KR101404262B1

KR101404262B1 - Ｎｅｌｌ2를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101404262B1
Application number: KR1020110008579A
Authority: KR
Inventors: 이병주; 김동열
Original assignee: 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2014-06-05
Also published as: KR20120087410A

Abstract

본 발명은 NELL2를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 NELL2 단백질은 소포체 스트레스와 관련된 여러 가지 단백질 발현에 관여하며, 또한 세포사멸 (apoptosis)과 관련된 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein) 및 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 발현에 영향을 주어 소포체 스트레스를 완화하는 효과가 있다. 더욱 자세하게는, 본 발명의 NELL2 단백질이 과발현되는 경우 소포체 샤페론인 BiP 단백질의 발현 증가; 소포체 스트레스 제거기능을 갖는 XBP1 스플라이싱의 증가; 세포사멸과 관련된 단백질인 CHOP의 발현 감소; 소포체 샤페론인 RP94, calnexin, BiP의 mRNA 발현 증가; 세포사멸에 관련된 단백질인 카스파제 3, 카스파제 7 및 PARP의 활성을 억제; 및 세포생존에 관련된 단백질인 Bcl-xL의 발현을 증가시키는 기작을 통하여 소포체 스트레스를 완화시키는 효과를 갖는다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 NELL2 단백질 및 NELL2 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＮＥＬＬ2를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of ER-stress Mediated Disease Comprising NELL2}

본 발명은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 소포체 스트레스를 완화시키는 효과를 나타내는 NELL2 단백질 또는 NELL2 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

소포체(ER, endoplasmic reticulum)의 내강은 번역 후 변형과 단백질의 폴딩을 위해 특수화된 세포적 환경이다. 소포체는 핵막으로부터 뻗어 나와 가지를 친 것 같은 막성분의 구조로서 리보좀이 붙어있는 조면소포체와 리보좀이 없는 활면소포체의 두 종류가 있다. 세포 내 단백질의 약 1/3이 조면소포체에서 mRNA에서 단백질로 번역 후 수정(post-translational modification) 즉 폴딩 (folding)과 조립 (assembly), 당화(glycosylation), 이황화결합(disulfide bond) 등의 과정을 통해 활성 형태를 띠는 단백질 구조가 된다. 또한 활면소포체는 지질과 스테로이드 호르몬의 합성장소이며 칼슘 저장소로 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을 한다.

소포체 스트레스 (ER stress)란 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 세포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되어 소포체 기능에 장애가 발생하는 것을 말하며, 주로 단백질 폴딩 용량을 넘어서서 ER 단백질 폴딩 능력을 초과한 상태를 의미한다. 소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전을 가지는데 이를 소포체 스트레스 반응 (ER stress response)라고 한다.

소포체 스트레스 반응은 소포체 막에 존재하는 소포체 막관통 수용체 (ER transmembrane receptor)인 pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase (PERK), activation transcription factor 6, inositol-requiring enzyme 1 (IRE1)을 통해서 신호가 전달된다. 일반적인 세포에는 이 세 가지 소포체 스트레스 수용체가 소포체 샤페론인 GRP78/BiP와 결합되어 불활성화 되어 있다가 unfoled 단백질이 소포체 내에 축적되면 GRP78/BiP가 수용체로부터 분리되어 수용체가 활성화되고 결과적으로 소포체 스트레스 반응이 유발된다. 이렇게 유발된 소포체 스트레스 반응은 소포체의 기능을 회복시키고 unfoled 단백질의 축적을 감소시킨다. 하지만, unfoled 단백질의 축적이 계속되고 소포체 스트레스가 완화되지 않으면 세포자연사(apoptosis) 경로가 활성화되어 결국 세포사멸이 일어나게 된다.

소포체 스트레스로 인해 야기되는 질환으로는 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 신경퇴화질환 (neurodegenerative disease), 양극성 장애(bipolar disorder), 당뇨병 (diabetes mellitus), 동맥경화증 (atherosclerosis), 염증 (inflammation), 국소빈혈 (ischemia), 심장병 (heart diseases), 간질환 (liver diseases), 췌장 질환 (kidney diseases), 암 (cancer) 등으로 소포체 스트레스가 다양한 질병의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.

따라서 소포체 스트레스를 조절하는 경우, 상기와 같은 소포체 스트레스 관련 질환의 발생을 예방하고 치료할 수 있을 것으로 제시되고 있으나, 소포체 스트레스반응 기전에 대해서는 알려지지 않은 부분이 많아 이에 대한 연구가 부족한 실정이다. 그러므로 효과적으로 소포체 스트레스를 조절할 수 있는 타겟을 개발할 필요성이 있다.

한편 NELL2 유전자는 닭의 배에서 발견된 neural tissue-specific EGF-like repeat domain containing protein (nel)과 유사한 유전자로, 인간에게는 이들 닭의 nel과 유사한 2개의 유전자가 존재하는데 이들을 각각 NELL1, NELL2라 한다. 특히 이들 중 NELL2가 닭의 NELL과 유사도가 높으며 성체의 뇌 조직특이적으로 발현되는 것으로 보고되었다 (Watanabe et al., 1996).

NELL2는 포유동물의 뇌에서 성 분화를 조절하는 유전자를 찾기 위한 실험 모델인 출생 직후 에스트로겐을 다량으로 투여한 흰쥐 모델의 시상하부에서 에스트로겐-의존적인 유전자들 중 하나로 발견되었다. 이 유전자는 6개의 epidermal growth factor (EGF)-like repeat domain을 가지고 있으며, 이 중 Ca² ⁺과 결합할 것으로 생각되는 3개의 Ca² ⁺-binding EGF-like domain들을 가지고 있다. NELL2는 포유동물에서 출생 이후에 신경조직 특이적으로 발현된다는 것이 보고되어져 있으며, 여러 신경세포 사멸조건에서 신경세포 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

그러나 상기와 같은 특징을 갖는 NELL2 유전자와 관련하여, 소포체 스트레스로부터 세포를 보호하는 효과가 있다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 NELL2가 소포체 스트레스로부터 세포의 생존에 어떤 영향을 주는지 규명하고자 하였으며, 그 결과 NELL2가 소포체 스트레스와 관련된 여러 가지 단백질 발현에 관여하며, 또한 세포사멸 (apoptosis)과 관련된 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein) 및 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 발현에 영향을 주어 소포체 스트레스를 완화시키는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 NELL2를 이용하여 소포체 스트레스 관련 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NELL2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NELL2는 소포체 샤페론인 GRP94, calnexin 또는 BiP 단백질의 발현 증가; 소포체 스트레스 제거기능을 갖는 XBP1 효소 발현의 증가; 또는 항세포사멸 인자인 Bcl-xL의 발현 증가를 통해 소포체 스트레스를 감소시키는 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NELL2는 카스파제-3, 카스파제-7 또는 PARP의 활성을 억제시키거나, 세포사멸인자인 CHOP의 발현 감소를 통해 소포체 스트레스를 감소시키는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소포체 스트레스 관련 질환은 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 면역글로블린 경쇄 아밀로이드증 (immumoglobulin light chain amyloidosis), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 혈액투석 연관성 아밀로이드증 (haemodialysis-related amyloidosis), 활동성 아밀로이드증 (reactive amyloidosis), 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis), 겸상적혈구 빈혈증 (sickle cell anemia), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 (Kreutzfeldt-Jakob disease), 가족성 고콜레스테롤혈증 (familial hypercholesterolaemia), 알파1-항트립신 결핍증 (Alpha1-antitrypsin deficiency), 경변 (cirrhosis), 전신성 폐기종 (emphysema systemic), 뇌성 유전성 아밀로이드증 (cerebral hereditary amyloidoses), 울콧-랠리스 증후군 (Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군 (Wolfram syndrome), 염증성 장질환, 코론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소포체 스트레스는 답시가르긴(thapsigargin)에 의해 유도되는 스트레스인 것일 수 있다.

본 발명의 NELL2 단백질은 소포체 스트레스와 관련된 여러 가지 단백질 발현에 관여하며, 또한 세포사멸 (apoptosis)과 관련된 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein) 및 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 발현에 영향을 주어 소포체 스트레스를 완화시키는 효과가 있다.

더욱 자세하게는, 본 발명의 NELL2 단백질이 과발현되는 경우 소포체 샤페론인 BiP 단백질의 발현 증가; 소포체 스트레스 제거기능을 갖는 XBP1 효소 발현의 증가; 세포사멸과 관련된 단백질인 CHOP의 발현 감소; 소포체 샤페론인 GRP94, calnexin, BiP의 mRNA 발현 증가; 세포사멸에 관련된 단백질인 카스파제 3, 카스파제 7 및 PARP의 활성을 억제; 및 세포생존에 관련된 단백질인 Bcl-xL의 발현을 증가시키는 기작을 통하여 소포체 스트레스를 완화시키는 효과를 갖는다.

따라서 상기와 같은 효과를 갖는 NELL2 단백질 또는 NELL2 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Cos7 세포에 답시가르긴(thapsigargin)을 농도별로 처리하고, 24시간이 경과한 후 MTS assay를 이용하여 세포생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다 (DEST40-대조군, NELL2-NELL2를 과발현시킨 실험군).
도 2는 Cos7 세포에 답시가르긴을 농도별로 처리하고, 48시간이 경과한 후 MTS assay를 이용하여 세포생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 Cos7 세포에 답시가르긴을 처리한 후 시간 경과에 따라 살아있는 세포 수를 trypan blue exclusion assay를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 4는 Cos7 세포에 답시가르긴을 처리한 후 시간 경과에 따라 사멸된 세포 수를 trypan blue exclusion assay를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 5는 Cos7 세포에 DMSO가 첨가된 무혈청배지를 24시간 처리한 후 CHOP, BiP, XBP1 스플라이싱 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 6은 Cos7 세포에 답시가르긴을 처리하고 24시간이 경과한 후 CHOP, BiP, XBP1 스플라이싱 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 7은 Cos7 세포에 답시가르긴을 처리하고 48시간이 경과한 후 CHOP, BiP, XBP1 스플라이싱 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8의 상측은 Cos7 세포에 답시가르긴을 처리하고 24시간, 48시간 처리한 후 GRP94, BiP, calnexin의 mRNA변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 8의 하측은 상기 GRP94, BiP, calnexin의 mRNA변화를 RT-PCR로 확인한 결과를 GAPDH를 기준으로 표준화한 후, 각 마커(GRP94, BiP, calnexin)의 상대적인 양을 대조군과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 Cos7 세포에 답시가르긴을 24시간 처리한 후 카스파제 3 (caspase 3), 카스파제 7 (caspase 7) 및 PARP의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 10은 Cos7 세포에 답시가르긴을 48시간 처리한 후 카스파제 3 (caspase 3), 카스파제 7 (caspase 7) 및 PARP의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 11은 Cos7 세포에 답시가르긴을 24시간, 48시간 동안 처리한 후 Bcl-xL의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.

본 발명은 NELL2를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)는 닭의 배에서 발견된 neural tissue-specific EGF-like repeat domain containing protein (nel)과 유사한 유전자로서, 사람 태아 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 nel의 2개의 포유동물의 동족체를 동정하였고, 이들을 각각 NELL1, NELL2라 하며, 특히 이들 중 NELL2가 닭의 nel과 유사도가 높으며 성체의 뇌 조직특이적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. NELL2는 포유동물에서 출생 이후에 신경조직 특이적으로 발현된다는 것이 보고되어져 있으며, 여러 신경세포 사멸조건에서 신경세포 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 상기 NELL2 유전자에 의해 발현되는 NELL2 단백질이 소포체 스트레스를 완화시킬 수 있다는 것을 처음으로 규명하였다.

본 발명에 의하면 NELL2 단백질은 소포체 스트레스와 관련된 여러 가지 단백질 발현에 관여하며, 또한 세포사멸 (apoptosis)과 관련된 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein) 및 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 발현에도 영향을 주어 소포체 스트레스를 완화시키는 것을 확인할 수 있었다.

더욱 자세하게는, 본 발명자들은 NELL2 단백질이 소포체 스트레스에 미치는 영향을 살피기 위해, 시험관 내 조건(in vitro)에서 세포에 소포체 스트레스를 인위적으로 발생시킨 후 NELL2 단백질을 과발현시킨 실험군과 음성 대조군을 비교하였다. 그 결과 NELL2 단백질을 과발현시킨 실험군에서 소포체 샤페론 단백질인 BiP 및 소포체 스트레스 제거와 관련된 XBP1의 스플라이싱이 증가되었으며, 세포사멸 관련 단백질인 CHOP의 발현은 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 NELL2 단백질이 소포체 스트레스의 완화를 위해 유전자 수준에서의 영향을 조사하였는데, 즉, 소포체 샤페론의 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과 NELL2 단백질을 과발현시킨 실험군에서 소포체 샤페론의 종류인 GRP94, calnexin, BiP의 mRNA 발현량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 세포 내 소포체 스트레스가 일어나는 경우 NELL2 단백질이 어떠한 경로로 세포사멸로부터 세포를 보호하는지를 살피기 위해, 시험관 내 조건에서 세포에 소포체 스트레스를 인위적으로 발생시킨 후 NELL2 단백질을 과발현시킨 실험군과 음성 대조군을 비교하였다. 그 결과 NELL2 단백질을 과발현시킨 실험군에서 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein)인 카스파제 3, 카스파제 7 및 PARP의 활성을 억제하고, 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)인 Bcl-xL의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들은 NELL2가 여러 가지 세포 내 기작을 통해 소포체 스트레스를 완화시키는 것을 증명하는 것이다.

따라서 상기와 같은 특징을 갖는 NELL2, 바람직하게는 NELL2 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 NELL2 단백질, 즉, NELL2 폴리펩티드는 NELL2의 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 NELL2 단백질은 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함한 해독 후 변형을 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명의 NELL2 단백질은 포유류의 조직으로부터 직접 분리하여 제조하거나, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 세포 또는 조직에 함유된 NELL2 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 예시할 수 있다.

또한 NELL2 단백질은 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다. 특히, 바람직한 폴리펩타이드의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase syntheses)을 이용하는 것이다. NELL2는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 그 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

또한 NELL2 단백질은 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, NELL2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 NELL2 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 NELL2 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

따라서 본 발명은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 NELL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, NELL2 단백질을 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

따라서 NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다. NELL2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 pcDNA-DEST40 벡터 (Invitrogen)를 이용하였다.

NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 NELL2 단백질을 발현하는 발현벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다. 세포내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 있어서 NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다는 의미는, NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 자체를 유효성분으로 포함하는 것과, NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현벡터를 유효성분으로 포함한다는 것을 의미한다.

한편 본 발명에서 제공하는 NELL2를 유효성분으로 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 NELL2 단백질 또는 NELL2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 이외에 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 치료제가 경구로 투여될 때, 치료제는 정제, 캡슐, 입자, 분말, 환제, 트로키, 내액제, 현탁제, 유화제, 또는 시럽 등의 제형으로 투여될 수 있다.

상기 제형들은 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 유전자요법 치료제 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 소포체 스트레스 관련 질환으로는, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 면역글로블린 경쇄 아밀로이드증 (immumoglobulin light chain amyloidosis), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 혈액투석 연관성 아밀로이드증 (haemodialysis-related amyloidosis), 활동성 아밀로이드증 (reactive amyloidosis), 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis), 겸상적혈구 빈혈증 (sickle cell anemia), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 (Kreutzfeldt-Jakob disease), 가족성 고콜레스테롤혈증 (familial hypercholesterolaemia), 알파1-항트립신 결핍증 (Alpha1-antitrypsin deficiency), 경변 (cirrhosis), 전신성 폐기종 (emphysema systemic), 뇌성 유전성 아밀로이드증 (cerebral hereditary amyloidoses), 울콧-랠리스 증후군 (Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군 (Wolfram syndrome), 염증성 장질환, 코론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 NELL2 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 '약제학적으로 유효한 양'이란, 치료하고자 하는 소포체 스트레스 관련 질환에 대해 완화, 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명의 NELL2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동물모델에서 실험을 수행하여 혈중 NELL2 단백질의 농도 범위가 세포배양에서 결정된 IC50(시험관내 분석, 약물 처리 시, 배양세포의 50%에 대한 치사량의 테스트 화합물의 농도)을 통하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정 할 수 있다. 일 구체예에서 본 발명의 약제학적 조성물을 피하 주사하는 경우, 용량은 일반적으로 체중 1kg당 1,000 내지 150,000단위이며 이를 1일 1회 또는 수회 분할하여 투여하나 용량은 증상에 따라 적당하게 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 제조자에 의해 권장되는 투여량에 따라 투여할 수 있다. 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 1ug/ml 농도로 피하 주사될 수 있다. 이때, NELL2 단백질은 0.1 내지 10 ug/ml 의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 NELL2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 NELL2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 ‘포유동물’은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 ‘치료상 유효량’상기 약제학적으로 유효한 양과 동일한 개념이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

소포체 스트레스 조건에서 NELL2 가 세포에 미치는 영향

NELL2가 소포체 스트레스 조건에서 세포를 보호하는지를 알아보기 위해, 세포에 소포체 스트레스를 유도한 후 NELL2 과발현 세포를 실험군으로 하여 세포 생존율을 비교 실험하였다. 세포 생존율 측정은 MTS assay 및 trypan blue exclusion assay 수행을 통해 이루어졌으며, 이들 실험에 대한 구체적인 방법은 하기 기술한 바와 같다.

<1-1> 세포 배양

Cos7 세포는 High Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)에 10% 소태아혈청(Hyclone)과 페니실린-스트렙토마이신 용액 (100unit/ml)이 포함된 배양액으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 이틀마다 서브컬처 하였다.

<1-2> NELL2 과발현 세포 제조

랫트의 NELL2 full 유전자 서열을 pcDNA-DEST40 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였고, 클로닝된 발현 벡터는 서열분석을 통해 NELL2 full 유전자의 벡터내로의 삽입을 확인하였다. Cos7 세포를 6웰 플레이트에 2×10⁵개/well 로 분주한 후 37℃ 인큐베이터에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 NELL2 발현 벡터를 리포펙타민 (Invitrogen)을 사용하여 트랜스펙션하였다. 그 후 G418 (Sigma) 300μg 을 처리하여 3주 동안 배양하여 NELL2가 트랜스펙션된 세포를 선별하였다.

<1-3> MTS assay

상기 <1-1>을 통해 배양된 Cos7 세포(대조군) 및 상기 <1-2>를 통해 선별된 NELL2 과발현 세포(실험군) 각각을 96웰 플레이트(NUNC)에 1×10⁴ 개/well로 분주한 후 37℃ 인큐베이터에서 밤새도록 배양하였다. 다음 날 소포체 스트레스를 유도하는 답시가르긴(thapsigargin)을 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM, 10μM 농도로 serum free high glucose DMEM에 희석한 후 세포에 처리하여 24시간 및 48시간이 경과한 후 MTS 용액 (Promega)과 PMS 용액 (Promega)을 상온에서 90분간 녹인 다음, MTS:PMS의 비가 1:20의 비율로 혼합된 혼합용액을 만들고 각 웰 당 20μ씩 첨가하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후 파장 490nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM 및 10μM 농도로 답시가르긴(thapsigargin)을 각각 24시간 처리한 경우에는 대조군과 NELL2 를 과발현시킨 실험군에서 세포생존율의 차이가 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타난 반면, 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM, 10μM 농도의 답시가르긴(thapsigargin)을 48 시간 처리한 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이, NELL2 를 과발현시킨 실험군이 대조군에 비해 세포 생존율이 더 우수한 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 NELL2가 소포체 스트레스로부터 세포를 보호하여 세포 생존율을 향상시키는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었다.

<1-4> trypan blue exclusion assay

상기 실시예 <1-3>를 통해 확인한 NELL2의 소포체 스트레스로부터 세포보호 활성을 트립판 블루 익스클루전 분석을 통해 다시 한번 확인하였다. 즉, 이를 위해 먼저 상기 <1-1>을 통해 배양된 Cos7 세포 및 상기 <1-2>를 통해 선별된 NELL2 과발현 세포 각각을 6웰 플레이트(NUNC)에 2.0×10⁵개/well로 분주한 뒤 하루 정도 배양한 다음 serum free high glucose DMEM에 5μM로 희석한 답시가르긴(thapsigargin)을 처리하고 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 후 세포 생존율을 확인하였다. 세포 생존율의 확인은 trypan blue exclusion assay을 이용하여 hemacytometer로 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 확인하는 방법으로 수행하였다(Behl et al., 1995).

그 결과, 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이, NELL2를 과발현시킨 실험군의 경우, 대조군에 비해 시간이 증가될수록 살아있는 세포의 수가 더 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었으며(도 3 참조), 반대로 죽은 세포의 수는 NELL2를 과발현시킨 실험군이 대조군에 비해 더 감소된 것으로 나타났다(도 4 참조). 이를 통해 NELL2가 소포체 스트레스로부터 세포를 보호한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

NELL2 가 소포체 스트레스 마커 발현에 미치는 영향

NELL2의 소포체 스트레스로부터의 세포 보호 효과가 어떤 기작을 통해서 발생하는지를 알아보기 위해, 세포에 소포체 스트레스를 유도한 후, 세포의 소포체 스트레스 마커(CHOP, XBP1, BiP)의 단백질 발현수준을 측정하였으며, 소포체 스트레스 반응 유전자(GRP94, calnexin, BiP)들의 mRNA 발현량을 측정하였다. 단백질 발현수준 측정은 웨스턴 블럿을 통해 수행하였고, 소포체 스트레스 반응 유전자들의 mRNA 발현량 측정은 RT-PCR을 통해 이루어졌으며, 상세한 실험 방법은 다음에 기술된 바와 같다.

<2-1> 단백질 분리 ( SDS - PAGE )

상기 <1-1>을 통해 배양된 Cos7 세포 및 상기 <1-2>를 통해 선별된 NELL2 과발현 세포 각각을 6 웰 플레이트(NUNC)에 2.0×10⁵개/well로 분주하여 하루 정도 배양한 다음 serum free high glucose DMEM에 5μM로 희석한 답시가르긴(thapsigargin)을 처리하고 24시간 및 48시간 후 세포를 배양 배지와 함께 수득하였다. 수득된 세포와 배지는 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche)을 포함한 용해버퍼(M-PER mammalian cell protein extract reagent, Pierce)에 처리하고 초음파처리(sonication)한 후 15분 동안 얼음 위에서 인큐베이션시켰다. 그 후 14000rpm 으로 원심분리한 다음, 상층액을 취하여 상기 세포로부터 단백질들을 분리하였고, 분리한 단백질을 정량 후 SDS-샘플 로딩 버퍼(0.1875M Tris-HCl, pH 6.8), 6% SDS, 30% 글리세롤, 0.03% 브로모페놀 블루, 15% 베타-메르캅토에탄올을 첨가하여 5분간 끓여서 변성시킨 후, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동 하여 크기별 세포내에 존재하는 단백질들을 분리하였다.

<2-2> 소포체 스트레스 마커의 단백질 발현 측정

상기 <2-1>을 통해 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 다이플로라이드 (PVDF, Whatman) 멤브레인으로 이동시켰다. 이동이 완료된 PVDF 멤브레인을 TBS-트윈 (Tris-buffered saline/Tween 20; 0.1% Tween 20, 150 mM NaCL, 10 mM Tris-HCL)으로 세척시킨 후 non-specific 한 부위에 항체가 결합하는 것을 방지하기 위해 5% non fat dry milk (Difco)가 함유된 TBS-트윈으로 상온에서 90분 동안 블로킹하였다. 그리고 1차 항체 처리로는 CHOP(1:1000, Santa cruze biotechnology), spliced XBP1(1:1000, Biolegend), BiP(1:2000, Cell signaling technology), β-액틴 (1:4000, SIGMA)을 TBS-트윈에 희석한 다음 상기 멤브레인에 처리하였다. 1차 항체 의 처리는 CHOP, spliced XBP1, BiP은 4℃ 저온실에서 밤새도록 처리 하였고, β-액틴은 60분 동안 처리하였다. 1차 항체처리 후 TBS-트윈으로 5분간 3번, 10분간 2번 세척한 후 β-액틴에는 항-마우스 IgG HRP 항체 (1:4000. Santa Cruz Biotechnology)를 2차 항체로 60 분간 처리하고 CHOP, spliced XBP1, BiP은 항-래빗 IgG HRP 항체 (1:4000, GE Healthcare)를 60분간 처리 하였다. 그 후 TBS-트윈으로 5분간 3번, 10분간 2번의 세척을 마친 후 ECL plus western blotting detection system kit (Amersham Biosciences)으로 검출하였다. 멤브레인은 생물화상분석기 (Luminescent image analyzer, GE Healthcare)로 확인하였다.

그 결과 답시가르긴(thapsigargin)을 처리하지 않은 군, 즉 소포체 스트레스를 유발시키지 않은 군은 대조군과 NELL2를 과발현시킨 실험군 모두에서 소포체 스트레스 마커의 발현량 변화가 관찰되지 않았다(도 5 참조). 이에 반해, 답시가르긴(thapsigargin) 을 24 시간 처리한 군의 경우에는 세포사멸과 관련된 단백질인 CHOP의 발현이 NELL2를 과발현시킨 실험군에서 대조군보다 더 감소된 것으로 나타났으며, 반대로 소포체 샤페론의 한 종류인 BiP의 경우 NELL2를 과발현시킨 실험군에서 더 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 또한 XBP1의 경우에도 splicing form 이 NELL2를 과발현시킨 실험군에서 더 증가되는 양상을 보였으며(도 6 참조), 이러한 결과는 답시가르긴(thapsigargin)을 48 시간 처리한 군에서도 동일한 결과로 나타났다(도 7 참조).

<2-3> 소포체 스트레스 반응 유전자들의 mRNA 발현 측정

상기 <1-1>을 통해 배양된 Cos7 세포 및 상기 <1-2>를 통해 선별된 NELL2 과발현 세포 각각을 6웰 플레이트에 각 웰 당 2.0×10⁵개/well로 분주하여 하루 정도 배양한 다음 답시가르긴(thapsigargin)을 5μM로 24시간, 48시간 동안 처리하였다. 그 후 microfuge tube에 옮겨서 5000rpm의 속도로 3분간 원심분리하여 sup을 제거한 후 TRI-regent (Bio science) 1ml을 넣고 세포를 용해(lysis)시킨 후 클로로포름(sigma) 200μl를 처리하여 15초간 vortexing 한 후 상온에서 5분간 둔 후 14000rpm으로 20분간 원심분리하여 RNA, DNA, protein 층을 분리시켰다. RNA을 포함한 투명한 상층액을 새로운 microfuge tube에 옮기고 이소프로판올(MERCK) 500μl를 첨가하여 vortexing 한 후 4℃에서 5분간 방치한 다음 14000rpm으로 15분간 세척한 뒤 상층액을 제거한 후 DEPC treated water 10μl를 넣어 RNA을 녹였다. 추출한 RNA는 분광광도계로 농도를 측정하였다.

상기 방법으로 분리한 RNA 3μg에 올리고 dT (QIAGEN) 1μl를 넣고 DEPC가 처리된 물로 9μl를 맞춘 혼합액을 잘 섞어주었다. 그 다음 65℃ water bath에서 10분간 변성(denature)시킨 후, 바로 얼음에 넣어서 10분간 식힌 다음 5X M-MLV reaction buffer (Promega) 4μl, 100mM DTT (Promega) 2μl, 2.5mM dNTP (TaKaRa) 4μl, M-MLV Reverse Transcription (Promega) 1μl을 넣은 후 37℃ water bath에서 2시간 동안 cDNA를 합성시켰는데, 합성한 cDNA1 μl를 주형으로 하였고, 하기 [표 1]과 같이 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 10pmol/μl 농도의 포워드와 리버스 프라이머를 각각 1μl 첨가한 후, 2x EF PCR Pre-mix (SOLGENT)를 사용하여 전체 양을 10μl로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 4분 동안 pre-denaturation, 94℃ 에서 30 초 동안 denaturation, 각 프라이머의 적정 온도에 따라 30초 동안 annealing, 72℃ 에서 30초 동안 elongation 하는 조건으로 27~30 cycle을 수행하고 마지막으로 72℃ 에서 5 분 동안 post-elongation 하였다.

프라이머 서열

유전자	프라이머 서열(5'→3')		Accession number	생성물 사이즈(bp)	서열번호
GAPDH	포워드	CACTGCCACCCAGAAGACTG	AY 624139	429	3
	리버스	ACCCTGTTGCTGTAGCCAAAT			4
GRP94	포워드	TTCAGGCCCTTCCTGAATTT	NM 001195524	534	5
	리버스	CCTTTGCATCAGGGTCAATG			6
BiP	포워드	CTGGCAAAGACGTCAGGAAA	AB 232154	484	7
	리버스	TTGGTCATGACACCTCCCAC			8
calnexin	포워드	CCAGACGCAGAGAAACCTGA	XM 002804665	500	9
	리버스	AGGATAACCAGGAACACGGG			10

(GAPDH:Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

그 결과, 도 8에서 나타낸 바와 같이, 소포체 샤페론의 종류인 GRP94, calnexin, BiP의 mRNA 발현량이 대조군과 비교하여 NELL2를 과발현시킨 실험군에서 증가되어 있는 것으로 나타났다.

결론적으로 NELL2를 과발현시킨 실험군에서는, 소포체 스트레스 마커 중 세포사멸과 관련된 단백질인 CHOP는 발현이 감소되었고, 반면 BiP 단백질과 XBP1 splicing form은 증가되는 양상으로 나타났다. 또한 소포체 샤페론의 종류인 GRP94, calnexin, BiP의 mRNA 발현량도 증가되는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 NELL2가 소포체 스트레스에 의해 나타나는 여러 소포체 스트레스 마커들의 발현을 조절하여 세포의 생존에 영향을 주며, 세포 내의 소포체 스트레스를 완화시켜주는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

< 실시예 3>

NELL2 가 세포사멸 전구단백질 및 항-세포사멸 단백질의 발현에 미치는 영향

NELL2가 세포보호작용에서 세포사멸 전구단백질 (pro-apoptotic protein) 및 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 발현을 어떻게 조절하는지 확인하기 위해 다음과 같은 웨스턴 블랏을 수행하였다. 웨스턴 블랏은 상기 실시예 <2-2> 방법과 동일하게 수행되었으며, 1차 항체로 cleaved caspase 3 (1:1000, Cell signaling technology), cleaved caspase 7 (1:1000, Cell signaling technology), cleaved PARP (1:1000, Cell signaling technology), Bcl-xL (1:1500, Cell signaling technology), β-액틴 (1:4000, SIGMA)을 사용하였다는 점만을 제외하고 동일한 방법에 따라 수행하였다.

그 결과, 답시가르긴(thapsigargin)을 24시간 처리한 군에서는 세포사멸 전구단백질(pro-apoptotic protein)들인 카스파제 3, 카스파제 7 및 PARP의 활성화 형태가 대조군에 비해 NELL2를 과발현시킨 실험군에서 발현이 감소되는 것으로 확인되었고(도 9 참조), 이러한 결과는 답시가르긴(thapsigargin)을 48시간 처리한 군에서도 동일하게 나타났다(도 10 참조).

또한, 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 종류인 Bcl-xL은 답시가르긴(thapsigargin)을 24시간, 48시간 처리한 두 그룹 모두 대조군에 비해 NELL2를 과발현시킨 실험군의 발현량이 증가된 것을 확인하였다(도 11 참조).

이러한 결과들을 종합해보면 NELL2는 세포사멸에 관련된 단백질인 카스파제 3와 카스파제 7, PARP의 활성을 억제하고 세포생존에 관련된 단백질인 Bcl-xL의 발현을 증가시켜 소포체 스트레스로부터 세포를 보호한다는 것을 알 수 있었고, 나아가 소포체 스트레스와 관련된 각종 질환의 치료에 NELL2를 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)를 유효성분으로 포함하는, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 (Kreutzfeldt-Jakob disease), 울콧-랠리스 증후군 (Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군 (Wolfram syndrome), 염증성 장질환, 코론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 NELL2은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 NELL2는 소포체 샤페론인 GRP94, calnexin 또는 BiP 단백질의 발현 증가; 소포체 스트레스 제거기능을 갖는 XBP1 스플라이싱의 증가; 또는 항세포사멸 인자인 Bcl-xL의 발현 증가를 통해 소포체 스트레스를 감소시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 NELL2는 카스파제-3, 카스파제-7 또는 PARP의 활성을 억제시키거나, 세포사멸인자인 CHOP의 발현 감소를 통해 소포체 스트레스를 감소시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NELL2(neural tissue-enriched epidermal growth factor-like repeat domain-containing protein)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 크로이츠펠트-야콥 질환 (Kreutzfeldt-Jakob disease), 울콧-랠리스 증후군 (Wolcott-Rallison syndrome), 울프람 증후군 (Wolfram syndrome), 염증성 장질환, 코론씨 병, 궤양성 대장염, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 NELL2는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제1항 또는 제6항에 있어서,
상기 소포체 스트레스는 답시가르긴(thapsigargin)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.