KR101420478B1 - 회충, 편충, 및 구충을 검출하기 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
샘플 내에서 하나 이상의 연충 분변항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법, 장치, 키트 및 조성물을 본원에서 개시한다. 본 발명의 방법, 장치, 키트 및 조성물은 포유동물로부터의 분변 샘플에서 회충, 편충 및/또는 구충의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용될 수 있고, 또한 하나 이상의 연충 감염 사이를 구분할 수 있다. 포유동물에서 회충, 편충 및/또는 구충의 존재 또는 부재의 확인은 예를 들어, 포유동물을 치료하는 최적 과정을 선택하기 위한 목적으로 및/또는 치료가 개시된 후 포유동물에게 감염이 없어졌는지 결정하기 위한 목적으로 이루어질 수 있다.
Description
교차 참조
본원은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 61/122,260 (2008년 12월 12일 출원); 61/128,077 (2008년 5월 19일 출원); 61/128,079 (2008년 5월 19일 출원); 61/128,076 (2008년 5월 19일 출원); 61/128,099 (2008년 5월 19일 출원); 및 61/122,254 (2008년 12월 12일 출원); 및 미국 특허 출원 11/763,592 (2007년 6월 15일 출원) 및 11/763,583 (2007년 6월 15일 출원)을 기초로 한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 포유동물에서 회충, 편충 및 구충의 검출 및 구분을 위한 조성물, 장치, 키트 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 포유동물로부터의 샘플 내에서 회충 항원, 편충 항원 및 구충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한, 및 회충, 편충 및 구충 항원을 구분하기 위한 항체 및 항체 조성물, 장치, 키트 및 방법에 관한 것이다.
기생충 (연충 (helminth)) 감염은 동물에게 흔하고, 진단되어 치료되지 않으면 심각한 질병 또는 사망을 일으킬 수 있다. 기생충 감염의 진단을 위한 현재의 방법은 주로, 분변 도말표본에서 직접적으로 또는 밀도 매질 내에서 부상분리 (flotation)에 의한 충란 (ova) 및 기생충의 농축 후에 분변 샘플의 현미경 검사를 포함한다. 상기 절차가 많이 채택되기는 하지만, 방법은 심각한 단점이 있다. 이들 현미경 방법은 시간 소모적이고, 전문화된 장비를 필요로 한다. 또한, 이들 방법의 결과의 정확도는 작업자의 기술과 전문지식에 따라 많이 좌우된다. 예를 들어, 편충의 존재는 알을 찾음으로써 결정되지만, 이들은 간헐적으로 적은 수로 배설된다. 구충은 평균적인 종사자가 감염 초기에 또는 어린 동물에서 검출하기 어렵다. 현미경 검사를 이용하는 회충 진단의 특이성은 대략 50％이다.
대변 취급은 유쾌하지 않고 위험하다. 대변을 처리하기 위한 위생적이고 무해한 절차는 불편하고 종종 복잡하다. 그러한 절차는 칭량하고, 원심분리하고, 저장하는 것을 포함할 수 있고, 적합한 기기, 보호 장비 및 숙련된 기술자가 갖추어진 임상 실험실을 제외하고는 어렵다. 따라서, 분변 시험을 위해 수행하도록 요구되는 단계의 수의 임의의 감소 및 시험 작업자와 시험 물질 사이의 접촉의 임의의 감소가 바람직하다. 임상 실험실에서는 분변 내에서 다양한 바이러스, 세균, 및 비-연충 기생충 및 유기체의 검출을 위한 면역분석 방법을 이용하였다. 그러나, 분변, 전혈 또는 혈청 내에서 기생충 감염의 검출을 위한 간단한 면역분석 방법이 여전히 필요하다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 (a) 편충 또는 구충 분변항원 (coproantigen)이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; (b) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 (c) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체가 그 위에 고정된 고체 지지체를 포함하는, 샘플로부터 연충 항원, 예를 들어 분변 샘플로부터 분변항원에 특이적으로 결합하고 단리하기 위한 장치를 제공한다. 장치는 예를 들어 ELISA 장치, 예를 들어 측방 유동 면역분석 장치 또는 미세적정 플레이트 장치일 수 있고 이로 제한되지 않는다. 장치에 의해 회충, 편충 및 구충에 대해 시험될 수 있는 샘플은 분변, 소화관 점액, 뇨, 전혈, 혈청, 모유 및 전체 조직, 예를 들어 유선, 창자, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육, 및 눈으로부터의 조직을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 장치는 하나 이상의 비-충 (worm) 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 및 하나 이상의 세균으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 검출을 위한 하나 이상의 시약을 더 포함할 수 있지만, 포함할 필요는 없다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터의 샘플을 (i) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; (ii) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 (iii) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체와 접촉시키고; (b) 존재하는 경우에 샘플 내의 분변항원의 존재 하에 항체-분변항원 복합체를 형성시키고; 및 (c) 존재하는 경우에 항체-분변항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플 내에 하나 이상의 연충 항원, 예를 들어 분변 샘플로부터 분변항원의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 연충 분변항원은 예를 들어 포유동물, 예를 들어 개과동물, 고양이과동물, 돼지과동물, 소과동물, 또는 인간으로부터 얻은 샘플 내의 회충, 예를 들어 톡소카라 카니스 (Toxocara canis; T. canis), 톡소카라 카티 (Toxocara cati; T. cati), 톡소카라 비툴로룸 (Toxocara vitulorum; T. vitulorum), 톡사스카리스 레오니나 (Toxascaris leonina; T. leonina), 바일리사스카리스 프로시오니스 (Baylisascaris procyonis; B. procyonis), 아스카리디아 갈리 (Ascaridia galli; A. galli), 파라스카리스 에쿠오룸 (Parascaris equorum; P. equorum), 아스카리스 수움 (Ascaris suum; A. suum), 또는 아스카리스 룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides; A. lumbricoides), 아니사키스 심플렉스 (Anisakis simplex; A. simplex), 또는 슈도테라노바 데시피엔스 (Pseudoterranova decipiens; P. decipiens), 편충, 예를 들어 트리쿠리스 불피스 (Trichuris vulpis), 트리쿠리스 캄파눌라 (Trichuris campanula), 트리쿠리스 세라타 (Trichuris serrata), 트리쿠리스 수이스 (Trichuris suis), 트리쿠리스 트리키우라 (Trichuris trichiura), 트리쿠리스 디스콜로르 (Trichuris discolor), 및 구충, 예를 들어 안실로스토마 카니눔 (Ancylostoma caninum), 안실로스토마 브라질리엔세 (Ancylostoma braziliense), 안실로스토마 듀오데날 (Ancylostoma duodenal), 안실로스토마 세일라니쿰 (Ancylostoma ceylanicum), 안실로스토마 튜바에포르메 (Ancylostoma tubaeforme) 및 안실로스토마 플루리덴타툼 (Ancylostoma pluridentatum), 네카토르 아메리카누스 (Necator americanus), 및 운시나리아 스테노세팔라 (Uncinaria stenocephala)의 분변항원을 포함하고, 회충, 편충 및 구충 사이의 구분을 포함한다. 한 측면에서, 방법은 회충 분변항원, 편충 분변항원, 및 구충 분변항원에 대해 분변 포유동물 샘플을 시험하기 위해 수행된다. 그러나, 방법은 분변 샘플을 시험하기 위해 수행되는 것으로 제한되지 않는다. 따라서, 샘플은 분변 이외에, 예를 들어 전혈, 혈청, 모유 및 전체 조직, 예를 들어 유선, 창자, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육, 및 눈으로부터의 조직일 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터의 샘플을 (i) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; (ii) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 (iii) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체와 접촉시키고; (b) 존재하는 경우에 샘플 내의 분변항원의 존재 하에 항체-분변항원 복합체를 형성시키고; (c) 존재하는 경우에 항체-분변항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하고; 및 (d) (i) 회충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 회충 감염이 존재하는 것으로 포유동물을 진단하고; (ii) 편충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 편충 감염이 존재하는 것으로 포유동물을 진단하고; 및 (iii) 구충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 구충 감염이 존재하는 것으로 포유동물을 진단하는 단계를 포함하는, 포유동물이 하나 이상의 기생충으로 감염되었는지를 진단하는 방법을 제공한다. 방법은 또한 회충, 편충 및/또는 구충이 존재하는 환경 오염에 대해 시험하고 그들 사이를 구분하기 위해 사용될 수 있다. 장치에 의해 회충, 편충 및/또는 구충에 대해 시험될 수 있는 환경 샘플은 토양, 분해 물질, 또는 마당, 정원, 모래 상자, 운동장을 포함하는 주거 환경으로부터의 분변 물질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 시험 위치는 공원, 해변, 숲, 농장, 또는 개, 고양이, 또는 회충의 다른 포유동물 숙주로부터의 분변 물질에 노출되는 다른 위치를 포함할 수 있다. 실내 및 실외 배설물 상자로부터의 분변도 시험될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 임의로 예를 들어 본 발명의 장치 및 본 발명의 하나 이상의 조성물 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 임의로 예를 들어, 장치의 일부로서 사용되고/되거나 방법의 수행시에 사용되는 하나 이상의 지시약, 하나 이상의 항체 표지 화합물, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 항원 포획 시약, 하나 이상의 억제제, 및 하나 이상의 세척 시약을 더 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 샘플로부터의 연충 항원, 예를 들어 분변 샘플로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하기 위한 장치를 포함하고, 상기 장치는 (a) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; (b) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 (c) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체가 그 위에 고정된 고체 지지체; 및 (d) 항체에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 종류의 회충 항원, 편충 항원, 및/또는 구충 항원을 포함한다.
도 1은 측방 유동 장치를 사용하여 수행하고 실시예 1의 본 발명의 방법에 따라 회충, 편충 및/또는 구충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플을 시험한 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 2는 미세적정 플레이트를 사용하여 수행하고 실시예 2의 본 발명의 방법에 따라 회충, 구충, 편충 또는 사상충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플을 시험한 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 3은 전체 성체 트리쿠리스 불피스로부터의 1210-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 4는 전체 성체 트리쿠리스 불피스로부터의 1059-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 2)을 보여준다.
도 5는 서열 3 및 서열 4의 비교 정렬을 보여준다. 서열 3 및 서열 4의 컨센서스 서열은 서열 9로서 제시된다.
도 6은 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 865-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 10)을 보여준다.
도 7은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 632-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 11)을 보여준다.
도 8은 서열 13 및 서열 14의 비교 정렬을 보여준다. 서열 13 및 서열 14의 컨센서스 서열은 서열 16으로서 제시된다.
도 9는 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 535-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 17)을 보여준다.
도 10은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 536-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 18)을 보여준다.
도 11은 서열 20 및 서열 21의 비교 정렬을 보여준다. 서열 20 및 서열 21의 컨센서스 서열은 서열 23으로서 제시된다.
도 12는 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 469-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 24)을 보여준다.
도 13은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 548-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 보여준다.
도 14는 서열 27 및 서열 28의 비교 정렬을 보여준다. 서열 27 및 서열 28의 컨센서스 서열은 서열 30으로서 제시된다.
도 15는 샘플로서 SP 컬럼으로부터의 용출 분획을 사용하는 ELISA를 보여주고, Copro6728이 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 SP 컬럼을 용출시킴으로써 부분적으로 정제되고 농축될 수 있음을 보여준다.
도 16은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-전장 DIV6728 IgG-HRP로 프로빙한 웨스턴 블롯 (Western Blot)을 사용하여 Copro6728의 분자량이 약 7KD임을 보여준다.
도 17은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 임페리얼 프로테인 스테인 (Imperial Protein Stain)으로 염색한 SDS-PAGE 겔을 사용하여 Copro6728의 분자량이 약 7KD임을 보여준다.
도 18은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 음영진 상자로 강조함으로써, 질량분광 분석에 의해 확인된 2개의 펩티드 (서열 35 및 서열 36)가 존재하는 전장 DIV6728의 아미노산 서열 (서열 21)을 보여준다.
도 19는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따른 구성체에 의해 코딩되는 6728N (서열 37) 및 6728C (서열 38) 아미노산 서열의 정렬을 보여준다.
도 20은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 재조합 6728N의 정제를 검토하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 21은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 재조합 6728C의 정제를 검토하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 22는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 상이한 재조합 6728 단백질에 대한 상이한 폴리클로날 항체를 시험하기 위해 상이한 분변 샘플을 사용하여 얻은 ELISA 데이타를 보여준다.
도 23은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 상이한 재조합 6728 단백질에 대한 상이한 폴리클로날 항체를 시험하기 위해 재조합 단백질을 사용하여 얻은 ELISA 데이타를 보여준다.
도 24는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-전장 DIV6728 IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
도 25는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-6728C IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
도 26은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-6728N IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
도 2는 미세적정 플레이트를 사용하여 수행하고 실시예 2의 본 발명의 방법에 따라 회충, 구충, 편충 또는 사상충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 샘플을 시험한 ELISA 분석 결과를 보여준다.
도 3은 전체 성체 트리쿠리스 불피스로부터의 1210-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 4는 전체 성체 트리쿠리스 불피스로부터의 1059-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 2)을 보여준다.
도 5는 서열 3 및 서열 4의 비교 정렬을 보여준다. 서열 3 및 서열 4의 컨센서스 서열은 서열 9로서 제시된다.
도 6은 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 865-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 10)을 보여준다.
도 7은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 632-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 11)을 보여준다.
도 8은 서열 13 및 서열 14의 비교 정렬을 보여준다. 서열 13 및 서열 14의 컨센서스 서열은 서열 16으로서 제시된다.
도 9는 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 535-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 17)을 보여준다.
도 10은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 536-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 18)을 보여준다.
도 11은 서열 20 및 서열 21의 비교 정렬을 보여준다. 서열 20 및 서열 21의 컨센서스 서열은 서열 23으로서 제시된다.
도 12는 전체 성체 톡소카라 카니스로부터의 469-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 24)을 보여준다.
도 13은 전체 성체 톡소카라 카티로부터의 548-뉴클레오티드 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 보여준다.
도 14는 서열 27 및 서열 28의 비교 정렬을 보여준다. 서열 27 및 서열 28의 컨센서스 서열은 서열 30으로서 제시된다.
도 15는 샘플로서 SP 컬럼으로부터의 용출 분획을 사용하는 ELISA를 보여주고, Copro6728이 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 SP 컬럼을 용출시킴으로써 부분적으로 정제되고 농축될 수 있음을 보여준다.
도 16은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-전장 DIV6728 IgG-HRP로 프로빙한 웨스턴 블롯 (Western Blot)을 사용하여 Copro6728의 분자량이 약 7KD임을 보여준다.
도 17은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 임페리얼 프로테인 스테인 (Imperial Protein Stain)으로 염색한 SDS-PAGE 겔을 사용하여 Copro6728의 분자량이 약 7KD임을 보여준다.
도 18은 실시예 3의 본 발명의 방법에 따라 음영진 상자로 강조함으로써, 질량분광 분석에 의해 확인된 2개의 펩티드 (서열 35 및 서열 36)가 존재하는 전장 DIV6728의 아미노산 서열 (서열 21)을 보여준다.
도 19는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따른 구성체에 의해 코딩되는 6728N (서열 37) 및 6728C (서열 38) 아미노산 서열의 정렬을 보여준다.
도 20은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 재조합 6728N의 정제를 검토하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 21은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 재조합 6728C의 정제를 검토하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 22는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 상이한 재조합 6728 단백질에 대한 상이한 폴리클로날 항체를 시험하기 위해 상이한 분변 샘플을 사용하여 얻은 ELISA 데이타를 보여준다.
도 23은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 상이한 재조합 6728 단백질에 대한 상이한 폴리클로날 항체를 시험하기 위해 재조합 단백질을 사용하여 얻은 ELISA 데이타를 보여준다.
도 24는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-전장 DIV6728 IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
도 25는 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-6728C IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
도 26은 실시예 4의 본 발명의 방법에 따라 토끼 항-6728N IgG-HRP로 프로빙한 상이한 분변 샘플의 웨스턴 블로팅을 보여준다.
<본 발명의 바람직한 실시양태의 상세한 설명>
I. 도입
본 발명은 일반적으로 포유동물로부터 얻은 분변 샘플에서 회충, 편충 및 구충을 검출하고 구분하기 위한 방법, 장치, 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들어 톡소카라, 예를 들어 톡소카라 카니스 또는 톡소카라 카티로부터의 회충 분변항원, 트리쿠리스, 예를 들어 트리쿠리스 불피스로부터의 편충 분변항원, 및 안실로스토마, 예를 들어 안실로스토마 카니눔으로부터의 구충 분변항원에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 예를 들어 회충, 예를 들어 톡소카라, 톡사스카리스, 바일리사스카리스, 아스카리디아, 파라스카리스, 아스카리스, 아니사키스, 또는 슈도테라노바, 예를 들어 티. 카니스, 티. 카티, 티. 비툴로룸, 티. 레오니나, 티. 비툴로룸, 비. 프로시오니스, 에이. 갈리, 피. 에쿠오룸, 에이. 룸브리코이데스, 및 에이. 수움, 에이. 심플렉스, 및 피. 데시피엔스, 편충, 예를 들어 트리쿠리스 불피스, 트리쿠리스 세라타, 티. 캄파눌라, 및 트리쿠리스 트리키우라, 및 구충, 예를 들어 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 브라질리엔세, 안실로스토마 듀오데날, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 튜바에포르메 및 안실로스토마 플루리덴타툼, 네카토르 아메리카누스, 및 운시나리아 스테노세팔라를 검출하고 구분하기 위한 방법, 장치 및 키트에 관한 것이다
본 발명은 기존의 현미경 검사 기술보다 우수한 대안을 제공한다. 이것은 본 발명이 (1) 사용과 일관적으로 신뢰할 수 있는 결과를 제시하기 쉽고; (2) 포유동물이 구충, 회충, 및/또는 사상충으로 감염되었는지와 상관없이 포유동물 내의 편충의 부재 또는 존재를 확인할 수 있고; (3) 충란이 감염된 숙주의 분변에서 처음으로 보이는 시점 이전에 회충, 편충 및 구충을 검출할 수 있고; (4) 회충, 편충 및 구충 감염을 구분할 수 있는, 포유동물로부터의 샘플에서 회충, 편충 및 구충의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 장치, 키트 및 방법을 제공하기 때문에 사실이다.
본 발명은 부분적으로는 회충, 편충 및 구충 감염에 특이적인 조성물의 예기치 않은 특성의 발견을 기초로 한다. 구체적으로, 충 특이적 폴리펩티드에 대해 생성시킨 (또는 전체 충의 추출물, 또는 충 생식 기관의 추출물, 또는 충 창자의 추출물에 대해 생성시킨) 항체가 포유동물에서 회충 항원, 편충 항원, 및 구충 항원을 포획, 검출하고, 이들을 구분하기 위해 사용될 수 있음이 결정되었다. 각각의 종류의 충에 대한 특이성은 놀라운 사실로서, 이것은 회충, 편충, 및 구충 모두가 관련되는 선충이고, 이들 충 중의 임의의 하나로부터 단리된 단백질에 대해 생성된 항체는 하나 이상의 다른 충, 숙주 항원, 또는 다른 숙주 성분과 교차반응할 것으로 예상되기 때문이다.
상기 항체는 포유동물이 처음 감염되고 9일 경과시까지의 조기에 포유동물에서 회충, 편충 및 구충 항원을 포획하고 검출하기 위해 사용될 수 있음이 추가로 결정되었다. 감염된 포유동물의 분변에 임의의 충란이 보이기 전에 빨리 회충, 편충 또는 구충을 검출하는 상기 능력은, 충란이 일반적으로 숙주가 감염된 후 약 5 내지 8주까지는 감염 숙주의 분변에 보이지 않기 때문에 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 포유동물에서 회충, 편충 및 구충 항원을 특이적으로 포획 및 검출하고, 그들 사이를 구분하기 위해 항체 및/또는 그의 단편을 사용하는 방법, 장치, 및 키트를 포함한다. 하나 이상의 다른 충 종류가 존재하는 경우에도 회충을 검출하고 진단하는 본 발명의 능력 때문에, 포유동물을 돌보는 사람은 포유동물로부터 회충, 편충 및/또는 구충을 제거하기 위한 치료법을 최적으로 선택할 수 있는 기회를 가질 수 있다. 또한, 몇몇 경우에, 포유동물이 처음 감염되고 9일 경과시까지의 조기에 포유동물에서 회충, 편충 및/또는 구충을 검출하는 본 발명의 능력은 포유동물이 심하게 아프기 전에 돌보는 사람이 상기 치료를 시작할 수 있도록 하는 가능성을 제공한다. 분변에 충란이 보이기 전에 개입하면, 감염이 다른 동물 또는 인간에게 퍼질 가능성을 크게 감소시키거나 제거할 것이다.
II. 용어의 정의 및 사용
용어 "본 발명의 조성물"은 본원에서 명시적으로 설명되거나 함축적으로 포함되거나 또는 다른 방식으로 개시된 모든 핵산, 폴리펩티드, 항체, 및 본 발명의 방법을 수행함으로써 포유동물로부터 얻은 샘플에서 회충, 편충 및/또는 구충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 상기 핵산, 폴리펩티드, 및 항체 및 하나 이상의 다른 화합물을 포함하는 혼합물을 의미한다.
그 내부에서 회충, 편충 및/또는 구충이 본 발명에 의해 검출될 수 있는 "포유동물로부터의 샘플"은 모든 신체 성분 및 그의 추출물, 예를 들어 회충, 편충 및/또는 구충 항원을 함유할 수 있는 임의의 유체, 고체, 세포 또는 조직을 포함한다. 따라서, 예시적인 샘플은 분변, 모유, 전혈 및 그의 일부, 예를 들어 혈청을 포함하고, 이로 제한되지 않고, 조직 추출물, 예를 들어 유선, 창자, 간, 심장, 폐, 식도, 뇌, 근육, 및 눈으로부터의 조직을 더 포함한다. 샘플은 포유동물로부터 직접 채취할 수 있거나 샘플은 포유동물과 접촉한 모든 것으로부터 채취할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 포유동물의 갓 배설한 또는 부패한 분변일 수 있다. 또다른 예로서, 샘플은 예를 들어 포유동물에 의해 배출될 수 있는 신체 성분, 예를 들어 분변과 혼합될 수 있는 토양, 진흙, 모래, 식물 물질, 또는 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다. 따라서, 샘플은 환경상의 공급원, 예를 들어 숲, 농장, 또는 주거 환경, 예를 들어 배설물 상자, 마당, 정원, 모래 상자, 운동장, 공원, 및 해변으로부터의 토양, 분해 물질, 또는 분변 물질로부터 채취할 수 있다. 샘플의 기원 또는 함량과 상관없이, 상기 샘플은 때때로 본원에서 "샘플", "포유동물 샘플", "시험 샘플" 또는 "시험 중의 샘플"로 언급된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 "유전자", "DNA", "cDNA", "EST", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "다중핵산", "RNA" 및 "mRNA"와 동의어이고, 따라서 상호 교환가능하게 사용된다. 핵산은 이중가닥 형태일 수 있거나 또는 단일가닥 형태일 수 있다. 또한, 핵산은 예를 들어 전체 회충, 편충 및/또는 구충 또는 그의 일부로부터 천연에서 단리되거나, 또는 재조합 숙주 유기체에서 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 인공적인 수단에 의해, 예를 들어 PCR-기반 기술을 사용하거나, 핵산을 합성하는 트랜스제닉 유기체를 생성하거나, DNA 합성 기기를 사용하거나, 또는 임의의 다른 분자 기반 기술에 의해 인공적으로 합성된다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 동의어로서, 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 예를 들어 전체 회충, 편충 또는 구충 또는 회충, 편충 또는 구충의 일부로부터 천연에서 단리되거나, 또는 재조합 숙주 유기체에서 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 인공적인 수단에 의해 인공적으로 합성될 수 있다.
용어 "항체" 또는 "본 발명의 항체"는 다른 충으로부터의 항원에 결합하지 않으면서 특정 충에 대한 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나 이상의 회충 항원에 대한 항체는 하나 이상의 회충 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 구충 또는 편충으로부터의 임의의 항원에는 결합할 수 없고, 하나 이상의 편충 항원에 대한 항체는 하나 이상의 편충 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 회충 또는 구충으로부터의 임의의 항원에는 결합할 수 없다. 본 발명의 항체는 본 발명의 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드에 대해 생성시킬 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명의 항체는 2 이상의 상이한 종류의 항체의 혼합물을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 항체는 2 종류의 항체의 혼합물일 수 있고, 여기서 두 종류 중의 하나는 하나의 특정 항원에 특이적으로 결합하고, 두 종류 중의 다른 하나는 몇몇의 다른 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "제1 항체"는 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "제2 항체"는 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "제3 항체"는 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체를 의미한다.
"본 발명의 면역원성 폴리펩티드" 및 간단히 "본 발명의 폴리펩티드"는 본 발명의 항체가 그에 대해 생성될 수 있는 면역원이다. 모든 "본 발명의 폴리펩티드"는 면역원성이고, 따라서 본 발명의 항체를 생산하기 위해 숙주 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 본 발명의 폴리펩티드는 다수의 성분의 혼합된 조성물의 한 성분일 수 있음을 이해하여야 한다.
"면역원"은 예를 들어 그 물질에 노출된 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질, 예를 들어 본 발명의 면역원성 폴리펩티드이다.
용어 "회충"은 본원에서 사용될 때, 톡소카라, 톡사스카리스, 바일리사스카리스, 아스카리디아, 파라스카리스, 아스카리스, 아니사키스, 및 슈도테라노바 속을 포함하는 아스카리디다 (Ascaridida) 목의 장내 회충과 같은 연충을 의미한다. 따라서, 용어 "회충"은 본원에서 사용될 때, 선형동물 (Nematoda) 문의 전체를 의미하지는 않는다. 따라서, "회충"은 안실로스토마, 운시나리아, 네카토르, 트리쿠리스, 사상충 (Wuchereria), 브루기아 (Brugia) 또는 디로필라리아 (Dirofilaria) 속의 임의의 멤버를 포함하지 않는다.
"회충 분변항원" 또는 "회충의 분변항원"은 회충에 감염된 포유동물의 분변에 존재하고 하나 이상의 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 회충 생성물이다. 예를 들어, 회충 분변항원은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명자들은 티. 카니스의 배설/분비 단백질인 DIV6728의 신규한 C-말단 7 kD 이소형이, 개과동물이 티. 카니스로 처음 감염되고 38일 경과시까지의 조기에 티. 카니스-감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것으로 결정하였다. 따라서, "회충 분변항원"은 본 발명자들에 의해 개과동물 분변에서 관찰된 DIV6728의 상기 신규한 C-말단 7 kD 이소형 (본원에서 "Copro6728"로 언급됨)일 수 있다.
용어 "편충"은 본원에서 사용될 때, 트리쿠리스 및 트리코세팔루스 (Trichocephalus) 속의 장내 편충과 같은 기생충을 의미한다. 따라서, 예시적인 편충은 트리쿠리스 불피스, 트리쿠리스 캄파눌라, 트리쿠리스 세라타, 트리쿠리스 수이스, 트리쿠리스 트리키우라, 트리쿠리스 디스콜로르 및 트리코세팔루스 트리키우리스 (Trichocephalus trichiuris)를 포함한다. 또한, 용어 "편충"은 본원에서 사용될 때, 선형동물 문의 전체를 의미하지는 않는다. 예를 들어, "편충"은 안실로스토마, 운시나리아, 네카토르, 톡소카라, 톡사스카리스, 아스카리스, 사상충, 브루기아 또는 디로필라리아 속의 임의의 멤버를 포함하지 않는다.
"편충 분변항원" 또는 "편충의 분변항원"은 편충에 감염된 포유동물의 분변에 존재하고 하나 이상의 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 편충 생성물이다. 예를 들어, 편충 분변항원은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드일 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "구충"은 안실로스토마, 네카토르 및 운시나리아 속의 장내 구충과 같은 연충을 의미한다. 따라서, 예시적인 구충은 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 브라질리엔세, 안실로스토마 듀오데날, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 튜바에포르메 및 안실로스토마 플루리덴타툼, 네카토르 아메리카누스, 및 운시나리아 스테노세팔라를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "구충"은 선형동물 문의 전체를 의미하지는 않는다. 예를 들어, "구충"은 트리쿠리스, 트리코세팔루스 톡소카라, 톡사스카리스, 아스카리스, 사상충, 브루기아 또는 디로필라리아 속의 임의의 멤버를 포함하지 않는다.
"구충 분변항원" 또는 "구충의 분변항원"은 구충에 감염된 포유동물의 분변에 존재하고 하나 이상의 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 구충 생성물이다. 예를 들어, 구충 분변항원은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명자들은 안실로스토마의 배설/분비 단백질인 ASP5의 신규한 N-말단 28 kDa 이소형이, 개과동물이 안실로스토마로 처음 감염되고 9일 경과시까지의 조기에 안실로스토마-감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것으로 결정하였다. 따라서, "구충 분변항원"은 본 발명자들에 의해 개과동물 분변에서 관찰된 ASP5의 신규한 N-말단 28 kDa 이소형 (본원에서 "CoproASP5"로 언급됨)일 수 있다.
"에 특이적인", "에 특이적으로 결합하다", 및 "에 안정적으로 결합하다"는 본 발명의 특정 조성물, 예를 들어 본 발명의 항체, 폴리펩티드, 또는 올리고뉴클레오티드가 예를 들어 적어도 하나의 다른 물질보다 더 큰 친화도로 하나 이상의 다른 물질을 인식하고 이에 결합함을 의미한다. 한 예로서, 본 발명의 항체는 항체가 비-회충 기생충으로부터의 임의의 다른 항원보다 더 큰 친화도로 회충 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있을 때 회충 항원"에 특이적인", "에 특이적으로 결합한다", 및 "안정적으로 결합한다"고 언급된다. 상기 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, ELISA 또는 방사성 면역분석 (RIA)을 사용하여 시험될 수 있다. 본 발명의 특정 조성물의 결합 특이성에 대해 관찰된 정보를 기초로 하여, 본 발명의 방법은 조성물의 특정 물질(들)에 대한 결합을 허용하지만 (따라서, 상기 결합의 검출을 허용하지만), 다른 물질에는 유의하게 결합하도록 허용하지 않는 조건을 유지하면서 상기 조건 하에서 수행할 수 있다. 한 예로서, 본 발명의 방법은 본 발명의 항체가 특정 샘플에 존재하는 하나 이상의 회충 항원에 결합하는 것을 허용하지만 (따라서, 상기 결합의 검출을 허용하지만), 샘플에 존재할 수 있는 임의의 구충 또는 편충 항원에는 유의하게 결합하도록 허용하지 않아 회충, 편충 및 구충을 구분하도록 하는 조건 하에서 수행할 수 있다.
"회충의 검출"은 예를 들어 하나 이상의 회충-특이적 생성물, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 항체 및 핵산, 또는 하나 이상의 회충 항원 또는 Copro6728의 검출을 의미한다. 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 회충 생성물의 존재는 임의의 전체 회충 유기체 또는 그의 알이 또한 샘플에 존재하는지의 여부와 상관없이 포유동물이 회충에 감염되었음을 나타낸다. 반대로, 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 회충 생성물의 부재는 포유동물이 회충에 감염되지 않았음을 나타낸다.
"편충의 검출"은 예를 들어 하나 이상의 편충-특이적 생성물, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 항체 및 핵산, 또는 하나 이상의 편충 항원의 검출을 의미한다. 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 편충 생성물의 존재는 임의의 전체 편충 유기체 또는 그의 알이 또한 샘플에 존재하는지의 여부와 상관없이 포유동물이 편충에 감염되었음을 나타낸다. 반대로, 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 편충 생성물의 부재는 포유동물이 편충에 감염되지 않았음을 나타낸다.
"구충의 검출"은 예를 들어 하나 이상의 구충-특이적 생성물, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드, 항체 및 핵산, 또는 하나 이상의 구충 항원 또는 CoproASP5의 검출을 의미한다. 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 구충 생성물의 존재는 임의의 전체 구충 유기체 또는 그의 알이 또한 샘플에 존재하는지의 여부와 상관없이 포유동물이 구충에 감염되었음을 나타낸다. 반대로, 포유동물로부터의 샘플 내의 하나 이상의 상기 구충 생성물의 부재는 포유동물이 구충에 감염되지 않았음을 나타낸다.
"아미노산"은 천연 생성 및 합성 아미노산을 의미한다. 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌은 A 또는 Ala이고; 아르기닌은 R 또는 Arg이고; 아스파라긴은 N 또는 Asn이고; 아스파르트산은 D 또는 Asp이고; 시스테인은 C 또는 Cys이고; 글루탐산은 E 또는 Glu이고; 글루타민은 Q 또는 Gln이고; 글라이신은 G 또는 Gly이고; 히스티딘은 H 또는 His이고; 이소류신은 I 또는 Ile이고; 류신은 L 또는 Leu이고; 라이신은 K 또는 Lys이고; 메티오닌은 M 또는 Met이고; 페닐알라닌은 F 또는 Phe이고; 프롤린은 P 또는 Pro이고; 세린은 S 또는 Ser이고; 트레오닌은 T 또는 Thr이고; 트립토판은 W 또는 Trp이고; 타이로신은 Y 또는 Tyr이고; 발린은 V 또는 Val이다. 본원에서 달리 규정되는 경우를 제외하고, X 또는 Xaa는 임의의 아미노산을 나타낸다. 다른 관련 아미노산은 4-히드록시프롤린 및 5-히드록시라이신을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 모든 경우에, 본원에서 설명되거나 달리 언급되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열의 맨 왼쪽 또는 제1 아미노산 잔기는 N-말단 잔기이고 서열의 맨 오른쪽 또는 마지막 아미노산 잔기는 C-말단 잔기인 통상적인 형태로 제시된다.
임의의 특정 핵산 서열의 "보존적 변이체"는 특정 핵산 서열에 대한 하나 이상의 다의성 (degenerate) 코돈 치환이 존재하는 임의의 서열, 특정 핵산 서열에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입, 및 결실이 존재하는 임의의 서열, 및 특정 핵산의 상보성 서열 및 상기 상보성 서열의 보존적 변이체를 포함한다. 특정 핵산 서열의 보존적 변이체는 특정 핵산 서열에 대해 바람직하게는 적어도 약 85％의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％의 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95-99％의 동일성을 갖는다. 특정 핵산 서열의 보존적 변이체는 인공적으로 합성될 수 있거나 유기체로부터 그의 천연 형태로 단리될 수 있다.
임의의 특정 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이체"는 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이하지만, 특정 폴리펩티드에 대해 생성시킨 본 발명의 항체가 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있도록 특정 폴리펩티드의 특이적인 결합 특성을 계속 보유하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩티드이다. 따라서, 예를 들어, 특정 폴리펩티드의 보존적 변이체는 특정 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가, 및 삽입을 가질 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드의 보존된 변이체는 특정 폴리펩티드에 대한 30개 이하, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하의 보존된 아미노산 치환을 가질 수 있다. 특정 폴리펩티드의 보존적 변이체는 필수적이지는 않지만, 바람직하게는 특정 폴리펩티드에 대한 적어도 약 80％의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％의 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 91-99％의 동일성을 갖는다. 다른 "표적" 핵산 또는 아미노산 서열에 대한 임의의 대상 핵산 또는 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드)의 동일성 ％는 다음과 같이 결정될 수 있다. 먼저, 본 발명의 표적 핵산 또는 아미노산 서열은 BLASTN 및 BLASTP를 함유하는 BLASTZ의 단독형 (stand-alone) 버전 (예를 들어, 버전 2.0.14)로부터의 BLAST 2 Sequences (Bl2seq) 프로그램을 사용하여 대상 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 비교 및 정렬될 수 있다. BLASTZ의 단독형 버전은 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 얻을 수 있다. BLASTZ, 구체적으로 Bl2seq 프로그램을 사용하는 방법을 설명하는 내용은 BLASTZ에 부수되는 "readme" 파일에서 볼 수 있다. 프로그램은 또한 문헌 [Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264]; [Karlin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873]; 및 [Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389]에 상세하게 기재되어 있다.
"CoproASP5"는 포유동물 분변에서 발견되는 ASP5의 N-말단 28 kD 단편을 의미한다.
"Copro6728"은 포유동물 분변에서 발견되는 DIV6728의 C-말단 7 kD 부분을 의미한다. 특정 실시태양에서, copro6728은 전장 DIV6728의 C-말단을 포함하지 않는다.
Bl2seq는 BLASTN (핵산 서열의 비교를 위해 사용됨) 또는 BLASTP (아미노산 서열의 비교를 위해 사용됨) 알고리즘을 사용하여 대상 서열과 표적 서열 사이의 비교를 수행한다. 일반적으로, BLOSUM62 스코어링 매트릭스, 갭 (gap) 존재 코스트 11 및 연장 코스트 1, 단어 크기 3, 기대값 10, 잔기당 코스트 1 및 람다 비율 0.85의 디폴트 파라미터가 아미노산 서열 정렬을 수행할 때 사용된다. 출력 파일은 표적 서열과 대상 서열 사이의 정렬된 상동성 구역을 포함한다. 정렬된 후, 길이는 임의의 매치된 위치로부터 시작하여 임의의 다른 매치된 위치에서 종결되는 대상 서열로부터의 서열과 정렬되는 표적 서열로부터의 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 (즉, 갭 제외)의 수를 계수함으로써 결정된다. 매치된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 표적 및 대상 서열 모두에 존재하는 임의의 위치이다. 구조적으로 보존된 도메인 (예를 들어, α-나선, β-시트, 및 루프) 사이의 서열 정렬을 최대화하기 위해서 하나 이상의 잔기의 갭이 표적 또는 대상 서열 내에 삽입될 수 있다.
특정 길이에 걸친 동일성 ％는 특정 길이에 걸쳐 매치된 위치의 수를 계수하고, 그 수를 길이로 나누고, 생성되는 값에 100을 곱하여 결정된다. 예를 들어, (i) 500개 아미노산의 표적 서열이 대상 아미노산 서열과 비교되고, (ii) Bl2seq 프로그램이, 200개 아미노산 구역의 제1 및 마지막 아미노산이 매치되는, 대상 서열의 구역과 정렬된 표적 서열로부터의 200개의 아미노산을 제시하고, (iii) 200개의 정렬된 아미노산에 걸친 매치의 수가 180이면, 500개 아미노산의 표적 서열은 200개의 길이 및 길이의 90％에 걸친 서열 동일성 (즉, 180/200x100=90)을 갖는다. 대상 서열과 정렬되는 핵산 또는 아미노산 표적 서열은 많은 상이한 길이를 생성시킬 것이고, 각각의 길이는 그 자신의 동일성 ％를 갖는다는 것이 이해될 것이다. 동일성 ％ 값은 반올림될 수 있음을 유의한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 반올림되고, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 반올림된다. 또한, 길이 값은 항상 정수일 것임을 유의한다.
특정 폴리펩티드 서열의 보존적 변이체는 인공적으로 합성될 수 있거나 또는 유기체, 예를 들어 회충 유기체, 예를 들어 톡소카라 카니스, 톡소카라 카티, 및 아스카리스, 편충 유기체, 예를 들어 트리쿠리스 및 트리코세팔루스, 및 구충 유기체, 예를 들어 안실로스토마, 네카토르 및 운시나리아로부터 그의 천연 형태로 단리될 수 있다. 회충에 대한 하나의 비제한적인 특정 예에서, 아래 제시된 서열 27에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 서열 26에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드의 보존적 변이체이고, 이것은 서열 27이 126개 아미노산의 정렬에 걸쳐 서열 26에 95％ 초과로 동일하기 때문이다. 보다 일반적으로는, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29 및 서열 30 중의 각각의 하나는 서로에 대한 보존된 변이체이다. 또한, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29 및 서열 30의 다른 보존된 변이체가 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 의해 고려됨을 이해하여야 하지만, 당업자는 상기 고려되는 모든 변이체가 나열하기에는 너무 많음을 알 것이다. 또한, 당업자는 상기 변이체가 염기성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 산성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 극성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 소수성 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 방향족 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환, 및 작은 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함하고 이로 제한되지 않음을 알 것이다 ("염기성" 아미노산 잔기는 K, R 및 H이다. "산성" 아미노산 잔기는 D 및 E이다. "극성" 아미노산 잔기는 N 및 Q이다. "소수성" 아미노산은 I, L, 및 V이다. "방향족" 아미노산 잔기는 F, Y, 및 W이다. "작은" 아미노산은 G, S, A, T 및 M이다).
III. 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드
본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 2008년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/128,077 ("Methods, Devices, Kits And Compositions For Detecting Whipworm"); 2008년 5월 19일 출원된 61/128,079 ("Methods, Devices, Kits And Compositions For Detecting Roundworm"); 2008년 5월 19일 출원된 61/128,076 ("Methods, Devices, Kits And Compositions For Detecting Roundworm"); 2008년 5월 19일 출원된 61/128,099 ("Methods, Devices, Kits And Compositions For Detecting Roundworm"); 2008년 12월 12일 출원된 61/122,254 ("Compositions, Devices, Kits and Methods for Detecting Hookworm") 및 2007년 6월 15일 출원된 실용 특허 출원 11/763,592 ("Roundworm Coproantigen Detection") 및 2007년 6월 15일 출원된 미국 특허 출원 11/763,583 ("Device, Kit and Method for Hookworm Antigen Detection"), 그와 동시에 출원에 "Methods, Devices, Kits, Compositions for Detecting Roundworm"에 상세하게 기재되어 있고, 이들은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
분변 샘플에서 회충의 존재 또는 부재를 확인하고 회충을 다른 기생충 감염으로부터 구분하기 위해 사용될 수 있는 조성물을 확인하기 위한 시도에서, 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고 합성하여, 전체 성체 톡소카라 카니스 또는 전체 성체 톡소카라 카티로부터 단리된 총 RNA를 포함하는 5' RACE, 3' RACE 및 RT-PCR 반응에 사용하였다. 상기 노력의 결과, 469-뉴클레오티드 cDNA 서열이 톡소카라 카니스로부터 추정되었고 (본원에서 서열 25로 확인됨), 548-뉴클레오티드 cDNA 서열이 톡소카라 카티로부터 추정되었다 (본원에서 서열 26으로 확인됨) (서열 25 및 서열 26을 사용하여 수행한 BLAST 탐색은 이들 서열이 아스카리스에서 처음 확인되었지만 티. 카니스 또는 티. 카티에서는 지금까지 확인되지 않은 세린 프로테아제 억제제 패밀리의 멤버를 코딩할 가능성이 있음을 나타내었다).
분변 샘플에서 편충의 존재 또는 부재를 확인하고 편충을 다른 기생충 감염으로부터 구분하기 위해 사용될 수 있는 조성물을 확인하기 위한 시도에서, 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 합성하여, 전체 성체 트리쿠리스 불피스로부터 단리된 총 RNA를 포함하는 5' RACE, 3' RACE 및 RT-PCR 반응에 사용하였다. 상기 노력의 결과로, 1210-뉴클레오티드 cDNA 서열 및 1059-뉴클레오티드 cDNA 서열이 추정되었다 (본원에서 각각 서열 1 및 서열 2로서 확인됨) (서열 1 및 서열 2를 사용하여 수행한 BLAST 탐색은 이들 서열이 마우스 기생충 트리쿠리스 무리스 (Trichuris muris) 및 인간 기생충 트리쿠리스 트리키우라에서 설명되었지만 트리쿠리스 불피스에서는 현재까지 확인되지 않은 주요 편충 배설/분비 단백질인 포린을 코딩할 가능성이 있음을 나타내었다).
이전에, 잔 (Zhan)과 동료들은 안실로스토마의 배설/분비 단백질인 ASP-5의 분자 확인 및 부분적인 특성화를 설명하였다 (문헌 [Zhan et al., International Journal for Parasitology 33:897-907 (2003)] 참조). 이들의 연구에서, 잔 그룹은 시험관 내에서 배양된 기생충으로부터 분비된, 약 56 kDa의 질량을 갖는 ASP-5 단백질의 단일 형태를 설명하였다.
N-말단 His6 태그를 포함하는 ASP-5 단백질 (서열 33)은 서열 31의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다:
구충-감염된 포유동물에서 구충 및/또는 구충 항원을 포획 및 검출하기 위한 도구 (tool)를 확인하기 위한 일환에서, 본 발명자들은 56 kDa 버전이 아니라 약 28 kDa의 변형 단백질이 안실로스토마에 의해 감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것으로 결정하였다 (ASP5의 상기 28 kDa 버전은 본원에서 "CoproASP5"로 언급되고; 안실로스토마-감염 개과동물의 분변에서 CoproASP5의 검출은 본원에 포함된 실시예 섹션에 설명된다). 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 CoproASP5를 특이적으로 포획 및 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. CoproASP5 결합에 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 상기 폴리펩티드의 하나는 ASP5-1 폴리펩티드로 언급되고, 다음 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다:
당업자는 유전자 코드의 다의성 때문에 서열 32 이외의 다른 핵산 서열이, 적절한 (침묵) 코돈 치환이 이루어질 경우 서열 34의 폴리펩티드를 코딩할 수 있음을 이해할 것이다
서열 24 및 서열 25에 대응하는 회충 서열의 분석은 상기 각각의 회충 서열이 큰 개방 판독 프레임 (ORF)을 갖는다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 서열 24의 큰 ORF는 서열 24의 뉴클레오티드 21 내지 446에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 회충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
또한, 서열 25의 큰 ORF는 서열 25의 뉴클레오티드 21 내지 446에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 회충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29 및 서열 30은 그 전부가 참고로 포함된, 2008년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/128,076에 개관되어 있다.
서열 1 및 서열 2에 대응하는 편충 서열의 분석은 상기 각각의 편충 서열이 큰 ORF를 갖는다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 서열 1의 큰 ORF는 서열 1의 뉴클레오티드 32 내지 1147에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 편충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
또한, 서열 2의 큰 ORF는 서열 2의 뉴클레오티드 1 내지 1059에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 편충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 및 서열 9는 그 전부가 참고로 포함된, 2008년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/128,077에 개관되어 있다.
서열 10 및 서열 11에 대응하는 회충 서열의 분석은 상기 각각의 서열이 큰 ORF를 갖는다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 서열 10의 큰 ORF는 서열 11의 뉴클레오티드 2 내지 616에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 편충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
또한, 서열 11의 큰 ORF는 서열 11의 뉴클레오티드 1 내지 486에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 회충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 및 서열 16은 그 전부가 참고로 포함된, 2008년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/128,079에 개관되어 있다.
서열 17 및 서열 18에 대응하는 회충 서열의 분석은 상기 각각의 회충 서열이 큰 개방 판독 프레임 (ORF)을 갖는다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 서열 17의 큰 ORF는 서열 17의 뉴클레오티드 28 내지 456에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 회충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
또한, 서열 2의 큰 ORF는 서열 18의 뉴클레오티드 29 내지 457에 대응하고, 다음 아미노산 서열을 갖는 회충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 및 서열 23은 그 전부가 참고로 포함된, 2008년 5월 19일 출원된 미국 특허 가출원 61/128,099에 개관되어 있다.
서열 31 및 서열 32에 대응하는 구충 서열의 분석은 상기 각각의 구충 서열이 큰 개방 판독 프레임 (ORF)을 갖는다는 것을 나타내었다. 구체적으로, 서열 31의 큰 ORF는 다음 아미노산 서열을 갖는 구충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
서열 33의 처음 38개의 아미노산은 클로닝 벡터로부터 유도되고, 당업자는 이 부분이 생략되거나 다른 적절한 융합 파트너로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 서열 32의 큰 ORF는 다음 아미노산 서열을 갖는 구충 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예측된다:
본 발명의 폴리펩티드는 서열 1, 서열 2, 서열 10, 서열 11, 서열 17, 서열 18, 서열 24, 서열 25, 서열 31 및 서열 32의 전부 또는 일부에 대응하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 서열의 모든 보존적 변이체를 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 가변적임을 이해하여야 한다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33 및 서열 34의 전부 또는 일부 또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33 및 서열 34의 보존적 변이체의 전부 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
하나의 구체적인 예에서, 본 발명의 회충 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:
하나의 구체적인 예에서, 본 발명의 편충 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:
다른 구체적인 예에서, 본 발명의 회충 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:
다른 구체적인 예에서, 본 발명의 회충 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:
다른 구체적인 예에서, 본 발명의 구충 폴리펩티드는 서열 34에 의해 제시되는 서열에 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
서열 28에 대응하는 회충 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 125개의 아미노산 잔기는 서열 26의 아미노산 잔기 18 내지 142를 구체적으로 나타낸다. N-말단 메티오닌은 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 서열 28에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 회충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였고, 이는 천연에서 톡소카라에 존재하는 것으로 생각되지 않기 때문에 (각각의 서열 26 및 서열 27의 위치 18의 히스티딘 잔기 바로 앞에 존재하는 잔기는 메티오닌이 아니라 알라닌임), 본 발명의 폴리펩티드는 서열 26의 아미노산 잔기 18 내지 142에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:
서열 5에 대응하는 편충 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 353개의 아미노산 잔기는 서열 3의 아미노산 잔기 20 내지 353을 구체적으로 나타낸다. N-말단 메티오닌은 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 서열 5에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 편충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였고, 이는 천연에서 트리쿠리스 불피스에 존재하는 것으로 생각되지 않기 때문에 (서열 3의 위치 20의 발린 잔기 바로 앞에 존재하는 잔기는 알라닌임), 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3의 아미노산 잔기 20 내지 353에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:
다른 구체적인 예에서, 본 발명의 편충 폴리펩티드는 다음 아미노산 서열을 갖는다:
서열 7에 대응하는 편충 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 353개의 아미노산 잔기는 서열 4의 아미노산 잔기 1 내지 353을 구체적으로 나타낸다. N-말단 메티오닌은 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 서열 7에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 편충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였기 때문에, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 4의 아미노산 잔기 1 내지 353에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:
서열 14에 대응하는 회충 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 129개의 아미노산 잔기는 서열 12의 아미노산 잔기 14 내지 142를 구체적으로 나타낸다. N-말단 메티오닌은 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 서열 14에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 회충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였고, 이는 천연에서 톡소카라에 존재하는 것으로 생각되지 않기 때문에 (각각의 서열 12 및 서열 13의 위치 14의 히스티딘 잔기 바로 앞에 존재하는 잔기는 메티오닌이 아니라 아르기닌임), 본 발명의 폴리펩티드는 서열 12의 아미노산 잔기 14 내지 142에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:
128개의 아미노산이 존재하는 회충 단백질 DIV6728 (서열 21)은 크기가 약 14 kD이고, 이론적 pI가 약 6.54이다. 이 단백질은 세린 프로테아제 억제제의 군인 TIL 수퍼패밀리에 속한다. 회충-감염된 포유동물에서 회충 및/또는 회충 항원의 포획 및 검출을 위한 도구를 확인하기 위한 노력에서, 본 발명자들은 14 kDa 버전이 아니라, 전장 (14 kDa) 단백질의 말단절단된 부분 (약 7 kDa)만이 티. 카니스로 감염된 개과동물의 분변에 존재하는 것으로 결정하였다 (상기 DIV6728의 7 kDa의 말단절단된 부분은 본원에서 "Copro6728"로 언급되고; 티. 카니스-감염된 개과동물의 분변에서 Copro6728의 검출은 본원의 실시예 섹션에서 설명된다). 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 Copro6728을 특이적으로 포획 및 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드를 제공한다.
서열 21에 대응하는 회충 폴리펩티드의 N-말단 메티오닌 잔기 다음의 127개의 아미노산 잔기는 서열 19의 아미노산 잔기 17 내지 143을 구체적으로 나타낸다. N-말단 메티오닌은 표준 클로닝 기술을 수행함으로써 상기 폴리펩티드의 N-말단에 인공적으로 부가하였다. 또한, 실시예 섹션 전체에서 설명되는 바와 같이, 서열 21에 대응하는 폴리펩티드에 대해 생성시킨 항체는 회충 항원의 검출에 유용하였다. N-말단 메티오닌을 인공적으로 부가하였고, 이는 천연에서 톡소카라에 존재하는 것으로 생각되지 않기 때문에 (각각의 서열 19 및 서열 20의 위치 17의 글라이신 잔기 바로 앞에 존재하는 잔기는 메티오닌이 아니라 알라닌임), 본 발명의 폴리펩티드는 서열 19의 아미노산 잔기 17 내지 143에 대응하는 아미노산 서열, 또는 보다 구체적으로 하기 서열을 가질 수 있음이 고려된다:
또한, 서열 28 (대부분 톡소카라 카니스-유래된 서열; 유일한 예외는 N-말단 메티오닌 잔기임)의 서열 27 (톡소카라 카티-유래된 서열)에 대한 정렬을 도 14에 제시한다. 서열 28에 대응하는 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 톡소카라 카티의 검출에 유용하였기 때문에, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열 30에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 2의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 3의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 4의 X는 L이거나 존재하지 않고 (또는 위치 4의 X는 I이고, 이는 서열 26의 위치 4에 존재함), 위치 5의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 6의 X는 F이거나 존재하지 않고, 위치 7의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 8의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 9의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 10의 X는 F이거나 존재하지 않고 (또는 위치 10의 X는 I이고, 이는 서열 26의 위치 10에 존재함), 위치 11의 X는 I이거나 존재하지 않고, 위치 12의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 13의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 14의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 15의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 16의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 16의 X는 M 또는 A이고, 위치 35의 X는 I 또는 M이고, 위치 39의 X는 Q 또는 E이고, 위치 42의 X는 Q 또는 T이고, 위치 65의 X는 A 또는 P이고, 위치 78의 X는 R 또는 H이고, 위치 88의 X는 P 또는 K이고, 위치 111의 X는 R 또는 K이고, 위치 132의 X는 G 또는 H이다.
또한, 서열 4에 대한 서열 3의 정렬을 도 5에 제시한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열 9에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 2의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 3의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 4의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 5의 X는 F이거나 존재하지 않고, 위치 6의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 7의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 8의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 9의 X는 I이거나 존재하지 않고, 위치 10의 X는 Y이거나 존재하지 않고, 위치 11의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 12의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 13의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 14의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 15의 X는 F이거나 존재하지 않고, 위치 16의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 17의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 18의 X는 D이거나 존재하지 않고, 위치 19의 X는 A이거나 존재하지 않고 (또는 위치 19의 X는 M이고, 이는 서열 5의 위치 19에 존재함), 위치 69의 X는 H 또는 D이고, 위치 136의 X는 I 또는 V이고, 위치 172의 X는 P 또는 A이다.
또한, 서열 14 (대부분 톡소카라 카니스-유래된 서열; 유일한 예외는 N-말단 메티오닌 잔기임)의 서열 13 (톡소카라 카티-유래된 서열)에 대한 정렬을 도 8에 제시한다. 서열 14에 대응하는 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 톡소카라 카티의 검출에 유용하였기 때문에, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열 16에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 I이거나 존재하지 않고, 위치 2의 X는 Y이거나 존재하지 않고, 위치 3의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 4의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 5의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 6의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 7의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 8의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 9의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 10의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 11의 X는 R 또는 M이고, 위치 18의 X는 N 또는 K이고, 위치 37의 X는 Q 또는 K이고, 위치 52의 X는 I 또는 V이고, 위치 55의 X는 Y 또는 F이고, 위치 110의 X는 E 또는 D이고, 위치 133의 X는 K 또는 E이고, 위치 135의 X는 Y 또는 F이고, 위치 138의 X는 A 또는 P이고, 위치 139의 X는 A 또는 I이고, 위치 140의 X는 S 또는 D이고, 위치 141의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 142의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 143의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 144의 X는 K이거나 존재하지 않고, 위치 145의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 146의 X는 D이거나 존재하지 않고, 위치 147의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 148의 X는 Y이거나 존재하지 않고, 위치 149의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 150의 X는 N이거나 존재하지 않고, 위치 151의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 152의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 153의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 154의 X는 D이거나 존재하지 않고, 위치 155의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 156의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 157의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 158의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 159의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 160의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 161의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 162의 X는 S이거나 존재하지 않는다.
또한, 서열 21 (대부분 톡소카라 카니스-유래된 서열; 유일한 예외는 N-말단 메티오닌 잔기임)의 서열 20 (톡소카라 카티-유래된 서열)에 대한 정렬을 도 11에 제시한다. 서열 21에 대응하는 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 톡소카라 카티의 검출에 유용하였기 때문에, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 서열 23에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 존재하지 않거나 M이고, 위치 2의 X는 존재하지 않거나 L이고, 위치 3의 X는 존재하지 않거나 S이고, 위치 4의 X는 존재하지 않거나 V이고, 위치 5의 X는 존재하지 않거나 L이고, 위치 6의 X는 존재하지 않거나 A이고, 위치 7의 X는 존재하지 않거나 L이고, 위치 8의 X는 존재하지 않거나 F이고, 위치 9의 X는 존재하지 않거나 A이고, 위치 10의 X는 존재하지 않거나 L이고, 위치 11의 X는 존재하지 않거나 I이고, 위치 12의 X는 존재하지 않거나 T이고, 위치 13의 X는 존재하지 않거나 F이고, 위치 14의 X는 존재하지 않거나 A이고, 위치 15의 X는 존재하지 않거나 V이고, 위치 16의 X는 M 또는 A이고, 위치 17의 X는 G 또는 D이고, 위치 19의 X는 E 또는 K이고, 위치 42의 X는 N 또는 D이고, 위치 66의 X는 N 또는 D이고, 위치 132의 X는 E 또는 A이다.
본 발명의 폴리펩티드는 서열 38에 대응하는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 여기서 위치 54의 아미노산은 E 또는 A이다. 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명에 포함된다.
서열 34에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 처음 38개의 아미노산 잔기는 안실로스토마에서 유래하지 않았기 때문에 (즉, 이들은 벡터 서열임), 또한 본 발명의 펩티드는 서열 34에 제시된 서열에 동일하거나 상동성인 아미노산 서열을 포함할 수 있을 것으로 고려되고, 여기서 위치 1의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 2의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 3의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 4의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 5의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 6의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 7의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 8의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 9의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 10의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 11의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 12의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 13의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 14의 X는 L이거나 존재하지 않고, 위치 15의 X는 V이거나 존재하지 않고, 위치 16의 X는 P이거나 존재하지 않고, 위치 17의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 18의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 19의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 20의 X는 H이거나 존재하지 않고, 위치 21의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 22의 X는 A이거나 존재하지 않고, 위치 23의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 24의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 25의 X는 T이거나 존재하지 않고, 위치 26의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 27의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 28의 X는 Q이거나 존재하지 않고, 위치 29의 X는 Q이거나 존재하지 않고, 위치 30의 X는 M이거나 존재하지 않고, 위치 31의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 32의 X는 R이거나 존재하지 않고, 위치 33의 X는 G이거나 존재하지 않고, 위치 34의 X는 S이거나 존재하지 않고, 위치 35의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 36의 X는 F이거나 존재하지 않고, 위치 37의 X는 E이거나 존재하지 않고, 위치 38의 X는 L이거나 존재하지 않는다. 또한, 서열 33에서 위치 251의 S는 그 서열에서 본원의 실시예 섹션에서 설명되는 클로닝 과정 동안 인공적으로 치환되기 때문에 (야생형 안실로스토마의 ASP5 단백질은 그 위치에 C 잔기를 포함한다), 서열 34의 위치 251의 X는 S 또는 C일 수 있음이 고려된다.
서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33 및 서열 34 중의 임의의 하나 이상은 단지 더 큰 폴리펩티드 서열의 일부일 수 있고, 따라서 예를 들어 회충에서 정상적으로 발현되는 하나 이상의 단백질, 또는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 또는 서열 38, 또는 Copro6728에 인공적으로 융합된 하나 이상의 폴리펩티드 서열의 부분 서열을 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 당업자는 2 이상의 폴리펩티드 단편을 함께 인공적으로 융합하기 위한 다양한 기술이 존재함을 알 것이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 서열 38, 및 Copro6728 중 하나 초과를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 또는 서열 38, 또는 Copro6728을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 또는 서열 38, 또는 Copro6728에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 함께 융합되는 서열 5, 서열 14, 서열 21, 또는 서열 28에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편에 의해 형성될 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 조합으로 함께 융합되는, 서열 5, 서열 14, 서열 21, 또는 서열 28에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편 및 서열 7, 서열 16, 서열 23, 또는 서열 30에 대응하는 다수의 폴리펩티드 단편에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 특정 폴리펩티드가 특정 기술 (본원에 포함되는 실시예 섹션에서 설명되는)에 의해 발현되고 단리되었지만, 당업자는 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 임의의 하나 이상의 다양한 기술을 사용하여 단리할 수 있음을 이해할 것이다 (예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sewald and Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Wiley Publishing (2002)]; [Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology) Howl, ed., Humana Press (2005)]; [Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (2002)] 참조). 상기 기술은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 서열 38, 및 Copro6728에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 천연에 존재하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 임의의 천연 생성 변이체를 단리하기 위해 수행될 수 있는 기술을 포함한다. 상기 기술은 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 서열 38, 및 Copro6728에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 임의의 보존된 변이체를 인공적으로 생성하기 위해 수행될 수 있는 기술을 더 포함한다. 상기 변이체는 예를 들어 임의의 하나 이상의 돌연변이 유발 기술을 사용하거나 또는 직접 합성에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 항체를 생산하기 위해 상기 폴리펩티드에 노출된 숙주 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 이들이 유도되는 기술에 상관없이, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 항체 생성을 위해 사용되어야 할 때 실질적으로 순수한 형태로 제조된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 적어도 약 80％ 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90-95％ 순수한, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 99％ 순수하다. 숙주 유기체에서 면역 반응을 유도하고 그로부터 항체를 단리하기 위한 예시적인 기술이 본원에 기재되지만, 본 발명이 이들 기술로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 당업자는 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 상기 목적을 달성하기 위한 다수의 기술이 존재함을 알 것이다.
IV. 본 발명의 항체
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드의 전부 또는 일부에 대해 생성되고 이에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 더 포함하고, 또한 상기 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함한다. 포유동물로부터 얻은 샘플에 접촉될 때, 상기 항체 및 항원-결합 단편은 특정 연충 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 회충 항체 및 항원-결합 단편은 샘플에 존재하는 회충 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 샘플에 존재할 수 있는 구충 또는 편충으로부터의 임의의 항원에는 특이적으로 결합할 수 없다. 추가의 예로서, 편충 항체 및 항원-결합 단편은 샘플에 존재하는 편충 항원에 특이적으로 결합할 수 있지만, 샘플에 존재할 수 있는 구충 또는 회충으로부터의 임의의 항원에는 특이적으로 결합할 수 없다. 본 발명의 항체는 단지 하나 이상의 회충 항원, 편충 항원 및/또는 구충 항원을 포획하기 위해, 단지 하나 이상의 회충 항원, 편충 항원 및/또는 구충 항원을 검출하기 위해, 또는 보다 바람직하게는 하나 이상의 회충 항원, 편충 항원 및/또는 구충 항원을 포획 및 검출하기 위해 사용하기 적절하다.
본 발명의 항체는 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 클래스에 속할 수 있고, 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998)]; [Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994)]; [Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994)]; [Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994)]; [Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993)]; [Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992)]; [Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)]; [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]; 및 [Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard and Kaser, eds., CRC Press (2006)] 참조).
하나의 기술에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 숙주 동물, 예를 들어 토끼, 마우스, 래트, 기니 피그, 염소, 돼지, 소, 양, 당나귀, 개, 고양이, 닭, 또는 말 내로 도입된다. 증강된 면역 반응은 폴리펩티드를 담체와 회합시키고/시키거나 숙주를 어쥬번트 (adjuvant)에 노출시킴으로써 숙주 동물에서 유도될 수 있지만, 본 발명이 폴리펩티드를 담체와 회합시키거나 숙주를 어쥬번트에 노출시킬 것을 필요로 하지 않음을 이해하여야 한다. 이를 사용될 수 있는 예시적인 담체는 소 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 및 대두 트립신 억제제이다. 예시적인 어쥬번트는 프로인트 (Freund) 완전 또는 불완전 어쥬번트 및 MDL-TDM 어쥬번트를 포함한다. 폴리펩티드를 상기 담체와 회합시키거나 숙주를 어쥬번트에 노출시키는지의 여부와 무관하게, 부스터 (booster) 면역화를 임의로 수행할 수 있고, 숙주 동물은 이후에 1회 이상 방혈된다. 이어서, 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는 혈액 또는 혈액들로부터 얻은 항혈청으로부터 정제될 수 있다. 그러한 정제는 예를 들어 폴리펩티드를 고체 지지체에 회합시키는 것을 수반하는 친화도 크로마토그래피 기술을 사용함으로써 달성할 수 있다. 상기 친화도 크로마토그래피 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
여러 실시태양에서, 본 발명의 회충 항체는 서열 28, 서열 14, 및 서열 21에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다 (이하에서, 상기 특정 항체는 각각 "항-DIV6744", "항-DIV6716" 및 "항-DIV6728"로 언급됨). 당업자는 항-DIV6744, 항-DIV6716 및 항-DIV6728, 또는 임의의 다른 본 발명의 항체의 생산 및 단리가 임의의 특정 기술로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 회충 항체는 6728C (서열 38)에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다 (이하에서, 상기 특정 항체는 "항-Copro6728C"로 언급됨). 상기 항체를 생산하고 단리하는 특정 기술은 본원의 실시예 섹션에서 설명되지만, 당업자는 항-Copro6728C의 생산 및 단리가 그 특정 기술로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 회충 항체는 미국 특허 출원 11/763,592 (명칭 "Roundworm Coproantigen Detection", 2007년 6월 15일 출원)에 기재된 바와 같이 전체 회충의 추출물, 회충 창자의 추출물, 또는 회충 생식 기관의 추출물로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 편충 항체는 서열 5 또는 7에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다 (이하에서, 상기 특정 항체는 "항-DIV6901" 또는 "항-DIV6902"로 언급됨). 당업자는 항-DIV6901, 항-DIV6902 또는 임의의 다른 본 발명의 항체의 생산 및 단리가 임의의 특정 기술로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 구충 항체는 서열 34에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다 (이하에서, 상기 특정 항체는 "항-Asp5-1"로 언급됨). 당업자는 항-Asp5-1 또는 임의의 다른 본 발명의 항체의 생산 및 단리가 임의의 특정 기술로 제한되지 않음을 이해할 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 미국 특허 출원 11/763,583 (명칭: "Device, Kit and Method for Hookworm Antigen Detection", 2007년 6월 15일 출원)에 기재된 바와 같이, 서열 33에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉 구충으로부터의 실질적으로 전장의 ASP5 단백질로 숙주 동물을 면역화시킴으로써 토끼에서 생성되는 항체이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 5, 서열 14, 서열 21, 서열 28, 및 서열 34에 대응하는 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 숙주에서 생성된다. 일부의 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 38, Copro6728 및 CoproAP5의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 임의의 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 대해 숙주에서 생성된다
다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 서열 38, Copro6728 또는 CoproAP5에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 그의 항원 부분에 특이적으로 결합하는 항체이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 5, 서열 14, 서열 21, 서열 28, 또는 서열 34에 대응하는 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 다른 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 38, Copro6728 또는 CoproAP5의 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 임의의 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
또한, 본 발명의 항체는 임의로 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 단일쇄 항체 (scFv), 키메라 (chimeric) 항체, 및 그의 단편일 수 있음을 이해하여야 한다. 관심있는 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들어 관심있는 폴리펩티드에 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포주를 생성시킴으로써 얻고 정제될 수 있다. 상기 종류의 세포주는 상기 설명한 바와 같이 폴리펩티드로 사전에 면역화된 숙주 동물로부터 단리된 특정 종류의 세포 (예를 들어, 비장 세포)로부터 유도될 수 있다. 상기 경우에, 상기 세포는 이어서 예를 들어 당업자에게 공지된 임의의 하나의 다양한 융합 기술을 수행하여 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 불멸화될 수 있다. 하나의 예시적인 기술에서, 면역화된 숙주 동물로부터의 세포는 하이브리드 (hybrid) 세포 (골수종 융합 파트너가 아니라)의 성장을 지지하는 배지에 도말되기 전에 짧은 시간 동안 세제의 존재 하에 그의 융합 파트너, 예를 들어, 골수종 세포와 함께 동시 인큐베이션된다. 상기 선택은 예를 들어 히포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT)을 사용하여 달성될 수 있다. 아마도 선택 과정 개시 1주 또는 2주 후에 하이브리드 세포가 선택 동안 출현할 때, 단일 하이브리드 콜로니 (및 이들의 상등액)는 그에 대해 숙주 동물이 면역화되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험된다. 가장 최적의 결합 특이성을 갖는 하이브리드 콜로니는 그로부터 모노클로날 항체가 단리될 수 있는 최상의 후보를 제시할 것이다. 상기 모노클로날 항체는 예를 들어 상기 콜로니가 당업자에게 공지된 임의의 하나의 다양한 기술을 사용하여 성장하는 상등액 (즉, 배지)으로부터 직접 단리될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체 (scFv), 또는 항체의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 구역을 포함하는 무손상 항체의 일부이고, 상기 일부에는 무손상 항체의 Fc 구역의 불변 중쇄 도메인이 존재하지 않는다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 동물 또는 포유동물 세포로부터의 생산 및 정제 이외에, 항체, 항체 단편, 또는 비-항체 스캐폴드는 다양한 시험관내 기술, 예를 들어 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 또는 세균 디스플레이를 기초로 하여 선택될 수 있다.
2차 항체를 포함하는 항체는 당업계에 공지된 임의의 종류의 표지, 예를 들어, 형광, 화학발광, 방사성, 효소, 콜로이드성 입자, 방사성 동위원소 및 생체발광 표지로 표지될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 하나 이상의 본 발명의 항체는 효소, 콜로이드성 입자, 방사성 핵종 또는 형광단으로 표지된다. 입자형 표지는 예를 들어 항체에 접합된 착색 라텍스 입자, 염료 졸 (sol), 또는 금 졸일 수 있다.
본 발명의 방법, 장치 및 키트
본 발명의 장치 및 키트
한 측면에서, 본 발명은 샘플로부터 하나 이상의 연충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한, 고체 지지체를 포함하는 장치이고, 상기 고체 지지체 위에는 (a) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; (b) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 (c) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체; 및 임의로, (d) 하나 이상의 종류의 회충 분변항원, 편충 분변항원, 및/또는 구충 분변항원이 고정되고, 여기서 하나 이상의 종류의 회충 분변항원, 편충 분변항원, 및 구충 분변항원은 항체에 특이적으로 결합된다. 포유동물로부터의 샘플에서 회충, 편충 및 구충으로부터의 연충 분변항원에 특이적으로 결합하고 단리하는 것을 돕는 장치가 배치된다.
한 측면에서, 장치는 고체 지지체를 포함하고, 하나 이상의 본 발명의 항체가 고체 지지체 상에 고정된다. 고체 지지체는 예를 들어 미세적정 플레이트의 웰의 내부, 저변 표면 또는 측방 유동 장치의 일부로서 포함되는 기판일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 미세적정 플레이트는 이뮬론 (Immulon) 1B 96-웰 플레이트 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific, 미국 매사추세츠주 밀포드))로부터 시판됨)이지만, 당업자는 이뮬론 1B 96-웰 플레이트가 아닌 매우 다양한 다른 미세적정 플레이트가 그에 대한 항체의 고정을 허용하고, 따라서 본 발명의 고체 지지체의 제공에 적절함을 알 것으로 이해된다.
예시적인 측방 유동 장치는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,726,010에 기재된 측방 유동 장치이다. 측방 유동 분석을 수행하기 위한 장치는 SNAP® 장치 (이덱스 래보래토리즈, 인크. (IDEXX Laboratories, Inc., 미국 메인주 웨스트브룩)로부터 시판됨)일 수 있다. 그러나, 당업자는 SNAP® 장치가 아니거나 또는 미국 특허 5,726,010에 설명되지 않은 매우 다양한 다른 측방 유동 장치가 그에 대한 항체의 고정을 위해 이용가능하고, 따라서 본 발명의 장치로서 사용하기 적절함을 알 것임을 이해하여야 한다. 상기 장치는 예를 들어 콜로이드성 금 기술을 사용하는 측방 유동 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 장치에 사용되는 항체는 예를 들어 공유 또는 비-공유 방식으로, 직접 또는 간접적으로 항체를 고체 지지체에 부착시키는 것을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 따라서, 상기 항체는 물리적 흡착 (즉, 화학적 링커를 사용하지 않은)에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있지만, 이들 항체는 당업자에게 공지된 임의의 화학적 결합 (즉, 화학적 링커의 사용을 통해) 방법에 의해 고체 지지체에 고정될 수도 있다.
또한, 고체 지지체는 본 발명의 항체의 고정을 위한 임의의 적절한 물질일 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 고체 지지체는 비드, 입자, 튜브, 웰, 프로브, 딥스틱 (dipstick), 피펫 팁, 슬라이드, 섬유, 멤브레인, 종이, 천연 및 변형 세룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 유리, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 플라스틱, 자철석 또는 당업자에게 쉽게 공지된 임의의 다른 적절한 물질일 수 있다.
장치는 임의로 본 발명의 장치에 적용하기 전에 포유동물로부터의 샘플과 혼합될 수 있는 하나 이상의 표지된 항원 포획 시약을 포함할 수 있다. 표지된 항원 포획 시약이 포함될 때, 표지된 항원 포획 시약은 장치의 고체 표면 상에 퇴적되거나 건조될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. "항원 포획 시약"은 관심있는 항원 또는 항원들에 특이적인 임의의 화합물을 나타낸다. 포유동물 샘플에 첨가되거나 또는 장치 상에 예비-퇴적되었는지와 상관없이, 표지된 항원 포획 시약은 예를 들어 본 발명의 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는, 회충 항원에 특이적인 표지된 항체일 수 있다. 한 예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-DIV6744는 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다. 다른 예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-DIV6901 또는 항-DIV6902는 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-DIV6716은 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-DIV6728은 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다. 또다른 추가의 예에서, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 항-Copro6728은 표지된 항원 포획 시약으로서 사용될 수 있다.
또한, 장치는 반응 구역 (고체상)으로부터 비결합 물질 (예를 들어, 포유동물 샘플의 미반응 부분, 예를 들어, 예를 들어 분변 추출물의 미반응 부분, 및 비결합 항원 포획 시약)을 수송하거나 (예를 들어, 장치가 SNAP® 장치일 때), 또는 그 제거를 용이하게 하는 (예를 들어, 장치가 미세적정 플레이트를 포함할 때) 액체 시약을 임의로 포함할 수 있다. 액체 시약은 세척 시약일 수 있고, 반응 구역으로부터 단지 비결합 물질을 제거하는 작용을 할 수 있거나, 또는 검출기 시약을 포함하고 비결합 물질을 제거하고 항원 검출을 용이하게 하는 작용을 할 수 있다. 예를 들어, 효소에 접합된 항원 포획 시약의 경우에, 검출기 시약은 반응 구역 (고체상)에서 효소-항체 접합체와의 반응시에 검출가능한 신호를 생성시키는 기질을 포함한다. 별법으로, 방사성, 형광, 또는 흡광 분자에 접합된 표지된 항원 포획 시약의 경우에, 액체 시약은 단지 비결합된 표지된 시약을 세척 제거함으로써 반응 구역에서 복합체 형성의 검출을 용이하게 하는 세척 용액으로 작용할 뿐이다.
액체 시약은 제한된 양의 "억제제", 즉, 검출가능한 최종 생성물의 발생을 차단하는 물질을 더 포함할 수 있다. 제한된 양은 검출가능한 최종 생성물이 생산되는 시점에 대부분 또는 모든 과량의 비결합 물질이 제2 구역으로부터 수송될 때까지 최종 생성물 발생을 차단하기에 충분한 억제제의 양으로 규정된다.
또한, 본 발명의 장치는 항원 포획 시약 또는 시약들과 상이한 위치에 고정된 다양한 결합 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표지된 항체의 종-특이적 (예를 들어, 회충-특이적) 항체 부분 또는 항원 포획 시약, 또는 효소-표지된 시약의 효소 부분을 인식하는 면역시약 (항체, 항원 또는 폴리펩티드)이 장치 내의 시약의 생존력을 평가하기 위한 양성 대조군으로서 포함될 수 있다. 예를 들어, 양성 대조군은 예를 들어 염소 또는 마우스에서 생성된 항-양고추냉이 퍼옥시다제 항체일 수 있다. 추가로, 시약, 예를 들어, 항원-항체 복합체의 항체 부분이 그로부터 유도되는 종의 비-면역 멤버로부터 단리된 항체가 면역복합체 (즉, 항원-항체 복합체) 형성의 특이성을 평가하기 위한 음성 대조군으로서 포함될 수 있다.
포유동물 샘플에서 회충, 편충 및 구충로부터의 연충 분변항원에 특이적으로 결합하고 단리되도록 설계되는 것 이외에, 임의로 본 발명의 장치는 수행될 하나 이상의 다른 진단 시험이 가능하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 또한 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약은 예를 들어 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 항체 또는 하나 이상의 항원일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 장치는 다수의 웰을 포함하는 미세적정 플레이트이고, 여기서 각각의 웰은 항-DIV6744 pAB가 그 위에 고정된 고체 지지체를 포함한다.
플레이트는 샘플에서 하나 이상의 연충 분변항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 회충 감염은 하나 이상의 회충 항원을 고체 지지체 상에 고정된 항-DIV6744 pAB로, 하나 이상의 편충 항원을 항-DIV6902 pAB로, 하나 이상의 구충 항원을 항-Asp5-1 pAB로 검출함으로써 포유동물에서 진단될 수 있다. 한 실시태양에서, 검출되는 항원은 분변항원이다. "분변항원"은 분변 샘플에 존재하고 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 회충, 편충 및 구충의 임의의 생성물 또는 생성물들이다. 따라서, 분변항원은 전체 충, 충란, 충 단편, 또는 충으로부터 분비, 배설 또는 탈락된 생성물 또는 이들의 조합일 수 있다. 분변항원은 추가로 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 또는 서열 38에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 상기 서열의 보존적 변이체인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및/또는 임의의 상기 폴리펩티드의 항원 단편, 및 CoproASP5 및 Copro6728을 포함한다.
본 발명은 포유동물 샘플에서 회충, 편충 및/또는 구충을 검출 및 구분하기 위한 분석 키트 (예를 들어, 제품)를 더 포함한다. 키트는 따라서 본 발명의 하나 이상의 장치 및/또는 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 항-회충 항체 및 샘플에서 회충 항원에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 수단, 항-편충 항체 및 편충 항원에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 수단, 및 항-구충 항체 및 구충 항원에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 하나의 특정 예에서, 상기 키트는 고정된 항-회충 항체, 예를 들어 항-DIV6744, 항-편충 항체, 예를 들어 항-DIV6902, 및 항-구충 항체, 예를 들어 항-Asp5-1, 예를 들어, 하나 이상의 항원 포획 시약 (예를 들어, 비-고정된 표지된 항원 포획 시약 및 고정된 항원 포획 시약) 및 세척 시약, 및 검출기 시약 및 원하거나 적절한 경우 양성 및 음성 대조군 시약을 갖는 장치를 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 성분, 예를 들어 버퍼, 대조군 등이 상기 시험 키트에 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약 용액의 농도를 제공하도록 상이할 수 있다. 특히, 시약은 대체로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있고, 용해 시에 샘플과 조합하기 위한 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다. 본 발명의 키트는 본 발명의 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 지시서, 예를 들어 키트와 함께 포함되는 본 발명의 임의의 장치 및/또는 조성물을 사용하기 위한 지시서를 더 포함할 수 있다.
B. 본 발명의 방법
본 발명은 샘플에서 하나 이상의 연충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 하나 이상의 장치, 키트 및/또는 조성물을 사용하기 위한 방법을 더 포함한다. 따라서, 방법은 개과동물, 고양이과동물, 돼지과동물, 소과동물 또는 인간을 포함하고 이로 제한되지 않는 포유동물로부터 얻은 샘플, 예를 들어 분변 샘플에서 회충, 편충 및/또는 구충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 또한, 방법은 톡소카라, 예를 들어 티. 카니스 또는 티. 카티, 또는 티. 비툴로룸, 아스카리스, 예를 들어 에이. 룸브리코이데스 또는 에이. 수움, 아니사키스, 예를 들어 에이. 심플렉스, 슈도테라노바, 예를 들어 피. 데시피엔스, 트리쿠리스 및/또는 트리코세팔루스, 예를 들어 트리쿠리스 불피스, 트리쿠리스 캄파눌라, 트리쿠리스 세라타, 트리쿠리스 수이스, 트리쿠리스 트리키우라, 트리쿠리스 디스콜로르 및 트리코세팔루스 트리키우리스, 안실로스토마 카니눔, 안실로스토마 브라질리엔세, 안실로스토마 듀오데날, 안실로스토마 세일라니쿰, 안실로스토마 튜바에포르메 및 안실로스토마 플루리덴타툼, 네카토르 아메리카누스, 및 운시나리아 스테노세팔라를 검출하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 회충, 편충 및/또는 구충의 검출은 하나 이상의 회충, 편충 및/또는 구충 항원, 예를 들어 Copro6728 및 CoproASP5 또는 예를 들어 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 또는 서열 38에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 서열의 항원 단편 및/또는 보존적 변이체, 및 CoproASP5의 존재 또는 부재를 검출함으로써 수행할 수 있다. 연충 분변항원에 대한 시험 중의 샘플이 분변일 경우, 분변의 가용성 부분은 당업계에 공지된 임의의 프로토콜에 의해 수집할 수 있다. 예를 들어, 본원의 실시예 섹션에서 설명되는 특정 프로토콜 이외에, 샘플의 가용성 부분은 일반적으로 여과, 추출, 원심분리, 또는 단순한 혼합, 이어서 중력 침강을 사용하여 수집할 수 있다. 당업자는 또한 포유동물로부터의 비-분변 샘플을 추출하고 제조하는 다양한 방식이 존재함을 알 것이다. 예를 들어, 샘플은 포유동물에서 천연적으로 배설 또는 방출되거나 또는 포유동물로부터 인공적으로 얻은 체액일 수 있다. 상기 인공적인 추출은 포유동물의 젖을 짜내거나 또는 주사기로 포유동물을 찔러 유체를 주사기 내로 빨아들임으로써 수행할 수 있다. 일단 수득하면, 유체를 임의로 분획화할 수 있다 (예를 들어, 혈청은 전혈로부터 분획화된 후, 샘플로서 사용될 수 있다). 다른 예로서, 샘플은 포유동물, 예를 들어 포유동물의 구강에 대한 면봉 채취에 의해 얻을 수 있다. 또 다른 예로서, 조직 절편은 생검에 의해 얻을 수 있다.
방법은 포유동물 샘플을, 항원/항체 복합체, 즉, 면역복합체가 형성하도록 하는 조건 하에 연충 분변항원에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 즉, 항체는 샘플에 존재하는 분변항원에 특이적으로 결합한다. 당업자는 상기 항원/항체 복합체 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있는 분석 및 조건을 잘 알고 있다. 예를 들어, 항원/항체 복합체는 항원/항체 복합체에 결합하는 2차 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 샘플 내의 항원과 항체 사이의 복합체의 형성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
또한, 하나의 특정 반응에서 형성되는 항체-항원 복합체의 상대적인 양은 상기 목적을 달성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 임의의 다른 반응에서 형성되는 것에 대해 측정할 수 있다. 시험 중의 샘플에 특이적 (회충, 편충 및/또는 구충) 항체-항원 복합체가 존재하는 것으로 결정될 때, 형성된 특이적 복합체를 기초로 하여 특이적 연충이 숙주 포유동물 내에 존재하고, 연충 (회충, 편충 및/또는 구충)이 존재한다고 결론을 내릴 수 있다. 이것이 사실일 때, 그로부터 시험 샘플을 얻은 포유동물은 장내 연충으로 감염되었다고 결론을 내릴 수 있다. 시험되는 포유동물이 장내 연충으로 감염되었다는 결론은 예를 들어 진단 서비스 제공처의 의사 또는 포유동물의 돌보는 사람, 예를 들어 포유동물의 수의사에 의해 내려질 수 있다. 포유동물이 연충에 감염되었고 연충이 존재한다고 포유동물의 돌보는 사람이 결정한 경우 (또는 연락을 받은 경우), 돌보는 사람은 일반적으로 기생 선충 감염보다는 포유동물에서 연충을 특이적으로 제거하도록 최적으로 설계된 치료 과정에 포유동물을 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 특정 연충 감염에 대한 치료를 받은 임의의 동물에서 감염이 없어졌는지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플이 회충 및 편충을 포함하지만 구충을 포함하지 않음을 알고 있는 돌보는 사람은 포유동물에게 회충에 최적으로 효과적인 약물 및 편충에 최적으로 효과적인 제2 약물을 투여함으로써 그로부터 회충에 대해 특이적인 샘플을 채취한 포유동물을 치료하기 위해 그 지식을 이용할 수 있다. 상기 지식이 없는 경우, 돌보는 사람은 예를 들어 회충에 대해서만 최적으로 효과적인, 편충에 대해서만 최적으로 효과적인, 또는 회충 및 편충에 최적으로 효과적이지 않은 약물로 포유동물을 치료할 수 있다 (이 경우에, 포유동물은 최적 미만의 (suboptimal) 치료가 시행될 위험에 처하게 될 것이다). 또한, 감염된 동물 또는 그의 배설물과 접촉할 수 있는 인간은 기생충 또는 기생충들의 감염에 대해 조심하도록 권고될 수 있다. 이러한 측면에서, 일부 연충, 예를 들어 회충 및 구충은 인간에서 심각한 질병 (예를 들어, 유충 유주증)을 유발하지만, 일반적으로 편충은 인간에서 중요한 인수 감염 역할을 하지 않는 것으로 인정되므로, 높은 특이성을 갖는 충 종을 결정하는 것이 중요하다.
본 발명의 방법의 단계는 포유동물 샘플을, 샘플 내의 존재하는 경우에 분변항원의 존재 하에 항체-분변항원 복합체를 형성하도록 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체; 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체를 포함하는 본 발명의 장치에 적용하고; 존재하는 경우에 항체-분변항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 회충의 항원에 특이적인 항체는 고체 지지체 또는 기질, 예를 들어 미세적정 웰, SNAP® 장치의 항체-고정 부분, 자성 비드, 비-자성 비드, 컬럼, 매트릭스, 멤브레인, 합성 또는 천연 섬유로 이루어진 섬유상 매트 (예를 들어, 유리 또는 세룰로스-기반 물질 또는 열가소성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에스테르), 입자형 물질 (예를 들어, 유리 또는 다양한 열가소성 중합체)로 이루어진 소결 구조체, 또는 니트로세룰로스, 나일론, 폴리술폰 등 (일반적으로 자연에서 합성임)으로 이루어진 주조 멤브레인 필름에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 이들 기질 물질은 모두 적합한 형상, 예를 들어 필름, 시트 또는 플레이트로 사용될 수 있거나, 적절한 불활성 담체, 예를 들어 종이, 유리, 플라스틱 필름 또는 직물 상에 코팅되거나 결합되거나 라미네이팅될 수 있다. 펩티드를 고체상 상에 고정하기 위한 적합한 방법은 이온성, 소수성, 공유 상호작용 등을 포함한다.
그러나, 본 발명의 방법은 고체상 또는 기질의 사용을 요구하지 않는다. 당업자는 고체상 또는 기질의 사용을 포함하지 않으면서 회충의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 발명의 방법이 수행될 수 있는 많은 방식이 존재함을 알 것이다. 단지 하나의 예에서, 고체상 또는 기질의 사용을 필요로 하지 않는 면역침전 방법을 수행할 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 항원/항체 복합체는 항체에 결합되는 지시약, 예를 들어 효소 접합체가 검출가능한 반응을 촉매할 때 검출된다. 임의로, 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약은 검출가능한 항원/항체/지시 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 항원/항체 복합체에 적용될 수 있다. 임의로, 항체는 항원/항체 복합체의 형성 전에 지시약으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법의 일부에서 항원/항체 복합체 또는 항원/항체/지시 복합체의 형성은 방사성 측정, 색도 측정, 형광 측정, 광도 측정, 크기-분리, 또는 침전 방법에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. 항원/항체 복합체의 검출은 또한 신호 발생 화합물을 포함하는 지시약에 결합되는 2차 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 폴리펩티드/항체 복합체와 회합된 신호 발생 화합물 (표지)를 포함하는 지시약은 상기 기재된 방법을 이용하여 검출할 수 있고, 발색제, 촉매, 예를 들어 효소 접합체, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 화학발광 화합물, 예를 들어 디옥세탄, 아크리디늄, 페난트리디늄, 루테늄 및 루미놀, 방사성 원소, 직접적 시각 표지, 및 보조인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함할 수 있다. 효소 접합체의 예는 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 등을 포함한다. 특정 표지의 선택는 중요하지 않지만, 이는 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 물질과 함께 신호를 발생할 것이다.
본 발명의 방법은 ELISA, RIA, 면역-형광 분석 (IFA), 적혈구응집반응 (HA), 형광 평광 면역분석 (FPIA), 및 미세적정 플레이트 분석 (즉, 미세적정 플레이트의 하나 이상의 웰에서 이루어진 임의의 분석)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 경쟁, 직접 반응 또는 샌드위치 (sandwich)형 분석에 기초한 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 하나의 분석은 가역적 유동 크로마토그래피 결합 분석을 포함하고, 이는 예를 들어, SNAP® 장치를 사용함으로써 수행할 수 있다 (미국 특허 5,726,010 참조).
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 샌드위치 또는 경쟁형 특이적 결합 분석을 용이하게 한다. 샌드위치 분석에서, 항원 포획 시약은 반응 구역 내에 고정된다. 이들 항원 포획 시약은 회충, 편충 및/또는 구충에 대해 시험되는 샘플 내의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 샘플로부터의 항원의 결합 후에, 항원 포획 시약/항원 복합체가 임의의 적절한 방법에 의해 검출된다. 예를 들어, 복합체는 표지된 특이적 결합 시약 (예를 들어, 효소-항체 접합체) 및 검출된 항원 (예를 들어, 기질과의 반응 시에)과 반응될 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 실시태양에서, 경쟁 분석을 수행한다. 경쟁 분석에서, 항원 포획 시약이 반응 구역 내에 고정되고, 샘플로부터의 항원 및 표지된 항원 (예를 들어, 항원-효소 접합체)와 동시에 접촉된다. 반응 구역에서 검출된 표지의 양은 샘플 내의 항원의 양에 역비례한다.
방법의 일부 실시태양에서, 회충, 편충 및 구충 분변항원에 특이적인 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 잠재적으로 회충, 편충 및/또는 구충으로부터의 항원을 포함하는 샘플을 기질에 첨가한다. 회충, 편충 및/또는 구충에 특이적으로 결합하는 항체가 첨가된다. 항체는 고체상에서 사용된 것과 동일한 항체일 수 있거나, 상이한 공급원 또는 종으로부터의 것일 수 있다. 또한, 이들 항체는 지시약, 예를 들어 효소 접합체에 연결될 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 (chromophore) 또는 효소 기질을 첨가할 수 있고, 색상을 발색시킬 수 있다. 색상 반응을 중단시킬 수 있고, 색상을 예를 들어, 분광광도계를 사용하여 정량할 수 있고/있거나, 색상을 인간 눈에 의해 주관적으로 평가할 수 있다.
방법의 다른 실시태양에서, 회충, 편충 및 구충 분변항원에 특이적인 항체가 고체상 또는 기질에 부착된다. 잠재적으로 회충, 편충 및/또는 구충 항원을 포함하는 샘플이 기질에 첨가된다. 분변항원에 특이적으로 결합하는 제2 항-종 항체가 첨가된다. 이들 제2 항체는 고체상 항체와는 상이한 종으로부터의 것이다. 제2 항체에 특이적으로 결합하고 고체상 항체에 특이적으로 결합하지 않는 제3 항-종 항체가 첨가된다. 제3 항체는 지시약, 예를 들어 효소 접합체를 포함할 수 있다. 각각의 첨가 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 발색단 또는 효소 기질을 첨가할 수 있고, 색상을 발색시킬 수 있다. 색상 반응을 중단시킬 수 있고, 색상을 예를 들어, 분광광도계를 사용하여 정량할 수 있고/있거나, 색상을 인간 눈에 의해 주관적으로 평가할 수 있다.
특정한 예에서, 본 발명의 방법은 제조된 포유동물 샘플을 장치의 유동 매트릭스에 제1 구역 (샘플 적용 구역)에서 첨가함으로써, 측방 유동 분석 장치인 장치에서 수행된다. 제조된 샘플은 유체 유동 경로 내에서 모세관 작용에 의해, 샘플 내의 항원에 결합하여 제1 복합체를 형성할 수 있는 입자형 표지가 존재하는 유동 매트릭스의 제2 구역으로 운반된다. 입자형 표지는 예를 들어, 회충 항원에 특이적인 항체에 접합된 착색 라텍스 입자, 염료 졸, 또는 금 졸일 수 있다. 제1 복합체는 회충 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 구별되는 위치에서 고정되어 있는 유동 매트릭스의 제3 구역으로 운반된다. 고정된 항체와 제1 복합체 사이에서 제2 복합체가 형성된다. 제2 복합체의 일부인 입자형 표지는 인간 눈에 의해 직접 가시화될 수 있다.
각각의 특이적 연충 항체는 반응 구역 (고체상) 내의 고정된 항원 포획 시약일 수 있다. 제2 항원 포획 시약, 즉, 표지에 접합된 제2 특이적 연충 항체가 샘플이 장치에 첨가되기 전에 샘플에 첨가될 수 있거나, 제2 항원 포획 시약은 장치 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 표지된 항원 포획 시약은 샘플 적용 구역 및 고체상 사이에 유체 소통을 제공하는 유체 유동 경로 상에 퇴적되고 건조될 수 있다. 표지된 항원 포획 시약을 시험 샘플과 접촉시키면 표지된 항원 포획 시약의 용해를 일으킬 수 있다.
본 발명의 방법의 한 실시태양에서, 특이적 연충 분변항원은 ELISA에 의해 검출된다. 본 발명의 ELISA 방법의 구체적인 예는 본원에 포함되는 실시예 섹션에 설명되어 있다. 본 발명은 이들 구체적인 ELISA 방법에 관하여 설명되지만, 당업자는 별도의, 추가의 또는 대체 ELISA 단계가 본 발명의 상기 방법을 통해 달성되는 기본 목표로부터 벗어나지 않으면서 사용될 수 있음을 알 것을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 연충 분변항원은 예를 들어, SNAP® 장치와 같은 측방 유동 장치를 사용함으로써 검출된다.
또한, 연충 감염의 검출을 위한 본 발명의 방법은 다른 유기체 또는 조건의 존재를 검출하기 위해 다른 진단 분석과 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분석은 하나 이상의 비-충 분변 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 하나 이상의 세균, 하나 이상의 혈액-매개 기생충 또는 잠혈 또는 그의 조합을 검출하는 시약과 조합될 수 있다. 단일 분석 장치 내에 2개 이상의 특유한 결합 부위 (예를 들어, SNAP® 분석 장치 상의 2개의 특유한 점 (spot))를 제공함으로써, 본 발명은 단일 샘플로부터 2 이상의 유기체의 검출을 허용한다. 한 실시태양에서, 단일 샘플로부터 3개의 유기체로부터의 과거의 또는 존재하는 감염 또는 기생충 감염의 검출을 위한 3개의 특유한 점 (점은 항원 또는 항체 결합 시약이다)이 존재한다 (즉, 동일한 개별 샘플이 단일 장치 상의 3개의 포획 시약에 노출된다). 또다른 실시태양에서, 단일 샘플로부터 4개의 유기체로부터의 과거의 또는 존재하는 감염 또는 기생충 감염의 검출을 위한 4개의 특유한 점 (점은 항원 또는 항체 결합 시약이다)이 존재한다 (즉, 동일한 개별 샘플이 단일 장치 상의 4개의 포획 시약에 노출된다). 그러나, 동일한 장치가 4개 초과의 특유한 점을 포함하고/하거나 4개 초과의 유기체의 검출을 허용할 수 있음을 이해해야 한다.
하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균의 검출을 위한 시약은 예를 들어, 하나 이상의 항체, 또는 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인지되는 하나 이상의 항원일 수 있다.
방법은 또한 임의로 본 발명의 핵산을 포함하고 이로 제한되지 않는, 회충, 편충 및 구충으로부터의 하나 이상의 핵산을 사용하여 포유동물 샘플 내에 회충, 편충 및/또는 구충의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 연충의 존재를 검출하기 위한 이들 핵산의 상기 용도는 항체에 의한 회충, 편충 및 구충의 검출을 포함한 방법의 임의의 다른 측면을 수행하기 전에, 수행한 후 또는 동시에 수행할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 특정 샘플 및 샘플이 얻어진 포유동물 내에서 회충, 편충 및/또는 구충이 검출되거나 검출되지 않거나, 또는 회충, 편충 및/또는 구충 감염이 있거나 있지 않은 것으로 진단된 후에, 샘플 (또는 진단된 포유동물로부터의 나중에 얻어진 샘플)을 본 발명의 임의의 하나 이상의 핵산을 포함한 임의의 하나 이상의 핵산의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 하나 이상의 핵산을 사용하여 특정 포유동물에서 특이적 연충을 검출하지 못하면 (하나 이상의 항체를 사용함으로써 연충이 검출된 후), 샘플 내에서 검출가능한 연충 핵산의 출현에 앞서 항체가 연충 분변항원을 검출한 가능성을 고려할 필요가 있을 것이다. 그러한 경우에, 포유동물을 돌보는 사람은 핵산이 연충을 검출하지 못한다는 관찰을 무시하고, 항체가 실제로 연충을 검출했다는 관찰에 기초하여 연충 감염에 대해 특이적으로 포유동물을 치료하는 것을 진행하도록 선택할 수 있다. 다른 측면에서, 핵산은 특정 포유동물 내에서 연충의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용되고, 이어서 기생충의 존재 또는 부재는 본 발명의 항체를 사용함으로써 추가로 평가된다. 하나 이상의 연충 핵산의 검출은 당업자에게 공지된 임의의 핵산 검출 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 그러한 검출은 PCR-기반 기술, 예를 들어, 비제한적으로 실시간 PCR-기반 기술을 수행함으로써 수행할 수 있다. 예시적인 PCR-기반 기술은 예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([PCR Protocols (Methods in Molecular Biology), 2nd ed., Bartlett and Stirling, eds., Humana Press (2003)]; 및 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)])에 기재되어 있다.
본 발명은 5개의 실시예를 참조하여 구체적으로 설명되지만; 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
달리 지시하지 않으면, 아래 설명된 바와 같은 실시예 1-4 중 하나 이상에 기재된 데이타를 생성하기 위해 다음의 물질 및 기술을 사용하였다.
폴리클로날 회충 항체 제조. 폴리클로날 항체 "항-DIV6728 pAB" (IgG)를 서열 21에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 토끼에서 생성시키고, 표준 방법을 이용함으로써 혈청으로부터 정제하였다. 간단히 설명하면, 항-DIV6728 pAB에 대해, 서열 17의 뉴클레오티드 76 내지 456을 벡터 (D8223 (pUC19의 유도체)) 내로 인-프레임 (in-frame)으로 클로닝하여 플라스미드 D8245를 생성하였다. 구체적으로, 그 서열의 N-말단에서 메티오닌 잔기 다음의 서열 21의 125개 아미노산은 서열 19의 일부에 대응하고, 서열 17의 클로닝된 부분에 의해 코딩된다. D8245 플라스미드에서, N-말단 메티오닌 잔기는 벡터가 서열 17로부터의 클로닝된 서열에 라이게이팅되는 그 플라스미드의 연결부에서 벡터 서열에 의해 코딩되었다.
이어서, 서열 21을 코딩하는 DNA 서열을 D8245 플라스미드로부터 제한 엑소뉴클레아제 분해 (NdeI 및 BamHI)에 의해 절단하고 정제하였다. 이어서, 상기 정제된 서열을 선형화된 발현 벡터, pET28a에 라이게이팅하고, 생성되는 원형 구성체 (pTDX198::DIV6728)를 BL21 (DE3) 이. 콜라이 (E. coli) 세포 내로 형질감염시켰다. (삽입체의 완전한 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다). His-태깅된 (tagged) 융합 단백질의 발현은 1 mM IPTG를 형질전환된 이. 콜라이의 배양액에 첨가하여 유도하였다. 재조합 단백질을 6 M 우레아 내에 가용화시키고, 니켈 친화도 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (상기 재조합 단백질은 이하 "rDIV6728"로서 칭한다).
rDIV6728을 토끼에 도입시킨 후, 항-DIV6728 pAB를 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 IgG 항체를 단리함으로써 면역화시킨 토끼의 혈장으로부터 정제하였다.
폴리클로날 편충 항체 제조. 폴리클로날 항체 "항-DIV6901 pAB" (IgG)를 서열 5에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 토끼에서 생성시키고, 표준 방법을 이용함으로써 혈청으로부터 정제하였다. 간단히 설명하면, 항-DIV6901 pAB의 경우에, 서열 1의 뉴클레오티드 89 내지 1147을 벡터 (D8223 (pUC19의 유도체)) 내로 인-프레임으로 클로닝하여 플라스미드 D9073을 생성하였다. 구체적으로, 그 서열의 N-말단에서 메티오닌 잔기 다음의 서열 5의 353개 아미노산은 서열 3의 일부에 대응하고, 서열 1의 클로닝된 부분에 의해 코딩된다.
이어서, 서열 5를 코딩하는 DNA 서열을 D9073 플라스미드로부터 제한 엑소뉴클레아제 분해 (NdeI 및 BamHI)에 의해 절단하고 정제하였다. 이어서, 상기 정제된 서열을 선형화된 발현 벡터 pET28a에 라이게이팅하고, 생성되는 원형 구성체 (ptDX233::DIV6901)를 이. 콜라이 세포 내로 형질감염시켰다. (삽입체의 완전한 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다). His-태깅된 융합 단백질의 발현은 1 mM IPTG를 형질전환된 이. 콜라이의 배양액에 첨가하여 유도하였다. 재조합 단백질을 6 M 우레아 내에 가용화시키고, 니켈 친화도 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (상기 재조합 단백질은 이하 "rDIV6901"로서 칭한다). 항-DIV6901 pAB를 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 IgG 항체를 단리함으로써 면역화시킨 토끼의 혈장으로부터 정제하였다.
폴리클로날 구충 항체 제조 및 단리. 폴리클로날 항체 항-ASP5-1 (IgG)를 서열 34에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 토끼에서 생성시키고, 표준 방법을 이용함으로써 혈청으로부터 정제하였다. 간단히 설명하면, 서열 32의 뉴클레오티드 50 내지 427을 플라스미드 내로 인-프레임으로 클로닝하였다. 구체적으로, 그 서열의 N-말단에서 메티오닌 잔기 다음의 서열 34의 129개 아미노산은 서열 33의 일부에 대응하고, 서열 32의 클로닝된 부분에 의해 코딩된다. 플라스미드 내에서, N-말단 메티오닌 잔기는 벡터가 서열 32로부터의 클로닝된 서열에 라이게이팅되는 그 플라스미드의 연결부에서 벡터 서열에 의해 코딩되었다.
이어서, 서열 32를 코딩하는 DNA 서열을 플라스미드로부터 제한 엑소뉴클레아제 분해 (NotI 및 SacI)에 의해 절단하고 정제하였다. 이어서, 상기 정제된 서열을 선형화된 발현 벡터, pET28a에 라이게이팅하고, 생성되는 원형 구성체를 BL21 (DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질감염시켰다. (삽입체의 완전한 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다). His-태깅된 융합 단백질의 발현은 1 mM IPTG를 형질전환된 이. 콜라이의 배양액에 첨가하여 유도하였다. 재조합 단백질을 6 M 우레아 내에 가용화시키고, 니켈 친화도 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. (상기 재조합 단백질은 이하 "rASP5-1"로서 칭한다).
rASP5-1을 토끼에 도입시킨 후, 항-ASP5-1 pAB를 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 IgG 항체를 단리함으로써 면역화시킨 토끼의 혈장으로부터 정제하였다.
개과동물 및 고양이과동물의 감염. 기생충 선충 감염은 회충 (톡소카라 카니스)의 약 150-300개의 유충화된 알, 구충 (안실로스토마 카니눔)의 150-300개의 감염성 유충, 또는 편충 (트리쿠리스 불피스)의 700개의 유충화된 알, 또는 임의의 3가지의 조합물을 건강한 개과동물 또는 고양이과동물에게 경구 투여함으로써 수행하였다. 감염은 이들 숙주 동물로부터 얻은 분변 샘플 내에서 충란의 현미경 관찰에 의해 확인하였다.
개과동물 및 고양이과동물 분변 샘플 제조. 기생충 감염이 없는 것으로 또는 회충, 구충 또는 편충 중 1, 2 또는 3개 모두로 감염된 것으로 알려진 개과동물 및 고양이과동물이 분변 샘플의 공급원으로 제공되었다. 동결된 무보존제 개과동물 또는 고양이과동물 분변 샘플로부터의 샘플 (대략 1 g)을 4 ml의 희석 용액 ("희석 용액"은 0.05 M Tris 염기; 1 mM EDTA; 0.45％ 카톤 (Kathon); 16 mg/l 겐타미신 술페이트; 0.05％ Tween-20; 40％ 태아 소 혈청; 10％ 토끼 혈청; 및 5％ 마우스 혈청이다) 내에 현탁시켰다. 현탁액을 테이블형 (tabletop) 원심분리기에서 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 제1 상등액을 생성하였다. 제1 상등액을 10,000 g에서 5분 동안 원심분리하여 본원에서 "분변 추출물"로서 언급되는 제2 상등액을 생성하였다.
ELISA 분석. 정제된 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB 및 항-Asp5-1 pAB (100 ㎕/웰; 실시예 2에 대해 3 ㎍/ml)를 4℃에서 철야로 이뮬론 1B 96-웰 플레이트 상에 물리적 흡착에 의해 고정시켰다. 이어서, 플레이트를 0.1 M Tris (pH 7.0) 중의 1％ BSA로 3시간 동안 실온에서 차단한 후, 0.1 M Tris 버퍼 (pH 7.0) 중의 2.5％ 수크로스에 의해 3시간 동안 실온에서 차단하고, 액체를 흡인시키고, 실온에서 건조시켰다. 대략 100 ㎕의 분변 추출물을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 이어서, 웰을 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 PBS-Tween-20 용액으로 5회 세척하였다. 별개의 반응 용기에서, 유리 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 및 항-Asp5-1 pAB를 가교결합제 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)를 사용하여 접합체를 생성함으로써 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지하고, 상기 접합체 (실시예 2에 대해 3 ㎍/ml)를 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 및 항-Asp5-1 pAB가 고정된 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 30분 인큐베이션 기간 후에, 비결합된 접합체를 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 PBS-Tween-20 용액을 사용하여 웰로부터 세척하였다. 이어서, 50 ㎕의 TMBLUE® 퍼옥시다제 기질 (세라케어 라이프 사이언시즈 (SeraCare Life Sciences, 미국 매사추세츠주 웨스트 브리지워터))을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 10분 인큐베이션 기간에 이어 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 사용하여 각각의 효소 반응을 중단시킨 후에, 96-웰 플레이트의 각각의 웰의 광학 밀도 (OD) 값을 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 각각의 웰에 대한 "OD650 값" (또는 보다 간단히 "OD 값")을 생성함으로써 표준 분광광도 기술에 의해 A650에서 측정하였다. 상기 배열에서, 96-웰 플레이트의 임의의 특정 웰에 대해 얻어진 OD 값은 웰 내에 존재하는 특이적으로 결합된 항원의 양에 정비례하였다 (IgG가 포화되지 않은 경우에).
실시예
1
측방 유동 형식으로 ELISA에 의해 시험될 때, 항-DIV6728 pAB는 회충 분변항원에 특이적으로 결합하고, 항-DIV6901 pAB는 편충 분변항원에 특이적으로 결합하고, 항-Asp5-1 pAB는 구충 분변항원에 특이적으로 결합한다. 연충 항체 및 그들의 비-특이적 구충제 사이에 교차 분변항원 결합은 존재하지 않았다. 항-DIV6728 pAB에 의한 회충 분변항원, 항-DIV6901 pAB에 의한 편충 분변항원, 및 항-Asp5-1 pAB에 의한 구충 분변항원의 특이적 결합은 인간 눈에 쉽게 관찰가능한 색도 변화를 일으킨다.
실시예 1의 목적은 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 및 항-Asp5-1 pAB가 측방 유동 ELISA에서 비-특이적 결합 없이 그들의 각각의 연충 분변항원을 포획하고 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있는지 결정하는 것이었다. 사용된 측방 유동 형식은 SNAP® 분석 장치로, 미국 특허 5,726,010에 설명된 것과 유사하다. 또한, 분석은 동일한 특허에 일반적으로 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 다른 성분 중에서, SNAP® 분석 장치는 샘플 도입 컵, 유동 매트릭스, 방해하는 입자형 물질을 제거하기 위한 샘플 프리필터 (prefilter) 패드, 특이적 결합 시약 패드, 반응 구역, 및 흡수 저장기를 포함하였다. 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 및 항-Asp5-1 pAB를 건조에 의해 반응 구역에서 작은 둥근 점 형태로 고정시켰다. 이어서, 반응 구역을 BSA로 차단하였다. 회충-감염된 개과동물로부터 모은 분변 추출물 (150 ㎕)을 200 ㎕ (1.0 ㎍/ml)의 접합된 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 또는 항-Asp5-1 pAB와 혼합하였다 (항체를 상기 기재된 바와 같이 HRP로 표지하기 전에 친화도-정제하였다). 상기 혼합물을 샘플 컵에 첨가한 후, 유동 매트릭스를 따라 유동시켰다. 유동 매트릭스 내에 있는 동안, HRP 표지된 항체는 분변 추출물 내에 존재하는 그들의 각각의 연충 분변항원에 특이적으로 결합하였다. 생성되는 복합체 (즉, HRP 표지된 항체 및 그들의 각각의 연충 분변항원을 포함하는 것)를 반응 구역에서 고정된 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 또는 항-Asp5-1 pAB에 특이적으로 결합시켰다. 유동 매트릭스를 따른 유동은 흡수 저장기를 유동 매트릭스와 접촉시킴으로써 역전되었다. 이때, 임의의 비결합 성분을 제거하기 위해 및 존재하는 임의의 분석물 복합체의 검출을 위해 검출기 및 세척 용액을 유동 매트릭스 내로 이동시켰고, 여기서 포획 시약은 반응 구역 상에 고정시켰다. (상기 검출 단계는 약 8분 지속하였다). 분석물 복합체의 검출 중지는 분석물 복합체를 0.1％ 나트륨 아지드에 노출시킴으로써 일으켰다.
도 1C-E에 도시된 바와 같이, 회충, 편충 및 구충 특이적 항체가 별개의 반응 구역 상으로 고정되는 경우의 연충 특이적 분석물 복합체의 검출은 회충 감염 (1D), 편충 감염 (1E) 및 구충 감염 (1C)에 대해 시각적으로 명백하였다. 도 1A에 도시된 음성 대조군 샘플에서 (희석 용액만), 분석물 복합체가 검출되지 않았다. 도 1B에 도시된 음성 대조군 샘플에서, 항체가 별개의 장치의 반응 구역에 고정되는 경우에 분석물 복합체가 검출되지 않았다 (음성 대조군 샘플은 연충 감염이 없는 개과동물로부터 얻은 분변 추출물의 풀 (pool)이었다). 따라서, 이들 데이타는 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB, 및 항-Asp5-1 pAB가 각각의 연충 분변항원에 따로 및 특이적으로 결합하도록 측방 유동 ELISA 형식으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 상기 특이적 결합은 인간 눈에 쉽게 보인다.
실시예
2
미세적정 접시 형식으로 ELISA에 의해 시험할 때, 항-DIV6728 pAB는 회충 분변항원에 특이적으로 결합하지만, 구충, 편충 또는 사상충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않고; 항-DIV6901 pAB는 편충 분변항원에 특이적으로 결합하지만, 구충, 회충 또는 사상충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않고; 항-Asp5-1 pAB는 구충 분변항원에 특이적으로 결합하지만, 회충, 편충 또는 사상충으로부터의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않는다. 항-DIV6728 pAB에 의한 회충 분변항원의, 항-DIV6901 pAB에 의한 편충 분변항원의, 및 항-Asp5-1 pAB에 의한 구충 분변항원의 특이적 결합은 인간 눈에 쉽게 관찰가능한 색도 변화를 일으킨다.
실시예 2의 목적은 항-DIV6728 pAB, 항-DIV6901 pAB 및 항-Asp5-1 pAB를 고체 지지체 상에 고정시키면서 항-DIV6728 pAB와 회충 분변항원 사이; 항-DIV6901 pAB와 편충 분변항원 사이; 및 항-Asp5-1 pAB와 구충 분변항원 사이의 특이적 결합이 인간 눈에 관찰가능한 색도 변화를 일으킬 수 있는지 결정하는 것이다.
도 2를 살펴보면, 항-DIV6728 pAB (3 ㎍/ml)를 앞서 설명된 바와 같은 미세적정 플레이트의 웰 D1-D12 및 E1-E12의 저변 표면 상에 고정시키고, 항-DIV6901 pAB를 웰 G1-G12 및 H1-H12의 저변 표면 상에 고정시키고, 항-Asp5-1 pAB를 웰 A1-A12 및 B1-B12의 저변 표면 상에 고정시켰다. 상기 고정 후에, A3, B3, D3, E3, G3 및 H3 웰을 사상충에 감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다 (도 2에서 "HW"로 나타냄). A4, B4, D4, E4, G4 및 H4 웰을 제1 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A5, B5, D5, E5, G5, 및 H5 웰을 제2 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A6, B6, D6, E6, G6, 및 H6 웰을 제3 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A7, B7, D7, E7, G7 및 H7 웰을 제1 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A8, B8, D8, E8, G8, 및 H8 웰을 제2 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A9, B9, D9, E9, G9, 및 H9 웰을 제3 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A10, B10, D10, E10, G10, 및 H10 웰을 제1 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A11, B11, D11, E11, G11, 및 H11 웰을 제2 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시키고, A12, B12, D12, E12, G12, 및 H12 웰을 제3 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출시켰다. A1, B1, D1, E1, G1 및 H1 웰을 rDIV6728, rDIV6901, 및 rAsp5-1 (1 ㎍/ml)에 노출시키고, 따라서 이들 웰은 양성 대조군으로서 역할을 하였다. A2, B2, D2, E2, G2, 및 H2 웰을 임의의 분변 추출물 또는 rDIV6728, rDIV6901, 및 rAsp5-1에 노출시키지 않았고, 따라서 이들 웰은 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 세척한 후, 웰 D1-12 및 E1-12를 상기 기재된 바와 같이 3 ㎍/ml에서 HRP-표지된 rDIV6728 pAB에 노출시키고; 웰 G1-G12 및 H1-H12를 HRP-표지된 rDIV6901 pAB에 노출시키고; 웰 A1-A12 및 B1-B12를 HRP-표지된 rAsp5-1 pAB에 노출시켰다.
이들 모든 웰을 TMBLUE® 퍼옥시다제 기질과 함께 인큐베이팅하고 SDS를 후속적으로 첨가한 후, 색도 변화가 회충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 항-DIV6728 pAB 웰 (D7-D9 및 E7-E9) 내에서 시각적으로 관찰되었지만, 구충, 편충 또는 사상충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 임의의 항-DIV6728 pAB 웰 내에서 색도 변화가 관찰되지 않았다. 색도 변화는 편충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 항-DIV6901 pAB 웰 (G10-G12 및 H10-H12) 내에서 시각적으로 관찰되었지만, 구충, 회충 또는 사상충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 임의의 항-DIV6901 pAB 웰 내에서 색도 변화가 관찰되지 않았다. 색도 변화가 구충-감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 항-Asp5-1 pAB 웰 (A4-A6 및 B4-B6) 내에서 시각적으로 관찰되었지만, 회충, 편충 또는 사상충으로 감염된 개과동물로부터의 분변 추출물에 노출된 임의의 항-Asp5-1 pAB 웰 내에서 색도 변화가 관찰되지 않았다.
이들 데이타는 강하고 인간 눈에 쉽게 보이는 색도 변화를 일으키기에 충분하게 ELISA 형식에서 항-DIV6728 pAB가 회충을 검출하고; 항-DIV6901 pAB가 편충을 검출하고; 항-Asp5-1 pAB가 구충을 검출함을 나타낸다. 추가로, 이들 데이타는 그러한 색도 변화로 인해 인간 눈이 회충, 구충 및 편충을 함유하는 연충 특이적 분변 샘플들 사이를 쉽게 구분함을 나타낸다.
실시예
3
DIV6728의 말단절단된 버전인 Copro6728이 티. 카니스 감염된 개과동물 분변 내에 존재한다.
A. 개과동물 분변 샘플 제조
회충 (티. 카니스) 감염이 있는 것으로 또는 기생충 감염이 없는 것으로 공지된 개과동물이 분변 샘플의 공급원이다. 5마리의 회충-감염된 개과동물 또는 감염되지 않은 개과동물로부터 모은 동결된 무보존제 개과동물 분변의 샘플 (대략 1 g)을 4 ml의 추출 버퍼 ("추출 버퍼"는 0.05％ Tween-20이 존재하는 1X 포스페이트-완충 염수 (PBS) (pH 7.0-7.5)이다) 내에 현탁하였다. 상기 현탁액을 2분 동안 볼텍싱 (vortexing)한 후, 13,000 rpm에서 25분 동안 원심분리하여 제1 상등액을 생성하였다. 이어서, 상기 제1 상등액을 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 제2 상등액을 생성하였다. 상기 제2 상등액을 이하 "분변 추출물"로서 칭한다.
B. 이온 교환
이온 교환 크로마토그래피에 의해 분변 샘플로부터 Copro6728을 농축할 수 있다. 본 연구를 위해 PLRS 샘플을 사용하였다. 분변 샘플을 PBST (0.05％ Tween 20) (pH 7.3)로 먼저 추출하였다. 샘플을 먼저 시트르산나트륨 버퍼 (pH 3.0)로 희석시킨 후, HCl로 pH를 3으로 조정하였다. 마지막으로, 샘플을 원심분리하고, 상등액을 술포프로필 (SP) 컬럼 상에 로딩하였다. SP 컬럼을 1 M NaCl이 있는 20 mM 시트르산나트륨 버퍼 (pH 3)로 용출시키고, 용출 분획을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트를 토끼 항-6728 IgG로 3 ㎍/ml에서 코팅하였다. 도 15에 도시된 결과를 기초로 하여, Copro6728은 SP 컬럼을 1 M NaCl이 있는 시트르산나트륨 버퍼로 용출함으로써 부분적으로 정제되고 농축될 수 있고, Copro6728은 A11 및 C9 사이의 분획 내에 존재함이 명백하다 (도 15)
C. 웨스턴 블로팅 및 SDS-PAGE
웨스턴 블로팅 및 SDS-PAGE 겔은 Copro6728의 분자량이 약 7 kD임을 보여주었다. SP 컬럼으로부터 용출 분획을 혼합하고, NaOH로 버퍼 pH를 7로 조정한 후, 토끼 항-6728 IgG를 아미노링크 (AminoLink) 수지 (피어스 (Pierce), 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))와 연결함으로써 제조한 친화도 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 세척하고 제조자의 지시에 따라 용출시켰다. 용출 분획을 10개의 웰 4-12％ Bis-Tris 구배 겔에 로딩하고, 웨스턴 블로팅을 위해 니트로세룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 토끼 항-6728IgG-HRP로 프로빙할 때, 웨스턴 블로팅은 주요 밴드 (Copro6728)이 약 7 kD임을 보여주었다 (도 16의 적색 화살표). 추가로 농축한 후, 동일한 샘플을 임페리얼 프로테인 스테인 (피어스, 써모 사이언티픽)을 사용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 가시화하였다. 항-6728IgG-HRP에 의해 지시된 크기에 대응하는 7 kD 밴드가 가시적이다 (도 17의 적색 화살표).
D. 질량분광법 분석
SDS-PAGE 겔로부터 절개한 밴드(도 17에서 적색 화살표로 지시함)에 대한 질량분광법 분석은 상기 밴드가 Copro6728을 함유하고, DIV6728의 C-말단 부분이 Copro6728을 함유함을 나타냈다.
웨스턴 블로팅 상의 7 kD 밴드에 대응하는 7 kD 밴드를 SDS-PAGE 겔로부터 절개하고, 질량분광법 분석을 위해 예일 대학교의 켁 센터 (Keck Center at Yale University)로 보냈다. 겔 내의 샘플을 먼저 트립신으로 분해시킨 후, 얼티마 (Ultima) 질량 분광기 (워터스 (Waters))의 Q-Tof를 이용하여 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 2개의 특이적인 펩티드가 질량분광법 분석에 의해 샘플 내에서 발견되었다: 펩티드 1: R.FVPCTR.N (서열 35) 및 펩티드 2: R.DAEGNCIK.F (서열 36).
DIV6728 (서열 21) 및 MS 분석에 의해 확인된 2개의 펩티드의 서열에 대한 정렬 분석은 두 펩티드가 모두 전장 DIV6728의 C 말단에 위치하는 것을 나타내고, 이것은 웨스턴 블롯에 의해 확인된 7 kb 밴드가 DIV6728로부터 유래됨을 확인하는 것이다. 2개의 펩티드 서열의 위치는 DIV6728의 C-말단 부분 (Copro6728)이 티. 카니스 양성 분변 샘플 내에 존재하였음을 나타낸다. 도 18은 음영진 상자로 강조한, MS 분석에 의해 확인된 2개의 펩티드가 존재하는 전장 DIV6728 (서열 21)을 보여준다.
실시예
4
DIV6728의 N-말단 부분 내의 64개 아미노산 및 DIV6728의 C-말단 부분 내의 65개 아미노산에 대응하는 2개의 재조합 단백질을 생성하였다.
MS 분석, 웨스턴 블로팅 및 SDS-PAGE 데이타에 기초하여, DIV6728의 말단절단부를 코딩하는 2개의 새로운 발현 구성체를 제조하였다. 이들을 전장 DIV6728의 N-말단 및 C-말단에 대해 각각 6728N (서열 37) 및 6728C (서열 38)로 명명하였다. 도 19는 구성체에 의해 코딩된 6728N (서열 37) 및 6728C (서열 38) 아미노산 서열의 정렬을 보여준다.
A. 재조합 6728N 및 6728C를 발현시키기 위한 합성 유전자
6728N 및 6728C 폴리펩티드를 발현시키기 위한 유전자는 이. 콜라이 내에서의 발현을 취해 최적화된 코돈이고, 이를 합성하고 각각의 재조합 단백질 (진아트 (독일 로겐스부르크 11D-93053 요세프-엥게르트-스트라쎄))의 N-말단에서 6개의 His(6) 태그를 갖는 벡터 pET28(a) 내로 클로닝하였다.
B. 재조합 단백질 6728N 및 6728C 발현
재조합 단백질 6728N 및 6728C를 이. 콜라이 BL21(DE3) 내에서 발현시키고 단일 니켈 컬럼으로 정제하였다. 플라스미드 pET28(a) 6728N을 BL21(DE3) 내로 형질전환시키고, OD ~0.8로 성장시키고, 1 mM IPTG (이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)로 37℃에서 2시간 동안 유도하였다. 세포를 마이크로플루이다이저 (Microfluidizer)® 프로세서 (Processor), M-11EH를 사용하여 용해시켰다. 재조합 6728N을 500 mM NaCl이 있는 20 mM Tris 버퍼 (pH 8.0) 내에 가용화시키고, 니켈 컬럼을 500 mM NaCl이 있는 20 mM Tris 버퍼 (pH 8.0) 내의 상이한 농도의 이미다졸로 용출시키는 단계에 의해 정제하였다. 재조합 6728N은 니켈 컬럼으로부터 500 mM 이미다졸이 있는 동일한 버퍼에 의해 용출되었다. 도 20은 재조합 6728N의 정제를 검토하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 재조합 6728N은 겔 상에서 크기가 약 ~12 kD (레인 9)이다.
플라스미드 pET28(a) 6728C를 BL21(DE3) 내로 형질전환시키고, OD ~0.8로 성장시키고, 1 mM IPTG (이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)로 37℃에서 2시간 동안 유도하였다. 세포를 마이크로플루이다이저® 프로세서, M-11EH를 사용하여 용해시켰다. 재조합 6728C를 500 mM NaCl이 있는 20 mM Tris 버퍼 (pH 8.0) 내에 가용화시키고, 니켈 컬럼을 500 mM NaCl이 있는 20 mM Tris 버퍼 (pH 8.0) 내의 상이한 농도의 이미다졸로 용출시키는 단계에 의해 정제하였다. 재조합 6728C는 니켈 컬럼으로부터 500 mM 이미다졸이 있는 동일한 버퍼에 의해 용출되었다. 도 21은 재조합 6728C의 정제를 확인하기 위해 상이한 샘플을 로딩한 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 재조합 6728C는 상기 겔 상에서 크기가 약 ~12 kD (레인 9)이다.
C. 토끼 폴리클로날 항체
6728C에 대해 생성시킨 토끼 폴리클로날 항체는 분변 ELISA에서 항원을 검출하는 반면, 6728N에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 분변 ELISA에서 항원을 검출하지 않는다.
단일 니켈 컬럼으로 정제한 재조합 단백질 6728N 및 6728C를 사용하여 폴리클로날 항체 생산을 위해 토끼를 면역화시켰다. 면역화시킨 토끼 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 단백질 G 수지로 친화도 정제하고, 2 ㎍/ml에서 이뮬론 I 플레이트를 코팅하기 위해 사용하였다. 4개의 상이한 개과동물 샘플을 상이한 항체 코팅된 플레이트로 시험하였다. 재조합 6728C로 면역화시킨 2마리의 토끼로부터의 항체는 티. 카니스 양성 분변 샘플을 구충, 편충 양성 샘플 및 선충 음성 샘플로부터 구분할 수 있다. 그러나, 재조합 6728N으로 면역화시킨 2마리의 토끼로부터의 항체는 티. 카니스 양성 분변 샘플을 구충, 편충 양성 샘플 및 선충 음성 샘플을 구분할 수 없다 (도 22). 상기 ELISA 데이타는 Copro6728이 전장 DIV6728의 C-말단 부분임을 추가로 입증한다. 추가의 실험에서는 6728N 및 6728C에 대해 생성된 항체가 교차반응 없이 단지 그들의 동족체 재조합 단백질을 인식함을 보여주었다 (도 23). 이들 폴리클로날 항체는 둘 모두 예상된 바와 같이 전장 재조합 DIV6728과 반응한다 (도 23).
D. 웨스턴 블로팅
재조합 6728C에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 항체는 웨스턴 블로팅에서 티. 카니스 양성 분변 샘플을 인식할 수 있지만, 재조합 6728N에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 그렇지 않다. 티. 카니스 전체 충 추출물 (레인 1)에 추가로, 선충 음성 (레인 2-4) 및 티. 카니스 양성 (레인 5-7) 분변 샘플을 고염 용출 버퍼 (20 mM 시트르산나트륨 버퍼 (pH 3) 중 1 M NaCl)를 사용하는 SP 컬럼에 의해 분획화하였다. 티. 카니스 충 추출물 (레인 1), 컬럼 상에 로딩된 샘플 (레인 2 및 5), 컬럼 관통물 (flow-through) (레인 3 및 6), 및 컬럼 용출물 (레인 4 및 7)을 10개의 웰, 4-12％ Bis-Tris 구배 겔에 로딩한 후, 니트로세룰로스 멤브레인으로 더 옮기고, 도 24-26에 지시된 바와 같이 상이한 접합체로 프로빙하였다. 항-전장 6728 IgG-HRP 및 항-6728C-IgG-HRP 모두는 티. 카니스 양성 분변 샘플을 선충 음성 분변 샘플로부터 구분할 수 있다 (도 24 및 25). 그러나, 항-6728N IgG-HRP는 이들 2가지 상이한 분변 샘플을 구분할 수 없다 (도 26). 이들 데이타는 Copro6728이 전장 DIV6728의 크기의 단지 약 절반임을 더욱 확인하였고, 이는 질량분광법 분석 및 분변 ELISA로부터 얻어진 데이타와 일치한다.
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Claims (42)
- (a) 포유동물로부터의 샘플을
(i) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체;
(ii) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및
(iii) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체
로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체와 접촉시키고;
(b) 존재하는 경우에 샘플 내의 분변항원의 존재 하에 항체-분변항원 복합체를 형성시키고;
(c) 존재하는 경우에 항체-분변항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것
을 포함하는, 샘플 내에 하나 이상의 연충 항원의 존재 또는 부재를 검출하는 방법. - (a) 포유동물로부터의 샘플을
(i) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체;
(ii) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및
(iii) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체
로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체와 접촉시키고;
(b) 존재하는 경우에 샘플 내의 분변항원의 존재 하에 항체-분변항원 복합체를 형성시키고;
(c) 존재하는 경우에 항체-분변항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하고;
(d) (i) 회충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 포유동물에서의 회충 감염의 존재 여부를 진단하기 위해 요구되는 정보를 제공하고;
(ii) 편충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 포유동물에서의 편충 감염의 존재 여부를 진단하기 위해 요구되는 정보를 제공하고;
(iii) 구충 항체-분변항원 복합체가 존재할 경우 포유동물에서의 구충 감염의 존재 여부를 진단하기 위해 요구되는 정보를 제공하는 단계
를 포함하는, 포유동물이 하나 이상의 기생충으로 감염되었는지를 진단하기 위해 요구되는 정보를 제공하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 제1 항체가 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 38, 및 Copro6728로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나; 또는 제1 항체가 전체 회충의 추출물, 또는 회충 생식 기관의 추출물, 또는 회충 창자의 추출물에 대해 생성시킨 것이고;
(b) 제2 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고;
(c) 제3 항체가 서열 33, 서열 34, 및 CoproASP5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고,
여기서, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항체가 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 38, 및 Copro6728로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나; 또는 제1 항체가 전체 회충의 추출물, 또는 회충 생식 기관의 추출물, 또는 회충 창자의 추출물에 대해 생성시킨 것이고, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제3 항체가 서열 33, 서열 34, 및 CoproASP5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플이 개과동물 또는 고양이과동물인 포유동물로부터 얻은 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 회충이 톡소카라 카니스 (Toxocara canis) 또는 톡소카라 카티 (Toxocara cati), 톡소카라 비툴로룸 (Toxocara vitulorum), 톡사스카리스 레오니나 (Toxascaris leonina), 바일리사스카리스 프로시오니스 (Baylisascaris procyonis), 아스카리디아 갈리 (Ascaridia galli), 파라스카리스 에쿠오룸 (Parascaris equorum), 아스카리스 수움 (Ascaris suum), 아스카리스 룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides), 아니사키스 심플렉스 (Anisakis simplex), 또는 슈도테라노바 데시피엔스 (Pseudoterranova decipiens)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 편충이 트리쿠리스 불피스 (Trichuris vulpis), 트리쿠리스 캄파눌라 (Trichuris campanula), 트리쿠리스 세라타 (Trichuris serrata), 트리쿠리스 수이스 (Trichuris suis), 트리쿠리스 트리키우라 (Trichuris trichiura), 트리쿠리스 디스콜로르 (Trichuris discolor) 및 트리코세팔루스 트리키우리스 (Trichocephalus trichiuris)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 구충이 안실로스토마 카니눔 (Ancylostoma caninum), 안실로스토마 브라질리엔세 (Ancylostoma braziliense), 안실로스토마 듀오데날 (Ancylostoma duodenal), 안실로스토마 세일라니쿰 (Ancylostoma ceylanicum), 안실로스토마 튜바에포르메 (Ancylostoma tubaeforme) 및 안실로스토마 플루리덴타툼 (Ancylostoma pluridentatum), 네카토르 아메리카누스 (Necator americanus), 및 운시나리아 스테노세팔라 (Uncinaria stenocephala)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 회충 분변항원, 구충 분변항원, 및/또는 편충 분변항원이 분변 샘플로부터 유래한 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 항체가 사상충으로부터 유래한 임의의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계가 적어도 하나의 복합체에 결합하는 적어도 하나의 2차 항체를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 적어도 하나의 2차 항체가 표지된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 항체 중 하나 이상이 표지된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 항체가 고체 지지체 상에 고정된 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 고체 지지체가 효소 연결 면역흡착 분석 장치의 일부를 형성하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 효소 연결 면역흡착 분석 장치가 측방 유동 면역분석 장치인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 비-충 (non-worm) 기생충, 사상충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 및 하나 이상의 세균으로 이루어지는 군 중의 하나 이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약과 샘플을 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약이 하나 이상의 비-충 기생충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균 또는 하나 이상의 세균에 특이적인 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 회충, 편충 또는 구충으로부터 유래한 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 더 포함하고, 상기 핵산이 서열 1, 서열 2, 서열 10, 서열 11, 서열 17, 서열 18, 서열 24, 서열 25, 서열 31, 서열 32, 서열 38, Copro6728을 코딩하는 핵산, 및 CoproASP5를 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 방법.
- 제21항에 있어서, 핵산의 존재 또는 부재를 결정하는 단계가 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-기반 분석을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- (a) 편충 또는 구충 분변항원이 아니라 회충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체;
(b) 회충 또는 구충 분변항원이 아니라 편충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체; 및
(c) 편충 또는 회충 분변항원이 아니라 구충 분변항원에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체
로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 2개의 항체가 위에 고정된 고체 지지체를 포함하는, 샘플로부터 하나 이상의 연충 항원의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 장치. - 제23항에 있어서, 하나 이상의 종류의 회충 항원, 편충 항원, 및/또는 구충 항원을 더 포함하고, 하나 이상의 종류의 회충 항원, 편충 항원, 및 구충 항원이 항체에 특이적으로 결합된 것인 장치.
- 제23항 또는 제24항에 있어서,
(a) 제1 항체가 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 38, 및 Copro6728로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나; 또는 제1 항체가 전체 회충의 추출물, 또는 회충 생식 기관의 추출물, 또는 회충 창자의 추출물에 대해 생성시킨 것이거나;
(b) 제2 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나;
(c) 제3 항체가 서열 33, 서열 34, 및 CoproASP5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것이고,
여기서, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 장치. - 제23항 또는 제24항에 있어서, 제1 항체가 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 38, 및 Copro6728로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있거나; 또는 제1 항체가 전체 회충의 추출물, 또는 회충 생식 기관의 추출물, 또는 회충 창자의 추출물에 대해 생성시킨 것이고, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖는 것인 장치.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 제2 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 장치.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 제3 항체가 서열 33, 서열 34, 및 CoproASP5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 장치.
- 제23항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 항체가 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 33, 서열 34, 서열 38, Copro6728, 및 CoproASP5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용한 면역화에 의해 얻은 것이고, 상기 Copro6728이 서열 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 일부이며 서열 21의 아미노산 91 내지 123을 포함하고 7 kDa의 분자량을 갖고, 상기 CoproASP5가 서열 33의 N-말단 28 kDa 단편인 장치.
- 제23항에 있어서, 샘플이 분변 샘플인 장치.
- 제30항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 항체가 사상충으로부터 유래된 임의의 분변항원에 특이적으로 결합하지 않는 것인 장치.
- 제23항, 제24항 및 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 효소 연결 면역흡착 분석 장치인 장치.
- 제32항에 있어서, 효소 연결 면역흡착 분석 장치가 측방 유동 면역분석 장치인 장치.
- 제23항, 제24항 및 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 개과동물 또는 고양이과동물로부터 얻은 것인 장치.
- 제23항, 제24항 및 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 하나 이상의 비-충 기생충, 사상충, 하나 이상의 바이러스, 하나 이상의 진균, 및 하나 이상의 세균으로 이루어지는 군 중의 하나 이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 더 포함하는 것인 장치.
- 제23항 또는 제24항에 따른 장치 및 하나 이상의 항원의 검출에 충분한 하나 이상의 시약을 포함하는, 포유동물 샘플에서 하나 이상의 회충 분변항원, 하나 이상의 편충 분변항원 및/또는 하나 이상의 구충 분변항원의 검출을 위한 키트.
- 제36항에 있어서, 하나 이상의 시약이 하나 이상의 지시약, 하나 이상의 항체 표지 화합물, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 항원 포획 시약, 하나 이상의 억제제, 및 하나 이상의 세척 시약으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 키트.
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