KR101410243B1 - 한국 토종 효모 사카로미세스 세레비제 ｃｋｋ１１０４２６ 및 그를 이용한 제과 기능성 소재의 제조방법 - Google Patents

한국 토종 효모 사카로미세스 세레비제 ｃｋｋ１１０４２６ 및 그를 이용한 제과 기능성 소재의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제과 및 제빵에 적합하고, 사용하기에 편리한 한국형 토종 효모 자원 및 그 이용에 관한 것으로, 본 발명의 효모는 국내 유기농 농업현장의 농산물에서 분리한 한국 토종 효모 자원으로서, 본 발명의 효모를 이용하여 제조된 빵 반죽이나 빵은 종래 상업용 효모와 다른 향미를 가지면서도 식감이 우수한 특화성을 갖는 제품으로, 빵반죽에 효모를 투입하기 전에 별도의 사전배양이 필요하지 않아 사용이 용이하면서도, 토종 효모를 이용한 풍미 및 식감이 색다르고 뛰어난 고급 브랜드 빵의 제조가 가능해지고, 나아가 본 발명의 한국 토종 효모는 상업효모와 비교했을 때 유기칼슘을 10 배, 유기철분을 3배 정도 함유하고 있어, 유기칼슘과 유기철분 함량이 높은 고미네랄 함유 제과 및 제빵 소재로 활용될 수 있고, 또한 상기 효모에서 분리한 세포벽 분리물은 제과 및 제빵에 이용되는 고온 가열 조건에서도 안정하면서, 반죽 내에 1 중량%까지는 빵 반죽의 발효율에 영향을 주지 않으면서 관능적으로도 문제가 없었으며, 장내 유산균을 증식시키는 프로바이오틱 소재로 활용될 수 있다.

Description

한국 토종 효모 사카로미세스 세레비제 ＣＫＫ１１０４２６ 및 그를 이용한 제과 기능성 소재의 제조방법{A novel Saccharomyces cerevisiae CKK110426 and preparation method of functional ingredient for making baked products using it}
본 발명은 효모 균주 및 그 이용에 관한 것이다. 특히 제과 및 제빵 산업에 이용 가능한 유기농 야생오이에서 분리한 한국 토종 효모에 관한 것이다.
제과 및 제빵에 있어서 효모, 즉 효모의 반죽 내 당분 발효 특성은 제품의 품질을 결정하는 가장 중요한 요소의 하나이다. 그러나 국내 제과 및 제빵 분야의 연구개발 현황을 분석하면 연구개발 인원의 부족에 따라 단순 제조 기술 개선 단계에 머물러 있고, 제과 및 제빵의 핵심 원료인 효모는 세계 몇몇 회사에서 독점적으로 공급되는 상업효모를 사용하고 있는 실정이다.
한국공개특허 제2001-0040742호는 "물엿 전처리 효모를 이용한 빵의 제조방법"에 관한 것으로 제빵용을 사용하고 있는 통상의 효모를 순수 맥아당 또는 물엿으로 만든 배지에서 처리하여 맥아당 발효에 관계되는 유전자의 발현을 사전 유도한 다음 이 효모를 빵 제조용 반죽에 첨가하는 것으로, 상업효모를 그대로 이용하는 것으로 상업효모가 가지는 풍미 및 식감의 한계를 벗어날 수 없다는 한계가 있었다.
또한 한국특허 제0767383호는 "신규한 전분자화성 효모와 그 용도"에 관한 것으로 누룩에서 분리한 한국 토종 효모자원에 관한 것이지만 알코올 발효 용도에 관한 것이지 제과 및 제빵 용도로 활용되기는 어려운 것이었다.
또한 본 출원인이 등록받은 한국특허 제1074340호는 "신규 효모 및 그를 이용한 빵의 제조방법"에 관한 것으로, 종래 상업용 효모와 다른 향미를 가지면서도 식감이 우수한 빵을 제조할 수 있는 한국 토종 효모 자원을 새로이 제시하고 있으나, 이 신규 효모는 상업 효모와 달리 효모 자체를 빵반죽에 직접 첨가할 경우 발효가 이루어지 않아, 빵반죽에 효모를 투입하기 전에 사전배양이 필요하여 사용이 용이하지 않다는 한계가 있었다.
본 발명은 제과 및 제빵에 적합하고, 사용하기에 편리한 한국형 토종 효모 자원을 제공하고, 이를 이용하여 제과 기능성 소재의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 야생오이 유래의 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426(기탁번호: KCCM11255P)를 제공한다.
본 발명은 상기 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426를 함유하는 것을 특징으로 하는 제과 또는 제빵용 반죽(dough)을 제공한다.
본 발명은 상기 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426 및 그 세포벽 분획물을 함유하는 것을 특징으로 하는 제과 또는 제빵용 반죽(dough)을 제공한다.
본 발명의 효모는 국내 유기농 농업현장의 과일에서 분리한 한국 토종 효모 자원으로서, 본 발명의 효모를 이용하여 제조된 빵 반죽이나 빵은 종래 상업용 효모와 다른 향미를 가지면서도 식감이 우수한 특화성을 갖는 제품으로, 빵반죽에 효모를 투입하기 전에 별도의 사전배양이 필요하지 않아 사용이 용이하면서도, 토종 효모를 이용한 풍미 및 식감이 색다르고 뛰어난 고급 브랜드 빵의 제조가 가능해지고, 나아가 본 발명의 한국 토종 효모는 상업효모와 비교했을 때 유기칼슘을 10 배, 유기철분을 3배 정도 함유하고 있어, 유기칼슘과 유기철분 함량이 높은 고미네랄 함유 제과 및 제빵 소재로 활용될 수 있고, 또한 상기 효모에서 분리한 세포벽 분리물은 제과 및 제빵에 이용되는 고온 가열 조건에서도 안정하면서, 반죽 내에 1 중량%까지는 빵 반죽의 발효율에 영향을 주지 않으면서 관능적으로도 문제가 없었으며, 장내 유산균을 증식시키는 프로바이오틱 소재로 활용될 수 있다.
도 1은 각각의 TSA(1), PDA(T)(2) 및 BCP(3) 고체영양배지를 사용하여 24 시간(A), 48 시간(B) 및 72 시간(C) 배양했을 때의 우점화 패턴을 조사했을 때의 우점화 패턴을 나타낸 배양 플레이트 사진을 나타낸 것으로, 좌측은 효모 및 유산균이 함께 분리된 경우, 우측은 효모균만 분리된 경우의 예시이다.
도 2는 발효에 따른 균우점화 형태별 당이용성 분석 결과를 나타낸 것으로, A는 적상추(일반균 우점형), B는 풋고추(유산균 우점형), C는 딸기(효모균 우점형), D는 야생오이(효모균 및 유산균 동시우점형)의 것으로, 1은 5% Sucrose 용액(0 시간: 발효배양경과시간), 2 는 배양 24시간 경과, 3은 배양 48시간 경과, 4는 배양 72시간 경과, 5는 배양 96시간 경과했을 때의 배지내 당패턴을 나타낸 그래프이다.
도 3은 발효에 따른 균우점화 형태별 유기산 증감결과를 나타낸 것으로, A는 적상추(일반균 우점형), B는 풋고추(유산균 우점형), C는 딸기(효모균 우점형), D는 야생오이(효모균 및 유산균 동시우점형)의 것으로, 1은 5% Sucrose 용액(0 시간: 발효배양경과시간), 2 는 배양 24시간 경과, 3은 배양 48시간 경과, 4는 배양 72시간 경과, 5는 배양 96시간 경과했을 때의 배지내 유기산 패턴을 나타낸 그래프이다.
도 4는 분리된 효모균을 Diversilab 시스템을 이용하여 상동성을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 효모 균주의 상동성 평가 결과를 나타낸 것으로, 1은 S. cerevisiae JKK091006(NCBI ID : 99%), 2는 상업효모(Jenico사, NCBI ID : 99%), 3은 S. cerevisiae CKK 110426(야생오이 분리 효모, NCBI ID : 99%), 4는 S. cerevisiae OKK110427(귤 분리 효모, NCBI ID: 96%)이다.
도 6의 A는 Jenico사의 상업효모, B는 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002, C는 야생오이에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 CKK110426, D는 귤에서 분리한 OKK110427, 및 E는 상업효모인 C. utilis(Kojin사)를 이용하여 제조한 식빵의 사진이다.
도 7의 A는 Jenico사의 상업효모, B는 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002, C는 야생오이에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 CKK110426, D는 귤에서 분리한 OKK110427, 및 E는 상업효모인 C. utilis(Kojin사)를 이용하여 제조한 하드롤의 사진이다.
도 8은 실시예 4의 효모추출물과 세포벽 분리물의 제조공정도이다.
본 발명의 균주는 한국 토착형 빵 효모를 선별하기 위해서 국산 유기농 과일을 대상으로 효모 자원을 탐색하던 중 유기농 야생오이에서 분리동정되었으며, 본 발명의 효모가 첨가된 빵 반죽을 발효시켜 빵을 제조하게 되면 종래 상업용 효모와 다른 향미를 가지면서도 식감이 우수한 빵을 제조할 수 있고, 유기칼슘과 유기철분 함량이 높은 고미네랄 함유 빵 및 과자를 제조할 수 있으며, 상기 효모에서 분리한 세포벽 분리물을 함께 첨가함으로써 프로바이오틱 기능성을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 균주는 동정 결과 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 속했으며 본 발명에서는 이를 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae ) CKK110426로 명명하고 2012년 2월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호를 KCCM11255P로 부여받았다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제 CKK110426는 본 발명자들이 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002와 달리 거봉 함유 배지에서 사전 배양하지 않은 상태에서도 빵 반죽에 바로 적용될 수 있다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제 CKK110426는 그 자체로 상업용 빵 효모를 대체하여 빵 반죽에 사용하여 발효시켰을 때, 향미가 풍부하면서도 식감이 우수한 빵이 제조된다.
또한 본 발명의 사카로마이세스 세레비제 CKK110426는 상업용 효모에 비하여 유기칼슘을 10 배 이상, 유기철분을 3배 정도 풍부하게 함유하고 있어서, 본 발명의 효모 추출물은 칼슘 강화를 위한 제과 및 제빵 기능성 소재로 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 사카로마이세스 세레비제 CKK110426에서 분리한 세포벽 분리물은 제과 및 제빵 과정의 고온 가열에 안정하여, 1 중량%까지 빵 반죽의 발효율이나 관능특성에 영향을 주지 않으면서, 빵 및 과자 제품에 프로바이오틱 기능성을 부여할 수 있다.
이하 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시적인 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 유기농 농산물로부터 효모 및 유산균의 분리 및 선발
국내에 시판되는 유기농 농산물 44 종에서 한국 토착형 효모 및 유산균을 분리하였다. 유기농산물의 종류와 재배 지역 또는 구입처를 표 1에 정리하여 나타내었다.
번호 구분 재배 지역 또는 구입처
1 오이맛 고추 경남 진주시 금산면 장사리
2 애호박 경북 안동시 안동바이오
3 적치콘 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
4 적상추 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
5 아욱 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
6 생채 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
7 뉴그린 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
8 쌈추 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
9 쑥갓 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
10 오크립(청) 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
11 적겨자 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
12 시금치 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
13 적치커리 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
14 고추 경남 밀양시 부북면 운전리
15 청포도 델몬트 미국
16 참다래 제주 서귀포시 도순동
17 금귤 롯데마트 유기농 코너
18 방울토마토 전남 담양군 대전면 갈항리
19 토마토 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
20 마늘 경북 영천시 화산면 용평리
21 곶감 상명농산
22 배 산청배 영농조합(경남 산청시 신일면 잠죽리)
23 청포도 델몬트 미국
24 적근대 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
25 청경자 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
26 청피망 경남진주 대곡면 덕곡리
27 치커리 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
28 풋고추 경남 밀양시 단장면 단장리
29 사과 경북 영주 풍기읍 서부리
30 시금치 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
31 배추 알배기 전남 영암
32 오크립(적) 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
33 다대기 오이 경기 평택시 진위면 하북리 249-3
34 금귤 롯데마트 유기농 코너
35 참외 월항 농협
36 대추 상명농산
37 딸기 전남 담양군 대전면 강의리 59-8
38 방울토마토 전남 담양군 수특면 황금리
39 양파 경남 창녕시 유미면 부곡리
40 매운고추 경남 밀양시 부북면 운전리
41 파프리카 경남 창녕시 길곡면 증산리
42 감 창원시 북면 농협
43 야생오이 전남 순천시 낙안면 교촌리, 최성은 농장
44 귤 제주도 중문 농협
상기 표 1의 유기농 농산물을 각각 10g씩 분취 및 분쇄한 후 이를 5%(w/v) sucrose 300ml 배지에 접종하고 최종 4일 동안 배양(30℃, 습도 : 50 %)을 실시함으로서, 효모 및 유산균 분리를 위한 배지 및 배양조건으로 하였다.
효모 및 유산균분리는 배양과정에서 일정별로 50 ml을 분취한 배양액을 TSA(Tryptic Soy Agar), PDA(T)(Potato Dextrose Agra with 10% tartaric acid) 및 BCP plate count agar 고체영양배지에 배양하였으며, 4일이 경과시 종료시점으로 하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. TSA 배지는 총균 배양을 위한 것으로 37℃, 호기배양 하였고, PDA(T) 배지는 효모를 배양하기 위한 것으로 25 ℃, 호기배양 하였으며, BCP 배지는 유산균을 배양하기 위한 것으로 37 ℃, 혐기배양하였다.
구분 결과확인
TSA PDA(T) BCP
24h 48h 72h 92h 24h 48h 72h 92h 24h 48h 72h 92h
1 오이맛 고추 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
2 애호박 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
3 적치콘 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
4 적상추 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
5 청상추 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
6 아욱 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
7 생채 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
8 뉴그린 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
9 쌈추 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
10 쑥갓 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
11 오크립(청) +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
12 적겨자 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
13 적치커리 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
14 고추 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
15 청포도 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
16 참다래 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
17 금귤 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
18 방울토마토 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
19 토마토 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
20 마늘 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
21 곶감 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
22 배 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
23 청포도 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
24 적근대 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
25 청경자 +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
26 청피망 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
27 치커리 +++ +++ +++ +++ - - - - +++ +++ +++ +++
28 풋고추 +++ +++ +++ +++ - - ++ +++ +++ +++ +++ +++
29 사과 +++ +++ +++ +++ - - + - +++ +++ +++ +++
30 시금치 ++ ++ +++ +++ - - ++ +++ ++ ++ +++ +++
31 배추 알배기 +++ +++ +++ +++ - - ++ +++ +++ +++ +++ +++
32 오크립(적) +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
33 다대기 오이 +++ +++ +++ +++ - - ++ +++ +++ +++ +++ +++
34 금귤 +++ +++ +++ +++ - - - ++ +++ +++ +++ +++
35 참외 +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
36 대추 +++ +++ +++ +++ - - - ++ +++ +++ +++ +++
37 딸기 +++ +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ +++ +++ +++
38 방울토마토 +++ +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ +++ +++ +++
39 양파 +++ +++ +++ +++ - - - +++ +++ +++ +++ +++
40 매운고추 +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
41 파프리카 +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
42 감 +++ +++ +++ +++ - - - ++ +++ +++ +++ +++
43 야생오이 +++ +++ +++ +++ - - - + +++ +++ +++ +++
44 귤 +++ +++ +++ +++ - ++ +++ - +++ +++ +++ +++
- : 불검출, + : 배양, ++ : 보통, +++ : 아주높음
도 1은 각각의 TSA(1), PDA(T)(2) 및 BCP(3) 고체영양배지를 사용하여 24 시간(A), 48 시간(B) 및 72 시간(C) 배양했을 때의 우점화 패턴을 조사했을 때의 우점화 패턴을 나타낸 배양 플레이트 사진을 나타낸 것으로, 좌측은 효모 및 유산균이 함께 분리된 경우, 우측은 효모균만 분리된 경우의 예시이다.
표 3에는 각각의 선택배지에서 배양했을 때의 균수를 나타낸 것으로, 효모는 배양일정별 형성되는 효모형 콜로니만을 선별 1차 분리한 후 이를 계대순수분리(3세대, PDA)하여 순수분리하였고, 유산균의 경우, 1차 분리는 선택배지로서 BCP agar(Eiken, Japan)를 사용하였으며, 선택배지에서 생성된 유산균 생육 시 특정하는 유산균형 콜로니를 1차 선별한 후 이를 3세대까지 반복적으로 순수분리 과정을 MRS agar(Difco, USA)를 사용하여 실시하였다.
구분 결과확인 비고
TSA PDA(T) BCP
24h 48h 72h 92h 24h 48h 72h 92h 24h 48h 72h 92h
1 오이맛 고추 1,6x108 2.4x108 4.0x107 4.0x109 ND ND ND ND 3.2x108 1.6x108 4.0x107 1.0x1010 일반균
2 애호박 1,2x108 4.0x108 8.0x107 2.0x109 ND ND ND ND 8.0x107 2.8x108 3.6x108 1.8x1010
3 적치콘 1,4x108 2.8x108 3.6x108 6.0x109 ND ND ND ND 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109
4 적상추 6.0x107 2.4x108 2.2x108 2.0x109 ND ND ND ND 1.8x1010 2.8x109 1.1x109 1.1x1010
5 청상추 1.0x108 2.8x108 4.2x108 1.8x1010 ND ND ND ND 1.1x1010 2.2x1010 2.5x109 9.0x108
6 아욱 3.2x108 1.6x108 4.0x107 1.0x1010 ND ND ND ND 7.2x1010 2.9x108 3.4x108 1.3x109
7 생채 8.0x107 2.8x108 3.6x108 1.8x1010 ND ND ND ND 5.0x108 5.6x108 5.6x108 1.6x1010
8 뉴그린 9.5x107 4.0x107 2.2x108 6.0x109 ND ND ND ND 1,4x108 5.6x108 5.6x108 1.6x109
9 쌈추 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109 ND ND ND ND 1,6x108 2.4x108 4.0x107 4.0x109
10 쑥갓 1.8x1010 2.8x109 1.1x109 1.1x1010 ND ND ND ND 1,2x108 4.0x108 8.0x107 2.0x109
11 오크립(청) 1.1x1010 5.7x109 9.6x109 1.1x109 ND ND ND ND 1.0x108 2.8x108 4.2x108 1.8x1010
12 적겨자 1.1x1010 2.2x1010 2.5x109 9.0x108 ND ND ND ND 1,4x108 2.8x108 3.6x108 6.0x109
13 적치커리 2.1x1010 7.0x108 3.8x109 4.0x107 ND ND ND ND 2.4x107 4.0x107 4.0x107 1.8x1010
14 고추 2.0x1010 1.2x1010 1.3x109 1.4x109 ND ND ND ND 7.2x1010 2.9x108 3.4x108 1.3x109
15 청포도 1.4x1010 2.7x109 5.1x109 3.6x109 ND ND ND ND 2.1x1010 7.0x108 3.8x109 4.0x107
16 참다래 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109 ND ND ND ND 2.8x1010 1.5x109 4.7x109 5.2x109
17 금귤 3.6x109 9.4x09 1.0x1010 4.0x107 ND ND ND ND 2.0x1010 1.2x1010 1.3x109 1.4x109
18 방울토마토 6.0x107 6.0x108 2.2x108 9.1x109 ND ND 2.0x107 ND 1.4x1010 2.7x109 5.1x109 3.6x109
19 토마토 6.0x107 2.4x108 3.0x108 5.2x109 ND ND ND ND 2.7x1010 2.9x109 1.5x1010 2.5x109
20 마늘 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109 ND ND ND ND 3.6x109 9.4x09 1.5x1010 2.5x109
21 곶감 1.1x1010 2.2x1010 2.5x109 9.0x108 ND ND ND ND 1.8x1010 2.8x109 1.3x109 1.4x109
22 배 5.0x108 5.6x108 5.6x108 1.6x1010 ND ND ND ND 5.7x109 9.6x109 5.6x108 5.6x108
23 청포도 2.8x1010 1.5x109 4.7x109 5.2x109 ND ND ND ND 2.2x1010 2.5x109 1.5x109 4.7x109
24 적근대 5.0x108 5.6x108 5.6x108 1.6x1010 ND ND ND ND 2.4x107 4.0x107 4.0x107 1.8x1010 유산균
25 청경자 1,4x108 5.6x108 5.6x108 1.6x109 ND ND ND ND 1.0x108 2.8x108 4.2x108 1.8x1010
26 청피망 1.0x108 2.8x108 4.2x108 1.8x1010 ND ND ND ND 9.5x107 4.0x107 2.2x108 6.0x109
27 치커리 2.4x107 4.0x107 4.0x107 1.8x1010 ND ND ND ND 1.1x1010 5.7x109 9.6x109 1.1x109
28 풋고추 1.8x1010 2.8x109 1.1x109 1.1x1010 ND ND ND ND 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109
29 사과 2.2x1010 1.8x109 4.1x109 4.5x109 ND ND ND ND 7.0x108 3.8x109 1.8x109 4.1x109
30 시금치 7.2x1010 2.9x108 3.4x108 1.3x109 ND ND 4.4x109 ND 6.0x107 2.4x108 2.2x108 2.0x109 효모
31 배추 알배기 2.8x1010 1.5x109 4.7x109 5.2x109 ND ND ND 2.0x107 3.2x108 1.6x108 4.0x107 1.0x1010
32 오크립(적) 2.4x1010 1.8x109 6.6x109 9.1x109 ND ND ND ND 1.0x108 2.8x108 4.2x108 1.8x1010
33 다대기 오이 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109 ND ND ND 2.0x107 1.1x1010 5.7x109 9.6x109 1.1x109
34 금귤 2.7x1010 2.9x109 1.5x1010 2.5x109 ND ND ND 2.0x107 2.4x1010 1.8x109 6.6x109 9.1x109
35 참외 1.1x1010 5.7x109 2.5x109 9.0x108 ND 3.6x109 4.3x109 ND 1.8x109 6.6x109 1.2x1010 5.0x109
36 대추 1.1x1010 2.2x1010 2.5x109 9.0x108 ND ND 3.4x109 1.2x109 4.7x109 1.1x1010 4.7x109 5.2x109
37 딸기 1.1x1010 5.7x109 9.6x109 1.1x109 ND ND 1.8x109 1.4x109 2.2x1010 1.8x109 4.1x109 4.5x109
38 방울토마토 6.0x107 6.0x108 2.2x108 9.1x109 ND ND 2.0x107 ND 1.4x1010 2.7x109 5.1x109 3.6x109
39 양파 4.7x109 1.1x1010 1.6x109 5.0x109 ND ND ND 4.0x107 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109
40 매운고추 1.8x1010 2.8x109 1.1x109 1.1x1010 ND ND ND 8.0x107 6.0x107 6.0x108 1.2x1010 5.0x109 효모,
유산균
41 파프리카 9.5x107 4.0x107 2.2x108 6.0x109 ND ND ND 1.6x109 1.1x1010 5.7x109 5.1x109 3.6x109
42 감 7.2x1010 2.9x108 3.4x108 1.3x109 ND ND ND 4.0x107 2.8x109 1.1x109 2.9x108 3.4x108
43 야생오이 1.1x1010 5.7x109 9.6x109 1.1x109 ND ND 2.2x109 1.4x109 6.0x107 2.4x108 1.1x109 1.1x1010
44 귤 1.8x1010 7.0x109 1.2x1010 5.0x109 ND ND ND 2.0x107 2.9x108 3.4x108 7.0x109 1.2x1010
실시예2 : 당이용성 및 유기산 생성패턴 평가
상기 실시예 1에서 일반균 우점형, 유산균 우점형, 효모균 우점형, 그리고 효모 및 유산균 동시 우점형 군에서 각각 1 종씩을 선발하여, 각각의 군에서의 당이용성과 유기산 생성패턴을 조사하였다.
일반균 우점형으로는 4번 적상추, 유산균 우점형으로는 28번 풋고추, 효모균 우점형으로는 37번 딸기, 효모 및 유산균 동시 우점형으로는 43번 야생오이에서 선발된 균주를 이용하였다.
당이용성 평가를 위한 당류는 Sucrose, Glucose, Galactose 및 Fractose를 대상으로 일정별 변화를 확인하여 그 결과를 표 4 및 도 2에 나타내었다.
구분 선별균의 먹이이용원에 대한 당변화 조사결과(ppm) 산도
(pH)		 생성균
Sucrose Glucose Galactose Fractose
24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h
기본배지a 49,318 NT NT NT 6.8
4 적상추 46,616 44,181 40,323 41,545 ND ND ND ND ND ND ND 1,574 ND ND ND ND 3.88 일반균
28 풋고추 43,438 34,616 29,463 29,112 ND ND ND ND 2,853 9,583 12,745 25,401 ND ND ND ND 2,63 유산균
37 딸기 45,669 41,951 38,696 33,357 ND ND ND ND 4,843 6,559 8,462 9,807 ND 68 95 ND 2.91 효모
43 야생
오이		 41,670 24,022 16,990 0 ND ND ND ND 3,901 17,813 20,495 29,536 ND ND ND ND 2.99 효모, 유산균
ND : Not Detected, NT : Not Tested
당이용성에 있어 Sucrose와 Galactose순으로 이용성 변화가 있었으며, Glucose 및 Fractose는 변화가 없었다.
효모 및 유산균이 동시우점형(야생오이: 수거시료 43)가 가장 대표적인 경우였는데, 최초 49,318ppm이였던 Sucrose는 배양시간이 경과하면서 급격히 이용되어 1일 경과시 약 16%, 2일 경과시는 약 51%, 3일경과시 약 66% 그리고 최종 4일이 경과시 100%가 사용되는 것으로 조사되었다.
또한, Sucrose의 감소와 더불어 Glucose 및 Galactose의 증감 패턴 및 산도의 변화를 연계하여 조사하여 보았더니, Glucose는 전체시험구에서 검출이 되지 않는 반면에 Galactose는 배양시간이 경과 급격히 증가하여 최종배양 4일이 경과시는 29,536ppm의 높은 수치를 보였고, 이때 pH는 2.99를 나타내었다. 이러한 결과는 균류가 Sucrose를 먹이원으로 사용함에 있어 우선적으로 사용하고, 이용과정에서 Glucose와 Galactose로 1차 분해한 후 이중 우선 먹이원으로 Glucose를 이어서 Galactose를 이용하는 패턴과 이때 유기산과 CO2를 생성하는 메카니즘을 가지고 있다고 보고 되어 있는데, 결과는 효모와 유산균이 동시에 증가되는 미생물의 우점화 경향과 더불어 Sucrose를 먹이원으로 활발히 사용하는 일련의 메카니즘과 동일 패턴을 보였다. 그리고, Fractose는 전체 시험구에서 불검출 되었는데, 이는 미생물의 생성에 따른 변화보다는 시료에서 용출되지 않은 이유로 판단되었다.
일정별 당이용성 차이를 우점형별로 구분하여 보았더니, 효모 및 유산균 우점형이 가장 이용성이 높은 것으로 나타났으며, 다음으로 유산균 우점형, 효모 우점형 그리고 일반균우점형 순으로 나타났다. 즉, 배양 4일을 기준을 효모 및 유산균 우점형(수거시료 43:야생오이)의 Sucrose는 0ppm, Galactose는 29,536ppm 그리고 pH는 2.99였다. 유산균 우점형(수거시료 28: 풋고추)의 경우는, Sucrose는 29,112ppm, Galactose는 25,401ppm 그리고 이때 pH는 2.63이였다. 효모우점형(수거시료 37: 딸기)의 경우는, Sucrose는 33,357ppm, Galactose는 9,807ppm 그리고 이때 pH는 2.91이였는데, 일반균 우점형(수거시료 4 : 적상추)은 Sucrose는 41,545ppm, Galactose는 0ppm 그리고 이때 pH는 3.88로 가장 낮게 나타났다. 이는 단일우점균을 기준으로 본다면 유산균이 당이용성이 가장 높고 다음으로 효모균의 순이고, 일반균의 경우는 당이용성이 떨어진다는 것을 알 수 있었는데, 효모와 유산균 동시에 우점화 되는 경우에서는 당이용성은 가속화됨을 확인 할 수 있었다.
또한 유기산 생성패턴은 Citric acid, Tartaric acid, D-Malic acid, Lactic acid, Formic acid, Acetic acid 및 L-Malic acid으로 7종을 대상으로 일정별 변화를 확인하여 표 5 및 도 3에 나타내었다.
구분 배양시간 선별균의 먹이이용원에 대한 유기산변화 조사결과(ppm) 생성균
Citric acid Tartaric acid D-Malic acid1 Lactic acid Formic acid Acetic acid L-Malic acid2
기본
배지		 24h ND ND ND ND ND ND ND 5%
Sucrose
48h NT NT NT NT NT NT NT
72h NT NT NT NT NT NT NT
92h NT NT NT NT NT NT NT
1 적
상
추		 24h 2,747 2,785 2,537 5,614 ND 674 ND 일반균
48h 2,247 2,028 2,639 7,770 493 2,747 ND
72h 2,245 1,780 7,519 7,418 997 3,680 ND
92h 2,475 1,992 3,643 5,368 911 3,320 ND
2 풋
고
추		 24h 46,013 1,274 13,880 9,461 ND 4,531 ND 유산균
48h 21,223 3,827 75,318 11,746 ND 4,955 ND
72h 25,306 3,571 45,518 9,081 ND 4,106 ND
92h 17,003 4,846 23,197 9,864 ND 4,616 ND
3 딸
기		 24h 28,426 3,880 33,555 16,376 ND 1,836 ND 효모
48h ND 5,318 37,239 13,433 ND 1989 ND
72h ND 5,518 34,247 18,366 ND 1,146 ND
92h ND 4,197 31,407 19,461 ND 1,274 ND
4 야생오이 24h 2,174 9,605 98,748 65,746 488 10,827 ND 효모,
유산균
48h ND 9,107 148,540 48,195 764 11,571 ND
72h ND 8,125 115,209 58,748 1,167 14,030 ND
92h ND 6,228 90,298 50,298 2,046 14.294 ND
ND : Not Detected, NT : Not Tested
배양 일정별 당이용성이 가장 높았던 효모 및 유산균 우점형에서 타우점형에 비하여 분석대상 유기산류 전체에서 가장 높은 수치를 보였다. 유기산중 D-Malic acid이 배양 24시간 경과시 65,746ppm에서 48시간 경과하면서 최대 148,540ppm으로 증가한 후 점차 감소하여 최종 92시간 경과시는 90,298ppm의 감소 경향을 보였다. 이러한 결과는 유기농산물 시료내 함유되어 있던 유기산이 발효과정에서 세포조직의 이완과 더불어 지속적으로 용출되면서, 미생물이 점차적으로 이용하는 것으로 판단되었다.
또한, 동일하게 농산물 기원성인 Tataric acid 역시도 24시간 경과시 9,605ppm이였던 수치가 점차 감소되어 최종 92시간 경과시 6,228ppm으로 조사되어 Malic acid와 동일 경향을 보였다.
그리고, Sucrose 기원성 Lactic acid와 Acetic acid의 변화를 확인하여 보았더니, 효모 및 유산균 우점형은 두종류 유산균을 동시에 생성하는 것으로 조사 되었는데, Lactic acid은 24시간 경과시 65,746ppm에서 92시간 경과후는 50,298ppm의 수치를 보여 다소 감소하는 경향을 보였는데, Acetic acid의 경향은 10,827ppm 및 14,294ppm로 증가하는 경향을 나타냈다.
또한, 농산물 기인성 Citric acid는 일반균 우점형에서 24시간에서 96시간 배양시 약 2,700ppm에서 2,400ppm의 범위의 수치를 보였는데, 효모 및 유산균 동시우점형의 경우에서는 24시간 배양시 2,174ppm이였던 수치가 48시간 이후 경과시 불검출됨에 따라 먹이로 이용되는 것으로 판단되었다.
이를 효모균 우점형과 유산균 우점형과 비교하여 Citric acid의 증감경향을 비교하여 보았더니, 효모우점형의 24시간후 Citric acid는 28,426ppm이 검출되었었는데, 48시간 경과이후는 불검출로 나타났는데, 유산균 우점형은 46,013ppm에서 점차 감소하다가 92시간이 경과시 17,003ppm으로 나타났다. 이는 유산균보다는 효모에 의하여 Citric acid을 적극적인 먹이원으로 이용하고 있음을 확인 할 수 있었다.
일반균 우점형을 기준으로 단일효모균 우점형 및 유산균 우점형의 유기산 생성 패턴을 조사하여 보았다.
일반균 우점형은 Lactic acid(24시간 경과시 : 5,614ppm, 92시간 경과시 : 5,368ppm) 및 Acetic acid(24시간 경과시 : 674ppm, 92시간 경과시 : 3,320ppm)를 균일하게 생성시키는 것으로 조사되었는데, 유산균 우점형에서는 Lactic acid는 9,081ppm~11,746ppm, Acetic acid는 4,106ppm~4,955ppm으로 조사되었다. 그러나, 효모균 우점형의 경우는 Lactic acid는 24시간 배양시 16,376ppm에서 92시간 배양후는 19,461ppm으로 점차 증가하였는데, Acetic acid는 1,000~1,900ppm의 범위를 보여 유산균 보다는 효모균에 의하여 Lactic acid가 높게 형성되는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 효모 및 유산균 우점형의 경우에서 높은 수치의 유기산의 증가는 효모와 유기산의 복합적인 활성으로 인한 것으로 확인할 수 있었다.
실시예3 : 선발된 효모 및 유산균의 동정
실시예 1에서 유기농 농산물 44종에서 분리된 효모 및 유산균에 대한 동정은 순수분리과정이 완료된 이후에 3단계로(API System, Vitek System 및 Diversilab 시스템) 구분하여 실시되었다.
분리가 완료된 효모 및 유산균의 순수분리과정은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 효모는 PDA배지(30℃, 24시간 배양)에서, 유산균은 MRS배지에서 (37℃, 24시간) 배양하였고, 이중 확실시 되는 균에 대한 분취 후 배지별 도말과 배양과정을 3회 이상 실시함으로서 순수분리과정을 완료하였다.
순수분리가 완료된 균들에 대하여 동정은 균종별 당이용성 평가를 통한 API 시스템(API Kit, Model : 20C-AUX)을 이용하여 실시하였는데, 효모는 API 20AUX(당류 : 10종) 그리고 유산균은 API CHL(당류 : 40종)의 분석 킷트를 사용하여 24시간 및 48시간배양에 따른 당이용성(색깔 및 성상변화)을 비교 평가하였다.
효모균 동정을 위한 API 키트 적용결과는 표 6에, 유산균 동정을 위한 API 키트 적용결과는 표 7에 나타내었다.
종류 %ID 동정결과 당 이용성 평가결과
귤 82.7 S. cerevisiae GLU +, XYL +,, MDG +, MAL +, SAC +, MLZ +, RAF +
야생오이 99.2 S. cerevisiae GLU +, MDG +,, MAL +, SAC +, RAF +
시금치 98.9 C. boidinii GLU+,GLY+XYL+,ADO+XLT+,SOR+
배추 알배기 99.7 C. guilliermondii GLU+,GLT,2KG+,ARA+,XYL+,ADO+XLT+,GAL+,SOR+,MDG+,NAG+,CEL,+,MAL+,SAC+,MLZ+,RAF+
다대기 오이 99.7
오크립(적) 99.7
금귤 99.7
파프리카 99.7
참외 99.7
딸기 98.2 C. famate GLU+,2KG+,ARA+,XYL+,ADO+XLT+,GAL+,SOR+,MDG+,NAG+,CEL,+,MAL+,SAC+,LAC+,MLZ+,RAF+
방울토마토 96.9
양파 98.2
매운고추 98.7 C. magnoliae GLU+,2KG+,ARA+,XYL+,ADO+XLT+,GAL+,SOR+,MDG+,NAG+,CEL,+,MAL+,SAC+,TRE+,MLZ+,RAF+
대추 99.9 C. luistaniae GLU+,GLT,2KG+,ADO+XLT+,SOR+,MDG+,NAG+,CEL,+,MAL+,SAC+,TRE+,MLZ+
감 99.9
유기
농산물
종류		 %ID 동정결과 당 이용성 평가결과
적근대 70.7 Lactococcus
lactis spp lactis1 		ADO +, GLU +, MNE +, NAG +, NAG +, ESC +, MAL +, MEL +, SAC+, RAF +
청경자 70.7 ADO +, GLU +, MNE +, NAG +, NAG +, ESC +, MAL +, MEL +, SAC+, RAF +
청피망 70.7 ADO +, GLU +, MNE +, NAG +, NAG +, ESC +, MAL +, MEL +, SAC+, RAF +
사과 70.7 ADO +, GLU +, MNE +, NAG +, NAG +, ESC +, MAL +, MEL +, SAC+, RAF +
파프리카 70.7 ADO +, GLU +, MNE +, NAG +, NAG +, ESC +, MAL +, MEL +, SAC+, RAF +
매운고추 61.5 Lactobacillus
brevis1 		GLU +, FRU +, MNE +, MAN +, NAG +, ARB +, ESC +, SAL +, CEL+, MAL +, SAC +, TRE +, GEN +, TUR +, HNT + 2KG+, 5 KG +
야생오이 99.7 LARA +, GLU +, MDG + , FRU +, MNE +, MAN +, NAG +, ARB +, ESC+, SAL +, CEL +, MAL +, SAC +, TRE +, GEN +, TUR +, HNT+ 2 KG +, 5 KG +
감 70.7 LARA +, GLU +, FRU +, FAF + , MNE +, MAN +, NAG +, ARB +, ESC+, SAL +, CEL +, MAL +, SAC +, TRE +, GEN +, TUR +, HNT+ 2 KG +, 5 KG +
치커리 87 Leuconostoc
citreum 		ARA +, GLU +, FRU +, MNE +, MDG +, NAG +, ARB +, ESC +, SAL+, CEL +, MAL +, SAC +, TRE +, GEN +, TUR +, HNT + 2KG+, 5 KG +
풋고추 71 Lactobacillus
fermentum 		LARA +, RIB +, DXYL +, GAL +, GLU +, FRU +,
SOR +, MDG +, NAG +, ARB +, ESC +, SAL +,
MAL +, MEL +, TRE +, RAF +, HNT +, 5 KG +
API분석결과의 추가적인 신뢰성을 확인하기 위하여, Vitek System (Vitek Kit, Model : YST card 당이용성 평가: 46종)를 사용하였으며, API와 동일조건으로 효모균을 배양 뒤 Vitek2 Compack 권장방법에 따라 실험을 실시하였으며, API분석결과와 동일성을 비교 확인하였다(표 8).
당류 효모분리 수거 유기농 농산물 Vitek 결과
시금치 배추 알배기 다대기 오이 오크립
(적)		 금귤 파프리카 참외 딸기 방울토마토 양파 매운 고추 감 대추 야생오이 귤
LysA - - - - - - - - - - - - - - -
TyrA (-) - - - - - - - - - - - - - -
dGLUa + + + + + + + + + + + + + + +
dRAFa + + + + + + + + + + + + + + +
lRHAa - + + + + + + - - - - + + - -
dTURa - + + + + + + + + + - + + + +
lGLTa - + + + + + + + + + - + + - -
lPROa - + + + + + + + + + - - - - -
lMLTa - + + + + + + + + + - + + - -
BNAG - - - - - - - - - - - - - - -
LACa - - - - - - - - - - - - - - -
NAGA1 - - - - - - - - - - - - - - -
XLTa - + + + + + + + + + - + + - -
dTREa - + + + + + + + + + - + + + +
dXYLa - + + + + + + + + + - + + - -
2KGa - + + + + + + + + + - + + - -
LeuA + + + + + + + + + + + + + + +
ARBa - + + + + + + - - - - + + - -
MAdGa - + + + + + + + + + - + + - -
dMNEa + + + + + + + + + + + + + + +
dSORa - + + + + + + + + + - + + - -
NO3a - - - - - - - - - - - - - - -
LATa - - - - - - - - - - - - - + +
NAGa - + + + + + + + + + + + + - -
A R G - + + + + + + + + + - + + - -
AMYa - - - - - - - - - - - - - - -
dCELa - + + + + + + + + + - + + - -
dMELa - - - - - - - - - - - - - - -
SACa + + + + + + + + + + + + + + +
lARAa - + + + + + + + + + - + + - -
ACEa - + + + + + + + + + - + + + +
dGNTa - + + + + + + + + + - + + - -
ERYa - - - - - - - - - - - - - - -
dGALa + + + + + + + + + + + + + - -
GGT - - - - - - - - - - - - - - -
dMLZa - + + + + + + + + + - + + - -
U R E - - - - - - - - - - - - - - -
dGATa - + + + + + + + + + + + + - -
CITa - + + + + + + + + + - + + - -
GLYLa - + + + + + + + + + - + + - -
GENa - + + + + + + + + + - + + - -
dMALa - + + + + + + + + + - + + + +
lSBEa - (+) + (+) + + - (-) - - - + + - -
AGLU + + + + + + + + + + + + + - -
ESC - - - - - - - - - - - - - - -
GRTas - + + + + + + + + + - + + - -
%ID 94 95 97 95 96 97 94 96 99 99 89 94 94 95 95
동정결과 C. boidinii C. guilliermondii C. famate C. magnoliae C. luistaniae S. cerevisiae
API 및 Vitek에 의한 동정 결과, 효모 및 유산균은 총 15종이 동정되었는데, 이중 효모는 7종(S. cerevaise 2종, Candida spp. 5종) 그리고 유산균류는 4종류(Lactococcus lactis spp lactis1 , Leuconostoc citreum , Lactobacillus brevis1, Lactobacillus fermenturn)였다.
상기 신규로 분리된 효모 중 사카로마이세스 세레비제는 야생오이(시료 No.37 )와 귤(시료 No. 42)에서 분리되었고, 당이용성을 분석한 결과에서 분리효모의 신규성이 예상됨에 따라 S. cerevaise 2종의 유전자 상동성을 비교하였다.
API 및 Vitek 결과를 최종 확인은 Diversilab 시스템을 이용하여 검정하였는데 분석간 신뢰성을 확인하기 위한 표준효모균주로서 S. cerevisiae JKK091002와 신규분리 효모의 상동성 평가를 실시하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 효모 균주를 DNA 염기서열 분석을 위하여 200U Lyticase(Sigma, L4025)처리하고 Dneasy Blood & Tissue kit (QIAGEN, 69504)를 이용하여 효모의 genomic DNA를 순수분리 한 후, 18S rRNA and 28S rRNA spacer region 분석하기 위하여 forward primer로 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')를 reverse primer로 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT G-3')를 이용하여 First denature(95℃, 2min.), Denaturation(95℃, 45sec), Annealing(55℃, 45sec), Extension(72℃, 45sec , 2 to 4 33 cycles) 그리고 Final extension(72℃,10min)의 조건으로 PCR을 실시하여 밴드패턴을 확인하고, 제한효소 절단법을 이용하여 분리효모의 DNA를 표준표모균주와 비교하였다(Sujaya, 2004). 또, 18s RNA의 염기서열을 CLUSTAL　2.0.11을 이용하여 Multiple sequence aligment를 실시하여 비교하였다.
상기 PCR 증폭산물을 (주)마크로젠에서 염기서열 분석하였고, 서열번호 1에 나타낸 18s rRNA sequence를 이용하여 NCBI의 블라스트 서치 후 상동성을 조사하였다.
그 결과 야생오이에서 분리된 효모 균주는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) ZP541(NCBI)에 90% 상동성을 나타내어 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426으로 명명하고 이를 2012년 2월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호를 KCCM11255P로 부여받았다.
또한 귤에서 분리된 효모 균주는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) ZP541(NCBI)에 96% 상동성을 나타내어 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) OKK110427로 명명하고 이를 2012년 2월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호를 KCCM11256P로 부여받았다.
또한 상기 새로 분리한 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426 및 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) OKK110427 균주는 본 발명자들이 먼저 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002와도 염기서열의 차이를 나타내었다.
실험예1 : 효모의 아미노산 함량
비교균주로서 상업효모 S. cerevisiae(Jenico사), 그리고 본 발명자들이 먼저 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002와 본 발명에서 분리한 신규 효모 균주의 아미노산 함량을 분석하여 표 9에 나타내었다. 아미노산 분석은 식품공전의 아미노산 자동분석기에 의한 정성 및 정량법을 이용하였다.
구분 아미노산 종류 아미노산농도(mg/100g)
SC(Jenico) SC(JKK) SC(CKK) SC(OKK)
1 Asparatic acid 1,565.3 1,143.8 1,130.9 1.130.0
2 Threonine 670.4 579.1 601.3 521.9
3 Serine 737.0 564.5 540.4 559.3
4 Glutamic acid 1,975.6 1,807.2 1,762.5 1,714.3
5 Proline 1,014.7 949.7 944.3 943.7
6 Glycine 680.7 518.6 512.2 477.5
7 Alanine 941.6 695.8 750.8 844.9
8 Cysteine 255.4 200.7 202.4 250.6
9 Valine 861.2 565.9 694.9 674.9
10 Methionine 213.8 181.2 204.2 156.6
11 Isoleusine 723.9 558.2 504.1 532.3
12 Leusine 1,026.9 817.3 807.7 799.6
13 Throsine 453.6 286.0 273.8 313.9
14 Phenylalanine 590.8 348.8 156.7 432.2
15 Histidine 330.6 258.0 252.7 253.4
16 Lysine 1,241.6 984.1 1,033.6 1,054.8
17 Arginine 752.2 752.4 735.3 712.8
18 Trytophane 79.7 80.7 71.1 34.0
총아미노산(%) 14.11 11.29 11.18 11.38
18종의 아미노산을 기준으로 상업효모(대조, 제니코사)의 경우, 효모 100g당 총14mg의 아미노산 함유량이 검출되었는데, S. cerevisiaeJKK091002의 경우는 11.3mg, S. cerevisiaeCKK110426은 11.2mg, S. cerevisiaeOKK110427는 11.4mg으로 유의한 차이는 없었다.
그리고, 아미노산 종류별 함유량 차이를 비교하여 목표인 기능성 부분을 선정코 져 하였다. 결과로서, 18종 아미노산 총량(100%)기준으로 비교시, Glutaminic acid가 14%~17%의 점유율을 보여 가장 높게 나타났으며, 다음으로 Asparatic acid가 9.8%~11%범위의 점유율을 보였으며, 이외의 아미노산류는 각각이 최대 8.4%이내의 범위를 보이는 것으로 평가 되었다.
결론적으로, 전체 선발효모류의 아미노산 함유량에 있어 유의한 차이는 없는 것으로 조사 되었고, 따라서, 단백질내 아미노산의 함유량 차이를 이용한 기능성 제과 및 제빵 소재항목에서 제외하였다.
실험예2 : 효모의 미네랄 함량
비교균주로서 상용효모 S. cerevisiae(Jenico사) 및 C. utilis(Kojin사), 그리고 본 발명자들이 먼저 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002와 본 발명에서 분리한 신규 효모 균주의 미네랄 함량을 분석하여 표 10에 나타내었다.
구분 미네랄 IPC 측정결과(mg/kg)
SC(Jenico) SC(JKK) SC(CKK) SC(OKK)
1 칼슘 47.0±9.6 170±7.4 497±2.3 812±2.3
2 인 3563±5.7 3039±42 3162±26 7887±26
3 마그네슘 562.8±3.2 529.5±19.3 593.6±2.8 1602±2.8
4 철 16.2±0.03 31.0±0.1 44.6±0.3 138±0.3
5 아연 129±0.3 135±6.5 157±0.9 388±0.9
6 황 2279±15 1855±11.3 1765±8.9 2706±8.9
7 망간 ND ND ND ND
ND : Not Detected
상업효모의 경우 칼슘의 함유량은 47mg/kg이였는데, 선발효모의 경우는 170~812 mg/kg의 함유량차이를 보였고, 칼슘이외 Fe , Zn, Mg 및 P 이온의 검출량도 유사한 경향을 나타냈다. 특히 S. cereviase OKK110427은 상업효모에 비하여 유기칼슘에서 17.3 배, 유기철분에서 8.5 배 높은 함량을 나타내었고, 다음으로 S.cereviase CKK110426은 유기칼슘이 10.6 배, 유기철분이 2.8 배를 나타내었고, 그리고 S. cereviaseJKK091002는 그 다음이었다.
따라서 상기 선발효모 중 제과 및 제빵의 반죽에 포함되어 흡수가 뛰어난 유기칼슘 및 유기철분을 상업효모에 비해 현저히 높게 강화시킬 수 있는 미네랄 강화 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
효모를 이용한 제빵 특성과 제과 특성을 가장 정확히 파악 할 수 있는 레시피를 각각 선발하였는데, 효모의 경우는 발효율 및 제빵 특성파악에 가장 용이한 "식빵"을 선정하였고, 제과 적용성 평가를 위하여 최저원료(밀가루, 물, 소금, 효모)만을 사용함으로서 개발소재별 평가와 결과확인이 용이한 "하드롤"을 대표 레시피로 선발하여 각각의 발효특성, 관능특성을 파악하였다.
실험예 3: 제빵 적용성 평가(식빵 기준)
식빵 재료(강력분 1200 g, 물 744 g, 소금 240 g, 설탕 60 g, 버터 70 g, 쇼트닝 36g, 탈지분유 48g, 이스트푸드 2g)에 각각의 효모(8.2ㅧ109 CFU/g) 48 g을 혼합하고 반죽온도 37 ℃에서 15분 1차 발효시킨 후, 30분간 중간발효시키고, 다시 74분간 2차 발효시킨 후, 윗불 170 ℃ 및 아랫불 190 ℃에서 30분 구워 스트레이트법으로 식빵을 제조하였다.
효모로는 Jenico사의 상업효모, 본 발명자가 거봉에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002, 본 발명자가 야생오이에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 CKK110426, 본 발명자가 귤에서 분리한 OKK110427, 및 상업효모인 C. utilis(Kojin사)을 사용하였다.
다만, 사카로마이세스 세레비제 JKK091002는 효모를 바로 반죽에 투입할 경우 오븐 점핑 이 Jenico사의 상업효모에 비해 1/3 수준으로 현저히 낮게 나타났기 때문에, 효모를 거봉을 분쇄한 분쇄물 400g에 멸균 증류수 300g을 혼합하고 5 중량%의 슈크로오스를 첨가한 시료를 1:1 중량비로 혼합하여 당도 13으로 조정한 후 멸균시킨 후 여과한 거봉 배지에 0.01 중량%(1ㅧ106 CFU/㎖)를 접종하여 25 ℃에서 72시간 호기배양한 배양액을 사용하여 빵을 제조하였다.
제조된 식빵의 전체 높이, 오븐 점핑 높이, 길이와 폭, 그리고 관능평가에 의한 식감과 효모취를 표 11에 나타내었고, 그 때의 사진을 도 6에 나타내었다.
구분 변화 SC(Jenico) SC(JKK) SC(CKK) SC(OKK) CU(Kojin)
1 전체 높이(mm) 138.0 135.3 131.0 138.1 51.4
2 오븐점핑(mm) 51.4 56.2 38.2 50.8 0
3 길이(mm) 18.6 18.6 18.6 18.6 18.0
4 폭(mm) 87.4 79.6 83.1 84.6 84.0
5 식감 + +++ +++ +++ -
6 효모취 ## # # # #
식감(대조 대비) : -(매우나쁨), +(보통), ++(좋음), +++(매우좋음)
효모취(대조 대비) : ###(매우심함), ##(심함), #(보통)
Jenico사의 상업효모(100% 기준) 대비 사카로마이세스 세레비제 CKK110426와 OKK110427는 약 95%에서 100%의 수준을 보여 상업효모 대비 발효율에서 차이를 보이지 않는 것으로 인정되었으나, 상업효모인 C. utilis(Kojin사)는 발효특성이 매우 낮음을 알 수 있었다(P<0.05). 이는 또한 본 발명자들이 선행연구에서 분리한 사카로마이세스 세레비제 JKK091002가 사전 배양을 필요로 하는 점에서, 이번에 분리한 효모들은 사용의 편이성 또한 상업효모와 동일함을 확인할 수 있었다. 또한 상업효모 적용시 발생하는 효모취가 감소하고, 식빵의 식감이 개선됨을 확인하였다. 및 효모취 증감여부를 비교한 결과, 선발효모의 경우는 식감을 증가 시키면서 효모취가 감소하는 결과를 보인는 것으로 평가 되었다(P<0.05).
상기 제조된 식빵을 이용하여 전문 교육을 이수한 관능평가 패널(n=18명) 검정을 통하여 비교하였다. 이를 위한 관능평가 주요항목은 냄새(냄새의 이미이취 정도, 냄새의 선호도 구분), 조직감(표면의 바삭한 느낌정도, 안의 부드러움 정도 그리고 조직감의 선호도로 구분) 및 맛[신맛의 정도, 전체적인 선호도로 구분)으로 3항 및 7세부항목으로 구분하여 실시하여 그 결과를 표 12에 나타내었다.
적용
효모 		1. 냄새 2. 조직감 3. 맛
1)냄새이미
이취 정도		 2)냄새
선호도		 1) 표면의
바삭한
느낌정도 		2) 안의
부드러움
정도		 3)조직감
선호도		 1)신맛의
정도		 2)전체적인
선호도
상업효모 5.00
±2.30 		4.25
±1.22 		4.83
±1.27 		5.75
±1.06 		5.42
±1.08 		3.50
±1.45 		5.67
±1.07
S. cereviase JKK091002 4.92
±2.19 		4.37
±2.05 		5.08
±1.78 		4.92
±1.16 		5.50
±1.45 		4.67
±2.02 		5.00
±1.41
S. cereviase CKK110426 6.34
±3.24 		5.43
±1.67 		5.12
±2.10 		6.43
±1.86 		6.26
±1.32 		2.86
±1.88 		6.78
±2.12
S. cereviase OKK110427 5.79
±1.36 		4.87
±1.03 		5.23
±1.75 		6.26
±0.76 		5.84
±1.65 		2.17
±0.65 		6.76
±2.15
C. utilis 0.01
±0.01 		0.01
±0.01 		0.01
±0.01 		0.01
±0.01 		0.01
±0.01 		0.01
±0.03 		0.01
±0.01
Jenico사의 상업효모(100% 기준) 대비 냄새, 조직감 및 맛으로 구분하고 각 항목별 선호도를 평가하여 보았더니, 선호도 역시 약 106%에서 108%범위에서 높게 나타났다.
조직감의 경우에서도 표면의 기호성인 바삭한 느낌 평가에서도 106%~108%, 안의 부드러움 정도평가 결과는 86%~133%로 나타났기 때문에 전체적인 조직선호도를 살펴 보았더니, 101%에서 116%로 냄새와 동일하게 높게 나타났다.
냄새와 조직감 증가가 혹시 발효과정에서 유기산(Acetic acid 및 Isobutric acid)의 증가로 인한 것인지 등의 차이를 확인하여보았다. 우선 신맛의 정도의 수치를 비교하여 보았더니, 상업효모(3.50 기준) 대비 S. cereviase JKK091002의 경우는 4.67의 수치를 보여 133%의 증가수치를 보였기 때문에 유기산의 증가로 인한 것일 것이라고 예측되었는데, S. cereviase CKK110426과 S. cereviase OKK110427경우는 오히려 18%~38%까지 검출량이 감소하는 경향을 보였다. 이는 효모류 마다 제빵 발효과정에서 유기산을 발생시키는 패턴이 다른 것이 아닌가 하고 판단되었기 때문에 추후 풍미분석을 통하여 이를 확인할 필요가 있었다.
최종적으로 맛과 관련하여 전체적인 선호도를 평가하여 보았더니, S.cereviase JKK091002의 경우는 88%로 나타나 상업효모 대비 18%의 선호도 감소결과를 보였는데 반하여 S. cereviase CKK110426과 S. cereviase OKK110427의 경우는 공히 130%의 수치를 보였다.
따라서, 상업효모 대비 전체적인 선호도를 평가하여 본 결과 S. cereviase CKK110426가 가장 우수한 것으로 나타났으며, 다음으로는 S. cereviase OKK110427, 상업효모(Jenico사) 그리고 S. cereviase JKK091002 순이였다.
실험예 4: 제과 적용성 평가( 하드롤 기준)
하드롤 레시피는 최종 굽기과정이 완료되면 표면이 딱딱하고 속은 부드러워 최종 성상이 제과와 제빵 특성을 한꺼번에 파악할 수 있기 때문에 선정하였다.
실험예 3과 비교시 배합 레시피 및 최종굽기 온도를 제외한 발효율 및 관능평가 등의 전체적인 방법 및 결과확인은 동일하게 적용하였다. 즉, 밀가루 800g기준으로 물 464g, 효모 40g, 이스트푸드 2g, 소금 2g, 설탕 16g,쇼트닝 16g, 흰자 1개와 탈지분유 8g을 기본 배합비로 하여, 반죽과정에 이어 37 ℃, 상대습도 78%에서 30분 1차 발효, 실온에서 성형 및 패닝과정과 37 ℃, 상대습도 78%에서 30분 2차 발효과정을 거쳐 윗불 200℃, 아랫불 온도 150℃에서 25분 굽기까지 일관되게 진행하였다. 다만, S. cereviase JKK091002의 경우만 효모를 직접투입하지 않고 실시예 3과 같이 사전배양을 실시하였다.
제조된 하드롤의 높이, 길이와 폭, 그리고 관능평가에 의한 식감과 효모취를 표 13에 나타내었고, 그 때의 사진을 도 7에 나타내었다.
적용효모 높이
(Y,mm)		 길이
(X, mm) 		폭
(Z,mm) 		식감 효모취 비고
S. cereviase 50.6±2.4 81.6±1.4 74.6±3.2 +
(기준) 		##
(기준) 		상업효모 (대조)
S. cereviase JKK091002 48.6±3.2 82.5±2.2 76.6±2.8 +++ # 개발효모
S. cereviase CKK110426 46.7±1.8 84.1±1.4 76.5±2.3 +++ # 개발효모
S. cereviase OKK110427 46.2±2.2 83.8±2.3 76.7±4.2 +++ # 개발효모
C. utilis NC NC NC NC NC 미발효
식감 (대조 대비) : -( 매우나쁨 ), +(보통), ++(좋음), +++( 매우좋음 )
효모취(대조 대비) : ###(매우심함), ##(심함), #(보통)
NC :미발효로 인하여 결과 불측정
Jenico사의 상업효모(100% 기준) 대비 개발 S. cereviase 각각에 대한 발효특성을 비교해 보았더니, 개발효모를 적용시 높이에서는 약 91%에서 약 96%의 수치를 보여 감소하는 것으로 나타나는 듯 보였으나, 길이와 폭의 수치는 오히려 101%에서 103%의 범위로 증가하는 것을 알 수 있었다. 그러나 상업효모인 C. utilis(Kojin사)는 발효가 이루이지지 않았다.
또한, 관능평가 과정을 실시하여 상용효모 적용시 식빵의 식감 및 효모취 증감여부를 비교한 결과, 선발효모의 경우는 식빵에서의 적용성 평가와 유사하게 식감을 유의성 있게 증가 시키면서 효모취 또한 감소시키는 결과를 보여, 일치하는 경향이였다.
따라서, 하드롤 레시피를 적용한 경우와 식빵의 발효율 및 총체적 관능평가 결과를 종합하여 보면, 개발 효모는 상업효모와 동등성 있는 발효율과 상품성을 확보할 수 있고, 제빵은 물론 제과에도 활용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 효모 유래 제빵 및 제과 적용 가능 기능성 소재 제조
본 발명의 S. cereviase CKK110426를 이용하여 효모 배양 후 얻은 압착 효모로부터 효모 추출물 및 세포벽 분획물을 제조방법을 시험생산을 통해 검토하였다.
10톤 발효액 중 1톤 발효액(OD600=22, wet weight 15kg)은 원심분리(Alfalaval, Clara200) 및 정제수를 투입하여 세척하여 농축 현탁액(크림효모)을 제조하였다. 크림효모 (PCV 21%, 43L) 중 23L는 고압세포파쇄기(Micronox, Picomax, 압력 13,000 psi, 유속 500L/h)를 이용하여 세포파쇄하고 20L는 비파쇄한 2가지 시료를 Autolysis시켜 효모추출물과 cell wall 분획에 대한 생산수율 등을 확인하여 표 14에 나타내었다.
Autolysis는 두 가지 시료에 같은 방법으로 진행하였다. 상세하게는, 가성소다를 사용하여 사용 효소의 최적 pH 6.3으로 보정하였으며, endo-peptidase인 alcalase(Novozymes, 2.4 AU/ml) 50m를 넣고, 온도를 서서히 가온하여 55℃에서 약 4.5~6시간 반응하였다. 반응의 중단은 반응 시간 동안 반응액의 Brix 증가 패턴을 확인하여 단위 시간 당 증가되는 비율이 감소되는 것을 기준으로 하였다. 반응완료 후 가열하여 90℃에서 15분간 살균하여 endo-peptidase를 비활성화 시키고, 다시 냉각시켜, 50℃에서 exo-peptidase인 Protamax(Novozymes, 1.5 AU/g) 20g와 Flavourzyme(Novozymes, 500LAPU/g) 20g를 넣어 약 15~20시간 처리하였다. 반응이 종료된 후 95℃에서 10~30분간 살균하여 효소활성제거 및 살균을 겸하였다.
구분 비파쇄한 효모추출물 제조 파쇄한 효모추출물 제조
부피
(L)		 농도
(Brix)		 Wet weight
(kg)		 부피
(L)		 농도
(Brix)		 Wet weight
(kg)
발효액 1,000 - <15 1,000 - <15
원심분리 20 0 4.2 23 0 4.8
세포파쇄 - - - 29 0.5 4.0
Autolysis1st 20 3.6 3.0 29 2.7 3.3
Autolysis2st 20 5.2 2.4 29 3.2 2.5
원심분리 17.5 5.2 1.8 27 3.2 2.0
농축, 여과 4.5 15 - 3.4 25 -
살균 4.5 15 - 3.4 25 -
건조 - - >140g - - >210g
세포파쇄 유무에 따른 autolysis 결과, 세포파쇄한 시료는 상등액으로 녹아나오는 단백질 또는 아미노산이 비파쇄한 시료에 비해 낮은 것으로 나타났으나, 세포파쇄한 시료를 autolysis할 경우 효모추출물 제조시 수율이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
autolysis 완료된 시료는 원심분리(관형원심분리기)를 진행하여 상등액은 효모추출물 제조 공정으로 진행하고, pellet(세포융해물)은 세포벽 분획물 제조공정으로 진행하였다. 상등액은 농축기(lab scale, 10L bow, inlet temp. 50℃)에서 3~5L (15~25 Brix) 수준으로 농축하여 여과(filterpad, 0.2μm) 및 살균(95℃, 30분)하여 분무건조(pilot scale, 50L)하였다.
상기 결과를 통해 효모 추출물 및 세포벽 분획물의 제조방법을 도 8과 같이 결정하였다.
우선 autolysis 공정을 진행하기 위해 압착효모 80kg(수분함량 67%, 건조함량 23kg 이상)을 반응탱크에 300L(PPV 27%, pH 4.3) 되게 현탁하였다. 현탁시 온도를 가온하여 약 35~40℃를 1~2시간 유지하고, 가성소다를 이용하여 pH 6.3~6.5로 보정하였다(약 20% NaOH 2L). 이후 온도를 천천히 올려 약 55~58℃로 변경하고, endo-peptidase인 alcalase(Novozymes, 2.4AU/ml) 200ml과 exo-peptidase인 flavourzyme 500MG (Novozymes, 500LAPU/g) 150g 을 투입하였다. 반응시간 동안 분해 활성이 좋지 않아 95% 에탄올 약 5L를 투입하여 반응을 촉진시켰다. 반응시간은 약 20~22시간 진행하였으며, 95℃ 30분간 살균 후 반응액은 약 6% 정도의 PPV 값이 감소하고, 반응액의 농도는 0.5Brix에서 6.7Brix까지 증가하였다. 생산용 연속원심분리기(Alfalaval, Clara200)를 이용하여 200L 상등액과 100L 슬러지(cell wall 분획 및 상등액이 포함)을 분리하였으며, 슬러지에 물을 200L 투입하여하여 상등액을 추가로 세척하여 회수하였다. 회수된 상등액은 총 500L, 4.8Brix이며, 이를 진공가온농축(45℃) 하여 27Brix, 70L 의 농축액으로 제조하고, 여과 및 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 회수되는 최종 수율을 확인하기 위함이였으나, 동결건조(Large scale, 100kg 급, -40℃, 12시간 냉동)에서 완전히 동결되지 않아 이론 수율(Brix 값을 기준으로 16.9kg)에 비해 42% 수준인 7kg의 분말 효모추출물을 생산하였다. 가성소다를 투입 및 원심분리를 1회 더 진행하여 상등액에 포함되어져 있는 단백질 성분을 최대한 제거하였다. 3회째 가성소다 투입시는 90~95℃, 30분간 처리하여 비누화를 진행하였으며, 지용성 성분 및 단백질을 제거하도록 하였다. 35% HCl를 투입하여 pH 수준을 산성 또는 약산성으로 보정하여 산에 녹는 물질 및 미네럴 등을 제거하려 하였다. 추가 세척 단계를 1회 더 진행하였으며, 에탄올로 세척하여 지용성 성분을 제거하였다. 최종 50L(PPV 21%)의 cell wall 분획을 확보하였으며, 이를 동결건조하여 약 3.35kg의 세포벽 분획물 건조분말을 제조하였다.
실험예 5: 사카로미세스 세레비제 CKK110426 및 그 유래 소재의 가열에 따른 풍미인자 확인
상기 실시예 4에서 제조한 효모추출물(이하, YEMaeil)과 세포벽 분획물(이하, GMaeil)과 S. cereviase에서 분리한 세포벽 동결건조 시료(일본 오리엔탈사, 이하 GJapan)와 C. utilis에서 분리한 추출물(일본 KOHJIN사, 이하 YEAR, 상품명 AROMILD)의 제빵 적용성 평가전 열처리시 물성 변화 및 풍미 등에 미치는 효과를 사전검정하기 위하여, 풍미인자 검정용 시험용기(50ml, GC-Mass)내 동일량을 각각 충진한 후 열처리 조건별(무처리, 75℃, 90℃ 및 110℃)로 풍미인자를 분석하여 표 15 및 16에 나타내었다.
개발효모에서 분리한 기능성 소재별 내열성 평가에 따른 성상변화 및 풍미변화조사
개발효모(CKK110426) GMaeil ß-Glucan(오리엔탈)
비열처리 75℃ 90℃ 110℃ 비열처리 75℃ 90℃ 110℃ 비열
처리		 75℃ 90℃ 110℃
Alcohols Ethanol 63.4 65.9 66.5 67.3 92.9 47.0 43.2 49.2 74.0 74.2 74.3 74.1
Isobutanol 2.4 2.1 1.7 3.7 0.1 1.1 1.5 1.7 0.0 0.0 0.0 0.1
2-methyl-1-butanol 0.6 0.7 0.5 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0 13.2 12.8 13.0 11.7
3-methyl-1-butanol 6.0 3.5 4.7 5.6 0.0 0.0 0.0 0.0 2.0 2.0 0.1 1.8
Nonanol 0.1 0.1 0.1 0.0 1.8 12.1 10.9 7.6 1.1 1.4 1.5 2.0
Phenyl ethyl alcohol 4.6 4.5 4.1 3.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 0.2 0.0 0.2
Aldehydes Hexanal 0.0 0.1 0.0 0.0 1.4 9.5 9.4 8.9 0.4 0.5 0.7 0.7
Benzaldehyde 0.3 0.3 0.3 0.2 0.4 3.5 5.0 8.1 2.8 2.9 3.6 4.6
Acids Acetic acid 4.5 4.2 4.3 3.9 0.2 1.3 1.1 1.0 3.5 3.4 3.1 2.0
Isobutyric acid 12.7 13.2 12.6 11.5 0.8 6.3 7.2 0.3 0.1 0.1 1.1 0.5
Butanoic acid 0.6 0.6 0.6 0.4 0.0 0.0 0.3 0.0 0.0 0.2 0.2 0.0
Hexanoic acid 3.9 4.1 3.8 3.1 0.0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Octanoic acid 0.1 0.1 0.1 0.0 1.9 14.7 15.6 11.6 1.7 1.4 1.4 0.9
Esters 2-Pentylfuran 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 1.4 1.7 5.3 0.1 0.1 0.1 0.2
Ethylcaproate 0.1 0.1 0.0 0.0 0.1 0.7 1.0 1.5 0.0 0.0 0.0 0.0
Ethyl octanoate 0.2 0.3 0.2 0.1 0.1 1.4 2.0 3.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Ethyl decanoate 0.2 0.2 0.1 0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0
Ketones Acetoin 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.6 0.8 1.1 0.5 0.6 0.7 1.0
SUM(%) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
개발효모에서 분리한 기능성 소재별 내열성 평가에 따른 성상변화 및 풍미변화조사
YEMaeil 효모추출물 Aromild(Kohjin)
비열처리 75℃ 90℃ 110℃ 비열처리 75℃ 90℃ 110℃
Alcohols Ethanol 43.9 39.0 38.1 37.8 0.3 0.6 0.3 0.4
Isobutanol 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0
2-methyl-1-butanol 0.0 0.0 0.0 0.0 50.3 46.2 46.0 32.3
3-methyl-1-butanol 0.0 0.0 0.0 0.0 7.6 7.0 0.2 0.2
Nonanol 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 0.0 0.2
Phenyl ethyl alcohol 20.4 21.4 20.4 14.3 0.1 0.1 0.1 0.2
Aldehydes Hexanal 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Benzaldehyde 0.5 0.6 0.8 1.0 0.4 0.5 0.6 0.5
Acids Acetic acid 28.4 32.2 34.3 40.0 37.3 39.7 43.2 54.6
Isobutyric acid 2.6 2.8 2.8 2.4 0.7 1.1 2.0 3.1
Butanoic acid 1.4 1.6 1.5 1.2 2.6 3.7 5.8 6.6
Hexanoic acid 1.9 2.1 2.1 1.6 0.1 0.2 0.4 0.8
Octanoic acid 0.2 0.2 0.0 0.1 0.3 0.3 0.8 1.1
Esters 2-Pentylfuran 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Ethylcaproate 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Ethyl octanoate 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1
Ethyl decanoate 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0
Ketones Acetoin 0.1 0.1 0.0 1.4 0.0 0.4 0.5 0.0
SUM(%) 100 100 100 100 100 100 100 100
본 발명의 사카로미세스 세레비제 CKK110426 및 그로부터 유래된 효모추출물 및 세포벽 분리물을 농도별로 첨가한 후 제조한 제빵 풍미인자를 GC-MS분석을 통하여 검정한 결과 총 18종의 성분이 검출되었으며, 전체분석 수치(100% 기준)중 알콜류 점유비율이 60%~90% 범위에서 가장 높게 나타났다.
사카로미세스 세레비제 CKK110426의 경우에서, 비가열시 전체 풍미인자에서 Ethanol는 약 63%의 점유율을 보였으며, 75℃로 처리한 경우는 약 65.9%, 90℃는 66.5% 그리고 110℃로 가열처리시는 67.3%로 나타나 가열온도가 증가하면 비례하여 다소 증가하는 경향을 보였으나, 유의한 차이는 인정되지 않았다(P<0.05). 이러한 경향은 효모를 제빵 및 제과에 적용 시, 반죽, 발효 및 굽기 과정에서 빵 안의 온도가 100℃정도임을 감안하면 Ethanol이 풍미에 있어 주요한 인자일 것으로 예측되었다.
한편 상기 사카로미세스 세레비제 CKK110426에서 분리된 세포벽 분획물(GMaeil)은 비열처리시 약 93%였는데 열처리를 한 경우에서는 43~49%의 검출수치를 보여 약 50%의 감소결과를 보여, β-Glucan(오리엔탈사, 일본)과는 큰 차이를 나타내었다.
또한 사카로미세스 세레비제 CKK110426에서 분리된 효모추출물(YEMaeil)은 비열처리시 약 44%, 열처리시는 37%~39% 범위에서 수치증가효과를 보였으나, Aromild의 경우에는 비열처리 및 열처리에 상관없이 Ethnol의 검출양이 0.1~1.1% 범위였다. 또한 사카로미세스 세레비제 CKK110426에서 분리된 효모추출물(YEMaeil)은 유기산 중에서 역한 냄새유발 유기산인 Isobutyric acid와 신냄새 유발 유기산인 Acetic acid 함량이 높아 풍미에 부정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 추정되었다.
실험예 6: 사카로미세스 세레비제 CKK110426 및 그 유래 소재를 이용한 제빵 및 제과 적용성 평가( 바게트 빵 기준)
"하드롤"과 마찬가지로 최종 굽기 후 딱딱한 표면과 부드러운 내부를 가져 제과 및 제빵 특성을 함께 확인할 수 있는"바게트빵" 레시피를 선발하여 이를 기준으로 실시예 4에서 제조한 효모추출물(이하, YEMaeil)과 세포벽 분획물(이하, GMaeil)의 적용가능성을 검토하였다. 대조군으로 기능성 소재를 넣지않은 것을 이용하였다.
바게트빵은 강력분 1,000g을 기준으로 물 600g, 상용 압착효모(제니코) 50g, 소금 18g을 기본 배합비율로 정하고, 반죽은 최종단계까지, 그리고 1차 발효(30℃, 수분: 80%, 30분) 및 성형(270g로드형, 270g 원형, 60g 원형), 중간발효(30분, 상온), 2차발효(30℃, 수분: 80%, 40분) 단계를 거쳐 최종 굽기(200℃/180℃,25분)를 실시하였고, 각각의 효모추출물 또는 세포벽 분리물을 10g(1%, w/w) 첨가하였다.
성형 및 패닝은 프랑스빵의 기본형태인 로드형(270g 분할)을 기본으로 하였으며, 결과분석의 편리성을 확보하기 위해 원형(270g 및 60g 분할)으로 3종류로 구분하여 준비하였다.
기능성 소재 첨가에 따른 제과제빵 특성변화 확인 결과, 세포벽 분리물(GMaeil)을 첨가한 경우 발효율은 기능성 소재를 넣지 않은 대조군의 80 % 수준이었고, 효모추출물(YEMaeil)을 첨가한 경우 발효율은 기능성 소재를 넣지 않은 대조군의 110 % 이상이었다. 다만 효모추출물(YEMaeil)은 굽기후에 관능평가를 실시하여 본 결과 1% 이상 첨가시는 우마미 및 짠맛이 다소 높게 나타났으며, 첨가농도가 높을수록 비례하여 빵 표면색의 고급화(황갈색)에 영향을 미치는 것으로 조사되었다
또한 제조된 빵의 샘플을 채취 후 18종 성분[Alcohol(6종), Aldehyde(2종), Acid(5종), Ester(4종) 및 Ketone(1종)] 에 대해서 분석 및 풍미관련 이화학적 조사를 실시하여 그 결과를 표 17에 나타내었다.
개발 기능성 소재 첨가가 제빵 풍미인자에 미치는 효과(단위: %)
상업효모
(대조, Jenico사)		 개발효모
(CKK110426)		 YEMaeil 1%추가 GMaeil 1%추가
Alcohols Ethanol 77.5 88.6 72.1 78.8
Isobutanol 0.7 2.0 0.5 0.7
2-methyl-1-butanol 0.2 0.6 0.7 0.9
3-methyl-1-butanol 4.2 1.3 1.6 3.3
Nonanol 1.4 1.0 1.7 1.2
Phenyl ethyl alcohol 7.2 1.7 12.0 9.9
Aldehydes Hexanal 0.4 1.2 0.8 0.5
Benzaldehyde 0.0 0.4 0.0 0.0
Acids Acetic acid 1.0 0.5 0.9 0.4
Isobutyric acid 0.6 0.2 0.7 0.2
Butanoic acid 0.0 0.0 0.0 0.0
Hexanoic acid 0.7 0.1 1.3 0.6
Octanoic acid 0.4 0.6 1.3 0.5
Esters 2-Pentylfuran 3.8 0.9 5.7 2.0
Ethylcaproate 0.2 0.0 0.1 0.1
Ethyl octanoate 1.3 0.2 0.5 0.6
Ethyl decanoate 0.4 0.0 0.2 0.2
Ketones Acetoin 0.1 0.7 0.1 0.0
SUM(%) 100 100 100 100
상기 풍미 인자 분석결과 세포벽 분리물(GMaeil)을 첨가한 경우나 효모추출물(YEMaeil)을 첨가한 경우 모두 상업효모와 유사한 풍미인자 생성패턴을 나타내어 1%까지는 제과 및 제빵 적용성에 문제가 없는 것을 확인하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11255P 20120217
<110> Maeil Dairies Co., Ltd. <120> A novel Saccharomyces cerevisiae CKK110426 and preparation method of functional ingredient for making baked products using it <130> HPC-3188 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 737 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 agcttttacc tgggcancaa gacaagaaat gganagtccn nccgggcctg cgcttanntg 60 cgcggncttg ctaggcttgt aagtttcttt tttgctattc caaacggnaa aaaatttctg 120 ggctttaann aataggacaa ttaaaaccgt ttcaatacaa caccctgtga agttttcgta 180 ttctggacng cttttctttg ggcattcnag caatcggggc ccaaaggtaa caaacccgaa 240 caattttatt tnttcnttaa atttttgncn nnnnnnnnnn ttttcgnatc tggaaatttt 300 aaaatattaa aaactttcan caacggatct tttgtttctc ccatcgatga anaacccngc 360 gaattgcnat ncttaatgna aattgcnnaa ttccgtgaat catcnaatct ttgaactcac 420 attgcgcccc ttggtattcc ngggggcatg cctgtttgag cgccatttcc ttcccaaaca 480 ttctgtttgg aantgagtga tacnctttgg agttaacttg aaattgctgg ccttttcatt 540 ggatgnnnnn nnnnccaaan anaggtttct ctgcntgctn gaggnataan gcaantacgg 600 ccgttttagg ttttaccaac tgcggcnaan cttttttata ctgagcgnat tggancgtta 660 tcnatcagaa nagagcgtcn aggcgaacaa cgttctnaaa gtttgacctc aaatcaggta 720 ggagtaccng ctgaact 737

Claims (3)

  1. 야생오이 유래의 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426(기탁번호: KCCM11255P).
  2. 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426를 함유하는 것을 특징으로 하는 제과 또는 제빵용 반죽(dough).
  3. 제 2 항에 있어서, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) CKK110426 및 그를 파쇄하여 얻은 세포벽 분획물을 함유하는 것을 특징으로 하는 제과 또는 제빵용 반죽(dough).
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