 종료되면 GMO와 비GMO가 혼재하는 형 태로 재배되는 경우도 있고, 수확 후 유통 과정에서도 혼입의 가능성을 부정할 수 없다. 또한, 식품 제조자 등은 가공 식품의 제조를 제조업자에게 위탁하는 경우도 많고, 만일 비GMO를 사용하도록 지정하여 위탁하여도, 제조업자의 공장에서 GMO도 사용하고 있는 경우는, 이 GMO가 가공 식품에 미량 혼입되는 경우가 있다. 따라서, 표시의 의무를 준수하기 위해서는, 식품 메이커 등은 완성된 가공 식품 중에도 GMO가 혼입되었는지의 여부를 검사 분석하여 확인하는 것이 요구된다.
가공 식품 및 그의 원료 등의 피검 시료 중 GMO 검출 방법으로는, 폴리머라제 연쇄 반응(이하 "PCR"이라 함)에 의해서 재조합 DNA를 검출하는 방법, ELISA법에 의해서 재조합 단백질을 검출하는 방법 등이 있다. 가공 식품의 경우, 가열이나 가압에 의해서 단백질이 변성되는 경우가 많기 때문에, ELISA법으로는 정확한 검출이 불가능한 경우도 많아, PCR법에 의한 검출이 일반적으로 행해진다.
검사 분석하는 방법으로서, JAS 분석 시험 핸드북 유전자 재조합 식품 검사·분석 메뉴얼 개정 제2판(비특허 문헌 1)에 기재되는 방법이나, 『재조합 DNA 기술응용 식품의 검사 방법에 대해서(일부 개정)』(2003년 6월 18일 후생노동부 식발 제0618002호)에 기재되는 방법이 있다. 이들에 따르면, GMO의 검사 분석에 있어서는, 피검 시료로부터 추출한 DNA로 PCR 증폭이 가능한지의 여부를 확인할 목적으로, 각 농산물의 내재성 DNA를 검지하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR법을 행하고, 예상되는 길이의 PCR 산물이 얻어짐으로써 확인할 필요가 있는 것이 기재되어 있다. 또한, 피검 시료 중에 포함되는 GMO를 정량하는 경우에는, 그 농산물이 반드시 가지고 있는 내재성 DNA에 대한 재조합 DNA의 존재 비율로부터, 재조합체의 혼 입율을 상대적으로 측정하는 방법이 이용된다.
예를 들면 옥수수로는, 5계통의 승인 GMO 품종 각각에 대하여 특이적인 검지프라이머쌍 이외에, 옥수수의 내재성 DNA로서 SSIIB 유전자의 영역을 검지하는 프라이머쌍이 개발되어 있다(비특허 문헌 1).
『재조합 DNA 기술 응용 식품의 검사 방법에 대해서(일부 개정)』(2003년 11월 13일 식안발 제1113001호)에서는 정량 PCR법을 행할 때, 옥수수 또는 대두의 내재성 DNA 및 재조합 DNA를 표적으로 한 특이적 프라이머쌍에 의해 증폭된 증폭산물을 플라스미드 상에 연결한 것을 표준 물질로서 사용하고 있다. 이러한 표준 물질을 이용하여 정량 PCR법을 행함으로써, 피검 시료에 대해서 일정 시간 정량 PCR을 행한 경우에 재조합 DNA의 복제수와 내재성 DNA의 복제수의 비를 정확하게 구할 수 있다.
옥수수와 같이 복수개의 계통의 GMO 품종이 존재하는 경우에는, 각 계통에 특이적인 DNA와 내재성 DNA를 하나의 환상 DNA에 조립한 표준 물질을 이용하면 각 계통의 혼입율의 측정에 있어서 공통의 표준 물질을 사용할 수 있어 특히 유용하다.
또한, 일반적으로 각 계통에 특이적인 유전자는 입수가 곤란하지만, 한번 이들을 조합하여 복제 가능한 DNA를 제조하면, 이 DNA 자체를 복제함으로써, 계통 특이적인 DNA를 안정적으로 공급하는 것도 가능해진다.
한편, 빵 소맥에 대해서 현재 시점에서 안전성 심사를 거친 유전자 재조합품은 없지만, 가까운 장래의 시장 판매가 예상된다. 이 때문에, 소맥의 GMO가 유통 된 경우에 구비하여, 소맥의 내재성 DNA를 검출 및 정량하는 방법 및 이것에 이용하는 PCR용 프라이머쌍의 개발이 요구되고 있다.
소맥은 다른 곡물에 비하여 유전자의 존재 형태에 여러가지 변이가 존재한다. 이는 소맥 품종에 의해 6배체, 4배체, 2배체의 유전자형이 존재하기 때문이다. 예를 들면, 일반적인 빵 소맥의 경우 6배체(AA, BB, DD)이지만, 각각의 유전자는 유사하지만, 전좌(轉座) 등에 의해 부분적인 차이가 인정되고 있다. 한편, 듀럼 소맥은 4배체이고, 게놈 DD를 갖고 있지 않다.
또한, 소맥의 경우에는 동일한 곡물 중에 게놈 구조나 코딩 유전자의 염기 서열에 대해서 상동성이 높은 보리류, 예를 들면 보리, 호밀, 귀리 등이 있다. 이들 보리류는 빵 소맥과의 상동성이 높아, 오검출될 가능성이 높다.
이러한 사정으로부터, 소맥에 대해서는 a) 소맥 품종으로 보편적으로 존재하고, b) 소맥 품종에 의해 존재량(검출량)이 편중되지 않으며, c) 다른 곡물이 존재하여도 교차성 없이 소맥만 검출 가능하고, d) PCR 반응에서 정량적으로 증폭된다는 조건을 만족시키는 DNA 서열의 발견이 곤란했다.
국제 공개 공보 WO2005/097989호(특허 문헌 1)는 이러한 조건을 만족시키는 소맥 내재성 DNA로서, 왁시(Waxy) 유전자(비특허 문헌 2를 참조)의 부분 서열 등을 사용할 수 있는 것을 개시하고 있다.
특허 문헌 1: 국제 공개 공보 WO2005/097989호
비특허 문헌 1: AS 분석 시험 핸드북 유전자 재조합 식품 검사·분석 메뉴얼 개정 제2판
비특허 문헌 2: Ainsworth C, et al., Plant Mol Biol. 1993 Apr; 22(1): 67-82
그러나 왁시 유전자가 결손된 변이체인 찰밀이 알려져 있고, 찰밀을 포함하는 피검 시료에 있어서는, 상기 특허 문헌 1에 개시된 왁시 유전자의 부분 서열을 검출하여도, 소맥 내재성 DNA를 정확하게 측정할 수 없다. 또한, 왁시 유전자는 소맥의 D 게놈 상에 존재한다고 생각되기 때문에, D 게놈을 갖지 않는 듀럼 소맥의 게놈 상에는 존재하지 않는다. 따라서, 특허 문헌 1에 개시된 방법은 듀럼 소맥과 빵 소맥을 식별하는 것을 목적으로 하고 있는 경우에는 유용하지만, 듀럼 소맥과 빵 소맥을 합쳐서 "소맥"으로서 검출하는 것이 요청되는 경우도 많아, 이러한 상황에서는 별도 듀럼 소맥의 내재성 DNA를 발견하여 검출·측정해야 한다.
따라서, 본 발명은 상기 a) 내지 d)의 조건을 만족시키는 추가적인 소맥 내재성 서열을 발견하고, 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 보다 정확하게 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 소맥의 게놈 DNA에서, 프롤린 풍부 단백질(PRP) 유전자(C. A. Raines et al., Plant Molecular Biology 16: 663-670, 1991)의 일부 영역은 소맥 품종으로 보편적으로 존재하고, 또한 PCR 반응에 있어서 다른 식물과의 교차성이 없으며, 해당 영역을 증폭함으로써 소맥 내재성 DNA 서열을 특이적으로 검출 또는 정량할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은
〔1〕피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열로 이루어진 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정과, 상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는, 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 검출 또는 정량하는 방법;
〔2〕상기〔1〕에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열로 이루어진 영역이 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 영역인 방법;
〔3〕상기〔1〕에 있어서, 상기 프라이머쌍이 (i) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (viii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (ix) 상기 (i) 내지 (viii)의 프라이머쌍의 각각에 있어서, 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％의 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍으로 이루어지는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍인 방법;
〔4〕상기〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 있어서, 상기 프라이머쌍에 포함되는 각 프라이머가 15 내지 40 염기 길이의 핵산인 방법;
〔5〕상기〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 있어서 증폭된 영역을 서열번호: 9 또는 10에 기재된 프로브를 이용하여 검출하는 방법;
〔6〕상기〔3〕에 기재된 프라이머쌍 중 1개 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 피검 시료로부터 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 소맥 내재성 DNA를 검출 또는 정량하기 위한 키트;
〔7〕유전자 재조합 소맥 및 유전자 비재조합 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA로서, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열로 이루어진 DNA와, 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA로서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열로 이루어진 1 이상의 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA;
〔8〕상기〔7〕에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열로 이루어진 DNA가 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 DNA인 복제 가능한 DNA;
〔8〕상기〔7〕에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열로 이루어진 DNA가 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 DNA인 복제 가능한 DNA;
〔9〕유전자 재조합 소맥 및 유전자 비재조합 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA로서, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열로 이루어진 DNA와 적어도 80 ％의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 DNA와, 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA로서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열로 이루어진 1 이상의 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA;
〔10〕상기〔9〕에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열로 이루어진 DNA가 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 DNA인 복제가능한 DNA;
〔11〕유전자 재조합 소맥 및 유전자 비재조합 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA로서, 상기〔3〕에 기재된 프라이머쌍 중 어느 하나를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시킬 수 있는 서열로 이루어진 DNA와, 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA로서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열로 이루어진 1 이상의 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA;
〔12〕상기〔7〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 복제 가능한 DNA를 포함하는 용액을 이용하여 2종 이상의 농도 희석 계열을 만들고, 각각에 대하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하고, 소맥 내재성 DNA와, 1종류 이상의 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA를 증폭하고, 각 부분 영역에 대해서 검량선을 구하는 공정과, 상기 피검 시료에 대해서 상기 검량선을 구하는 공정과 동일한 조건으로 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하고, 상기 검량선을 이용하여 피검 시료 중에 존재하는 상기 소맥 내재성 DNA의 분자수와 상기 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA의 분자수를 구하는 공정을 포함하는, 피검 시료에 있어서의 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정하는 방법;
〔13〕상기〔12〕에 있어서, 상기 피검 시료 중에 존재하는 상기 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA의 분자수를 상기 소맥 내재성 DNA의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A와, 유전자 재조합 소맥의 각 계통의 표준 종자를 이용한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하여 구해지는 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA의 분자수를 소맥 내재성 DNA의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 이용하고, 수학식 100×A/B를 계산하여 상기 피검 시료 중 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정하는 공정을 추가로 포함하는 방법; 및
〔14〕상기〔12〕에 있어서, 상기 소맥 내재성 DNA의 증폭을 (i) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (viii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및 (ix) 상기 (i) 내지 (viii)의 프라이머쌍의 각각에 있어서, 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％의 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍으로 이루어지는 프라이머쌍으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머쌍을 이용하여 행하는 방법에 관한 것이다.
<발명의 효과>
본 발명에 따르면, PRP 유전자의 일부 영역을 PCR법에 의해 증폭함으로써, 식품 소재 및 가공 식품 등의 피검 시료로부터, 다른 작물과 교차하지 않고 소맥 내재성 DNA를 특이적으로 검출 또는 정량할 수 있다.
또한, 상기 방법에 의해 제공되는 유전자 재조합 소맥(이하 "GM 소맥"이라고도 함) 검지를 위한 표준 물질을 이용함으로써, 정량 PCR법으로 피검 시료 중 GM 소맥의 혼입율을 GMO 계통별로 정밀도 있게 구하는 것이 가능해진다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하에 본 명세서에 있어서 이용하는 용어의 의미 등을 나타내고, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "소맥"은 특별히 언급하지 않는 한 빵 소맥, 듀럼 소맥, 및 찰밀을 의미한다.
본 발명의 방법은, 소맥의 내재성 DNA 서열로서 소맥 게놈 상의 PRP 유전자(진뱅크 접속 번호 X52472, 서열번호: 1)의 특정 부분, 즉 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역을 검출하는 것이다.
각종 소맥 품종에 있어서, 특허 문헌 1에 개시된 Wx012 영역과, PRP 유전자의 복수개의 부분 영역을 PCR에 의해 증폭한 바, Wx012 영역의 증폭산물과, PRP 유전자의 각 영역의 증폭산물과의 비는 1:1 내지 1:3 사이에서 변동하는 것을 알 수 있다. 1:1 이외의 비가 되는 것은 PRP 유전자 상에 동일한 프라이머로 증폭되는 영역이 복수개 존재하는 것에 의한 것이라고 생각되기 때문에, 이러한 영역은 본 발명에 이용되는 소맥 내재성 서열로는 부적당하다. 따라서, 본 발명자들은 더욱 검토를 거듭한 결과, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역(단 80 염기 이상의 영역)을 증폭하면, 해당 증폭산물과 Wx012 증폭산물이 1:1의 비율로 얻어지는 것을 발견하였다.
또한, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열은 듀럼 소맥에서도 검출되는 것을 확인하였다. 이에 따라, PRP 유전자는 소맥 게놈의 A 또는 B 상에 존재하는 것으로 추정된다. 현재 시장에 유통되는 소맥에는 빵 소맥, 듀럼 소맥, 찰밀 등이 포함되기 때문에, 검출되는 소맥 내재성 유전자로는, 이들 소맥 품종에 공통적으로 존재하고, 품종에 의해 존재량이 변화하지 않는 유전자가 바람직한 바, 이들 소맥 품종에는 게놈 A, B가 반드시 존재하기 때문에, 이 점에서도 서열번호: 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 영역이 소맥 내재성 유전자로서 바람직하다.
한편, PRP 유전자에는 매우 유사한 슈도유전자(pseudogene)가 존재하는 것이 확인되어 있다. 이 때문에, 가공 식품 중 소맥 게놈을 증폭시킬 때, PRP 유전자의 전체 길이로부터 무작위로 선택한 부분 서열을 증폭하는 프라이머를 사용하면, 슈도유전자의 부분 서열도 동시에 증폭될 가능성이 있다. 즉 소맥 품종에 의해서는 단위 소맥 당 DNA 증폭량이 일정하게 되지 않는 경우가 상정된다. 그러나 본 발명자들은 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역을 증폭하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하면, 슈도유전자와도 교차하지 않고 PRP 유전자의 해당 영역만을 증폭할 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 영역은 330 bp로 게놈 전체 길이에 비하여 극단적으로 짧기 때문에, DNA가 단편화되어 있을 가능성이 있는 가공 식품 등의 시료로부터도 소맥 내재성 DNA의 검출 및 정량이 가능하다.
서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열은 특별히 한정되지 않지만, 80염기 길이 이상의 서열이 바람직하고, 특히 서열번호: 11 내지 18 중 어느 1개에 기재된 염기 서열이 바람직하다. 이들 서열은 서열번호: 3 내지 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머를 적절하게 조합함으로써 PCR에 의해 증폭할 수 있다.
도 1에, 서열번호: 2에 있어서의 서열번호 3 내지 8에 기재된 프라이머의 결합 영역을 나타낸다.
또한, 서열번호: 3 내지 8에 기재된 프라이머의 염기 길이를 변경하거나, 프라이머가 결합하는 영역을 약간 변경함으로써, 증폭되는 서열도 서열번호: 11 내지 18에 기재된 염기 서열을 포함하는 영역과 약간 틀어진 영역이 되지만, 이들의 영역도 본 발명에 있어서의 "서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 부분 서열"에 포함된다. 이러한 영역으로는, 예를 들면 서열번호: 3 내지 8에 기재된 염기 서열과 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상 공통의 영역을 갖는 영역을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 PCR법에 이용되는 프라이머쌍은 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머쌍이면 특별히 한정되지 않으며, 증폭하고자 하는 영역의 염기 서열에 기초하여 프라이머 제조 상의 기본 규칙에 따라 설계할 수 있다. 이 때, 각 프라이머의 Tm값의 통일을 도모하는 것에 유의한다. 또한, 각 프라이머의 길이는, 통상은 15 내지 40 bp, 바람직하게는 15 내지 30 bp이다.
본 발명에 따른 방법으로는, 사용하는 프라이머쌍이 소맥 이외의 작물과 교차 반응하면, 소맥 검출의 오류 가능성이 발생할 뿐만 아니라, 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA 서열의 정확한 정량은 곤란해진다. 또한, 본 발명의 방법은 식품 소재 및 가공 식품 등의 피검 시료 중 소맥의 존재 및 그 양의 정확한 정보를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 이용하는 PCR용 프라이머쌍은 소맥을 특이적으로 검출하고, 소맥 이외의 작물, 예를 들면 쌀, 보리, 호밀, 귀리, 유채씨, 옥수수, 좁쌀, 수수, 메밀 등과는 교차 반응하지 않는 것이 필요하다.
이러한 프라이머쌍으로는, 예를 들면 (i) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (ii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iii) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (iv) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (v) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vi) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (vii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, (viii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍 및 (ix) 상기 (i) 내지 (viii)의 프라이머쌍의 각각에 있어서, 각 핵산이 갖는 염기 서열의 적어도 80 ％, 바람직하게는 90 ％, 더욱 바람직하게는 85 ％의 연속된 염기 서열을 포함하는 핵산의 쌍으로 이루어지는 프라이머쌍 등을 들 수 있다. 이들 프라이머쌍은 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열을 포함하는 영역을 소맥 이외의 작물과 교차성없이 특이적으로 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서는, 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭된 영역을 검출하는 프로브는 증폭산물을 정량적으로 검출할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 9 또는 10에 기재된 염기 서열로 이루어지는 프로브를 이용하여 검출하는 것이 바람직하다. 이들 프로브는 증폭산물, 즉 서열번호: 11 내지 18 중 어느 한 항에 기재한 염기 서열을 포함하는 영역의 일부에 높은 특이성으로 결합하기 때문에, 증폭산물을 정량적으로 검출하는 것이 가능하다. 도 1에는, 서열번호: 9 또는 10에 기재된 염기 서열로 이루어지는 프로브가 결합하는 영역도 나타나 있다.
본 발명에서 이용되는 피검 시료는 소맥을 포함하거나 포함할 가능성이 있는 식품 소재 및 가공 식품이고, 예를 들면 소맥의 미처리 종자, 건조 종자, 밀가루나 믹스 분말 등의 식품 원료나 그의 가공 중간 원료, 빵류나 국수류 등의 가공 식품이 포함된다. 또한, 식품 소재 또는 식품은 인간의 식품뿐만 아니라, 애완동물 사료나 사료를 포함한다. 또한, 소맥 이외의 작물은 식품 소재, 식품 원료로서 이용되는 모든 작물을 의미하고, 예를 들면 상술한 작물이다.
이러한 시료는, 예를 들면 그대로 또는 분쇄하여 핵산 추출에 제공할 수도 있고, 세정하여 건조시킨 후 파쇄하여 핵산 추출에 제공할 수도 있다. 피검 시료로부터 추출하여 분석에 이용하는 핵산은 통상적으로 DNA이다. DNA는 공지된 임의의 방법에 의해서 추출할 수도 있지만, 현재는 다수개의 DNA 추출 키트가 시판되어 있고, 이들을 이용하여 추출할 수 있다. 예를 들면 DNeasy 플랜트 맥시(DNeasy Plant Maxi) 키트(퀴아젠(QIAGEN)사 제조)를 이용하여 코펠(Kopell) 등의 방법(Kopell, E. et al., Mitt. Gebiete Levensm, Hyg., 88, 164)에 따라서 피검 시료로부터 DNA를 추출한다. 추출한 DNA는 흡광도의 측정 등에 의해 농도를 구하고, PCR에 바람직한 농도까지 희석하여 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, PCR은 사용하는 프라이머나 DNA 폴리머라제를 고려하여 통상법에 따라서 행할 수 있다. 그 때에 PCR 완충액, dNTP, MgCl2 등의 시약은 제조할 수도 있고, 시판되고 있는 PCR 키트를 이용할 수도 있다. PCR에는 상기 프라이머쌍을 1그룹 또는 2그룹 이상 이용할 수도 있다. 또한, PCR 조건은, 예를 들면 95 ℃ 30 초, 63 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초를 1 사이클로 하여 40 사이클을 행하고, 마지막으로 종료 반응으로서 72 ℃ 7 분간이라는 조건을 들 수 있지만, 이용하는 프라이머의 Tm이나 증폭하여야 할 영역의 길이, 주형 DNA의 농도 등을 고려하여 적절하게 변경할 수 있다.
증폭된 핵산(PCR 산물)의 검출은 특정한 DNA 단편을 동정할 수 있는 임의의 방법, 구체적으로는 아가로스겔 전기 영동, 아크릴아미드겔 전기 영동, 모세관 전기 영동, 혼성화, 면역학적 방법 등을 이용하여 실시할 수 있다. 일반적으로는 PCR 산물을 전기 영동하고, 그 영동 패턴에 의해 확인하지만, 예를 들면 에티듐 브로마이드를 포함하는 0.8 ％의 아가로스겔에 의한 전기 영동을 행하고, 밴드를 확인함으로써 검출할 수 있다.
본 발명은 상술한 검출 또는 정량 방법으로 이용하는 프라이머쌍 및 이들의 프라이머쌍을 포함하는 키트를 포함한다. 프라이머는 통상법에 따라서 제조할 수 있다. 또한, 키트는 프라이머쌍 이외에, 다른 시약, 예를 들면 dNTP, MgCl2, TaqDNA 폴리머라제 등의 폴리머라제, 완충액(예를 들면 트리스-HCl), 글리세롤, DMSO, 양성 대조군용 DNA, 음성 대조군용 DNA, 증류수 등을 포함할 수도 있다. 이들 시약은 키트 중에서, 각각 독립적으로 포장되어 제공될 수도 있고, 2종 이상의 시약이 혼합된 형태로 제공될 수도 있다. 키트 중 각각의 시약 농도에 특별히 제한은 없고, 본 발명의 PCR을 실시하는 것에 대해서 가능한 범위이면 된다. 또한, 키트에는 바람직한 PCR 조건 등의 정보가 추가로 첨부되어 있을 수도 있지만, 프라이머 시약만일 수도 있다.
또한, 본 발명은 GM 소맥의 혼입율을 정량 PCR법에 의해서 측정할 때에 유용한 표준 물질을 제공한다. 이 표준 물질은 비GM 소맥과 GM 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA와, 1 이상의 GM 소맥 특이적 DNA를 1개의 복제 가능한 DNA 상에 연결한 것이다. 또한, 상기 부분 서열로는 서열번호: 11 내지 18 중 어느 1개에 기재된 염기 서열로 이루어진 DNA를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 표준 물질은, 예를 들면 내재성 DNA로서, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 부분 서열로 이루어진 DNA와 적어도 80 ％의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어진 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA일 수도 있다.
표준 물질로서 이용되는 복제 가능한 DNA는 내재성 DNA 및 GM 소맥의 계통 특이적 DNA를 삽입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 pBR계 벡터(예; pBR322, pBR328 등), pUC계 벡터(pUC19, pUC18 등), λ페이즈계 벡터(λgt10, λgt11 등), 이들에 개변을 가한 시판되고 있는 벡터 등을 사용할 수 있다.
GM 소맥을 검출하는 경우는, 유전자 재조합에 의해 보통 소맥 게놈에 삽입된 외래 DNA 서열만을 증폭하여 검출하는 것은 아니고, 외래 DNA 서열의 상류 및 하류의 내재성 서열을 포함하는 영역을 증폭할 필요가 있다. 다른 작물에도 동일한 외래 DNA 서열을 삽입하여 GMO를 제조하는 경우가 있기 때문에, 외래 DNA 서열만 검출하면 GM 소맥 유래인지, 다른 작물의 유전자 재조합체인지를 판별할 수 없기 때문이다. 따라서, GMO 계통 특이적 서열을 검출하기 위한 프라이머는, 각 계통의 GM 소맥에 삽입된 외래 DNA 서열과 그의 상류 및 하류의 내재성 서열을 포함하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머일 필요가 있다. 이러한 프라이머는, 예를 들면 대두에 대해서 보고된 상기 코펠 등의 방법 및 뷔르츠(Wurz) 등의 방법(Wurz, A. et al.; 2nd Status report. BgVV, BgVV-Heft, 1/199797, 118), 또는 그것에 준한 방법에 따라서 제조된다. 상기 표준 물질에 삽입되는 GM 소맥의 각 계통에 특이적인 서열은 이들의 프라이머로 증폭할 수 있는 DNA 서열이 선택된다.
표준 물질에 삽입하는 소맥 내재성 DNA와, GM 소맥 특이적 DNA가 결정되면 보통 소맥 게놈 또는 GM 소맥 게놈을 주형으로 한 PCR을 행하여 내재성 DNA 및 GM 소맥 특이적 DNA를 클로닝하고, 클로닝한 DNA 단편과 상기 복제 가능한 DNA의 클로닝 사이트를 동일한 제한 효소로 절단함으로써, DNA 단편을 복제 가능한 DNA의 절단된 부위에 연결할 수 있다. 제한 효소는 자체 공지된 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있고, 예를 들면 EcoRI, SpeI, EcoRV, SmaI, SacI, NotI, HindIII, XhoI 등이 이용된다.
이와 같이 하여 제조된 표준 물질을 포함하는 용액에 대해서, 2종 이상의 희석 계열을 만들고, 각각에 대하여 정량적 PCR을 행하면 소맥 내재성 DNA 서열, GMO 특이적 DNA 서열의 부분 영역의 각각에 대하여 검량선을 구할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 표준 물질은 정성 PCR에서의 소맥 내재성 DNA 서열 또는 GMO 특이적 DNA 서열의 양성 대조군으로서도 이용할 수 있다.
본 발명은 상술한 표준 물질을 이용한 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 피검 시료 중에서의 GM 소맥의 혼입율을 결정하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 상술한 표준 물질을 이용하여 특정한 서열의 검량선을 구하는 공정과, 피검 시료에 대해서 검량선을 구할 때와 동일한 조건으로 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하여, 소맥 내재성 DNA 서열의 부분 영역 및 GM 소맥 특이적 DNA 서열의 부분 영역을 증폭하고, 검량선을 이용하여 피검 시료 중에 존재한 소맥 내재성 DNA 서열의 부분 영역 및 GM 소맥 특이적 DNA 서열의 부분 영역의 분자수를 구하는 공정을 포함한다.
피검 시료에 있어서의 GM 소맥의 혼입율을 계산하는 경우는, 우선 피검 시료 중 GM 소맥 특이적 DNA 서열의 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열의 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A를 구한다. 또한, 유전자 재조합 소맥의 표준 종자를 이용한 정량적 PCR을 행하여 구해지는 GM 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA 서열의 부분 영역의 분자수를 소맥 내재성 DNA 서열의 부분 영역의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 구한다. 그리고 수학식 100×A/B를 계산하여 피검 시료 중 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정하는 공정을 행함으로써 구할 수 있다. 상기 비 B는 비특허 문헌 1에 있어서 "내표비"라 불리는 것으로, 순수한 GM 계통마다 종자로부터 추출한 DNA 중 (재조합 유전자)/(내재성 유전자)의 비율이다. 내표비는 각 재조합 계통 종자 중에서 일정한 비율을 나타낸다.
본 발명에 따른 GM 소맥 혼입율의 결정 방법에 있어서 행해지는 각 PCR 공정은 개별적으로 실시할 수 있지만, 동시에 실시할 수도 있다. 또한, 각 PCR 공정은 검량선을 제조하기 위해서 행한 PCR과, 대략 동일한 속도로 핵산의 증폭 반응이 발생하는 조건으로 행하는 것이 바람직하다. 이러한 조건으로는, 예를 들면 검량선을 제조하기 위해서 행한 PCR과 온도 및 사이클을 동일하게 하는 조건을 들 수 있다. 또한, GM 소맥의 혼입율의 산출은 내재성 DNA와 재조합 DNA의 양을 개별적으로 측정하여, 그 측정 결과로부터 산출할 수도 있지만, 비특허 문헌 1의 방법에 따라서 실시간 PCR 장치에 의해 증폭하고, GM 소맥의 혼입율을 산출하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서 "재조합 DNA"란, 인위적으로 소맥에 도입한 임의의 외래성 DNA이고, 예를 들면 외래성 유전자를 코드하는 영역, 미전사 또는 미번역 영역, 링커 영역, 벡터 부분의 DNA를 의미한다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로 한정되지 않고, 여러가지 실시 형태가 가능하며, 본 발명은 본 명세서 및 도면에 개시된 사상에 따른 것인 한, 모든 실시 형태를 포함하는 것은 이해되어야 한다.
또한, 이하의 실시예에 있어서는, 다음에 나타내는 시료, 시약 및 장치를 사용하였다.
(1) 시료
소맥(Triticum aestivum)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 행 크(Hank), 스칼렛(Scarlet), 타라(Tara), 이어라로조(YearaRojo), 핀치(Finch), 류자인(Lewjain), 로드(Rod), 웨더포드(Wheatherford), 에스티카(Estica), 부캐넌(Buchanan), 핀리(Finley), 갈란드(Garland), TAM107, 데클로(Declo), 핫튼(Hatton), 모건(Morgan), 닐리(Neely), 램프(Ramp), 아미돈(Amidon), 어네스트(Ernest), 맥닐(Mcneal), AC-배리(AC-Barrie), AC-스플렌더(AC-Splender), CDC-틸(CDC-Teal), 로라(Laura), 니시카제, 니시호나미, 치크고이즈미, 쯔가루 HDC, 시로가네, 시라사기, 비호로 HDN, 호쿠신, 반도우와, 키타 HDI, 농림 61호는 하쯔모찌, 모찌오토메, 관동 107, 백화.
듀럼 소맥(Triticum durum)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: AC 네비게이터(AC Navigator)종.
옥수수(Zea mays)는, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 덴트콘.
대두(Glycine max)는, 다음 건조 종자를 이용하였다: 유전자 재조합 대두 라운드업 레디 소이(Roundup Ready Soy) 계통후대 품종.
쌀(Oryza sativa)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 코시히카리종.
대맥(Hordeum vulgare)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 벤케이종.
귀리(Avena sativa)는, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 시판 품종.
호밀(Secale cereale)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 시판 품종.
유채씨(Brassica napus)는, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 카놀라종.
좁쌀(Setaria italica Beauvois)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 찰좁쌀종.
수수(Panicum miliaceum Panicum)는, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 찰수수종.
마일로(Sorghum subglabrescens)는, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 시판품.
메밀(Fagopyrum esculentum)은, 다음 품종의 건조 종자를 이용하였다: 재래 품종.
(2) 시약
(2-1) 시료로부터의 DNA 추출에는 이하의 시약을 사용하였다.
라우릴황산나트륨(SDS)(시약 특급)(시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co.))
퀴아젠 DNeasy 플랜트 맥시 키트(퀴아젠 게엠베하)
퀴아젠 DNeasy 플랜트 미니 키트(퀴아젠 게엠베하)
DNA의 전기 영동에는 이하의 시약을 사용하였다.
아세트산(시약 특급)(와코 쥰야꾸: 와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
트리스[히드록시메틸]아미노메탄(트리스)(시약 특급)(시그마 케미컬사)
에틸렌디아민사아세트산(EDTA)(시약 특급)(시그마 케미컬사)
아가로스 분말 "LO3「다카라」"(다카라 슈즈오사(TaKaRa Shuzo Co., Ltd.))
에티듐브로마이드(시그마 케미컬사)
브롬페놀블루(시그마 케미컬사)
크실렌시아놀(시그마 케미컬사)
DNA 마커 "1 kb 래더"(뉴 잉글랜드 바이오랍사(New England Biolabs Inc.))
DNA 마커 "100 bp 래더"(뉴 잉글랜드 바이오랍사)
(2-2) 정성적 PCR에는 이하의 시약을 사용하였다.
DNA 폴리머라제 "AmpliTaq 골드(AmpliTaq Gold)"(어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems))
×10 PCR 버퍼 II(어플라이드 바이오시스템)
(2-3) 플라스미드 제조·정제에는 이하의 시약을 사용하였다.
DNA 폴리머라제 "AmpliTaq 골드"(어플라이드 바이오시스템)
×10 PCR 버퍼 II(어플라이드 바이오시스템)
DNA 폴리머라제 "KOD"(도요보사(도요보 Co., Ltd.))
×10 PCR 버퍼 II(도요보사)
TOPO TA 클로닝 키트 (TOP10F' 세포 함유)(인비트로젠사(Invitrogen Co.))
효모 엑기스 트랙트(디프코 라보레토리(Difco Laboratories))
트립톤 펩톤(디프코 라보레토리)
NaCl(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
아가로스 분말(다카라 BIO)
D[-]-α-아미노벤질페니실린(암피실린)나트륨염(시그마 케미컬사)
퀴아젠 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠 게엠베하)
에탄올(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))
2-프로판올(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
트리스[히드록시메틸]아미노메탄(트리스)(시약 특급)(시그마 케미컬사)
에틸렌디아민사아세트산(EDTA)(시약 특급)(시그마 케미컬사)
제한 효소 "EcoRI"(다카라 슈즈오사)
제한 효소 "SacI"(뉴 잉글랜드 바이오랍사)
제한 효소 "XbaI"(뉴 잉글랜드 바이오랍사)
칼프 인테스티날 알카라인 포스파타제(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(인비트로젠(Invitrogen))
페놀(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
클로로포름(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
이소아밀알코올(시약 특급)(와코 퓨어 케미컬 인더스트리사)
(2-4) 정량적 PCR에는 이하의 시약을 사용하였다.
TaqMan 유니버설 PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템)
(3) 장치
(3-1) 시료로부터의 DNA 추출에는 이하의 장치를 사용하였다.
분쇄기 "멀티 비즈 쇼커 MB301"(야스이 기까이사(Yasui Kikai Co.))
(3-2) DNA의 전기 영동에는 이하의 장치를 사용하였다.
전기 영동 장치 "머피드 2"(어드번스드사(Advance Co., Ltd))
(3-3) 정성적 PCR에는 이하의 장치를 사용하였다.
서멀사이클러 "PTC-200"(MJ 리서치사(MJ Research Inc.))
(3-4) 정량적 PCR에는 이하의 장치를 사용하였다.
정량적 PCR 장치 "ABI PRISM 7700 시퀀스 디텍터 시스템"(어플라이드 바이오시스템)
또한, 프라이머 및 프로브의 합성은 오퍼론(Operon)사에 위탁하였다.
[실시예 1] 플라스미드의 구축
어네스트 품종 소맥 종자로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이 DNA를 주형에 PCR을 행하였다. 증폭 대상은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 소맥 내재성 유전자 후보 2종(PRP 유전자 및 왁시 유전자)과, 가상 GM 소맥 유전자로서 RRS 유전자에 대해서 실시하였다. 사용한 프라이머를 하기 표 2에 나타낸다. 또한 RRS 유전자란, 후술하는 바와 같이 라운드업 내성 유전자이다.
이어서, 얻어진 증폭 DNA를 주형에 제한 효소 부가 프라이머를 이용하여 재차 PCR을 행하였다.
그리고 얻어진 증폭 DNA는 제한 효소 절단 후, 정제 단편을 pUC19 벡터에 라이게이션하고, 이것을 대장균으로 형질 전환하였다. 또는 벡터 pCR4에 TA 클로닝하였다.
얻어진 클론은 제한 효소 맵핑에 의해 삽입 단편을 확인한 후, 시퀀싱에 의해 전체 서열의 확인을 행하였다.
TA 클로닝한 각 클론을 제한 효소로 절단한 후, 정제 단편을 pUC19 벡터에 라이게이션하고, 이것을 대장균으로 형질 전환하였다.
형질 전환체로부터 플라스미드를 추출 정제하고, 서열을 확인하였다.
이상의 흐름에 의해 플라스미드를 구축하였다. 구체적으로는 제한 효소 부가 프라이머를 이용하여 증폭한 왁시 D1 영역을 XbaI로 절단한 후, 이것을 동일하게 XbaI로 절단한 후 탈인산화한 pUC19에 라이게이션하고, pWIG01을 구축하였다.
PCR 증폭한 RRS 유전자를 일단 TA 클로닝하고, 얻어진 플라스미드 pRRS를 EcoRI, SacI로 절단하고, RRS 단편을 정제하였다. 동일하게 pWIG01을 EcoRI, SacI로 절단하고, 플라스미드를 정제 후, 여기에 RRS 단편을 라이게이션하고, pWIG02를 구축하였다.
PCR에 의해 증폭한 PRP 영역을 일단 TA 클로닝하고, 얻어진 플라스미드 pPRP를 EcoRI로 절단하고, PRP 단편을 정제하였다. 동일하게 pWIG02를 EcoRI로 절단하고, 탈인산화 후, 여기에 PRP 단편을 라이게이션하고, pWIG03을 구축하였다.
구축한 플라스미드는 시퀀싱을 행하고 삽입 서열을 확인하였다. 확인된 서열은 전부 목적 서열과 일치하였다.
또한, 실시예 1 내지 3에 있어서 이용한 각 방법을 이하에 구체적으로 나타낸다.
(1) 제한 효소 절단
각 제한 효소 메뉴얼에 따라서 실시하였다. 즉, 각 DNA 용액과 효소에 첨부한 ×10 버퍼, 증류수, 제한 효소를 혼합하고, 통상 37 ℃ 2 시간 동안 반응하였다.
(2) 절단 후의 DNA 단편 정제
아가로스겔 전기 영동으로 분리하였다. 겔로부터의 정제는 퀴아젠사 제조 키트를 사용하였다. 즉, 목적 DNA를 포함한 겔을 가열 융해하고, DNA를 실리카막에 결합시켰다. 실리카막을 에탄올을 포함하는 용액 등으로 세정한 후, 증류수로 용출하였다.
(3) 제한 효소 절단 플라스미드의 탈인산화
제한 효소 절단 후 탈염 처리한 플라스미드를 CIAP(지브코(GIBCO)사 제조)와 전용 버퍼를 혼합하여 37 ℃ 30 분간 반응하였다. 반응 후 페놀 처리에 의해 CIAP를 실활시키고, 에탄올 침전으로 탈인산화 플라스미드를 회수하였다.
(4) DNA 라이게이션
다카라사 제조 DNA 라이게이션 키트 Ver.2를 사용하였다. 즉, 목적 DNA를 혼합하고, 키트의 반응 혼합액(soln I)을 등량 첨가하고, 16 ℃에서 30 분간 정치함으로써 DNA를 라이게이션하였다.
(5) 형질 전환
도요보사 제조 컴피턴트 셀(Competent Cell) E. coli DH5α를 사용하였다. 융해시킨 10 내지 50 ㎕에 컴피턴트 셀을 빙상에서 DNA와 30 분간 혼합 정치하고, 42 ℃에서 50 초간 히트 쇼크 후, 빙상으로 복귀시키고, 2 분 후 37 ℃로 따뜻하게 둔 SOC 배지를 450 ㎕ 첨가, 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅하였다. 이 용액을 서클글로 배지 Amp + 플레이트에 100 ㎕/플레이트로 전개하고, 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다.
(6) 배양
플라스미드 정제의 목적에서의 배양은 배지 서클글로를 이용하여 실시하였다. 플라스미드 생산의 선택압에는 Amp 내성을 이용하고, 최종농도 100 ㎍/㎖의 암피실린을 이용하였다. 배양은 시험관 진탕기에서 37 ℃, 14 내지 16 시간 동안 행하였다.
(7) PCR
어플라이드 바이오시스템사 제조 AmpliTaq 골드 폴리머라제를 사용하였다. 반응 조성으로는 하기 표 3의 조성을 이용하였다. 반응 조건은 하기 표 4와 같이 실시하였다.
(8) TA 클로닝
TA 클로닝은 인비트로젠사 제조 TOPO TA 클로닝 시스템을 이용하고, 동사 메뉴얼에 따라서 실시하였다.
(9) DNA 시퀀싱
DNA의 시퀀싱은 벡맨 콜터사 제조 CEQ8000을 이용하고, 동사 메뉴얼에 따라서 실시하였다. 키트로서 동사 DTCS 퀵 스타트 마스터 믹스를 이용하였다.
(10) 실시간 PCR SYBR법
다카라사 제조 키트(다카라 SYBR 프리믹스 Ex TaqTM(퍼펙트 리얼 타임(Perfect Real Time)) 코드번호: RR041A)를 이용하여 행하였다.
1) 템플레이트 DNA(플라스미드)를 하기 표 5에 따라서 희석하였다(희석에는 ColE1 5 ng/㎕ 용액을 이용하였다).
2) 미지의 DNA는 10배로부터 2배의 희석열로 각 4점 제조하였다(희석에는 ColE1 5 ng/㎕ 용액을 이용하였다).
3) 마스터 믹스는 표 5에 따라서 프라이머마다 제조하였다.
4) 마스터 믹스와 템플레이트 DNA를 혼합하였다.
5) 하기 표 6에 나타내는 조건으로 반응을 개시하였다.
(11) 실시간 PCR TaqMan법
다카라사 제조 키트(다카라 프리믹스 Ex TaqTM(퍼펙트 리얼 타임) 코드번호: RR039A)를 이용하여 행하였다.
1) 각종 게놈의 DNA 농도를 희석하지 않고 템플레이트로 하였다.
2) 마스터 믹스는 하기 표 7에 따라서 프리믹스, ROX, 프라이머, 프로브를 혼합하여 제조하였다.
3) 마스터 믹스 16 ㎕/웰과 템플레이트 DNA 4 ㎕/웰을 혼합하였다.
4) 하기 표 8에 나타내는 조건으로 반응을 개시하였다.
템플레이트 DNA(플라스미드)는 하기 표 9에 따라서 희석하였다(희석에는 ColE1 5 ng/㎕ 용액을 이용하였다).
(12) 종자의 분쇄 소량의 경우
상술한 분쇄기 멀티 비즈 쇼커 MB301을 사용하였다.
1) 2 ㎖ 튜브에 종자를 1알 넣고, 금속 콘을 넣어 뚜껑을 덮었다.
2) 2000 rpm으로 10 초간의 분쇄를 2회 행하였다.
3) 분쇄된 분말로부터 직접 DNA를 추출하였다.
(13) 종자의 분쇄 대량의 경우
밀을 이용하여 행하였다.
1) 밀에 종자를 30 g 넣고, 뚜껑을 덮었다.
2) 30 초간의 분쇄를 2회 행하였다.
3) 분쇄된 분말을 보관하였다.
(14) 게놈 DNA의 제조
퀴아젠사 제조 키트(퀴아젠 플랜트 미니 키트)를 이용하여 행하였다. 조작은 키트 메뉴얼에 따라서 실시하였다.
1) 분쇄 종자에 400 ㎕의 AP1 용액, 4 ㎕의 RNaseA를 첨가하고, 교반하였다.
2) 65 ℃에서 10 분간 인큐베이팅하고, 인큐베이팅 중 2, 3회 믹스하였다.
3) 130 ㎕의 AP2를 첨가하고, 교반 후 10 분간 빙상에서 방치하였다.
4) 원심 분리(15000 rpm=20000 g, 5 분, RT)를 행하였다.
5) 상청을 QIAshredder에 전량 제공하고, 원심 분리(15000 rpm, 2 분, RT)를 행하였다.
6) 경사분리로 통과된 상청을 별도 용기에 옮기고 1.5 용적(675 ㎕)의 AP3/E 첨가 교반하였다.
7) 절반량을 스핀 칼럼에 제공하고, 원심 분리(10000 rpm, 1 분, RT)를 행하였다.
8) 유출물을 버리고 잔량을 동일하게 처리하였다.
9) 새로운 튜브에 칼럼을 놓고, 500 ㎕의 AW를 첨가하고, 원심 분리(10000 rpm, 1 분, RT)를 행하였다.
10) 동 처리 후, 유출물을 버려 원심 분리(15000 rpm, 2 분, RT) 1.5 ㎖의 새로운 튜브에 칼럼을 놓고 50 ㎕의 AE를 첨가하고, 실온 방치 5 분 후, 원심 분리(10000 rpm, 1 분, RT)를 행하였다.
이하, 상술한 공정을 반복하였다.
(15) DNA의 정량
기기는 GeneSpec을 사용하고, 메뉴얼에 따라서 실시하였다.
셀은 5 mm, 희석율 1배, 대조는 키트 용출액(AE)으로 하였다.
[실시예 2] PCR 증폭 효율의 확인
PRP, 왁시의 각 유전자의 각각 증폭 영역에 대해서 표준 플라스미드 pWIG03을 주형으로 SYBR법에 의해 실시간 PCR을 실시하였다. 그 결과 모든 유전자, 모든 PCR 영역에서 동일한 조건하에 있어서, 주형 농도 의존적인 증폭이 확인되었다. 증폭산물의 융해 곡선을 확인한 바 모든 산물이 고융점의 메인 피크를 갖고, 프라이머 이량체의 형성도 관찰되지 않았다. 증폭 곡선과 융해 곡선을 도 2에 도시한다. 또한, 실시예 2 이후에 사용한 프라이머 서열의 일람을 하기 표 10에 나타낸다.
[실시예 3] PRP 유전자 중 증폭 영역의 검색
PRP 유전자 중, 소맥 품종에 의해 검출량의 변동이 없는 영역의 검색을 행하였다. 양성 대조로서 왁시 유전자를 이용하고, Wx012 증폭 영역의 검출량에 비하여 동등한 검출이 얻어지는 영역을 검색하였다. 프라이머쌍으로서, 표 10에 표시되는 PRP01-F와 PRP01-R, PRP03-F와 PRP03-R, PRP03-F와 PRP07-R 각각을 이용하여 소맥 종자로부터 추출한 DNA를 주형에 SYBR법에 의해 실시간 PCR을 실시하였다.
결과, 도 3에 도시한다. PRP03-F와 PRP03-R, PRP03-F와 PRP07-R의 프라이머쌍을 이용한 경우는 Wx012와 거의 동일한 정도의 검출량이 확인되었다. 그러나 PRP01-F와 PRP01-R을 프라이머에 이용한 경우는 WxO12의 대략 3배량 검출되었다.
이에 따라 PRP 유전자의 상류 영역(번역 후의 단백질 서열로서 아미노 말단측)에 상동인 유전자가 소맥 DNA에 존재하고, 해당 상류 영역은 내재성 DNA로서 바람직하지 않은 것이 확인되었다.
[실시예 4] 프로브의 검색
실시예 1 내지 3까지의 검토에 의해 내재성 유전자의 PCR 증폭 영역으로서 PRP04-F에서 PRP06-R까지의 영역이 바람직한 것이 확인되었다. 따라서, 이 영역에 대하여 각종 프라이머쌍에 적합한 프로브를 설계하였다. 프로브의 설계는 프라이머 설계 지원 소프트, 프라이머 익스프레스, 또는 Primer3(프라이머3 및 프라이머3 웹 사이트 개발은 R01-HG00257(데이비드 씨. 페이지(David C. Page)) 및 P50-HG00098(에릭 에스. 랜더(Eric S. Lander))의 기금으로 하워드 휴즈 의학 연구소(Howard Hughes Medical Institute) 및 국립 건강 연구소(National Institute fo Health), 국립 인간 게놈 연구소(National Human Genome Research Institute)에 의해 지원받았음.: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/Primer3/Primer3_www.cgi)를 사용하였다. 설계한 프로브 서열로부터 형광 표지 프로브를 합성하였다. 형광 표지는 5' 말단에 FAM을, 3' 말단에 TAMM을 표지하였다. 이 프로브를 이용하여 표준 플라스미드를 주형에 TaqMan법에 의한 실시간 PCR의 조건 설정을 행하였다. 최적의 조건을 발견한 후, 각종 프라이머(표 10 참조), 각종 프로브의 조합에 의한 비교를 행하였다. 그 결과 어느 조합에 있어서도 양호한 증폭이 얻어졌고, 각각 동일한 정도의 검출 효율이었다.
설계한 프로브 서열을 하기 표 11에 나타낸다. 또한, 각종 프라이머를 이용하여 얻어진 결과를 도 4에 도시한다.
[실시예 5] 실시간 PCR의 조건 설정
실시예 1에 있어서의 실시간 PCR법에 따라서, 실시예 4에 기재된 프로브를 이용하고, 프라이머 농도, 프로브 농도, PCR 반응 온도, 시간에 대한 각 파라미터를 변화시켜 최적 조건을 발견하였다. 선택된 조건을 하기 표 12 및 13에 나타낸다.
[실시예 6] 소맥 품종에 있어서의 보편성의 확인
소맥 품종 40종에 대해서, TaqMan법에 의한 실시간 PCR에 의해, 그 검출량의 비교를 행하였다. 비교 대조는 프라이머 Wx012-F 및 Wx012-R의 증폭산물 Wx012(서열번호: 31)로 하였다. 이용한 프라이머는 PRP03-F와 PRP03-R, 프로브는 PRPTaq-1을 이용하였다. 40 종류 모두에서 프라이머 PRP03-F와 PRP03-R에 의한 증폭산물 PRP03(서열번호: 15)이 검출되었다. Wx012는 듀람종, 떡소맥종을 제외한 모두에서 검출되었다. Wx012의 검출된 품종으로 PRP03과 비교한 결과, 모든 품종에 있어서 거의 Wx012:PRP03=1:1의 비율이었다.
PRP03이 검출된 40 종류 중 20 종류의 소맥 품종에 있어서의 검출예를 도 5에 도시한다. 도 5 중, 하쯔모찌, 모찌오토메는 찰밀 품종을 나타내고, AC-나비는 듀럼 소맥 품종 AC 네비게이터를 나타낸다. 이들은 모두 검출되었다.
[실시예 7] 가상 CM 소맥에 의한 혼입율 추정 시험
현 시점에 있어서 GM 소맥은 몬산토(Monsanto)사 등에 의해 생산되고 있지만, 모두 입수 곤란하다. 그래서 GM 소맥의 혼입율 추정이 본 발명에 의해 발견된 소맥 내재성 유전자 정량에 의해 가능한지 확인할 목적으로, 가상 GM 소맥을 이용하여 실험을 행하였다.
몬산토사가 만들어낸 GM 소맥은 라운드업 내성 유전자를 부여한 것이기 때문에, 동일하게 라운드업 내성 유전자를 부여한 GMO인 GM 대두를 사용하는 것으로 하였다. 즉, GM 대두 종자를 분쇄하고, 이것과 AC 배리 품종 소맥 종자를 분쇄한 것을 혼합하고, 이것을 가상 GM 소맥으로 하였다. 양자의 혼합율은 예비 시험에 의해 내표비가 1에 근접하도록 검토하고, GM 대두:소맥=6:94로 혼합하였다. 이 가상 GM 소맥으로부터 추출한 DNA를 주형에 실시예 5에 나타낸 조건하에 TaqMan 프로브에 의한 실시간 PCR법(프로브로서 PRP-Taq2, 프라이머로서 하기 표 14에 기재된 것을 이용하였다. 표 중, RRS는 라운드업 내성 유전자를 나타냄)으로 라운드업 내성 유전자 및 내재성 유전자(PRP 영역)의 정량을 행하였다. 이 때 증폭되는 서열을 서열번호: 32에 나타낸다. 얻어진 RRS 정량값을 소맥 내재성 유전자 정량값으로 나눈 수치를 내표비(1.0)로 하였다.
이 가상 GM 소맥과 별도로 분쇄한 소맥(이어라로조 품종)을 임의로 혼합한 표품으로부터 DNA를 추출하고, 이 DNA를 주형에 본 발명의 방법에 따라서 소맥 내재성 유전자와 라운드업 내성 유전자의 정량을 행하였다. 그 결과를 이용하여 가상 GM 소맥의 혼입율을 구한 결과를 도 6에 도시한다. 실제 배합율과, 본 발명의 방법에 따라서 계산에 의해 구한 혼입율이 높은 상관성을 나타내는 것이 확인되었다. 즉, 얻어진 주형 액량당 GM 소맥 검출량(복제수 농도: 복제수/㎕)을 소맥 내재성 유전자의 주형 액량당 검출량(복제수 농도: 복제수/㎕)으로 나누고, 그 몫을 내표비 1.0으로 나눈 몫을 100배 한 값을 GM 혼입율로 하였다.
[실시예 8] 특이성의 확인 시험
본 발명에 의한 방법이 다른 작물과 교차성을 갖지 않는 것을 확인할 목적으로 특성 시험을 실시하였다. 다른 작물로는 대맥, 귀리, 호밀, 쌀, 마일로, 유채씨, 옥수수, 메밀, 좁쌀, 수수를 이용하였다. 이들 작물로부터 DNA를 추출하고, 실시예 5에 나타내는 방법에 의해 확정한 조건으로 이들 DNA를 주형에 실시간 PCR을 행하였다. 프라이머쌍으로는 PRP03-F와 PRP03-R, PRP03-F와 PRP07-R의 2종을, 프로브는 PRP-Taq2를 이용하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. PRP03-F와 PRP07-R을 프라이머쌍에 이용한 경우, 소맥으로는 DNA 1 ㎍당 140 복제수가 검출되는 것에 대하여, 이들 작물로는 0.2 복제수 이하였다. 즉, 이들 작물의 비특이적 검출율은 0.05 ％ 이하이고, 소맥 검출에 있어서의 표준 오차를 훨씬 하회하기 때문에, 이들 작물이 소맥 내재성 유전자의 정량에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다. PRP03-F와 PRP03-R을 프라이머쌍에 이용한 경우는 대맥에서 소맥에 대하여 0.3 ％의 검출이 보였지만, 그 밖의 작물은 0.05 ％ 이하였다. 따라서, 이 프라이머쌍을 이용한 경우도, 소맥 검출에 있어서의 표준 오차를 훨씬 하회하고, 이들 작물이 소맥 내재성 유전자의 정량에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.
[도 1] 서열번호: 2에 있어서의 서열번호 3 내지 8에 기재된 프라이머의 결 합 영역을 나타낸다.
[도 2] PRP, 왁시의 각 유전자의 각각 증폭 영역에 대해서 표준 플라스미드 pWIG03을 주형에 SYBR법에 의해 실시간 PCR을 실시했을 때의 증폭 곡선과 융해 곡선을 나타낸다.
[도 3] 표 10에 나타내는 PRP01-F와 PRP01-R, PRP03-F와 PRP03-R, PRP03-F와 PRP07-R 각각을 이용하고, 소맥 종자로부터 추출한 DNA를 주형에 SYBR법에 의해 실시간 PCR을 실시한 결과를 나타낸다.
[도 4] 표 11에 나타내는 각종 프라이머의 조합을 이용한 실시간 PCR의 검출 효율을 나타낸다.
[도 5] PRP03이 검출된 40 종류 중 20 종류의 소맥 품종에 있어서의 검출예를 도시한다.
[도 6] 이 가상 GM 소맥과 별도로 분쇄한 소맥(이어라로조 품종)을 임의로 혼합한 표품으로부터 DNA를 추출하고, 이 DNA를 주형에 본 발명의 방법에 따라서 소맥 내재성 유전자와 라운드업 내성 유전자의 정량을 행한 결과를 이용하여 가상 GM 소맥의 혼입율을 구한 결과를 나타낸다.
[도 7] 프라이머쌍으로는 PRP03-F와 PRP03-R, PRP03-F와 PRP07-R의 2종을, 프로브는 PRP-Taq2를 이용하여 행한 다른 작물과의 교차성의 확인 시험의 결과를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> NISSHIN SEIFUN GROUP INC.
<120> Method for detecting and quantifying wheat endogenous DNA sequence
<130> N0419VP01PCT
<150> JP 2006-135835
<151> 2006-05-15
<160> 34
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1487
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(122)
<223> the region amplified by primers PRP01-F and PRP01-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (1158)..(1487)
<223> the region to be amplified for the method of the present inventio
n
<400> 1
ggcgacaccc catccacttt atctcagttg agaggtttag aagcgcgcgg tgaagcacaa 60
agtgcagcaa gagctgcgag aaggagcgag cagcaatggc gaggcacagc ctccttgccg 120
tgctcctcgt cgggctggtc gcggcctccg gcttcagcca ggcggccgcc gctggccggg 180
gccttgctga gaagctcccc gagccggagc ccaagccgac gccgtaccca gagcccaagc 240
cgcaacccaa gccagagcca atgcctaagc ctgaacccat gccaaagcca gagcctaagc 300
ctctgcctaa acctgaaccc atgccaaaac cagagcctaa gcctctgccc aaacctgaac 360
ccatgccaaa gccagagccc aaaccggagc cgaagccgga gccgatccca aagcccgaac 420
caaagcctga gcccaagcct gacccgatgc ccaaacctga gcctaagcct gagcccaagc 480
cagagccgat gcccaaaccg gaaccaaagc cagagcccaa gcccgagcct atgccaaaac 540
ctgaaccaaa gcccgagccc aaacccgagc cgatgaagcc tgagcctaag ccgatgccaa 600
aacccgaacc gaagccagag cccaagcccg agccgatgcc taaaccagaa ccaaagccag 660
agcccaaacc cgagccgata aagcctgagc ctaagccgat gccgaaaccc gaacctaagc 720
cagagcccaa gcctgagccg atgccaaaac cggaacccaa gcctgagccc aagcctgagc 780
cgatgccaaa accggagccc aagcccgagc ccaagcccga gccgatgcca aaaccggaac 840
caaagcctga gcccaagcct tacccaatgc ccaaacctga gcctaagcct gagcccaaac 900
ccgagccgat gcccaaacca gaaccaaagc cagagcccaa acccgagccg atgccaaagc 960
cggaaccaaa gccagagccc aaacccgagc ccaagccaga gccgatgcca aagccggaac 1020
caaagcccga gcccaagccc gagccaatgc cgaagccaga accgaagcca gagcccaagc 1080
ctgagccgat gccaaagcca gagcctaagc ccaaaccatt gcctaaacca gagcctaagc 1140
ctgaacctat gcctaagcca gagcccaagc ctgagcccga accgaagccg gagccgcctc 1200
cgaagggcaa gccaccgatg actgacaatt gatgtgatac tcacatatga cagctgaagg 1260
aggagatcga ccccgtccgg agccacgatg tgctatttct agaataagtg gcatagtatc 1320
cggttagcga gatagtgatg atgcatcttt ttgtattcct tgtattccac cattcctttt 1380
agtttctgtt gttccatgca cccatgatga gtactactat tctgtaatta tcatttgcgt 1440
gttggtatat gttcatctgt gcacatgact cagttgttct ttcgtgt 1487
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region to be amplified for the method of the present inventio
n
<400> 2
ccagagccca agcctgagcc cgaaccgaag ccggagccgc ctccgaaggg caagccaccg 60
atgactgaca attgatgtga tactcacata tgacagctga aggaggagat cgaccccgtc 120
cggagccacg atgtgctatt tctagaataa gtggcatagt atccggttag cgagatagtg 180
atgatgcatc tttttgtatt ccttgtattc caccattcct tttagtttct gttgttccat 240
gcacccatga tgagtactac tattctgtaa ttatcatttg cgtgttggta tatgttcatc 300
tgtgcacatg actcagttgt tctttcgtgt 330
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP03-F
<400> 3
aagccaccga tgactgacaa t 21
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP07-R
<400> 4
cgcaaatgat aattacagaa tagtagtac 29
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PRP primer PRP04-F
<400> 5
gcctccgaag ggcaagc 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP06-R
<400> 6
gaacatatac caacacgcaa atg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP03-R
<400> 7
cgctaaccgg atactatgcc a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP04-R
<400> 8
atagcacatc gtggctccgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR probe PRP-Taq1
<400> 9
tcgaccccgt ccggagccac 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR probe PRP-Taq2
<400> 10
agctgaagga ggagatcgac ccc 23
<210> 11
<211> 231
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP03-F and PRP07-R
<400> 11
aagccaccga tgactgacaa ttgatgtgat actcacatat gacagctgaa ggaggagatc 60
gaccccgtcc ggagccacga tgtgctattt ctagaataag tggcatagta tccggttagc 120
gagatagtga tgatgcatct ttttgtattc cttgtattcc accattcctt ttagtttctg 180
ttgttccatg cacccatgat gagtactact attctgtaat tatcatttgc g 231
<210> 12
<211> 244
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP04-F and PRP07-R
<400> 12
gcctccgaag ggcaagccac cgatgactga caattgatgt gatactcaca tatgacagct 60
gaaggaggag atcgaccccg tccggagcca cgatgtgcta tttctagaat aagtggcata 120
gtatccggtt agcgagatag tgatgatgca tctttttgta ttccttgtat tccaccattc 180
cttttagttt ctgttgttcc atgcacccat gatgagtact actattctgt aattatcatt 240
tgcg 244
<210> 13
<211> 246
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP03-F and PRP06-R
<400> 13
aagccaccga tgactgacaa ttgatgtgat actcacatat gacagctgaa ggaggagatc 60
gaccccgtcc ggagccacga tgtgctattt ctagaataag tggcatagta tccggttagc 120
gagatagtga tgatgcatct ttttgtattc cttgtattcc accattcctt ttagtttctg 180
ttgttccatg cacccatgat gagtactact attctgtaat tatcatttgc gtgttggtat 240
atgttc 246
<210> 14
<211> 259
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP04-F and PRP06-R
<400> 14
gcctccgaag ggcaagccac cgatgactga caattgatgt gatactcaca tatgacagct 60
gaaggaggag atcgaccccg tccggagcca cgatgtgcta tttctagaat aagtggcata 120
gtatccggtt agcgagatag tgatgatgca tctttttgta ttccttgtat tccaccattc 180
cttttagttt ctgttgttcc atgcacccat gatgagtact actattctgt aattatcatt 240
tgcgtgttgg tatatgttc 259
<210> 15
<211> 121
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP03-F and PRP03-R
<400> 15
aagccaccga tgactgacaa ttgatgtgat actcacatat gacagctgaa ggaggagatc 60
gaccccgtcc ggagccacga tgtgctattt ctagaataag tggcatagta tccggttagc 120
g 121
<210> 16
<211> 88
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP03-F and PRP04-R
<400> 16
aagccaccga tgactgacaa ttgatgtgat actcacatat gacagctgaa ggaggagatc 60
gaccccgtcc ggagccacga tgtgctat 88
<210> 17
<211> 101
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP04-F and PRP04-R
<400> 17
gcctccgaag ggcaagccac cgatgactga caattgatgt gatactcaca tatgacagct 60
gaaggaggag atcgaccccg tccggagcca cgatgtgcta t 101
<210> 18
<211> 134
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers PRP04-F and PRP03-R
<400> 18
gcctccgaag ggcaagccac cgatgactga caattgatgt gatactcaca tatgacagct 60
gaaggaggag atcgaccccg tccggagcca cgatgtgcta tttctagaat aagtggcata 120
gtatccggtt agcg 134
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP01-F
<400> 19
gcgacacccc atccacttta 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer PRP01-R
<400> 20
cacggcaagg aggctgtg 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx012-F
<400> 21
ggtcgcagga acagaggtgt 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx012-R
<400> 22
ggtgttcctc cattgcgaa 19
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer RRS-F
<400> 23
tggaaaagga aggtggctcc tac 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer RRS-R
<400> 24
gggaattgga tccggtaccg a 21
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer RRS-Sac-F
<400> 25
agagctctgg aaaaggaagg tggctcctac 30
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer RRS-Sac-R
<400> 26
gggaattgga tccggtaccg a 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx-F
<400> 27
ttttgttgtg ccgcttgcct 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx-R
<400> 28
agtttagcgc gtcacagact ca 22
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx-Xba-F
<400> 29
tctctagatt ttgttgtgcc gcttgcct 28
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PCR primer Wx-Xba-R
<400> 30
tctctagagt ttagcgcgtc acagactca 29
<210> 31
<211> 102
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<223> the region amplified by primers Wx012-F and Wx012-R
<400> 31
ggtcgcggga acagaggtgt tcaaggcggc cgaaataggt tgccgcctgc ggcggaatcg 60
ccacccaccg tgaagttcac cgtttcgcaa tggaggaaca cc 102
<210> 32
<211> 121
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> the region amplified by primers RRS-F and RRS-R; specific sequenc
e of roundup resistant gene
<400> 32
cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60
ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120
c 121
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer RRS2-F
<400> 33
cctttaggat ttcagcatca gtgg 24
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer RRS2-R
<400> 34
gacttgtcgc cgggaatg 18
Claims (14)
- 피검 시료 중의 핵산 또는 상기 피검 시료로부터 추출한 핵산을 주형으로 하고, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 연속된 80 염기 이상의 영역으로 이루어진 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 영역의 핵산을 증폭하는 공정과,상기 증폭된 핵산을 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는, 피검 시료 중 소맥 내재성 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 검출 또는 정량하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 연속된 80 염기 이상의 영역으로 이루어진 영역이 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 영역인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍이(i) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(ii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(iii) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(iv) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(v) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(vi) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(vii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및(viii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머쌍인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머쌍에 포함되는 각 프라이머가 15 내지 40 염기 길이의 핵산인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 있어서 증폭된 영역을 서열번호: 9 또는 10에 기재된 프로브를 이용하여 검출하는 방법.
- 제3항에 기재된 프라이머쌍 중 1개 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 피검 시료로부터 폴리머라제 연쇄 반응에 의해서 소맥 내재성 DNA를 검출 또는 정량하기 위한 키트.
- 유전자 재조합 소맥 및 유전자 비재조합 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA로서, 서열번호: 2에 기재된 염기 서열 또는 그의 연속된 80 염기 이상의 영역으로 이루어진 DNA와,유전자 재조합 소맥 특이적 DNA로서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열로 이루어진 1 이상의 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA.
- 제7항에 있어서, 상기 서열번호: 2에 기재된 염기 서열의 연속된 80 염기 이상의 영역으로 이루어진 DNA가 서열번호: 11 내지 18 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어진 DNA인 복제 가능한 DNA.
- 삭제
- 삭제
- 유전자 재조합 소맥 및 유전자 비재조합 소맥이 공통적으로 갖는 내재성 DNA로서, 제3항에 기재된 프라이머쌍 중 어느 하나를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시킬 수 있는 서열로 이루어진 DNA와,유전자 재조합 소맥 특이적 DNA로서, 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 서열로 이루어진 1 이상의 DNA를 포함하는 복제 가능한 DNA.
- 제7항 또는 제8항에 기재된 복제 가능한 DNA를 포함하는 용액을 이용하여 2종 이상의 농도 희석 계열을 만들고, 각각에 대하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하고, 소맥 내재성 DNA와, 1종류 이상의 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA를 증폭하고, 각 부분 영역에 대해서 검량선을 구하는 공정과,피검 시료에 대해서 상기 검량선을 구하는 공정과 동일한 조건으로 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하고, 상기 검량선을 이용하여 피검 시료 중에 존재하는 상기 소맥 내재성 DNA의 분자수와 상기 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA의 분자수를 구하는 공정을 포함하는, 피검 시료에 있어서의 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 피검 시료 중에 존재하는 상기 유전자 재조합 소맥 특이적 DNA의 분자수를 상기 소맥 내재성 DNA의 분자수로 나누어 얻어지는 비 A와,유전자 재조합 소맥의 각 계통의 표준 종자를 이용한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 행하여 구해지는 유전자 재조합 소맥의 각 계통에 특이적인 DNA의 분자수를 소맥 내재성 DNA의 분자수로 나누어 얻어지는 비 B를 이용하고,수학식 100×A/B를 계산하여 상기 피검 시료 중 유전자 재조합 소맥의 혼입율을 결정하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 소맥 내재성 DNA의 증폭을(i) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(ii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 4에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(iii) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(iv) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 6에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(v) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(vi) 서열번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍,(vii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 8에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍, 및(viii) 서열번호: 5에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산과 서열번호: 7에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산으로 이루어지는 프라이머쌍으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머쌍을 이용하여 행하는 방법.
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