KR101402371B1

KR101402371B1 - 히어리 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR101402371B1
Application number: KR1020120007235A
Authority: KR
Inventors: 이민원; 김많흔
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2014-06-11
Also published as: KR20130086448A

Abstract

본 발명은 히어리 (Corylopsis coreana .Uyeki) 잎의 추출물, 분획물 또는 이들에서 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물, 분획물 및 페놀성 화합물은 자유라디칼 억제활성, 크산틴 옥시다제 수퍼옥시드 소거 활성에서 우수한 항산화 효과를 나타냈고, NO 생성을 억제하는 활성도 나타냄으로써 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효과적이다.

Description

히어리 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물{Anti-oxidative or Anti-inflammatory Composition Comprising Extract from Leaves of Corylopsis coreana.Uyeki or Phenolic Compounds Isolated from the Same}

본 발명은 히어리 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물에 관한 것이다.

히어리는 조롱나무과(Hamamelidaceae) 식물로 범의귀목에 속하는 식물이다.¹⁾ 중국의 중서부 지방에 히어리와 비슷한 나무로 히어리 보다 꽃이 좀 더 길게 늘어지고 가지는 바로 서는 중국히어리(C. sinensis)가 있고, 일본에는 도사물나무라는 일본히어리(C. spicata)도 있다³ ⁾. 조롱나무과(Hamamelidaceae) 식물에 대한 연구로는 중국의 하마맬리스를 이용한 항산화 활성 연구⁴ ⁾, 프로안토시아니딘(proanthocyanidins)과 가수분해성 탄닌(hydrolysable tannins) 분리 및 이를 이용한 간독성 연구⁵ ^-6) 등과 관련하여 보고되었으며, 또한 지방산⁷ ⁾ 등이 분리되었다. 히어리(Corylopsis coreana.Uyeki; CL)에 대한 성분 연구는 많이 이뤄지지 않았으나 최근 HPLC를 이용하여 플라보노이드류 등이 함유되어 있다고 보고되었다⁸ ⁾. 이외 한국 히어리의 경우 연구된 바는 계통 연구 및 원예 관련 이외에는 보고된 바가 없고, 대부분이 조롱나무과(Hamamelidaceae)와 같은 과 식물에서의 분리 및 활성 연구가 이루어져 있다.

최근 산화적 스트레스 및 염증 과정은 유리산소, 즉 과산화지질 (peroxidized fat)에 의한 세포 장애설⁹ ⁾을 바탕으로 하고 있다. 자유라디칼(free radical)은 유리전자를 포함한 것으로, 어떤 물질과 전자를 공유하여 안정화 되려 하기 때문에 생체내에 수많은 활성산소종(reactive oxygen species)을 생성하게 되며¹⁰ ⁾, 이러한 활성산소종은 반응성이 큰 ¹O₂ 및 OH를 .비롯하여 O₂ ^-,H₂O₂, ROO, RO, ROOH 및 HOCl 등을 포함하며, 이들은 DNA 분절과 단백질의 불활성화 및 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으켜 생체기능을 저하시킴으로서, 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질의 산화, DNA산화 등을 통하여 인체에 다양한 문제를 가속화 시킨다¹ ¹ ^-12). 이러한 문제를 완화하기 위한 활성산소 조절인자로는 수퍼옥시드 디스무타제(superoxide dismutase), 카탈라제(catalase), 글루타티온 환원효소(glutathion reductase) 등의 효소계열의 항산화제와, 페놀성 화합물, 플라본 유도체, 아스코르브산, 카로테노이드, 글루타티온 등의 천연 항산화제와, BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluen), PG(propyl gallate) 등의 합성화제가 있다. 그러나 의약품 등에 사용되는 합성 항산화제제는 변이원성 및 독성이 지적되어, 안전한 대체 항산화제의 개발이 요구 되면서 천연물로부터 항산화제 물질 발굴하려는 노력이 진행되고 있다¹ ³ ^-15).

NO(nitric oxide)는 여러 조직과 세포들에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 합성되며, 면역기능 조절, 혈관확장, 신경전달, 혈액응고 등과 같은 역할을 한다고 알려져 있다. NOS는 크게 cNOS와 iNOS로 나눌 수 있으며, 즉 신경 NOS 및 내피 NOS는 cNOS에 속하며 이는 Ca² ⁺-칼모둘신(calmodulcin) 의존성이며, 평상시에도 지속적으로 NO를 분비하고 있어 항상성을 조절한다. 반면, iNOS(inducible NOS)는 IFN-γ, 인터루킨-1, TNF(tumor necrosis factor)-등의 사이토카인이나 박테리아의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)에 의해서 활성화되며 연개 반응을 통해 장시간 동안 대량의 NO를 생성하게 된다¹⁷ ⁾. 이 NO는 대식세포(macrophage)의 세포독성활성에 큰 영향을 미치므로 미생물이나 종양세포로부터 숙주를 방어하는 중요한 역할을 하고 있다. 하지만, 과도하게 생성된 NO에 의해서 염증형태의 질환에서 염증을 악화시키므로 유해한 작용을 나타내기도 한다. 자극된 iNOS는 대식세포와 간세포에 존재하게 되며, 염증이 다른 병원균들과 관여하는 동안 NO 생성은 현저하게 증가하고, 세포독성을 나타나게 되며, 더욱이 정상적인 NO의 자유라디칼과 과산화질소를 생성하기 위한 산소와의 커다란 반응으로 산화력의 상실을 야기할 수 있는 강력한 친 산화성 분자인 NO를 생산하게 된다¹⁸ ⁾. 그러므로 염증성 자극의 반응에서 NO 생성의 저해는 염증성 질병에서 치료적 방법으로 사용 될 수 있다¹⁹ ^-20).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 동시에 항산화능도 우수한 천연물질을 발굴하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 히어리(Corylopsis coreana.Uyeki) 잎의 추출물에서 분리한 페놀성 화합물이 자유라디칼 억제능이 우수하며, 크산틴 옥시다아제 수퍼옥시드 소거 활성에서도 우수한 항산화를 나타냈고, NO 생성 활성도 억제함으로써 항염증 활성도 갖는다 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 히어리 잎의 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 히어리 잎의 추출물로부터 분리한 페놀성 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 히어리 (Corylopsis coreana .Uyeki) 잎 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물성 페놀계 화합물로서 3-카페오일 퀸산 메틸에스테르(3-Caffeoyl quinic acid Methyl ester), 4-카페오일 퀸산(4-caffeoylquinic acid), 3-카페오일 퀸산(3-caffeoylquinic acid), 3-O-갈로일-β-D-글루코피라노시드(3-O-galloyl-β-D-glucopyranoside), 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II), 다티스세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(datiscetin 3-O-β-D-rhamnpyranoside) 또는 미리세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(myricetin 3-O-β-D-rhamnopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물성 페놀계 화합물로서 3-O-갈로일-β-D-글루코피라노시드(3-O-galloyl-β-D-glucopyranoside), 노르베르게닌(nor-bergenin), 11-갈로일베르게닌(11-galloylbergenin), 텔리마그란딘 I(Tellimagrandin I), 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II), 다티스세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(datiscetin 3-O-β-D-rhamnpyranoside) 또는 미리세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(myricetin 3-O-β-D-rhamnopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 히어리 잎 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 히어리 잎에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 히어리 잎 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 히어리 잎 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 히어리 잎 추출물을 히어리 잎에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 히어리 잎에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘분획물’은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획한 분획물도 포함한다. 즉, 히어리 잎 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 히어리 잎 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 히어리 잎 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 히어리 잎 추출물, 분휙물 또는 이로부터 분리한 페놀성 화합물은 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘염증’ 또는 ‘염증반응’은 어떤 장애성 자극에 대한 생체조직의 방어반응을 의미한다. 형태학적으로는 국소조직의 퇴행성 변화, 순환장애와 삼출(渗出), 조직증식의 세 가지를 병발하는 병변이다.

본 발명의 활성성분은 하기 구체적인 실시예에서 입증되는 바와 같이 NO (Nitric Oxide)의 생성을 저해하는 활성을 갖는다. NO는 생체내에서 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 합성되며, 면역기능 조절, 혈관확장, 신경전달, 혈액응고와 같은 역할을 하나, 염증발생 부위에서는 과도하게 생성된 NO에 의해 서 염증질환이 악화된다.

본 발명의 조성물에 의해 예방, 개선 또는 치료될 수 있는 염증 질환의 예로는 자가 면역 질환, 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 페쇄성 페질환, 알러지, 페혈병성 쇼크증, 페섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증, 암, 심장 질환, 뇌졸중, 알츠하이머 질환 또는 조직이식 거부 반응을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 페섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘항산화’또는 ‘항산화 물질’은 생체 내에서 영양분을 분해하는 과정에서 생성된 활성산소를 소거하는 역할을 하는 작용 및 이러한 작용을 하는 물질을 의미한다. 활성산소들은 화학적인 반응성이 뛰어나며 이들에 의해서 유도되는 자유 라디칼(free radical) 반응은 생체내의 각종 반응에 영향을 미치고 노화나 암을 일으키는 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 생물체는 자유 라디칼(free radical)들에 의해 일어나는 유해성에 항상 노출되어 있으며, 세포의 연령증가에 따라 이들의 유해성이 점진적으로 축적되어 여러 질병들을 일으킨다.

본 발명의 활성성분은 하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 자유라디칼 소거능이 우수한 항산화 활성을 갖는다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 (ⅰ) 히어리 잎 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물의 약제학적 유효량; 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 히어리 잎 추출물, 분획물 또는 페놀성 화합물이 염증질환의 치료 또는 예방의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있으며, 이 경우 (ⅰ) 히어리 잎 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물의 식품학적 유효량; 및 (ⅱ) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품 조성물이다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 히어리 잎 추출물 또는 분획물 또는 페놀성 화합물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 히어리 잎 추출물 또는 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물로 제공될 수 있으며, 이 경우 히어리 잎 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 히어리 잎 추출물, 분획물 또는 페놀성 화합물 이외에, 그 작용(히어리 잎 추출물 또는 분획물에 의한 항염 또는 항산화 작용)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어 오던 항염제 또는 항산화제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가 알코올류(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급 지방산류(팔미틸산 또는 리놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유, 마카데미아땅콩유, 아보가드유, 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 필요에 따라 계면활성제, 살균제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.

계면활성제는 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌, 올레일에테르, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌, 글리세릴모노스테아레이트, 모노스테아린산소르비탄, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 소르비탄, 자당지방산에스테르, 모노라우린산헥사글리세린, 폴리옥시에틸렌 환원라놀린, POE, 글리세릴피로글루타민산, 이소스테아린산, 디에스테르, N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.

살균제는 히녹티올, 트리크로산, 크롤헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아즐렌 (azulene), 살리실산 및 징크피리타온으로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.

산화방지제는 부틸히드록시아니솔, 몰식자산, 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.

자외선 흡수제는 디히드록시벤조페논 등의 벤조페논류, 멜라닌, 파라아미노벤조산에틸, 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸헥실에스테르, 시녹사이트, 파라메톡시계피산 2-에틸헥실에스테르, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐) 벤조트리아졸, 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.

소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인을 사용할 수 있고, 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘톨을 사용할 수 있다.

상기 조성물의 제형은 히어리 잎 추출물 또는 분획물을 유효 성분으로서 배합할 수 있는 임의의 제형으로서 항염 또는 항산화 화장품의 형태로는 에센스, 토닉, 크림, 로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤 등과 같이 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 히어리 잎의 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 페놀성 화합물의 항염증 및 항산화 용도를 제시한다.

(ⅱ) 본 발명의 유효성분인 히어리 잎의 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물은 자유라디칼 억제능이 우수하며, 크산틴 옥시다아제 수퍼옥시드 소거 활성에서도 우수한 항산화를 나타내었고, NO 생성 억제능도 우수하여 항염증 활성도 갖는다.

(ⅲ) 본 발명 조성물에서 유효성분인 히어리 잎의 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리된 페놀성 화합물은 천연물 유래이기 때문에 인체 적용시 안전성이 우수하다.

도 1은 히어리 잎의 사진이다.
도 2는 히어리 잎에서 추출된 추출물과 분리된 화합물들을 보여주고 있다.
도 3은 히어리 잎에서 추출된 추출물과 분획물들의 TLC 모니터링 결과를 보여주고 있다.
도 4는 요산 생성 과정을 보여주고 있다.
도 5는 히어리 잎에서 추출된 추출물 및 분획물 1-5를 처리했을 시 RAW 264.7 세포주의 생존정도를 보여주는 그래프이다. 상기 세포의 생존은 MTT 분석법에 의하여 측정하였으며 결과는 대조군 흡광도의 백분율(％)로써 나타내었다.
도 5는 히어리 잎에서 추출된 화합물 1-15를 처리했을 시 RAW 264.7 세포주의 생존정도를 보여주는 그래프이다. 상기 세포의 생존은 MTT 분석법에 의하여 측정하였으며 결과는 대조군 흡광도의 백분율(％)로써 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

추출 및 성분 분리

실험재료

본 발명에 사용한 히어리 잎(Corylopsis coreana.Uyeki)은 2010년 09월 7 kg을 수원 국립산림과학원에서 분양 받아 사용하였다.

시약 및 기구

편광계(Polarimeter, Jasco DIP-370, Japan), ¹H-NMR 스펙트로미터(Varian GEMINI 2000, 300 MHz, USA / Bruker AMX-500, 500MHz, Germany), ¹³C-NMR 스펙트로미터(Bruker AMX-500, 125MHz, Germany), FAB MS 스펙트로미터(VG70-VSEQ, England FAB 소스: ionized by 35 keV Cs⁺ ion beam, 매트릭스 : 글리세롤), TLC(Absorbent: Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany), 셀룰로즈(Sigma, USA), Solvent(v/v): 클로로포름: 메탄올 : H₂O = 70 : 30 : 4 / 벤젠 : 에틸포르메이트 : 포름산 = 1 : 7 : 1 / Detection : 에탄올-FeCl₃ 용액, 10％ H₂SO₄, UV-램프(254 nm)), 크로마토그래픽 젤(세파덱스 LH 20 (75-230μm 메쉬, Pharmacia) / MCI-겔 CHP-20P (75-150μm, Mitsubishi) / YMC-겔 ODS-A (230/70, 400/230, 500/400 메쉬, YMC Co.)), MPLC (Middle pressure liquid column chromatograph, 샘플 인젝터: Waters 650E (Waters, Milford Massachusettsv, USA) / 펌프: TBP5002 (Tauto Biotech, Sanghai, China)/디텍터: Gilson 112 UV/VIS (280 nm)/겔 : Daisogel (SP-120-40/60-ODS-B, Daiso Co., LTD. Japan) / 데이터 시스템: Autochro-Win 3.0 plus (Young-lin Co., Korea))을 이용하였다.

추출 및 물질의 단리

히어리 잎(CL) 7 kg을 80％ 식용 메탄올로 실온에서 3회 추출하였다. 추출액은 여과한 후 감압 농축하여 추출물(1,362 g)을 얻었다. 농축한 추출물 중 일부(325 g)는 여과하여 필터층(270 g)와 비필터층(34 g)을 얻었다. 필터층(270 g)을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(0→100% 메탄올, 그레디언트 시스템)를 실시하여 5 개의 분획(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5)으로 나누었다. 그 중 우수한 항산화 활성을 나타낸 순으로 Fr5, Fr4, Fr3, Fr2을 Daisogel ODS-B MPLC 시스템(0→100％ 메탄올 그레디언트 시스템)을 실시하였다. 그 결과 Fr 5에서 화합물 10(11 g)을 얻었고, Fr 4에서 화합물 7 (810 mg), 화합물 8 (4.2 g), 화합물 11 (1.1 g), 화합물 12 (10.3 g), 화합물 14 (1.8 g) 및 화합물 15 (475 mg)을 얻었으며, Fr 3에서 화합물 1 (370 mg) 및 화합물 3 (692 mg)을 얻었고, Fr 2에서 화합물 2 (481 mg), 화합물 4 (300 mg), 화합물 5 (15.5 g) 및 화합물 6 (87.5 mg)을 얻었다(도 2).

TLC 테스트

히어리 잎의 구성 성분을 추정하기 위하여 TLC를 통한 분석을 실시하였다. 먼저 히어리 잎을 80％ 식용 메탄올로 추출하여 히어리 잎의 추출물을 얻고, 농축한 추출물은 여과하여 필터층과 비필터층을 얻었다. 필터층을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(0→100% 메탄올, 그레디언트 시스템)를 실시하여 5 개의 분획(Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5)으로 나누고 TLC 테스트를 실시하였다. 전개용매는 클로로포름:메탄올:H₂O의 비율이 70:30:4인 용매 및 벤젠:에틸포르메이트:포름산의 비율이 1:7:1인 용매를 사용하였으며, 전개시킨 뒤에는 염화철분무, 아니스-알데히드(Anis-Aldehyde) 및 10％ 황산을 분무한 후 열판에 가열하는 방법을 이용하여 발색시켰다. TLC 결과 각 분획이 효율적으로 나누어졌음을 알 수 있었다(도 3).

생리활성 실험

시약 및 기기

Raw 264.7 세포(한국 세포주 은행, Korea), DMSO(Sigma Chem. Co. USA), FBS(Gibco BRL, USA), MTT(Sigma Chem. Co. USA), 페니실린-스트렙토미신: Gibco BRL (USA), DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium, Mediatech. Inc. USA), 항생제(Gibco BRL, USA), L-NMMA(N^G-monomrthyl-L-arginine, Sigma Chem. Co. USA), 리포폴리사카라이드(E.coil 055:B5, Sigma Chem. Co. USA), 뮤린 재조합 INF-γ(Sigma Chem. Co. USA), Griess reagent(Sigma Chem. Co. USA), 소디움 디에틸디티오카르바메이트 하이드레이트(Sigma Chem. Co. USA), 원심분리기(Eppendorff, German), CO₂ 인큐베이터(Vision Sci. Co. Korea), 현미경(Olympus, Japan), ELISA 리더(TECAN, Sazburg, Austria), 워터 배스(Vision Sci. Co. Korea), 멀티채널-파이펫(Gilson, France).

DPPH를 이용한 자유 라디칼 소거능 측정

Hatano의 방법¹⁶ ⁾에 의하여 히어리(CL) 추출물과 히어리(CL) 추출물의 분획물 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4 및 Fr5 시료를 최종 농도 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/ml의 5 가지 농도로 조제하였으며, CL 추출물의 분획물 중 Fr5, Fr4, Fr3a 및 Fr2 에서 얻은 화합물 1-15 시료는 최종 농도 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎛/ml의 7 가지 농도로 조제하였다. 각 시료 10 ㎕에 0.1 mM DPPH 용액 (99.5% 에탄올) 180 ㎕을 가한 후 혼합기로 10 초간 진탕하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 ELISA 리더(TECAN, Sazburg, Austria)를 이용하여 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조 약물로 L-아스코르브산을 상기 방법의 7 가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH에 대한 EDA％(Electron donating ability, 전자공여능)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였고, 각 시료의 항산화능을 비교 검토하기 위해서 EDA가 50％에 이르도록 하는데 필요한 시료의 양인 IC₅₀을 측정하였다.

NBT를 이용한 항산화능 측정

NBT(nitroblue tetrazolium) 환원방법에 의해 측정하였다. 인체 내에서 요산(uric acid)의 생성에 관여하는 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase)는 하이포크산틴(hypoxanthine)과 크산틴(xanthine)을 기질로 하여 요산을 생성한다. 하지만 이 과정에서 수퍼옥시드(superoxide)가 생성되며, 이는 인체내에서 산화적 손상을 입힌다. 이러한 생체내 과정을 생체 밖 시험관내에서 재현하여 이들 과정에서 시험물질이 수퍼옥시드를 얼마나 소거하는지 확인함으로서 항산화 효과를 가늠해 볼 수 있다(도 4). 먼저 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(PPB), pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.6 mM 하이포크산틴, 0.2 mM NBT가 되도록 반응혼합물을 제조하였다. 이들을 튜브에 400 ㎕씩 소분하고 시료를 적당한 농도로 설정하여 저장 용액(stock solution)을 만들고 이들을 5 ㎕ 첨가하였다. 여기에 크산틴 옥시다아제를 100 mU/ml가 되도록 희석하고 이들을 100 ㎕ 첨가하여, 최종 크산틴 옥시다아제 농도가 20 mU/ml이 되도록 만들었다. 37℃에서 20분 인큐베이션한 후에 612 nm에서 흡광도를 측정하였다. 크산틴 옥시다아제의 저해제로 알려진 알로퓨리놀(allopurinol)을 이용하여, 하이포크산틴/크산틴 옥시다아제 시스템이 활성화되었는지 확인하였다. 이들 활성의 평가는 대조군을 기준으로 상대적인 수퍼옥시드 소거 활성으로 측정하였다.

마우스 대식세포 RAW 264.7 세포 배양

마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주 은행에서 동결 상태로 구입하였다. 세포가 들어 있는 앰플을 미온수(30 - 40℃)에 바로 녹여 10％ FBS(fetal bovine serum), 페니실린 G (100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 동결 과정에서 들어간 DMSO를 제거하였다. 상기 RAW 264.7 세포에 DMEM 배지 5 ml를 첨가하여, 온도 37℃, 5％ CO₂를 유지하는 인큐베이터에서 배양하였으며, 1-2일마다 세포의 성장 정도에 따라 계대 배양하였다.

MTT 분석

본 발명에서 RAW 264.7 세포에 대한 분획물, 추출물 및 화합물 1-2의 세포 독성 여부 및 실험 시의 처리 농도를 결정하기 위해 MTT 분석을 실행하였다. MTT 분석법은 Mosmann의 방법²¹⁾을 변형하여 실시한 것으로 살아있는 세포의 미토콘드리아 디하이드로제나제에 의해서 노란색의 수용성 기질인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)가 진청색의 비수용성인 포르마잔(formazan)으로 환원되는 것을 이용한 방법이다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지로 1 X 10⁴/ml 농도가 되도록 희석하여 96웰에 180 ㎕씩 넣고 2시간 동안 배양하여 세포들이 부착되도록 하였다. 부착된 세포 배양액에 각각의 시료를 20 ㎕씩 넣은 후 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후, 보라색으로 생성된 포르마잔의 양을 정량하여 세포의 생존율을 측정하였다.

LPS와 INF-γ에 의해 유도된 NO(Nitirc oxide) 생성 억제 작용 측정

리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide) 및 INF-γ를 이용하여 RAW 264.7 세포의 NOS(nitric oxide synthase)를 발현시키고 생성된 NO의 양을 Griess의 방법²²⁾으로 측정하는 것이다. Griess 시약(1％ 설파닐아민, 0.1％ N-(1-나프틸)-에틸렌 디아민 디히드로클로라이드, 2.5％ H₃PO₄)는 NO를 산화시켜 NO₂로 변화시키며, 생성된 NO₂는 540 nm에서 흡광도를 측정하여 그 농도를 NaNO₂의 검량선을 이용하여 구한다. 즉, RAW 264.7 세포를 5 X 10⁴/ml 농도로 배양한 후, 1 X 10⁴/ml 농도로 희석하여 96 웰에 160 ㎕씩 넣고 2 시간 동안 배양하여 세포들이 부착되도록 한다. LPS(1 ㎍/㎖) 10 ㎕, INF-γ(1 ㎍/㎖) 10 ㎕ 및 양성 대조군인 L-NMMA(NO 생성 억제 시약)을 포함한 각각의 시료를 20 ㎕씩 첨가하고 20 시간 배양 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 정량하였다.

실험결과

화합물 1-15 구조 확인

화합물 1-15

히어리잎(CL)을 80％ 메탄올로 추출하여 5개의 분획물(Fr)로 분획하였으며, 이 분획물을 통해 3개의 카페일 유도체(caffeoyl dervatives), 4개의 갈로탄닌(gallotannins), 3개의 엘라기탄닌(ellagitannins)과 5개의 플라보노이드(flavonoids)를 획득하였다. TLC로써 FeCL₃,10％ H₂SO₄를 이용하여 일차적으로 분리 확인하였다. 그 후 LC MS, ¹H-NMRa 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 통해 구조를 동정하여 기존 문헌을 토대로 화합물 1-15의 구조를 확인하였다. 화합물 1-15는 3-카페오일 퀸산 메틸 에스테르(3-caffeoylquinic acid methyl ester)(1)²³⁾, 4-카페오일퀸산(4-caffeoylquinic acid)(2)²⁴ ⁾, 3-카페오일퀸산(3-caffeoylquinic acid)(3)²³⁾, 3-O-갈로일-β-D-글루코피라노시드(3-O-galloyl-β-D-glucopyranoside) (4)²⁵⁾, 베르게닌(bergenin)(5)²⁶⁾, 노르베르게닌(nor-bergenin) (6)²⁷⁾, 11-갈로일베르게닌(11-galloylbergenin)(7)²⁸⁾, 텔리마그란딘 I(Tellimagrandin I)(8)²⁹⁾, 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II)(9)²⁹⁾, 카수아리닌(casuarinin)(10)³⁰⁾, 쿼르세틴(quercetin)(11)³¹⁾, 쿼르시트린(quercitrin)(12)³²⁾, 쿼르시트린 3-O-β-D-글루쿠로니드(quercetin 3-O-β-D-glucuronide)(13)³³⁾, 다티스세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(datiscetin 3-O-β-D-rhamnpyranoside)(14)³⁴⁾ 및 미리세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(myricetin 3-O-β-D-rhamnopyranoside)(15)³⁵⁾로 확인하였다. 히어리 잎에서는 처음 이 물질들이 분리 정제되었다.

화합물 1

[3-Caffeoyl quinic acid Methyl ester](암갈색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 2.17 (2H, m, H-6), 2.22 (2H, m, H-2), 3.75 (3H, s), 3.77 (1H, m, H-4), 4.19 (1H, m, H-5), 5.33 (1H, m, H-3), 6.29 (1H, d, J=16.2 Hz, H-8), 6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5), 7.06 (1H, dd, J=0.6, 8.4 Hz, H-6), 7.18 (1H, d, J=0.6 Hz, H-2), 7.57 (1H, d, J=16.2 Hz, H-7)

화합물 2

[4-Caffeoyl quinic acid](암갈색 비결정 분말)

FAB-MS m/z: 353 [M-H]^-

¹H-NMR (300 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 1.90 (2H, m, H-2), 2.06 (2H, m, H-6), 3.73 (1H, m, H-5), 4.13 (1H, m, H-3), 5.18 (1H, m, H-4), 6.26 (1H, d, J=16.8 Hz, H-8), 6.76 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5), 7.00 (1H, dd, J=1.8, 7.8 Hz, H-6), 7.04 (1H, s, H-2), 7.48 (1H, d, J=16.8 Hz, H-7)

화합물 3

[3-Caffeoyl quinic acid](암갈색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 2.20 (2H, m, H-6), 2.24 (2H, m, H-2), 3.77 (1H, m, H-4), 4.22 (1H, m, H-5), 5.37 (1H, m, H-3), 6.29 (1H, d, J=15.6 Hz, H-8), 6.87 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 7.13 (1H, dd, J=1.8, 8.1 Hz, H-6), 7.15 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2), 7.57 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7)

화합물 4

[3-O-galloyl-β-D-glucopyranoside](황색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 3.20 (1H, m, H-3’), 3.33 (1H, m, H-4’), 3.54 (2H, m, H-6’, 5’), 3.76 (1H, m, H-6’), 3.81 (1H, m, H-2’), 5.57 (1H, d, J=7.8Hz, anomeric H-1’), 7.07 (2H, s, H-2, 6)

¹³C-NMR (125 MHz, 메탄올-d4 +D₂O) : δ 60.8 (C-6’), 69.8 (C-4’), 73.2 (C-2’), 76.8 (C-3’), 78.5 (C-5’), 94.9 (C-1’), 109.3 (C-2. 6), 119.3 (C-1), 139.0 (C-4), 145.8 (C-3,5), 165.0 (C-7)

화합물 5

[bergenin](흰색 비결정 분말)

FAB-MS m/z: 327 [M-H]^-

¹H-NMR (600 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 3.47 (1H, m, H-3’), 3.73 (2H, m, H-11), 3.84 (1H, m, H-2’), 3.89 (3H, s, CH₃), 4.04 (1H, t, J=9.6 Hz, H-4β’), 4.09 (1H, t, J=9.6 Hz, H-4α’), 4.96 (1H, d, J=10.2 Hz, anomeric H-1’), 7.07 (1H, s, H-7)

¹³C-NMR (125 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 59.4 (C-12), 61.2 (C-11), 70.4 (C-3’), 72.8 (C-10β), 74.2 (C-4’β), 80.0 (C-4’α), 81.7 (C-2’), 109.7 (C-7), 115.9 (C-10α), 118.0 (C-6α), 140.8 (C-9), 148.0 (C-10), 150.8 (C-8), 164.3 (C-6)

화합물 6

[norbergenin](흰색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 3.47 (1H, m, H-3’), 3.73 (2H, m, H-11), 3.84 (1H, m, H-2’), 4.04 (1H, t, J=9.6 Hz, H-4β’), 4.09 (1H, d, J=9.6 Hz, H-4α’), 5.26 (1H, d, J=10.2 Hz, anomeric H-1’), 7.08 (1H, s, H-7)

화합물 7

[11-galloylbergenin] (흰색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, 메탄올-d ₄ +D₂O) : δ 3.02 (1H, m, H-3’), 3.26 (1H, m, H-4’), 3.36 (2H, m, H-5’, 6’), 3.59 (1H, m, H-6), 3.80 (1H, m, H-2’), 5.57 (1H, d, J=7.8 Hz, anomeric H-1’), 7.07 (2H, s, H-2, 6)

¹³C-NMR (125 MHz, 메탄올-d ₄ ) : δ 60.8 (C-6’), 69.8 (C-4’), 73.2 (C-2’), 76.8 (C-3’), 78.5 (C-5’), 94.9 (C-1’), 109.3 (C-2, 6), 119.3 (C-1), 139.0 (C-4), 145.7 (C-3, 5), 165.0 (C-7)

화합물 8

[Telemagradin I]담황색 비결정 분말

FAB-MS m/z: 787 [M+H]⁺

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O):δ 3.76(1H, t, J=13.2Hz, H-6β’’), 3.82 (1H, t, J=13.2 Hz, H-6α”), 4.32 (1H, dd, J=6.6, 9.6 H-4 α”), 4.53 (1H, dd, J=6.6, 9.6, H-4β”), 4.83 (1H, m, H-5α”), 4.88 (1H, m, H-5β”), 4.92 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1β’’), 4.98 (1H, dddd, J=1.2, 10.2 Hz, H-2α’’), 5.01 (1H, dddd, J=1.2, 10.2 Hz, H-2β’’), 5.09 (1H, t, J=6.6 Hz, H-6β’’), 5.12 (1H, t, J=6.6 Hz, H-6α”), 5.35 (1H, d, J=3.6 Hz, H-1α’’), 5.52 (1H, t, J=10.2, 9.6 Hz, H-3 β”), 5.67 (1H, t, J=10.2, 9.6 Hz, H-3”α), 6.50 (2H, s, HHDP-3’), 6.67 (2H, s, HHDP-3’), 6.96 (2H, s, G-2, 6), 7.01 (2H, s, G-2, 6), 7.07 (2H, s, G-2, 6), 7.08 (2H, s, G-2, 6)

¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 63.0 (C-6α”, 6β”), 66.3 (C-5α”), 70.4 (C-4α”, 4β”), 70.6 (C-3α”, 2α”), 70.6 (C-5β”), 72.0 (C-3β”), 73.9 (C-2β”), 90.1 (C-1α”), 95.5 (C-1β”), 105.9 (HHDP-3), 106.0 (HHDP-3’), 109.1 (HHDP-1, 1’), 109.3 (G-1, 1’), 115.6 (G-2), 118.8 (G-2’), 124.3 (HHDP-5, 5’), 124.9 (HHDP-2, 2’), 135.6 (G-4’), 138.9 (G-4), 144.6 (HHDP-4, 4’), 144.8 (HHDP-6, 6’), 145.4 (G-3), 145.7 (G-3’), 165.5 (-COO ), 165.8 (-COO), 167.3 (-COO), 168.0 (-COO)

화합물 9

[Telemagradin II](담황색 비결정 분말)

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 3.92 (1H, d, J=6.6Hz, H-6β’’), 4.58 (1H, d, J=1.2, 6.6 Hz, H-4’’), 5.26 (1H, t, J=8.4, 9.6 Hz, H-5”), 5.38 (1H, dd, J=6.6 Hz, H-6”α), 5.64 (1H, dd, J=1.2, 8.4 Hz, H-2”), 5.87 (1H, t, J=8.4, 9.6 Hz, H-3”), 6.22 (1H, d, J=8.4 Hz, H-1’’), 6.68 (2H, s, HHDP-3’), 7.00 (2H, s, G-1, 6), 7.03 (2H, s, G-1, 6), 7.13 (2H, s, G-2, 6)

¹³C-NMR (125 MHz, Aceton-d ₆ +D₂O) : δ 62.2 (C-6”), 69.8 (C-4”), 71.0 (C-2”), 72.2 (C-5”), 72.4 (C-3”), 92.8 (C-1”), 107.0 (HHDP-3), 107.2 (HHDP-3’), 109.2 (HHDP-1, 1’), 109.3 (G-1’, 1”,1”’), 114.8 (G-2”’), 118.8 (G-2’, 2”), 124.8 (HHDP-2, 2’), 125.0 (HHDP-5, 5’), 135.6 (G-4”, 4”’), 138.9 (G-4’), 144.6 (HHDP-4, 4’), 144.9 (HHDP-6, 6’), 145.1 (G-3”, 3”’), 145.3 (G-3’), 164.2 (-COO), 165.0 (-COO), 165.6 (-COO), 166.9 (-COO), 167.3 (-COO)

화합물 10

[casuarinin] (담황색 비결정 분말)

EI-MS m/z: 937 [M+H]⁺

¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 3.72 (1H, t, J=13.2 Hz, H-6β’’), 3.79 (1H, t, J=13.2 Hz, H-6α”), 4.43 (1H, dd, J=6.6, 9.6 H-4 α”), 4.46 (1H, dd, J=6.6, 9.6, H-4β”), 4.83 (1H, m, H-5α”), 4.88 (1H, m, H-5β”), 4.79 (1H, m, H-2α”) 4.82 (1H, m, H-2β’’), 4.83 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1β’’), 4.96 (1H, m, H-6β”), 4.98 (1H, m, H-6α”), 5.32 (1H, d, J=3.6 Hz, H-1α’’), 5.47 (1H, t, J=10.2, 9.6 Hz, H-3 β”), 5.66 (1H, t, J=10.2, 9.6 Hz, H-3”α), 5.90 (2H, s, G-2, 6), 6.26 (2H, s, HHDP-3), 6.81 (2H, s, HHDP-3), 6.86 (2H, s, HHDP-3), 6.92 (2H, s, HHDP-3)

¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 63.0 (C-6α”, 6β”), 66.2 (C-5α”), 70.3 (C-4α”, 4β”), 70.4 (C-3α”, 2α”), 70.8 (C-5β”), 72.0 (C-3β”), 72.5 (C-2β”), 90.2 (C-1α”), 95.4 (C-1β”), 103.2 (HHDP-3), 105.6 (HHDP-3'), 108.6 (HHDP-1), 109.1 (HHDP-1’), 109.3 (G-1, 1’), 115.5 (G-2), 118.8 (G-2’), 124.0 (HHDP-5, 5’), 124.2 (HHDP-2, 2’), 135.5 (G-4’), 139.0 (G-4), 142.8 (HHDP-4, 4’), 144.7 (HHDP-6, 6’), 145.5 (G-3), 145.7 (G-3’), 165.6 (-COO ), 165.8 (-COO), 167.3 (-COO), 168.0 (-COO)

화합물 11

[quercetin] (황색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 6.19 (1H, d, J=2.1Hz, H-6), 6.41 (1H, d, J=1.8Hz, H-8), 6.89 (1H, d, J=8.4Hz, H-5’), 7.55 (1H, dd, J=2.1, 8.4Hz, H-6’), 7.68 (1H, d, J=2.1Hz, H-2’)

화합물 12

[quercitrin](황색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 0.80 (3H, H-6”), 3.18 (3H, m, H-3”, 5”, 4”), 3.97 (1H, dd, J=4.5Hz, H-2”), 5.24 (1H, s, anomeric H-1”), 6.22 (1H ,d, J=1.8Hz, H-6), 6.41 (1H, d, J=1.8Hz, H-8), 6.88 (1H, d, J=8.4Hz, H-5’), 7.26 (1H, dd, J=2.1, 8.4Hz, H-6’), 7.29 (1H, d, J=2.1Hz, H-2’)

화합물 13

[quercetin 3-O-β-D-glucuronide](황색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 3.08 (2H, H-6”), 3.21 (1H, m, H-2”), 3.33 (2H, m ,H-4”, 3”), 3.58 (1H, m, H-5”), 5.48 (1H, d, J=7.8Hz, anomeric H-1”), 6.22 (1H, d, J=2.1Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J=2.1Hz, H-8), 6.87 (1H, d, J=8.7Hz, H-5’), 7.57 (1H, dd, J=2.1, 8.7Hz, H-6’), 7.59 (1H, d, J=2.1Hz, H-2’)

화합물 14

[datiscetin 3-O-β-D-rhamnpyranoside] (황색 비결정 분말)

FAB-MS m/z: 447 [M-H]^-

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 0.83 (3H, H-6”), 3.18 (3H, m, H-3”, 5”, 4”), 3.96 (1H, dd, J=4.5 Hz, H-2”), 5.24 (1H, s, anomeric H-1”), 6.22 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J=1.2 Hz, H-8), 6.88 (2H, d, J=7.6, 8.4 Hz, H-3’, 5’), 7.29 (1H, dd, J=7.6, 8.4 Hz, H-4’), 7.59 (1H, d, J=7.5 Hz, H-6’)

화합물 15

[myricetin 3-O-β-D-rhamnopyranoside] (황색 비결정 분말)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ +D₂O) : δ 0.81 (3H, s, H-6”), 3.16 (2H, m, H-5”, 4”), 3.32 (1H, m, H-3”), 3.97 (1H, d, J=4.5Hz, H-2”), 5.19 (1H, s, H-1”), 6.39 (2H, d, J=1.2, H-6, 8), 6.88 (2H, s, H-2’, 6’)

DPPH 를 이용한 자유라디칼 소거능 측정

DPPH법은 항산화 활성 평가시 대표적으로 측정하는 방법이다¹³ ⁾. DPPH 법은 분자 내에 안정한 라디칼을 함유하지만 항산화활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 제거되는데 이때 DPPH의 흡광도의 변화를 측정하여 항산화 효과를 확인할 수 있다. DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 프리라디칼로서 시스틴 및 글루타티온과 같은 황을 함유한 아미노산과 아스코르브산, BHA 및 BHT 등에 의해 환원되어 탈색되므로 이러한 색도의 변화를 통하여 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는 데 많이 이용되고 있다¹⁵ ⁾.

히어리(CL) 추출물과 이를 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 얻은 분획물, Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5로 자유라디칼 소거능을 측정하였을 때 CL 추출물(IC₅₀ = 12.33 ± 0.91 mg/ml)은 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 6.68 ± 0.11 mg/ml)에 미치진 못하나 자유라디칼 억제능을 나타냈으며, 컬럼 크로마토그래피로 분획한 분획물들은 Fr5 > Fr4 > Fr3 > Fr2 > Fr1 순서로 자유라디칼 억제능이 확인되었다. 특히, Fr5 (IC₅₀ = 5.89 ± 0.03 ng/ml)의 경우 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 6.68 ± 0.11 mg/ml)와 비교하였을 때 우수한 자유라디칼 억제능을 나타냈다. 또한 유사한 자유라디칼 소거능을 나타낸 Fr5, Fr4, Fr3 및 Fr2 로부터 분리된 화합물 1-15에 대하여 동일한 방법으로 DPPH를 실행하였다. 그 결과 엘라기탄닌계 물질인 화합물 8 (IC₅₀ = 3.12 ± 0.05 ㎍/ml), 화합물 9 (IC₅₀ = 2.97± 0.04 ㎍/ml) 및 화합물 10 (IC₅₀ = 3.29± 0.26 ㎍/ml)이 양성 대조군인 L-아스코르브산(IC₅₀ = 8.22 ± 0.64 ㎍/ml) 보다도 더 나은 자유라디칼 억제능이 보였으며, 그 외 나머지 화합물들의 경우도 유사한 활성을 나타냈다. 표 1에는 히어리 잎 추출물 및 이로부터 분획한 분획물들의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정한 IC₅₀ 수치를 나타내었다. 표 2에는 히어리 잎 추출물로부터 분리한 화합물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정한 IC₅₀ 수치(농도: 화합물 6.25 - 100 ug/mL, 아스코르브산(양성대조군) 6.25 - 0.7812 ug/mL)를 나타내었다.

NBT 를 이용한 항산화능 측정

CL 추출물과 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 얻은 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5를 농도별 조제하여 크산틴 옥시다아제 수퍼옥시드 소거능을 측정한 결과 Fr 5 > Fr 4 > 추출물 > Fr 3 > Fr 2 > Fr 1 순서로 농도 의존적인 활성을 나타내었다. 우수한 활성을 나타낸 분획물(Fr)에서 분리된 대부분의 화합물은 양성대조군인 알로퓨리놀(IC50= 2.39 ± 0.09 ug/mL)과 비교하여 농도 의존적으로 우수한 크산틴 옥시다제 수퍼옥시드 소거 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, DPPH 자유라디칼 소거 활성에서와 같이 엘라기탄닌계 화합물인 화합물 8 (IC₅₀= 0.29 ± 0.69 ug/mL), 9(IC₅₀= 0.09 ± 0.02 ug/mL) 및 10(IC₅₀= 0.16 ± 0.02 ug/mL)의 경우 양성대조군보다 더 우수한 활성을 나타냈다. 하기 표 3에는 분획물의 크산틴 옥시다아제 수퍼옥시드 소거 활성을 측정한 IC₅₀ 수치를 나타내었다. 표 4에는 분리한 화합물의 크산틴 옥시다제 수퍼옥시드 소거 활성을 측정한 IC₅₀ 수치를 나타내었다.

MTT 분석 결과

화합물 1-15, 추출물, 및 분획물 Fr 1-5의 RAW 264.7 세포에 대한 세포 독성을 평가하기 위한 MTT 분석 결과, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 처리 농도에서 분획물 Fr5를 제외한 모든 분획물에서 유의성 있는 세포독성이 나타나지 않았다. 또한 Fr5에서 분리된 화합물을 제외한 모든 화합물에서도 유의성 있는 세포 독성이 나타나지 않았다(도 5 및 도 6 참조). 상기 실험 결과에서 나타난 NO 생성량의 변화가 세포 독성에 의한 것임을 확인하였다.

LPS 에 의해 유도된 iNOS 에 의한 NO 생성 억제 활성 측정 결과

추출물, 분획물(Fr) 1-5, 및 화합물 1-15의 NO 생성 억제 효과를 평가한 결과, 추출물과 분획물은 12.5, 25, 50 및 100 mg/ml 농도에서, 화합물은 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도에서, 모두 농도 의존적 방식으로 NO (nitric oxide)의 생성을 억제하는 작용을 나타냈다. 또한, 분획물 수준에서 나타났던 활성이 분리된 화합물에서 동일하게 확인됨으로써 NO 생성 억제 효과가 어느 화합물에 의한 영향인지 확인할 수 있었다. 하기 표 5에는 히어리 잎 추출물과 분획물의 NO 생성 억제 활성 측정한 IC₅₀ 수치를 나타내었다. 하기 표 6에는 분리된 화합물 1-15의 NO 생성 억제 활성을 측정한 IC₅₀ 수치를 나타내었다.

결론

조롱나무과 히어리속에 속하는 식물인 히어리(Corylopsis coreana..Uyeki)의 신선한 잎을 80％ 메탄올로 추출하여, 세파덱스 LH 20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여, 총 5개의 분획으로 나누었다. 그 중 우수한 항산화 활성을 보인 분획(Fr) 2-4 에서 비화합물(non-compounds) 15종을 분리 및 정제하였다. 각종 기기분석 결과를 통해서 분리한 화합물 1-15는 3-카페오일퀸산 메틸 에스테르(3-caffeoylquinic acid methyl ester)(1), 4-카페오일퀸산(4-caffeoylquinic acid)(2), 3-카페오일퀸산(3-caffeoylquinic acid)(3), 3-O-갈로일-β-D-글루코피라노시드(3-O-galloyl-β-D-glucopyranoside)(4), 베르게닌(bergenin)(5), 노르베르게닌(nor-bergenin)(6), 11-갈로일베르게닌(11-galloylbergenin)(7), 텔리마그란딘 I(Tellimagrandin I)(8), 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II)(9), 카수아리닌(casuarinin)(10), 쿼르세틴(quercetin)(11), 쿼르시트린(quercitrin)(12), 쿼르시트린 3-O-β-D-글루쿠로니드(quercetin 3-O-β-D-glucuronide)(13), 다티스세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(datiscetin 3-O-β-D-rhamnpyranoside)(14) 및 미리세틴 3-O-β-D-람노피라노시드(myricetin 3-O-β-D-rhamnopyranoside)(15)로 구조가 확인하였다. 히어리 잎 추출물, 분획물 및 화합물 1-15의 DPPH 프리라디칼 소거 활성은 고농도에서 양성대조군인 아스코르브산 보다도 우수한 자유라디칼 억제능을 확인하였다. 크산틴 옥시다아제 수퍼옥시드 소거 활성 평가에서도 양성대조군인 알로퓨리놀과 비교시 매우 우수한 항산화력이 확인되었다. 또한, NO 생성 활성 억제 평가에서도 양성대조군인 L-NMMA와 비교 시 엘라기탄닌 계열 화합물에서 양성대조군과 유사한 NO 생성 억제 작용을 나타냈었다. 이는 MTT 분석법을 통해 독성에 의한 것임이 확인되었다. 토종 히어리속 식물에서는 처음으로 우수한 항산화 및 항염 효과를 가지는 15 종의 페놀성 화합물을 분리함으로써 국내 자생 식물의 고유 가치성을 증명하였으며, 또한 고농도에서의 항산화 활성 효과 및 독성 활성이 비타민 C 및 알로퓨리놀보다 더 우수하다는 것을 확인함으로써, 추후 히어리 잎에서 분리된 화합물, 추출물 및 분획물을 이용하여 항산화제 및 항암제로써 개발될 수 있을 것으로 판단된다.

참고문헌

1. 임동옥, 정흥락, 김종홍, 황인천, 김철환, 이현우., Kor.J. Eco., 19, 269-278, (2005)

2. 윤주복, 나무 쉽게 찾기,. 진선출판사, (2004)

3. 이창복, 대한식물도감., 향문사, (1980)

4. Hu Fenglin, Lu Ruili, Huang bao, Ming Liang, Fitoterapia., 75, 1423, (2004)

5. CLaudia hartisch and Herbert kolodziej., Phytocheraistry., 42, 191-198, (1996)

6. Andreas Dauer, Andreas Hensel, Evelyne Lhoste, Siegfried Knasm, Volker Mersch-Sundermann., Phytochemistry., 63, 199-207, (2003)

7. Beate brewer, Thomas stuhlfauth, Heinrich fuck and Herbert Huber., Phymchemictry,, 26, 1441-1445, (1987)

8. Tsukasa iwashina, Tomoko takemura and Tamaki mishio., J. Japan. Soc. Hort. Sci., 78, 485490, (2009)

9. Yun, K. A., Park, Y. J., Bae, S. J., J Korean Soc Food Sci Nutr., 33, 7-15, (2004)

10. Kim J. Y., Park, S. N., J. Soc. Cosmet. Scientists Korea., 34, 83-92, (2008)

11. Park S.N., J. Korean Ind Eng Chem., 14, 657-665, (2003)

12. Cross, E. E, Halliwell, B, Borish, E.T, Pryor, W. A, Ames, B.N, Saul, R.L. and McCord, J.M. Ann. Intren. Med., 107, 536-545, (1987)

13. Corl M. M., JAOCS, 51,321, (1974)

14. Cho, Y.J, Ju, I.S, Kwon, O. J, Chun, S. S, An, B.Jm and Kim, J.H., J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 51, 49-54, (2007)

15. Kang, M. C., Lee, J. Y., Lee, J. A., Han, J. H., Kim, B. S., Kim, G. O., Korean J. Biotechnol. Bioeng. 23, 77-82, (2008)

16. Lee S.H., Lee J.S., Kor. J. Microbiol. Biotechnol, 35, 220-225, (2007)

17. Kharitonov S., Yates D., Robbins R.A. Logan-SinCLair R., Shinebourne E.-A.and Barnes P.-J., Lancet, 343, 133-5, (1994)

18. Epe B., Ballmaier D., Roussyn I., Brivida K., Sied H., NuCLeic Acids Res., 24, 4105-4110, (1996)

19. Hobbs A., Higgs A., Moncada S., Annu. Rev. Phermacol. Toxicol., 39, 191-220, (1999)

20.Sautebin L., Fitoterapia, 71, S48-57, (2000)

21. Mosmann, T., J. Immun. Methods., 65, 55(1983)

22. Park,S.Y., Hong, S. S., Han, X. H., 깨, J. S. and Hwang, B. Y., 11, 85-88, (2005)

23. E.W.C. Chan, Y.Y. Lim, S.K. Ling, S.P. Tan, K.K. Lim, M.G.H. Khoo., LWT - Food Science and Technology., 42, 10261030, (2009)

24. Hideo iwahashi, Hideko morishitaIDEKO MoRlsHITA, NORIKO OSAKA and RYO KIDO., Phyrc&mi.rrry., 24, 630-632, (1985)

25. Zeliha S Akdemir, I Irem Tatli, ICLal Saracoglu, U.Burcin Ismailoglu, Inci Sahin-Erademli, Ihsan Calis., Phytochemistry., 56, 189-193, (2001)

26. Dong Wang, Hong-Tao Zhu, Ying-Jun Zhang and Chong-Ren Yang., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters., 15, 40734075, (2005)

27. Laurent Pouys, Tahiri Sylla, Tony Garnier, Luis B. Rojas, Jaime Charris, Denis Deffieux, StQuideau., Tetrahedron., 66, 5908e-5917, (2010)

28. Chen xin-min, Takashi voshida, Tsutomu hatano, Makoto fukushima and Takuo okudat., fhy&wmrsrry., 26, 515-517, (1987)

29. Elisabeth M, Gross t Holger Meyer and Gerhard Schilling., Phytochemistry., 41, 133-138, (1996)

30. Jeng de su, Toshihiko osawa, Shunro kawakishi and Mitsuo namiki., Phytochemzstry., 27, 1315-1319, (1988)

31. A. Lommen, M. Godejohann, D. P. Venema, P. C. H. Hollman and M. Spraul., Anal. Chem., 72, 1793-1797, (2000)

32. Philippe Op De Beck, Marie-Genevieve Dijoux, Gilbert Cartier and Anne-marie Mariotte., Phytochemistry., 47, 1171-1173, (1998)

33. Mohamed Bouktaib, Aziz Atmanib and Christian Rolando., Tetrahedron Letters., 43, 62636266, (2002)

34. Sunhee Lee, Younghee Park, Byoung-Ho Moon, Eunjung Lee, Sungwon Hong, and Yoongho Lim., Bull. Korean Chem. Soc., 29, 1597-1600, (2008)

35. Jung Im Lee, Chang-Suk Kong, Myoung Eun Jung, Joo Wan Hong, Il Noh and Youngwan Seo., Ocean and Polar Research., 33, 185-191, (2011)

Claims

텔리마그란딘 I(Tellimagrandin I) 또는 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II) 화합물을 포함하는 항산화용 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 3-카페오일 퀸산 메틸에스테르(3-Caffeoyl quinic acid Methyl ester), 4-카페오일 퀸산(4-caffeoylquinic acid), 3-카페오일 퀸산(3-caffeoylquinic acid), 3-O-갈로일--D-글루코피라노시드(3-O-galloyl--D-glucopyranoside), 노르베르게닌(nor-bergenin), 11-갈로일베르게닌(11-galloylbergenin), 다티스세틴 3-O--D-람노피라노시드(datiscetin 3-O--D-rhamnpyranoside) 및 미리세틴 3-O--D-람노피라노시드(myricetin 3-O--D-rhamnopyranoside)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 히어리 (Corylopsis coreana.Uyeki) 잎으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 자유라디칼 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
텔리마그란딘 I(Tellimagrandin I) 또는 텔리마그란딘 II(Tellimagrandin II) 화합물을 포함하는 항산화용 식품 조성물로서, 상기 조성물은 3-카페오일 퀸산 메틸에스테르(3-Caffeoyl quinic acid Methyl ester), 4-카페오일 퀸산(4-caffeoylquinic acid), 3-카페오일 퀸산(3-caffeoylquinic acid), 3-O-갈로일--D-글루코피라노시드(3-O-galloyl--D-glucopyranoside), 노르베르게닌(nor-bergenin), 11-갈로일베르게닌(11-galloylbergenin), 다티스세틴 3-O--D-람노피라노시드(datiscetin 3-O--D-rhamnpyranoside) 및 미리세틴 3-O--D-람노피라노시드(myricetin 3-O--D-rhamnopyranoside)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
삭제