KR101397855B1 - 돼지 주조직적합항원 유래 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 HLA를 통해 T 세포가 간접 인식하는 돼지 주조직적합항원 (SLA) 유래 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 핵산, 및 이들의 이용방법에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 주조직적합항원(SLA) 유래 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318}의 사람 HLA-DR4에 대한 결합을 억제하는 활성을 나타내었으므로, HLA-DR4 분자를 통하여 제시되는 항원성이 강력한 펩티드로 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은 펩티드 특이적 CD4 T 세포 반응을 유도하거나, 펩티드 특이적 조절(regulatory) T 세포의 생산을 유도하여 이종면역거부반응을 억제하는데 이용될 수 있다.

Description

돼지 주조직적합항원 유래 폴리펩티드 및 이의 용도{Swine leukocyte antigen―derived polypeptides and their use}

본 발명은 사람 HLA를 통해 T 세포가 간접 인식하는 돼지 주조직적합항원 (SLA) 유래 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 핵산, 및 이들의 이용방법에 관한 것이다.

장기이식은 말기 장기부전증의 유일하고 궁극적인 치료방법이지만, 이종장기 이식 후 거부반응의 위험이 존재한다. 이식 거부반응은 초급성 거부반응 (hyperacute rejection), 급성 혈관성 거부반응 (acute vascular rejection), 급성 세포 매개성 거부반응 (acute cellular xenograft rejection), 만성 거부반응 (chronic rejection)의 순서로 나타나는데, 초급성 면역거부반응의 문제는 2002년에 초급성 면역거부반응을 일으키는 주요 항원인 α1,3 Gal을 만드는 α 1,3-galactosyltransferase (α1,3-GalT)가 넉아웃(knock out)된 돼지(GTKO)를 생산함으로써 어느 정도 해결되어 가고 있고, 급성 혈관성 거부반응의 문제에 대해서는 보체조절단백질(CD55, CD46, CD59)의 발현조절, 혈관내피세포의 활성화 조절, 응고 병증 조절 등의 전략으로 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이나, T 세포 매개성 거부반응에 관해서는 그 발생기전조차도 제대로 밝혀져 있지 않은 상태이다. 이와 같이 지금까지는 이종장기 이식 시 일어나는 초급성 거부반응, 급성 혈관성 거부반응이 우선 해결되어야 할 시급한 문제로 대두되어 왔으나, 이제부터는 그 다음 단계인 T 세포 매개성 거부반응의 극복을 위한 연구가 적극적으로 추진될 필요가 있다.

이종장기 이식 시 T 세포가 이종항원을 인식하는 경로는 직접인식(direct recognition)과 간접인식(indirect recognition)이 있다. 직접인식은 사람의 T 세포가 돼지 주조직적합항원 (Swine leukocyte antigen, SLA)을 직접 인식해 활성화되는 것이고, 간접인식은 사람의 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)가 돼지 SLA을 탐식한 후, 세포내 처리과정을 거쳐, 자기의 주조직적합항원(HLA)을 통하여 SLA 유래 이종항원 펩티드(펩티드)를 제시하는 것을 사람의 T 세포가 인식하는 것을 말한다(도 1). 돼지의 세포 또는 장기를 사람에게 이식할 때 나타나는 사람 T 세포에 의한 이식거부반응에 있어서는 직접인식보다 간접인식이 훨씬 더 중요성을 갖는데, 그 이유는 돼지 SLA 분자가 사람 HLA 분자와 많이 다를 뿐만 아니라, 돼지의 공동자극인자(co-stimulatory molecule)와 사람 공동자극인자 간의 상호작용이 allogenic response에서 보다는 훨씬 약하기 때문이다. 따라서, 사람 HLA 항원에 의하여 제시되는 돼지 SLA 항원 유래 펩티드(즉, 간접인식 과정에 관여하는 펩티드)가 무엇인지를 규명하고, 이 펩티드 특이적 면역관용(immunotolerance)을 유도하는 기술을 개발하는 것은 사람 T 세포에 의한 이종장기이식 거부반응의 제어라는 측면에서 매우 중요한 일이다. 사람의 경우, SLA 항원과 같은 외부 항원은 항원제시세포에 의하여 탐식된 다음, HLA class I 분자(HLA-A, B, C) 및 class II 분자(DP, DQ, DR)를 통하여 T 세포에 제시된다. 그런데, HLA class I 및 class II 분자는 아주 다양 (polymorphic)하기 때문에 사람의 HLA haplotype에 따라서 HLA 분자를 통해 제시되는 SLA 유래의 펩티드는 종류가 다를 수밖에 없고, 따라서 SLA 유래의 어떤 펩티드가 T 세포 반응 유도의 주요 펩티드(immunodominant 펩티드)인지는 사람마다 다를 수밖에 없다.

세포 매개성 거부반응의 조절을 위해서는 자연 면역반응의 주요한 역할을 하는 T 세포의 면역 반응 조절이 필수적이다. 사람 T 세포 조절을 위해서는 돼지 세포 표면에 존재하며, 장기이식 거부반응의 주요 항원으로 알려진 돼지 SLA 유래 에피토프(epitope)를 확인해 어떤 것이 면역거부반응의 주 에피토프(immunodominant epitope)인지를 결정하는 것이 기본적으로 요구된다. 일단 항원성 펩티드가 확인된 다음에는 확인된 펩티드 특이적 면역조절세포(regulatory T cell, Treg) 유도 관련 연구가 뒷받침되어야 한다. 항원 특이 Treg의 유도는 급성 세포 매개성 면역거부뿐 아니라, 만성적 면역거부반응 극복의 주요 수단이 될 수 있다. 그럼에도, 사람 HLA, 특히 한국인에게서 가장 흔하게 발견되는 allele인 HLA-DRB1 (한국인의 35.0%)을 통하여 제시되는 돼지 SLA 유래 펩티드 항원의 정체는 아직 규명되지 않고 있어, HLA 결합 펩티드를 이용하여 돼지 SLA 특이적 면역관용을 유도하는 방법으로 이식된 돼지 세포 및 돼지 장기에 대한 이식거부반응을 억제할 수 있는 원천기술을 확보할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 사람의 HLA-DRB1*0401 분자를 발현하는 형질전환 마우스(transgenic mice) (HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-Eb)를 이용하여, 한국인에게서 가장 흔하게 존재하는 HLA-DR allele인 HLA-DRB1(35.0%)을 통하여 제시되는 SLA 유래 펩티드를 찾아냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국공개특허 2013-0138803

본 발명의 목적은 이종장기 이식에 따른 면역거부반응을 조절 또는 통제할 수 있는 돼지 주조직적합항원(SLA) 유래 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 이종장기 이식에 따른 면역거부반응을 조절 또는 통제할 수 있는 단백질, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 이종장기 이식에 따른 면역거부반응의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 17, 서열번호 20 및 서열번호 32, 및 (b) 상기 (a)의 서열에서 한 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 돼지 주조직적합항원(swine leukocyte antigen, SLA)에서 유래하였으며, 사람 주조직적합항원(HLA)을 통하여 T 세포에 인식될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)의 서열에서 한 개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형된 서열은 본래의 폴리펩티드 서열과 동일한 기능을 유지하는 것으로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 본래의 폴리펩티드 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 T 세포를 활성화하거나 또는 T 세포의 증식을 억제하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역 반응을 억제하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 면역 반응을 조절하거나 통제하는 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 분비를 용이하게 하는 펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 단백질을 제공한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분비를 용이하게 하는 펩티드는 신호 펩티드가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 이종장기 이식에 따른 면역거부반응의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 돼지 주조직적합항원(SLA) 유래 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318}의 사람 HLA-DR4에 대한 결합을 억제하는 활성을 나타내었으므로, HLA-DR4 분자를 통하여 제시되는 항원성이 강력한 펩티드로 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은 펩티드 특이적 CD4 T 세포 반응을 유도하거나, 펩티드 특이적 조절(regulatory) T 세포의 생산을 유도하여 이종면역거부반응을 억제하는데 이용될 수 있다.

도 1은 이종장기 이식 시 T 세포가 이종항원을 인식하는 경로를 나타낸 그림이다. A) 직접인식(direct recognition), B) 간접인식(indirect recognition).
도 2는 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_{306 -318})의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 10의 폴리펩티드가 1 μM 농도의 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_{306 -318})의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 저해하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 4는 서열번호 11의 폴리펩티드가 1 μM 농도의 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_{306 -318})의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 저해하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 5는 서열번호 17의 폴리펩티드가 1 μM 농도의 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_{306 -318})의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 저해하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 6은 서열번호 20의 폴리펩티드가 1 μM 농도의 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_{306 -318})의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 저해하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 7은 서열번호 32의 폴리펩티드가 1 μM 농도의 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드(HA_306-318)의 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)에 대한 결합을 저해하는 능력을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 돼지 주조직적합항원(SLA)에서 유래된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드는 사람 HLA를 통해 T 세포에 의해 인식될 수 있다. 본 발명자들은 이종 항원 특이적 면역관용(immunotolerance)을 유도하는 기술을 개발하던 중에, 돼지 SLA 유래 폴리펩티드들 중에서 사람 CD4 T 세포 활성화 에피토프를 확인할 수 있었다. 사람 CD4 T 세포는 사람의 항원제시세포인 HLA class II 분자를 통하여 제시되는 항원만을 인식한다. 따라서, 돼지 세포 또는 장기를 사람에게 이식할 경우, 돼지 SLA 분자는 사람의 항원제시세포에 의하여 탐식된 다음, 세포 내 처리 과정을 거쳐 사람의 HLA class II 분자를 통하여 사람 T 세포에 제시되고, 사람 CD4 T 세포는 활성화되면서 이종면역거부반응이 나타나게 된다. 본 발명자들은 돼지 SLA에서 유래된 펩티드로서 사람 HLA-DR4 분자를 통하여 제시되는 항원성이 강력한 펩티드를 컴퓨터 모델링 및 in vitro 실험을 통하여 찾아내었다(표 1). 본 발명의 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318}의 사람 HLA-DR4에 대한 결합을 억제하는 활성을 나타내었으므로, HLA-DR4 분자를 통하여 제시되는 항원성이 강력한 펩티드로 평가될 수 있다.

따라서 본 발명은 돼지 주조직적합항원 유래 펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 상기 분리(isolated)는 핵산, 단백질 또는 다른 성분이, 그것이 정상적으로 관련되어 있는 성분(다른 단백질, 핵산, 세포, 합성 시약 등)으로부터 부분적으로 또는 완전히 따로 떨어질 때를 의미한다. 상기 재조합형이라는 용어는, 핵산 또는 폴리펩티드가 인공 또는 가공적이거나, 인공 또는 가공적인 핵산 또는 단백질로부터 유도되는 경우를 지칭한다. 상기 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 상호교환적으로 사용되어 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하며, 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머에 모두 사용된다. 이 용어는, 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하여, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하는데, 여기에서 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 결합에 의하여 연결되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드에는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 17, 서열번호 20, 또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이들과 동일한 기능을 수행하는 변이체들을 포함한다. 상기 "변이체" 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드가 갖는 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드 서열과 폴리펩티드 서열 잔기의 총 수의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% 또는 그 이상으로 상이한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또다른 실시예로서, 상기 변이체 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드 서열에 대하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 변이체 폴리펩티드는, 본래의 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환, 또는 그러한 결실(들), 첨가(들) 및/또는 치환(들)의 임의의 조합에 의하여, 본래의 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드로 총체적으로 지칭되는 신규한 폴리펩티드를 제공하며, 본 발명의 폴리펩티드는 본 명세서에서 밝힌 폴리펩티드 서열의 변형체 및/또는 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 폴리펩티드는 사람 HLA에 결합하는 재조합형 또는 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 변이체 폴리펩티드를 포함하는 재조합형 융합 단백질을 포함하며, 그러한 융합 단백질의 모노머성 및 다이머성 형태를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 변이체 폴리펩티드를 포함하는 멀티머를 포함한다. 또한 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 변이체 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 포함한다. 본 발명의 일부 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다. 예를 들어, 본 발명은 변이체 폴리펩티드의 용해도를 증진시키는 상이한 폴리펩티드(예컨대, Ig Fc 폴리펩티드와 같은 면역글로불린 폴리펩티드)에 연결되는 변이체 폴리펩티드를 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함한다.

본 발명은 T 세포 의존성 면역 반응의 조절을 포함하여, 면역계의 질환, 장애 및 이상을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 단백질, 그러한 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산은, 예컨대, 자가면역질환, 장애 및 이상, 면역증식성 질환, 이식편 관련 장애, 면역 억제가 바람직한 면역계 질환, 장애 및 이상의 치료, 공여자 조직, 세포, 장기 또는 이식편에 저항하는 수용자 내에서의 면역 반응의 억제가 바람직한 수용자에게 공여자로부터의 조직, 세포, 장기 또는 이식편 이식을 수반하는 치료 방법 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 바람직하게는 이종이식으로 인한 면역거부반응의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 사람 HLA-DR4 분자의 기능 또는 결합 활성 이상을 포함하여 T 세포에 의한 면역반응을 억제하기 위해, 다양한 돌연변이생성(mutagenesis) 및 스크리닝 방법 등을 통해 신규한 변이체 분자를 만드는데 이용될 수 있다. 상기 분자는 T 세포 활성화에 중요한 신호전달 경로를 저해되거나 차단할 수 있으며, 그에 따라 T 세포는 선택적으로 활성화되지 않고 감소된 증식 능력을 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드를 이용한 변이체 분자는 T 세포가 작동하기 위한 신호전달 경로의 길항제로서, T 세포-의존성 면역 반응을 억제하거나 차단함으로써, 면역억제제로서 기능할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 그 분비를 용이하게 하는 펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 단백질을 제공할 수 있다. 상기 분비를 용이하게 하는 펩티드는 신호 펩티드일 수 있다. 여기에서 신호 펩티드는 일반적으로 대상 폴리펩티드에 선행하는 펩티드(또는 아미노산) 서열로서, 대상 폴리펩티드와 결합되어 번역되며, 폴리펩티드를 분비 시스템으로 가게 하거나 그것을 용이하게 하는 역할을 한다. 신호 펩티드는 일반적으로 대상 폴리펩티드의 아미노 말단에 공유적으로 부착되거나 융합되며, 숙주 세포로부터 대상 폴리펩티드의 분비를 용이하게 한다. 신호 펩티드는 일반적으로 번역 후 대상 폴리펩티드로부터 절단된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 서열 및 그의 보체에 의하여 제공된 여섯 개의 상이한 리딩 프레임(reading frames) 중 임의의 하나에서 암호화될 수 있다. 핵산과 폴리뉴클레오티드는 상호교환적으로 사용되어 단일- 또는 이중-가닥 형태의 핵산 잔기의 폴리머(예, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 지칭한다. 특별히 제한하지 않으면, 이 용어는 본래의 핵산과 유사한 결합 성질을 가지며 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 표현되지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 개질된 변형체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환(degenerate codon substitutions)) 및 상보적 핵산 서열은 물론이고 명백하게 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 성취될 수 있다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605 2608 (1985); 및 Cassol 등 (1992); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91 98 (1994)). 상기 변이체 핵산은 (WT 핵산과 같은) 원본 핵산의 뉴클레오티드 서열과 하나 이상의 핵산 잔기로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 하나의 양태에서, 변이체 핵산은 본래의 핵산의 뉴클레오티드 서열의 총 수의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 30% 40%, 50% 또는 그 이상으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 변이체 핵산은 본래의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 변이체 핵산은, 예컨대 본래의 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 결실, 첨가 또는 치환, 또는 그러한 결실(들), 첨가(들) 및/또는 치환(들)의 임의의 조합에 의하여,본래의 핵산의 것과 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 핵산에 있어서의 변이는 뉴클레오티드의 대안적 스플라이싱(splicing) 또는 트렁케이션(truncation), 또는 뉴클레오티드의 가공 또는 절단(cleavage)에서의 에러로부터 일어날 수도 있다. 참조 또는 부모 핵산은 그 자체가 변이체 핵산이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 숙주 세포에서 핵산을 전달하거나 유지할 수 있는 임의의 제제일 수 있으며, 예를 들어, 플라스미드(예, DNA 플라스미드), 네이키드 핵산, 바이러스 벡터, 바이러스, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 기타 분자와 복합된 핵산은 물론이고, 고체 상태 입자상으로 고정화된 핵산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 벡터는 숙주 세포에서 외인성 유전자 및/또는 단백질을 전달하거나 유지하는 제제로서 유용할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나(transducing), 형질감염하거나(transfecting), 형질전환하여(transforming), 세포가 세포에 고유한 것들 이외의 핵산 및/또는 단백질을 또는 세포에 고유하지 않는 방식으로 복제하거나 발현하게 한다. 벡터는, 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅, 등과 같이, 세포 내로 핵산이 인입하는 것을 돕는 물질을 포함할 수 있다. 세포 내로 핵산을 전달하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 달리 표시되지 않으면, 벡터는 세포 내로 핵산을 운반하는 임의의 특정 방법을 의미하거나 임의의 특정 세포 타입이 형질도입의 주체라는 것을 의미하지 않는다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는, 숙주 세포 내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 성분과 함께, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는, 핵산 구성체 또는 서열을 일반적으로 지칭한다. 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결되는 전사될 핵산을 일반적으로 포함한다. 상기 발현은, 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및/또는 분비를 포함하나 이에 한정되지 않는, 폴리펩티드의 생산에 수반되는 임의의 단계를 포함한다. 예컨대, 본 발명의 발현벡터는 원핵생물 숙주 세포와 양립할 수 있는 발현 벡터가 이용될 수 있는데, 그러한 원핵생물 발현 벡터에는 BLUESCRIPT 벡터(Stratagene), T7 발현 벡터(Invitrogen), pET 벡터(Novagen) 등이 포함된다. 진핵생물 숙주 세포에 양립할 수 있는 발현 벡터는, 예컨대, pCMV 벡터(Invitrogen), pIRES 벡터(Clontech), pSG5 벡터(Stratagene), pCDNA3.1(Invitrogen Life Technologies), pCDNA3(Invitrogen Life Technologies), Ubiquitous Chromatin Opening Element(UCOE TM) 발현 벡터(Millipore) 등이 있다.

상기 본 발명의 벡터에는 적절한 프로모터 또는 조절 서열이 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 일반적으로 본 발명의 핵산 서열에 결합되고 및/또는 작동적으로 연결되어 있다. 발현 조절 서열은 다른 뉴클레오티드 서열의 발현을 촉진, 증진, 또는 제어하는 뉴클레오티드 서열이다. 채용될 수 있는 적합한 발현 조절 서열은, 구성 프로모터, 유도성 프로모터 및/또는 억제 프로모터, 발현을 증폭시키는 인핸서, 개시 서열, 종결 번역 서열, 스플라이싱 조절 서열, 등을 포함하는 프로모터를 포함한다. 본 발명의 핵산이 벡터에 포함될 때, 핵산은 일반적으로 적절한 전사 조절 서열(프로모터)에 기능적으로 연결되어 mRNA 합성을 유도한다. 프로모터는 재조합 폴리펩티드 발현의 수준에 특히 중요한 영향을 준다. 임의의 적합한 프로모터가 이용될 수 있다. 적합한 프로모터의 예는, 첫 번째 인트론(intron A)을 가지거나 가지지 않는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, HIV 긴 말단 반복 프로모터(long terminal repeatpromoter), 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터, 로스 육아종 바이러스

(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터, 예컨대 RSV 긴 말단 반복(LTR) 프로모터 같은 것, SV40 프로모터, 마우스 유방암 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, HSV 프로모터, 예컨대 Lap2 프로모터 또는 헤르페스 티미딘 키나아제(herpes thymidine kinase) 프로모터(예, Wagner 등 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.78:144-145에 기술됨) 같은 것, SV40 또는 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus)에서 유도된 프로모터, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 프로모터, 예컨대 p5 프로모터 같은 것, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터(예, 양 메탈로티오네인 프로모터 또는 마우스 메탈로티오네인 프로모터(Palmiter 등 (1983) Science 222:809-814을 참조)), 인간 유비퀴틴(ubiquitin) C 프로모터, E. coli 프로모터, 예를 들어 lac 및 trp 프로모터 같은 것, 파지 람다 PL 프로모터, 및 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 프로모터(세포에서 직접적으로 또는 세포를 감염시킨 바이러스에서)를 포함한다.

본 발명의 핵산(또는 본 발명의 대응 폴리펩티드)의 발현 수준은 당업계에 공지된 기술에 의하여 평가될 수 있다. 예컨대, 노던 블랏 분석(Northern Blot analysis)(예, McMaster 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(11):4835-38(1977) 및 Sambrook), 역전사-중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase-polymerase chain

reaction, RT-PCR)(미국특허번호 제 5,601,820호 및 Zaheer 등, Neurochem. Res. 20:1457-63 (1995)), 및 인-시츄(in situ) 혼성화 기술(예, 미국특허번호 제 5,750,340호 및 제 5,506,098호)을 포함한다. 또한, 단백질의 정량화는 Lowry 분석 및 다른 단백질 정량 분석(예, Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976); Lowry 등, J. Biol. Chem. 193:265 (1951)을 참조)에 의하여 성취될 수 있다. 재조합형 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 세포의 용해물로부터 얻은 본 발명의 재조합형 폴리펩티드의 웨스턴 블랏 분석은, 재조합형 폴리펩티드 발현의 수준을 평가하기 위한 또 다른 적합한 기술이다.

본 발명의 벡터, 예컨대, 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 번역 개시 및 전사-종결 영역을 위한 리보좀-결합 자리(ribosome-binding site)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 전사-종결 영역은, DNA 서열로부터 생산된 RNA 전사체의 절단 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 용이하게 하는 폴리아데닐화 서열이다. 합성 최적화 서열은 물론, BGH(소 성장 호르몬(Bovine Growth Hormone))의 폴리아데닐화 서열, 인간 성장 호르몬 유전자, 폴리오마(polyoma) 바이러스, TK(티미딘 키나아제(Thymidine Kinase)), EBV(엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)), 래빗 베타 글로빈(rabbit beta globin), 그리고 인간유두종바이러스 (humanpapillomaviruses) 및 BPV(소유두종바이러스(Bovine Papilloma Virus)를 포함하는 유두종바이러스(papillomaviruses)를 포함하는, 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 이용될 수 있다. 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 관심의 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는데 사용될 수 있는, 부위-특이적 재조합 자리(site-specific recombination sites)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는, 원하는 세포 구획, 막, 또는 세포 기관에 폴리펩티드 발현을 표적화하거나, 주변세포질(periplasmic) 공간 또는 세포 배양 배지 내로 폴리펩티드 분비를 유도하기 위하여, 분비/위치이동 서열을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 그러한 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 분비 및/또는 위치이동 서열(들)에 대응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 덧붙여, 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase resistance) 내성, 네오마이신(neomycin) 내성, 또는 E. coli에서 테트라사이클린(tetracycline) 또는 앰피실린(ampicillin) 내성과 같이, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위하여, 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택 마커 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드는 미생물에서 증식에 유용한 복제 기점(origin of replication)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 핵산으로 형질도입되거나, 형질감염되거나, 형질전환된, 조작된 숙주 세포를 제공한다. 여기에서 숙주 세포는 핵산과 함께 형질전환하기 쉬운 임의의 세포를 지칭한다. 조작된 숙주 세포는, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 관심의 핵산을 증폭하기에 적당하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH, 등과 같은, 배양 조건은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것들이며, 당업자들에게, 그리고 예컨대, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3판, Wiley - Liss, New York 및 그것에 인용된 참조문헌을 포함하는 본 명세서에 인용된 참조문헌에서 분명할 것이다. 본 발명의 그러한 벡터 또는 핵산에 의하여 인코딩된 본 발명의 폴리펩티드는 그러한 숙주 세포에서 발현되고, 표준 기술에 의하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물로 방출된 폴리펩티드는 초원심분리(ultracentrifugation) 또는 유사한 기술에 의한 배양물로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, 인간 및 비-인간 영장류 세포를 포함하는 포유류 세포(예, CHO 세포)와 같은 동물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 발현 숙주에서, 그리고, 식물, 이스트, 균류, 박테리아, 등과 같은 비-동물 세포에서 생산될 수 있다. 적합한 발현 숙주의 예는, E. coli, Streptomyces, 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아 세포; Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, 및 Neurospora crassa과 같은 진균 세포; Drosophila 및 Spodoptera frugiperda과 같은 곤충 세포; CHO(예, CHO-K1), COS (예, COS-1, COS-7), BHK, 및 HEK (예, HEK 293) 세포와 같은 포유류 세포, 보우스씨 흑색세포종 세포(Bowes melanoma cells), 및 식물 세포를 포함한다.

본 발명은, 본 발명의 핵산, 벡터, 또는 다른 구성체 또는 그의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함하는 세포를 제공한다. 또한, 본 명세서에 기술된 본 발명의 폴리펩티드, 융합 단백질, 또는 다른 구성체, 또는 이러한 것들의 하나 이상의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함하는 세포가 포함된다. 본 발명의 세포는 일반적으로 분리형 또는 재조합형 세포이며, 숙주 세포를 포함할 수 있다. 그러한 세포, 예컨대, 재조합형 세포는, 형질전환, 형질감염, 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산, 벡터, 또는 다른 구성체에 의한 감염에 의하여 변형될 수 있다.

그러한 세포는 진핵생물 세포(예, 포유류, 이스트 또는 식물 세포) 또는 원핵생물 세포(예, 박테리아 세포)일 수 있으며, 예컨대 인산칼슘 형질감염(예, 인산칼슘 공동-침전 방법을 참조), DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기천공(Irving 등, Cell 64:891-901 (1991)), 유전자 또는 백신 총, 주사, 지질감염 및 바이오리스틱

(biolistics) 또는 상기에 주지된 다른 통상의 기술을 포함하여, 다양한 알려진 방법을 이용하여 본 발명의 임의의 그러한 구성체로 형질전환될 수 있다. 숙주 세포 종(strain)은 선택적으로 그의 능력에 따라 선택되어 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 발현된 단백질을 원하는 방법으로 가공한다. 단백질의 그러한 변형은, 아세틸화(acetylation), 카르복실화(carboxylation), 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 지질화(lipidation) 및 아실화(acylation)를 포함하나

이에 한정되지 않는다. E. coli, Bacillus sp., 이스트, 또는 CHO, HeLa, BHK, MDCK, HEK 293, WI38, 등과 같은 포유류 세포와 같은, 상이한 숙주 세포는, 특이적인 세포 기구 및 그러한 번역후 활동에 대한 특징적인 메커니즘을 가지며, 정확한 변형 및 도입된 외부 단백질의 가공을 확보하도록 선택될 수 있다.

본 발명의 핵산은 적절한 숙주 세포에 삽입되어(배양에서 또는 숙주 유기체에서) 숙주가 관심의 단백질을 발현하도록 허용할 수 있다. 임의의 적합한 숙주 세포는 본 발명의 핵산에 의하여 형질전환되고 및/또는 형질도입된다. 적절한 발현 숙주의 예는 다음을 포함한다: E. coli, Streptomyces, Bacillus sp., 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아 세포; Saccharomyces cerevisiae,

Pichia pastoris, 및 Neurospora crassa와 같은 진균 세포; Drosophila 및 Spodoptera frugiperda와 같은 곤충 세포; Vero 세포, HeLa 세포, CHO 세포(예, CHO-K1), COS 세포, WI38 세포, NIH-3T3 세포(및 MRC-5 세포와 같은 다른 섬유아 세포), MDCK 세포, KB 세포, SW-13 세포, MCF7 세포, BHK 세포, HEK-293 세포와 같은 포유류 세포, 보우스씨 흑색세포종 세포(Bowes melanoma cells) 및 식물 세포 등.

또한 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 핵산 또는 벡터로 형질도입되거나, 형질전환되거나 형질감염되는 숙주 세포를 제공한다. 상기에 검토된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 일반적으로 본 발명의 핵산을 포함한다. 숙주 세포는, 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 조작된다(예, 형질도입되거나, 형질전환되거나, 감염되거나, 형질감염된다). 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지, 감쇄된 박테리아, 또는 임의의 다른 적합한 타입의 벡터의 형태일 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 및/또는 본 발명의 바이러스 벡터의 복제를 위한 본 발명의 바이러스 벡터를 이용한 형질도입 및/또는 감염에 적합한 숙주 세포는 상기-기술된 세포를 포함한다. 바이러스 벡터 입자의 패키징(packaging)에 적합한 것으로 입증된 세포의 예는, 예컨대, Polo 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 96(8):4598-603 (1999), Farson 등, J. Gene Med. 1(3):195-209 (1999), Sheridan 등, Mol. Ther. 2(3):262-75 (2000), Chen 등, Gene Ther. 8(9):697-703 (2001), 및 Pizzaro 등, Gene Ther. 8(10):737-745 (2001)에 기술되어 있다. AAV 벡터와 같은 복제-결핍 바이러스 벡터에 있어서, 보완적인 세포주, 헬퍼 바이러스로 형질전환된 세포주, 또는 필수 유전자를 인코딩하는 플라스미드로 형질전환된 세포주가 바이러스 벡터의 복제에 필요하다.

조작된 숙주 세포는, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 관심의 핵산을 증폭하기에 적절하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 숙주 세포는 혈청-함유한 배지 또는 무-혈청 배지에서 배양될 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드(예, 다이머성 또는 모노머성 융합 단백질 및 멀티머성 폴리펩티드를 포함함), 접합체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 무한증식 세포(immortalized cells) 또는 세포주를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 이종장기 이식에 따른 면역거부반응의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 동물 또는 인간을 포함하여, 대상체에서 약학적 이용에 적합한 조성물을 지칭한다. 약학적 조성물은 일반적으로 유효한 양의 활성화제 및 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 담체, 부형제 또는 희석제는 일반적으로, 각각, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제이다. 상기 예방은, 제제를 병리, 질환 또는 장애의 징후나 증상을 나타내지 않거나, 그것의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에 투여하였을 때, 대상체가 병리, 질환 또는 장애를 발전시킬 위험을 막거나 줄이는 제제의 활동이다. 예방적으로 유용한 제제(예, 핵산이나 폴리펩티드)는 질환, 병리 또는 장애의 발전을 막는데 유용한, 또는 질환, 병리 또는 장애의 추가적인 발전 또는 증진을 저해하거나 억제하는데 유용한 제제를 지칭한다. 상기 치료는 병리, 질환 또는 장애의 증상이나 징후를 보이는 대상체에 행해지는 치료인데, 이러한 치료는 그러한 징후나 증상을 감소시키거나 제거할 목적으로 대상체에 행해진다. 치료적 활동은 그러한 징후나 증상으로 고통받는 대상체에 투여될 때 병리, 질환 또는 장애의 징후나 증상을 제거하거나 감소시키는 제제의 활동이다.

본 발명의 분자 또는 성분(예, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 및/또는 세포)은 조성물로서 대상체에 투여될 수 있다. 조성물은 일반적으로 적어도 하나의 상기 분자 또는 성분 및 부형제, 담체, 또는 희석제를 포함한다. 조성물은 적어도 하나의 그러한 분자 또는 성분 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제(예, PBS)를 포함하는 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 pH는, 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5을 포함하여 일반적으로 약 pH 6.0 내지 약 pH 9.0의 범위이고, 보통 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0의 범위이다. 본 발명의 일부 조성물은 하나 이상의 염(예, 염화나트륨, 인산나트륨, 염화칼슘 등), 하나 이상의 완충제(예, HEPES, 시트르산나트륨, 인산나트륨(예, Na2HPO4/Na3PO4), 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스(Tris)) 등), 하나 이상의 당류 또는 당(예, 수크로오스, 만노오스, 말토오스, 트레할로오스, 덱스트로오스 등), 및/또는 하나 이상의 폴리알코올 또는 당알코올(예, 만니톨, 소르비톨, 글리콜, 글리세롤, 아라비톨, 에리스리톨, 자일리톨, 리비톨, 락티톨 등)을 포함한다. 하나 이상의 단당류, 이당류 및/또는 다당류는 상기 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 대상체에 투여될 때 면역 반응을 억제하는데 유효한 임의의 농도의 상기 분자 또는 성분을 포함할 수 있다.

특정 대상체에 투여되는 본 발명의 분자의 유효한 양 또는 용량은 예를 들어, 치료될 질환, 장애, 또는 이상, 투여될 본 발명의 특정 변이체의 효능(즉, 효험), 본자의 투여 방식, 및 특정 분자의 구체적인 양을 견디는 대상체의 개인의 능력에 따라서 변할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법에서, 본 발명의 분자 또는 성분(예, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포)은 비경구, 피하, 또는 정맥내 투여될 수 있다. 본 발명의 분자 또는 성분은 치료적으로 유효한 양으로 한달에 한 번, 두 번, 세 번 또는 네 번, 일주일에 두 번, 이주일에 한 번, 또는 두 달에 한 번으로 투여될 수 있다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제 또는 화합물의 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 면역 반응을 억제하는 것을 필요로 하는 대상체에게 (1) 유효한 양의 적어도 하나의 제1의 면역억제제, 여기에서 각각의 그러한 제1의 면역억제제는 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포이고, 및 (2) 유효한 양의 적어도 하나의 제2의 면역억제제를 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하며, 여기에서 대상체에서의 면역 반응은 억제된다.

다양한 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제는 본 발명의 분자(예, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 조성물, 및/또는 세포)와 함께 사용되거나 투여될 수 있다. 그러한 제제는 예를 들어, 질환-변형 항-류마티스 약물(disease-modifying anti-rheumatic drug, DMARD)(예를 들어, 메토트렉사트(MTX), 사이토카인 길항제(예, IL-2 또는IL-6 길항제), 스테로이드성 화합물(예컨대, 코르티코스테로이드, 글루코코스테로이드, 예, 프레드니손 또는 메틸프레드니손), 비스테로이드성 화합물, 살리실산나트륨, 살리실산 마그네슘, 이부프로펜, 아세틸살리실산, 아세트아미노펜, 항체, 항염증 사이토카인의 합성 또는 생산을 차단하는 생물학적 제제, 렙티바 에팔리주맙(Raptiva efalizumab), 항염증 제제 또는 화합물, 및 비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)을 포함한다. 상기 추가적인 치료적 또는 면역억제 제제는 추가적인 제제 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하여 약학적 조성물로 대상체에 투여될 수 있다. 투여될 제제의 유효한 양 및 용량은 구체적인 제제에 따라 다를 것이다. 일부 그러한 제제는 현재 면역억제 치료에 사용되고 적절한 투여량은 치료될 질환, 장애 또는 이상 및 구체적인 양 또는 용량을 견디는 대상체의 능력, 및 제제의 면역억제 유효성에 기초하여 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

사람 HLA - DR4 에 대한 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드의 결합 측정

<1-1> HLA - DR4 특이 단클론 항체인 L243 생산

HLA 분자와 펩티드의 결합력 측정실험을 위해 HLA 분자 특이 단클론 항체가 대량 필요하므로, HLA 분자 특이 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)인 L243 (ATCC)을 약 1주일 전에 500 μl pristane(Sigma Aldrich)을 복강 주사하여 염증을 유발시킨 Balb/c(오리엔트 바이오) 마우스 복강에 10⁷(cells)씩 투여한 다음, 한 달 후에 복강액을 18G needle을 이용하여 채취하였다.

복강액 내에 존재하는 HLA 특이 단클론 항체(IgG2a)는, 아가로오스(agarose)에 protein A가 결합된 비드(bead)가 충진된 컬럼(column)에 복강액을 가하여 HLA 특이 단클론 항체만을 결합시킨 후, 용출 버퍼(elution buffer)(pH3)를 이용하여 HLA 특이 단클론 항체를 용출시켜 얻은 후, PBS로 버퍼 교환(buffer exchange)을 하였다. 용출 분획별 총 단백질 함량은 BCA assay kit(Thermo science)를 이용해 측정하였고, 최종 정제된 항체는 SDS-PAGE를 통해 단일 밴드를 확인하였다.

<1-2> PRIESS 세포 용해물의 제조

세포표면에 HLA 분자를 발현하는 PRIESS 세포(ECACC)에 프로테아제 억제제(protease inhibitor) (2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg/ml aprotinin, 25 mM indoacetamide)를 사용 직전에 넣은 용해 버퍼(1% NP-40 detergent , 0.15 M NaCl, 0.02% sodium azide in 0.05 M Sodium phosphate buffer, pH7)를 1×10⁸세포당 1ml씩 가하여 4℃, 1시간 동안 세포를 파괴하고, 4000g로 10분 동안 원심분리한 후 세포 잔해물을 제거한 상층액을 얻었다. 상층액 부피의 1/5만큼 5% Sodium deoxycholate를 첨가하고 4℃에서 10분 동안 섞어주어 HLA 분자의 용해성을 높여준 후, 17,000 rpm으로 100분 동안 초고속원심분리를 해주고 잔해물을 0.45 μm 필터로 걸러서 PRIESS 세포 용해물을 얻었다.

<1-3> 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드( HA _{306 -318} )의 사람 HLA - DR4 에 대한 결합

HLA-DR4 특이 단클론 항체인 L243으로 코팅된 ELISA 플레이트에 사람 HLA-DR4 (DRB1*0401)분자를 발현하는 세포주인 PRIESS 세포 용해물(lysate)을 가하고 2 시간 배양한 다음, 생리식염수로 세척하여 결합하지 않은 단백질을 모두 제거한 다음, 비오틴(biotin)이 결합된 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318} (PKYVKQNTLKLAT, 서열번호 33) (펩트론에 의뢰해서 합성)을 농도별로 가하고 하룻밤 배양한 다음, 스트렙타비딘(streptavidin)이 부착된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) (Sigma Aldrich) 및 기질인 4-MUP (4-methylumbelliferyl phosphate) (Sigma Aldrich)를 각각 가한 후, 여기(excitation) 파장 440nm, 방출(emittion) 파장 365nm에서 형광 값을 측정하였다. 그 결과, 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 - 318}는 농도 의존적으로 HLA-DR4에 결합하며, 약 1000 nM의 농도에서 결합이 거의 포화 상태에 이르는 것을 확인하였다(도 2).

< 실시예 2>

사람 HLA - DR4 를 통해 제시되는 돼지 주조직적합항원 ( SLA ) 유래 펩티드의 확 인

돼지 주조직적합항원(swine leukocyte antigen, SLA) class I (SLA-1,2,3) 및 class II (SLA-DR,DQ) 분자의 세포막에 존재하는 extracellular domain에서 유래된 펩티드로서, 사람 주조직적합항원 (Human leukocyte antigen, HLA) class II 분자인 HLA-DR4 (더 정확히는 DRB1*0401) 분자의 antigen binding creft 와의 결합력이 좋을 것으로 예상되는 15 개 아미노산으로 구성된 펩티드를 컴퓨터 모델링 (프로그램명: SYFPEITHI 프로그램)으로 예측한 다음, 예측된 펩티드 중에서 HLA-DR4에 대한 결합력 강도가 우수하고, 다양한 SLA allele 들과의 공유성 (universality)이 높은 32종의 펩티드를 펩트론에 의뢰해 합성하였다(표 1).

합성된 펩티드들의 HLA-DR4에 대한 결합력은 상기 실시예 1에서 기술한 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318}가 HLA-DR4에 결합하는 것(도 2)을 억제하는 정도를 상대적으로 비교하는 방법으로 측정하였다. 즉, HLA-DR4 특이 단클론 항체인 L243으로 코팅된 ELISA 플레이트에 사람 HLA-DR4 분자를 발현하는 세포주인 PRIESS 세포 용해물을 가하고 2 시간 배양한 다음, 생리식염수로 세척하여 결합하지 않은 단백질을 모두 제거한 다음, 비오틴이 결합된 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318} 1000 nM 및 합성된 SLA 유래 펩티드를 농도별로 가하고 하룻밤 배양한 다음, 스트렙타비딘이 부착된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 및 기질인 4-MUP (4-methylumbelliferyl phosphate)를 각각 가한 후, 여기 파장 440nm, 방출 파장 365nm에서 형광 값을 측정하였다.

표 1의 IC₅₀은 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 - 318}를 단독으로 가한 경우 나타내는 형광도 값을 100으로 하였을 때, 인플루엔자 바이러스 유래 펩티드인 HA_{306 -318}의 HLA-DR4에 대한 결합을 50% 억제하는 SLA 유래 펩티드의 농도를 나타낸다.

결론적으로, HLA-DR4와 친화력이 강력한 것으로 나타난 것은 SLA class I 에서 유래된 pep11(서열번호 11) (IC₅₀: 50 nM) 및 SLA class II에서 유래된 pep32(서열번호 32) (IC₅₀: 50 nM), 추가적으로 pep10(서열번호 10) (IC₅₀: 300 nM), pep17(서열번호 17) (IC₅₀: 400 nM), pep20(서열번호 20) (IC₅₀: 250 nM) 등도 친화력이 높은 것으로 나타났다(도3 내지 도7).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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Claims (5)

1. 서열번호 32의 폴리펩티드 서열로 이루어진 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 돼지 주조직적합항원(swine leukocyte antigen, SLA)에서 유래하였으며, 사람 주조직적합항원(HLA)을 통하여 T 세포에 인식되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 폴리펩티드는 면역 반응을 억제 또는 증강하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. (a) 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드, 및 (b) Ig Fc 폴리펩티드를 포함하는 분리형 또는 재조합형 단백질로서, 면역 반응을 조절하거나 통제하는 기능을 갖는 단백질.
4. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 포함하는 이종장기 이식에 따른 면역거부반응의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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