CN105606807A - 检测犬恶丝虫病的elisa诊断试剂盒 - Google Patents

检测犬恶丝虫病的elisa诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，属于免疫学领域。本发明解决的技术问题是提供检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，该试剂盒包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原。本发明利用从犬恶丝虫转录组数据中鉴定筛选组装的Di-TCTP基因，在大肠杆菌BL21中诱导表达获得Di-TCTP蛋白为抗原，建立间接ELISA方法检测犬科动物犬恶丝虫感染。该方法特异性高、灵敏度强，并且操作简单，检测快速，易于判断结果。

Description

检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，属于免疫学领域。
背景技术
犬恶丝虫(亦称犬心丝虫)是心肺心丝虫病的病原体，主要寄生于温带、热带地区的家养犬猫及野生哺乳动物体内。作为一种以蚊媒形式传播的人畜共患传染病病原，该虫可导致人的犬恶丝虫病。此外，一些血清制品也可能会导致人的犬恶丝虫病。通常，狗作为犬恶丝虫的天然宿主，其成虫大多寄生在狗的肺动脉和右心室，而其微丝蚴则分散与狗的血液循环系统。患病狗常因感染少量虫体而不表现出病状，但是其血液中的微丝蚴或循环性犬恶丝虫抗原却是目前诊断该病的主要依据；并且在一些没有微丝蚴的隐性感染情况下，抗原检测被认为是最敏感的检测方法。因此鉴定和筛选一种犬恶丝虫特异的、敏感的分子诊断抗原将对该虫病的防控奠定基础。
发明专利CN102798716公开了一种犬恶丝虫ELISA检测试剂盒及其制备方法，利用从犬恶丝虫成虫cDNA表达文库中筛选出的与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白同源为88％的MTFP基因，并在大肠杆菌质粒中表达获得的MTFP蛋白作为抗原，通过间接ELISA法检测犬的犬恶丝虫感染。该方法可快速检测犬恶丝虫感染，但是，其灵敏度有待进一步的提高，特别是对单一的雌虫或雄虫感染，其检测结果并不准确。
因此，亟需一种检测灵敏度高的ELISA检测试剂盒。
自肿瘤蛋白(TCTP)从小鼠埃利希腹水瘤细胞和红白血病细胞内被最次描述以来，该蛋白已在不同的生物，如哺乳动物、植物、较低的真核生物和原核生物内被发现和报道。此外，在寄生虫中，tctp基因还被发现存在于恶性疟原虫、约氏疟原虫、布氏锥虫、秀丽隐杆线虫、马来丝虫及班氏丝虫体内。重要的是，由于丝虫肿瘤蛋白的钙结合特性和组胺释放功能，该蛋白目前已被认定与犬恶丝虫的致病性以及其在宿主体内的存活息息相关。当前，相关研究对于TCTP在寄生虫中的生理角色已有了详细了解，然而对于该蛋白质在丝虫寄生虫阶段是否具有免疫原性仍知之甚少。有报道称在马来丝虫的微丝蚴和成虫体内均可检测到高水平的TCTP蛋白质表；并且作为一种分泌蛋白，马来丝虫肿瘤蛋白(Bm-TCTPs)在其微丝蚴的分泌、排泄物中含量丰富，可引起宿主免疫反应。鉴于上述研究结果，本发明的发明人推测丝虫的TCTP同系物在丝虫病的检测上应该具有潜在免疫诊断价值。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒。
本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如SEQIDNo.1所示；
所述洗涤液为PBST，所述PBST为磷酸盐吐温缓冲液；
所述封被液为3wt％牛血清蛋白；
所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；
所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为2.5NH2S04。
其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：
a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；
b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；
c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；
d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得Di-TCTP蛋白抗原。
进一步的，所述PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；最后72℃延伸10min。
所述表达载体为pET-28a(+)。
本发明解决的第二个技术问题是提供检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，该方法可以检测血清以及血清制品中是否存在犬恶丝虫。
本发明检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，包括如下步骤：
a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，过夜，再使用PBST彻底清洗四次；
b、将已包被的ELISA板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再使用PBST彻底清洗四次；
c、加入待测血清100μL到孔内，室温处理1h，再加入HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应1h后，使用PBST彻底清洗四次；
d、加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；显色反应由2.5NH2S04终止，在波长为450nm的光波下读取吸光度；
e、根据吸光度值判断检测结果。
其中，a步骤所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被浓度为2.5μg/mL；c步骤所述的HRP标记的羊抗狗IgG二抗稀释度为1:5000。
其中，d步骤所述的显色时间为5～30min，优选显色时间为10min。
e步骤所述的根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为：若吸光度值大于或等于0.294，则血清中存在犬恶丝虫，若吸光度值小于0.294，则血清中不存在犬恶丝虫。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)新基因筛选方法先进：本发明是通过高通量测序技术从犬恶丝虫的转录组数据中筛选到的Di-TCTP基因。
(2)敏感性高：以Di-TCTP蛋白作为抗原，不仅能检测单一的雌虫感染，而且还能检测所有的雄虫感染。因此优于CN201110419523.6公开的以MTFP蛋白作为抗原建立的ELISA检测试剂盒。
(3)特异性强：本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒分别评估感染有犬钩虫，犬弓蛔虫和豆状带绦虫3种不同寄生虫的6份犬血清，均为阴性，表明该试剂盒特异性强。
附图说明
图1为Di-TCTP基因二级结构。
图2为预测的Di-TCTP蛋白三级结构，其中，深色粗线为α-螺旋，浅色粗线为延伸链，其余细线为无规卷曲。
图3a为Di-TCTP蛋白SDS-PAGE电泳图；图3b为Di-TCTP蛋白免疫印迹图；图中，箭头表明Di-TCTP蛋白位置。
具体实施方式
本发明借助第二代测序技术所产生的犬恶丝虫成虫转录组中20810个独特的转录表达基因(unigenes)和15698个编码序列(CDS)数据集，鉴定和筛选出来一个犬恶丝虫肿瘤蛋白基因(以下简称Di-TCTP)，基因序列如SEQIDNo.1所示。
Di-TCTP是在筛选组装的犬恶丝虫转录组数据中鉴定的。根据Nr注释信息，该基因(UnigeneID881)表现出与罗阿丝虫的TCTP高的同源性。ORF分析表明，Di-TCTP含有一个可编码181个氨基酸的ORF(546bp)，其假定的分子质量为20.7396kDa，pI为4.62。相似性分析表明，Di-TCTP和罗阿丝虫的受翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)(基因库：EFO28099.1)在蛋白水平享有最高的相似点(97％)，其次是和班氏丝虫的TCTP(GenBank:AAK71499.1)(96％)和马来丝虫的TCTP(GenBank:EDP33421.1)(95％)。信号PV4.0分析表明，在Di-TCTP中不存在信号肽。Di-TCTP编码的蛋白有显著的亲水性(图1)。用不同方法预测的Di-TCTP蛋白的二级结构表现出明显的不同。例如，用Garnier-Robson方法预测，有两个α螺旋和两个无规则卷曲，而用Chou-Fasman的方法，Di-TCTP推断的氨基酸序列预测则有10个阿尔法螺旋，8个片层和11个无规则卷曲。用KarplusSchulz方法预测，Di-TCTP有13个可变区。图2为预测的Di-TCTP蛋白三级结构。该预测是利用在线分析工具(http://swissmodel.expasy.org/)预测的三级结构。
利用Di-TCTP编码的蛋白具有良好的免疫原性，可用于制备检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒。
本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为利用Di-TCTP基因编码得到的蛋白；所述洗涤液为磷酸盐吐温缓冲液(PBST)，即在PBS溶液中加入Twen-20配制而成，优选为含0.05wt％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封被液为3wt％牛血清蛋白；所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为2.5NH2S04。
其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：
a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；
b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；
c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；
d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得Di-TCTP蛋白抗原。
进一步的，所述PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；最后72℃延伸10min。
所述表达载体为pET-28a(+)。
本发明检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒的检测原理为：以纯化的重组蛋白(Di-TCTP蛋白)为抗原，将其包被ELISA板后，洗去游离部分；用3％牛血清蛋白封被，洗去游离部分；再加入被检血清，如果被检血清是抗犬恶丝虫血清，就能和抗原特异性结合，形成免疫复合物，将游离的被检血清洗去；加入酶标二抗(HRP标记的羊抗狗IgG)，就会形成Di-TCTP蛋白-抗犬恶丝虫血清-酶标二抗复合物，洗去游离的酶标二抗；加入显色物TMB(3,3,5,5–Tetramethylbenzidine)，酶标二抗会使无色的显色物出现颜色，加2.5NH2S04终止；若被检血清不是抗犬恶丝虫血清，则不能形成Di-TCTP蛋白-抗犬恶丝虫血清-酶标二抗复合物，酶标二抗不能被固定于ELISA板上，加入显色物及终止液2.5NH2S04后无色。
本发明检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，包括如下步骤：
a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，过夜，再使用PBST彻底清洗四次；
b、将已包被的ELISA板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再使用PBST彻底清洗四次；
c、加入待测血清100μL到孔内，室温处理1h，再加入HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应1h后，使用PBST彻底清洗四次；
d、加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；显色反应由2.5NH2S04终止，在波长为450nm的光波下读取吸光度；
e、根据吸光度值判断检测结果。
其中，a步骤所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被浓度为2.5μg/mL；c步骤所述的HRP标记的羊抗狗IgG二抗稀释度为1:5000。
其中，d步骤所述的显色时间为5～30min，优选显色时间为10min。
e步骤所述的根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为：若吸光度值大于或等于0.294，则血清中存在犬恶丝虫，若吸光度值小于0.294，则血清中不存在犬恶丝虫。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1Di-TCTP蛋白抗原的制备
1、RNA的提取以及cDNA的合成
从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；其中，犬恶丝虫RNA提取根据Qiagen74104总RNA小量提取试剂盒说明书操作，按逆转录试剂盒(thermo)操作步骤将RNA逆转录成cDNA。
2、目的基因的扩增
以cDNA为模板，进行PCR扩增。
根据犬恶丝虫肿瘤蛋白基因Di-TCTP基因序列，设计片段扩增引物：
上游引物为5’-GGATCCATGCTGATTTTCAAGG-3’，包含一个BamHI的酶切位点(以下划线显示)
下游引物为5’-CTCGAGTCATTGTTTTTCTTC-3’，包含一个XhoI的酶切位点(以下划线显示)
PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；最后72℃延伸10min。
扩增得到的PCR产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行比对，然后经过Goldview染色，凝胶成相系统观察结果。
3、重组表达质粒pET28a(+)-Di-TCTP的构建
(1)连接目的基因与pMD19-T载体的连接体系如表1所示。
表1
(2)转化将上述连接产物均匀缓慢的加入到30μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min；然后再42℃水浴下热激90sec。接下来再冰浴5min。最后每管中加入600μL的LB肉汤培养基，在37℃水浴下震荡培养1h到2h，使细菌复苏；然后将菌液均匀涂布于含Amp的LB琼脂平板中，37℃恒温箱中倒置培养过夜，挑培养好的菌落，按照质粒抽提试剂盒的说明书提取犬恶丝虫Di-TCTP的T克隆质粒。
(3)T克隆质粒的双酶切
提取的T克隆质粒用QuickCut酶进行双酶切，体系如表2所述。
表2
反应物 体积
质粒 4.0μL
QuickCut Buffer 1.0μL
QuickCut酶1 0.5μL
QuickCut酶2 0.5μL
ddH2O 4μL
总体积 10μL
将上述反应体系在37℃水浴2h，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检查结果，然后回收酶切产物。
(4)pET28a(+)质粒的提取与酶切
按上述方法提取pET28a(+)表达载体质粒后，分别用QuickCutEcoRⅠ与QuickCutHindⅢ进行双酶切(酶切体系与反应条件同表2)。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收酶切产物。
(5)酶切回收的Di-TCTP与pET28a(+)质粒的连接与转化
经双酶切后的质粒和pET28a(+)质粒，在T4DNA连接酶作用下，37℃连接1h，连接体系见表3。
表3
反应物 体积
酶切后功能基因质粒 3μL
酶切后pET28a(+)质粒 1μL
T4DNA Ligase 1μL
ddH2O 17.5μL
10×T4DNA LigaseBuffer 1μL
总体积 25μL
将产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，并铺于含有Amp的平板中，并在37℃温箱中倒置培养过夜。第二天挑取数个单个独立菌落进行菌落PCR的鉴定。
(6)重组表达质粒双酶切鉴定
将阳性的质粒进行提取。通过双酶切鉴定是否含有目的片段，然后命名重组阳性质粒为pET28a(+)-Di-TCTP。
(7)重组表达质粒测序鉴定
送英潍捷基(上海)贸易有限公司[InvitrogenTrading(Shanghai)Co.,Ltd]进行测序。测序选用正反双向测序，对测序结果采用人工峰图对比校对，重复测序三次，以保证所测序列的准确性。测序结果表明，Di-TCTP和unigeneID881有100％的相似性，该结果也是试验性地验证了我们组装的犬恶丝虫转录组是个可信和强有力的挖掘犬恶丝虫新基因的工具。
4、重组表达质粒的诱导表达及融合蛋白的获得
将重组表达质粒pET28a(+)-Di-TCTP的表达宿主菌BL21(DE3)菌落接入含有Amp(200μg/mL)的LB培养液中，37℃培养过夜。按照前述步骤进行诱导表达，获得重组蛋白菌液。
上述表达菌液10,000r/min离心10min，留下菌体将上清弃去，然后置于-20℃30min，反复冻融，已达到完全破除菌体细胞壁的作用。
在菌体中加入20mL20mmol/LTris-HCl(pH8.0)，重新悬浮沉淀，加入溶菌酶于菌液中使其终浓度为1mg/mL，37℃振荡30min后-20℃冻融过夜。
超声波破碎：200W，1min/次，破碎20次，直到菌液澄清。
10,000r/min离心15min，留上清备用。
将上清液进行亲和层析，得到Di-TCTP蛋白抗原。
亲和层析具体方法如下：
(1)金属(Ni2+)螯合琼脂糖凝胶装柱，柱床的体积为5mL；
(2)用缓冲液A平衡5-10个床体积，流速为1mL/min；
(3)将上清(20mmol磷酸盐缓冲液)，pH7.4，0.5MNaCl0.45μm滤膜过滤，流速为1mL/min；
(4)用缓冲液A洗5-10个床体积，流速为1mL/min；
(5)用20、100、200、400mmol缓冲液B洗脱，2mL/min的流速，并收集各洗脱峰，通过SDS-PAGE检测重组蛋白的分子量大小和浓度；
(6)用超纯水洗10个柱床体积，再用20％的乙醇洗10个柱床体积，1mL/min的流速，将柱子于4℃保存。
5、Di-TCTP蛋白抗原的性能分析
采用SDS-PAGE分析重组的Di-TCTP蛋白，其结果显示其分子量～43kDa(详见图3a)
犬恶丝虫阳性血清所做的免疫印迹如图3b所示，Western-blot分析参考Towbinetal.(1979)的方法进行。纯化的rDi-TCTP经SDS—PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜。以5％脱脂奶粉封闭2h，依次用1：500稀释的细粒棘球蚴感染鼠血清(室温2h、PBST洗3次)及BIORAD公司的羊抗鼠lgG—HRP(二抗按1：3000稀释，室温反应1h、PBST洗涤3次)处理，最后加底物4-氯-l-萘酚显色并拍照。
从图3可以看出，Di-TCTP蛋白具有良好的免疫原性。
实施例2用Di-TCTP蛋白进行间接酶联免疫吸附试验
1、抗原和一抗最佳工作浓度的确定
用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液对重组蛋白进行稀释，抗原包被量按16、8、4、2ug/孔依次作倍比稀释，每孔100uL包被96孔的ELISA板，37℃温箱孵育2h后于4℃过夜包被；次日将ELISA板甩干，用PBST(0.01mol/L，pH7.4PBS中加入0.05％吐温-20)洗涤3次，5min/次，每孔加入100μl含5％脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h，甩干；用PBST洗涤3次，将标准阴性、阳性老鼠血清用PBS依次作1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400共4个梯度做ELISA方阵滴定，100uL/孔，37℃作用1h；甩干，用PBST洗涤3次后加入1﹕3000稀释羊抗鼠lgG—HRP(BIORAD)，100uL/孔，37℃1h；同上甩干后用PBST洗涤3次，每孔加入100μl的TMB(天跟)底物显色液，37℃避光反应20min，每孔加入100μl2mol/LH2SO4终止反应，用酶标仪(Thermo)于450nm处测定D450nm。P/N值最大时的抗原包被量和血清稀释倍数为最佳工作浓度。抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL，血清的最佳稀释倍数为1:60。
2、酶标二抗工作浓度的确定
抗原和一抗按最佳工作浓度稀释，将HRP标记的羊抗狗IgG二抗稀释为不同浓度，加底物显色后，用酶标仪(Thermo)于450nm处测定D450nm值，确定酶标二抗的最佳工作浓度为1:5000。
3、ELISA检测临界值的确定
用ELISA方阵法确定的抗原包被量和血清稀释度检测13份羊阴性血清，测定D450nm值，运用Excel2013和SPSS11.5软件对数据进行统计分析，计算平均值(Mean)和标准差(SD)，样品测定D450nm值按Mean+3SD作为阳性和阴性判定标准。其结果表明，ELISA检测临界值为0.294，即吸光度值大于或等于0.294，则判定为阳性，反之则为阴性。
4、样品中犬恶丝虫的测定
所用的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，所述Di-TCTP蛋白抗原为利用权利要求1所述的犬恶丝虫肿瘤蛋白基因，在大肠杆菌BL21中诱导表达获得(即实施例1所制备得到的Di-TCTP蛋白抗原)；所述洗涤液为磷酸盐吐温缓冲液PBST；所述封被液为3wt％牛血清蛋白；所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB；所述终止液为2.5NH2S04。
11份用于Di-TCTP-ELISA检测的流浪狗血清由四川农业大学动物医学院寄生虫室提供(其中，6只感染犬恶丝虫，5只未感染)。流浪狗ELISA检测结果与尸体剖检做对比，以确定该血清学诊断法的敏感性。
用最佳浓度的Di-TCTP蛋白(2.5μg/mL)包被ELISA板过夜，再使用PBST彻底清洗四次。然后将这些平板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再如上所述一样的清洗四次。加入PBST适当稀释好待测血清100μL到孔内，室温处理1h，再加入以1:5000稀释的HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应。反应一小时后，将这些孔如上所述清洗四次。清洗完后，加入TMB(3,3,5,5–Tetramethylbenzidine)进行显色。显色反应由2.5NH2S04终止，在波长为450nm的光波下读取吸光度。其血清学反应检测结果与解剖犬收回的虫体数量见表4。
表4
注：a：犬性别：m表示雄性，f表示雌性；
b：吸光度值为三组平行试验的平均值；
c：阳性临界值为0.294。
5、特异性试验
用已建立的ELISA方法测定两份犬钩虫阳性血清、3份犬弓蛔虫阳性血清、1份犬豆状带绦虫阳性血清，结果均为阴性(详见表5)，说明该方法特异性强。
表5
注：a：吸光度值为三组平行试验的平均值；
b：阳性临界值为0.294。

Claims (8)

1.检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，其特征在于：
所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如SEQIDNo.1所示；
所述洗涤液为PBST，所述PBST为磷酸盐吐温缓冲液；
所述封被液为3wt％牛血清蛋白；
所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；
所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
所述终止液为2.5NH2S04。
2.根据权利要求1所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：
a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；
b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；
c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；
d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得Di-TCTP蛋白抗原。
3.根据权利要求2所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：
所述PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求2所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述表达载体为pET-28a(+)。
5.检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，过夜，再使用PBST彻底清洗四次；
b、将已包被的ELISA板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再使用PBST彻底清洗四次；
c、加入待测血清100μL到孔内，室温处理1h，再加入HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应1h后，使用PBST彻底清洗四次；
d、加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；显色反应由2.5NH2S04终止，在波长为450nm的光波下读取吸光度；
e、根据吸光度值判断检测结果。
6.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：a步骤所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被浓度为2.5μg/mL；c步骤所述的HRP标记的羊抗狗IgG二抗稀释度为1:5000。
7.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：d步骤所述的显色时间为5～30min，优选显色时间为10min。
8.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：e步骤所述的根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为：若吸光度值大于或等于0.294，则血清中存在犬恶丝虫，若吸光度值小于0.294，则血清中不存在犬恶丝虫。
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