KR101383831B1

KR101383831B1 - 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐

Info

Publication number: KR101383831B1
Application number: KR1020130062926A
Authority: KR
Inventors: 이경희; 박종대; 김종철; 이현규; 이지수
Original assignee: 주식회사 천지양
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2014-04-10

Abstract

본 발명은 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산(PGA)의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐에 관한 것으로서, 위 및 소장 내의 환경에서 홍삼 추출물을 안정한 상태로 전달하여 혈행개선 효과가 증강되면서도, 쓴맛이 차폐되기 때문에 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐 {Nanocapsules for red ginseng extracts coated chitosan, fucoidan and poly-gamma-glutamic acid}

본 발명은 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐에 관한 것이다.

일반적으로 질병은 사회, 경제, 문화, 환경 등의 요인이 변화함에 따라 여러 가지 다른 형태로 표출된다. 이는 근래의 급속한 경제발전과 생활수준의 향상으로 인해 식생활을 포함한 생활방식이 다양화되면서, 과거의 감염 위주의 질병이 감소하고 선진국형의 만성퇴행성 질환이 증가하는 것으로도 확인할 수 있다.

특히 이러한 변화는 고혈압, 동맥경화, 허혈성 심장질환, 뇌경색, 뇌출혈 및 뇌졸중 등의 뇌ㆍ심혈관계 질환으로 인한 사망률을 매우 급격하게 증가시키는 데에 일조하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 뇌ㆍ심혈관계 질환은 혈중 콜레스테롤 증가, 지질조성의 변화에 따른 혈액 성분의 변화와 과도한 정신적 긴장 상태가 가장 큰 원인이다.

혈액을 구성하는 혈장 및 혈구세포(혈소판)는 혈행 활동에 주로 관여하며, 이들은 혈류의 항상성을 유지하고 혈관의 손상된 부위나 염증 부위에서 지혈과 보호를 통해 인체의 정상적인 기능을 유지시킨다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 혈관벽이 과도하게 손상을 받게 되고, 손상된 혈관벽이 콜라겐에 노출되면, 여기에 혈소판이 유착하게 된다. 유착된 혈소판은 ADP(adenosine diphosphate), 트롬빈, 칼슘 등을 유리하고, 트롬복신 A2(TXA2)를 생성하여 주위 혈소판을 활성화시켜 응집하게 된다. 이렇게 생긴 응집물이 혈류에 의해 떨어져 나간 것을 혈전이라 하며, 혈전은 혈류를 따라 흐르다 미세혈관을 막아 심근경색, 허혈 등의 혈행장애를 유발한다. 또한, 이 외에도, 혈전의 생성은 동맥경화, 심장질환 및 뇌졸중 등의 질환을 일으킬 수 있는데, 이 때문에, 혈행장애와 관련된 혈관 질환에 대한 약물 개발이 매우 중요해지고 있으며, 최근에 이러한 질환의 예방 및 치료를 위하여 항혈소판 응집 또는 항응고 활성이 우수한 치료제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

혈관 질환의 예방 및 치료를 위하여 민간 또는 동의보감 등의 전통의서에 많은 생약이 소개되어 있는데, 그 중에서도 홍삼은 그 활성이 전통의서 뿐 아니라 현대적인 실험에서도 증명이 되어 있다. 홍삼(紅衫, red ginseng)은 인삼(人蔘, ginseng)의 뿌리를 쪄서 제조한 붉은 인삼이며, 홍삼의 제조에 이용될 수 있는 인삼은 파낙스(Panax) 속에 속하는 다년생 식물로, 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax vietnamensis), 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus) 또는 파낙스 비핀라티피두스(Panax bipinratifidus), 파낙스 안구스티폴리움(Panax angustifolium) 등이 있다. 홍삼은 사포닌을 많이 함유하고 있는데, 식물계에서 존재하는 대부분의 사포닌은 올레아난(oleanane) 계열이고 홍삼 사포닌은 타 식물계에 거의 존재하지 않는 담마란(dammarane) 계열의 트리테르페노이드(triterpenoid) 사포닌으로서, 홍삼 특유의 사포닌 성분으로는 진세노사이드(ginsenoside) Rh₂, Rg₂, Rg₃, Rg₁, Rh₁ 등이 있다. 사포닌의 일반적인 특징은 물, 알코올에 잘 녹고 지속적으로 거품이 나며 생리적으로 해독작용이 있으며 과량 투여에 독성이 없다고 밝혀져 있다. 특히, 진세노사이드는 중추신경계를 비롯하여 내분비계, 면역계, 대사계 등에 영향을 미쳐 신체조절기능에 다양한 효과를 발휘한다고 알려져 있다.

한편, 홍삼 추출물은 경구투여를 통해 섭취할 경우, 위장의 낮은 pH 조건에서 각종 진세노사이드를 비롯한 홍삼 추출물의 유효성분들이 낮은 안정성을 나타내는 것으로 확인된다. 이에, 본 발명자들은 낙하유막식(falling film evaporator, 이하 FFE이라 함)으로 농축한 홍삼 추출물을 제조한 후, 상기 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐을 제조하였으며, 상기 홍삼 나노캡슐 조성물이 혈행개선 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한편, 한국공개특허 제2011-0122499호에는 홍삼이 혈소판 응집 억제 효과가 있음이 개시되어 있지만, 나노캡슐로 제조하는 것에 관해서는 전혀 나타나 있지 않으며, 유럽등록특허 제1358876호에는 키토산과 폴리머를 이용한 캡슐에 관한 기술이 개시되어 있으나, 이는 여드름 개선용 조성물에 관한 발명으로서 본 발명과는 기술적인 특성이 전혀 다르다.

또한, 한국공개특허 제2006-0060644호에는 홍삼 추출물 내의 진세노사이드 Rg₃ 및 Rh₁의 함량이 증가된 홍삼 추출물에 관해 개시되어 있기는 하지만, 이를 나노캡슐로 제조하는 것에 관해서는 전혀 개시되어 있지 않으며, 한국등록특허 제466719호에는 홍삼 또는 인삼정분을 함유하는 구형의 미세캡슐 제조방법이 개시되어 있으나, 홍삼의 안정성을 유지시키며, 쓴맛이 억제된다는 것만이 개시되어 있을 뿐, 본 발명에 개시된 바와 같은 혈행개선 효과는 개시되어 있지 않다.

한국공개특허 제2011-0122499호 (홍삼분말을 이용한 건강 기능성 식품의 제조 방법, 2011.11.10. 공개) 유럽등록특허 제1358876호 (Microcapsules containing anti-acne agents Cognis IP Management GmbH, 2007.11.07. 등록) 한국공개특허 제2006-0060644호 (고려인삼의 간이법에 의한 홍삼제조법, 2006.06.05. 공개) 한국등록특허 제466719호 (홍삼 또는 인삼정분을 함유하는 구형의 미세캡슐 제조방법, 2005.01.07. 등록)

본 발명의 목적은 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산(poly-γ-glutamic acid, 이하, PGA라 함)의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐에 관한 것이다.

상기 홍삼 나노캡슐은 홍삼 추출물 100 중량부 기준으로 키토산 20~40 중량부, 후코이단 0.01~2.5 중량부, PGA 6~16 중량부의 혼합코팅물로 피복된 나노캡슐일 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐은 250~1000㎚의 입자크기를 가질 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐은 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있다. 마찬가지로, 상기 홍삼 나노캡슐은 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은, (1공정) 키토산 용액에 홍삼 추출물을 분산시킨 후 교반하는 단계; 및,

(2공정) 상기 키토산 및 홍삼 추출물의 혼합물 분산액에 PGA 및 후코이단 혼합액을 떨어뜨리는 단계;

를 통해 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 PGA의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐을 제조할 수 있다.

상기 1공정의 홍삼 추출물의 농도는 2~15㎎/㎖일 수 있다.

상기 1공정의 키토산의 농도는 2~4㎎/㎖일 수 있다.

상기 2공정의 PGA 및 후코이단 혼합액 내의 후코이단의 농도는 0.001~0.25㎎/㎖일 수 있다.

상기 2공정의 PGA 및 후코이단 혼합액 내의 PGA의 농도는 0.6~1.6㎎/㎖일 수 있다.

이하, 본 발명을 자세하게 설명한다.

상기 홍삼 나노캡슐에 함유되는 홍삼 추출물은 고형분 함량 50~70중량%의 홍삼 추출액을 낙하유막식(falling film evaporator, 이하 FFE이라 함)으로 농축한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍삼 추출물은 물, 알코올 수용액, 및, 알코올 중에 선택되는 추출용매로 추출된 홍삼 추출액을 고형분 함량이 60%가 되도록 농축한 후, FFE 농축한 것으로서, 상기 알코올은 탄소수 1 내지 4개로 이루어진 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올 중에서 선택될 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐은 Rg1 5~10%, Rb1 25~30%, Rg1 및 Rb1 혼합에서 20~25%의 포집효율을 나타낸다.

상기 홍삼 나노캡슐은 250~1000㎚의 입자크기를 가질 수 있으며, 제타전위 10~25mV, 입자 분산도 0.04~0.30, 산란강도 70,000~500,000에서 선택되는 특징을 가질 수 있다. 이 때, 홍삼 나노캡슐은 입자크기가 250㎚ 미만, 1000㎚ 초과한 것은 형성되지 않는다.

상기 홍삼 나노캡슐의 제조방법에서, 상기 1공정의 홍삼 추출물의 농도는 2~15㎎/㎖일 수 있으며, 상기 1공정의 키토산의 농도는 2~4㎎/㎖일 수 있고, 상기 2공정의 PGA 및 후코이단 혼합액 내의 후코이단의 농도는 0.001~0.25㎎/㎖, PGA의 농도는 0.6~1.6㎎/㎖일 수 있는데, 상기 홍삼 추출물, 키토산, 후코이단, PGA의 각각의 최소농도 미만인 조건, 또는 최대농도를 초과한 조건에서는 나노캡슐이 제조되지 않고, 각 성분들이 단순 응집되는 현상이 나타난다.

상기 홍삼 추출물, 키토산, 후코이단, PGA는 수용액 상태(용매:물)에서 나노캡슐의 제조에 이용된다.

상기 홍삼 나노캡슐의 제조방법에서, 1공정의 키토산 용액과 홍삼 추출물의 분산속도와 2공정의 PGA 및 후코이단 혼합액을 떨어뜨리는 속도는 어떤 조건에서도 가능하나, 1공정의 키토산 용액과 홍삼 추출물을 분산속도는 100~10000rpm, 바람직하게는 300~5000rpm, 더욱 바람직하게는 500~2000rpm일 수 있으며, 2공정의 PGA 및 후코이단 혼합액을 떨어뜨리는 속도는 0.1~10㎖/min, 바람직하게는 0.3~5㎖/min, 더욱 바람직하게는 0.5~2㎖/min일 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐은 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및, 및 이들의 첨가제로서 이용될 수 있다. 상기 건강기능성식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가물 등일 수 있다. 상기 홍삼 나노캡슐을 함유하는 조성물은 약학 조성물 또는 건강기능식품의 제품 총량을 기준으로 하여 0.05 내지 99.9 중량%로 함유될 수 있다.

상기 혈관질환은 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환일 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐을 함유하는 약학적 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 제형으로 투여될 수 있으며, 고형제제로서, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등으로 제조될 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐은 제조된 분산액 상태로 바로 이용될 수 있으며, 특히, 바람직하게는 연질캡슐제, 또는 경질캡슐제로 제조될 수 있다.

또한 상기 홍삼 나노캡슐을 함유한 약학 조성물은 통상적인 약제학적 부형제, 담체 및 희석제를 포함할 수도 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 홍삼 나노캡슐을 함유하는 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회~수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량 기준으로 1일 투여량은 홍삼 추출물의 건조중량 기준으로 0.001~500㎎/㎏, 바람직하게는 0.1~200㎎/㎏이 투여될 수 있다.

도 1은 본 발명의 홍삼 나노캡슐 제조 모식도를 나타낸다.
도 2는 키토산/후코이단 나노캡슐과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 키토산 농도에 따른 혈소판 응집 효과를 나타낸다.
도 3은 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 후코이단 농도변화에 따른 제타전위를 나타낸다.
도 4는 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 후코이단 농도변화에 따른 입자 분산도를 나타낸다.
도 5는 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 후코이단 농도변화에 따른 입자 크기를 나타낸다.
도 6은 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 후코이단 농도변화에 따른 산란강도를 나타낸다.
도 7은 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 PGA 농도변화에 따른 제타전위를 나타낸다.
도 8은 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 PGA 농도변화에 따른 입자 분산도를 나타낸다.
도 9는 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 PGA 농도변화에 따른 입자 크기를 나타낸다.
도 10은 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 PGA 농도변화에 따른 산란강도를 나타낸다.
도 11은 반응표면분석에 따른 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 PGA와 후코이단의 농도변화가 제타전위에 미치는 영향을 나타내는 3차원 그래프와 등고선 그래프이다.
도 12는 반응표면분석에 따른 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 PGA와 후코이단의 농도변화가 입자분산도에 미치는 영향을 나타내는 3차원 그래프와 등고선 그래프이다.
도 13은 반응표면분석에 따른 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 PGA와 후코이단의 농도변화가 입자크기에 미치는 영향을 나타내는 3차원 그래프와 등고선 그래프이다.
도 14는 반응표면분석에 따른 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 PGA와 후코이단의 농도변화가 나노캡슐의 산란강도에 미치는 영향을 나타내는 3차원 그래프와 등고선 그래프이다.
도 15는 본 발명에 사용된 세로토닌 방출 분비량 확인 실험의 표준곡선을 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 홍삼 추출물의 제조>

실시예 1-1. Rg1 강화 홍삼 추출물의 제조

홍삼 추출물의 제조를 위해서는 뇌두와 잔뿌리를 제거한 홍삼 동체(4년근, 2010년)를 사용하였다. 상기 홍삼동체 10kg에 10배의 증류수 100ℓ를 가하여 85℃에서 8시간씩 4번 반복 추출하였다. 추출액은 20℃에서 12시간 동안 냉침한 후 7,600rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이후 상등액을 취하여 스팀 온도 90℃에서 FFE(falling film evaporator) 농축하여, 고형분 함량이 65%가 되도록 제조하였다. FFE 농축법은 농축액을 가열관의 상부에서 얇은 막 상태로 흘러내리게 하여 증발시키는 방법으로서, 순환형과 무순환형이 있으며, 전열속도가 크고, 체류시간이 짧기 때문에 열에 민감한 용액, 과일주스, 우유, 약학조성물의 증발농축에 적합하다.

실시예 1-2. 일반 홍삼 추출물 제조

실시예 1-1과 동일한 방법으로 홍삼 추출물을 제조하되, 홍삼 추출액을 원심분리하고 상등액을 취한 후에, 이를 FFE 농축하지 않고, 대신 일반농축기에 넣고 온도 60℃, 진공도 600~700mmHg의 조건에서 감압농축하여 고형분 함량이 65%가 되도록 제조하였다.

<실시예 2. 홍삼 추출물의 성분 분석>

실시예 2-1. 일반 특성 확인

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물 3g을 드라이오븐(dry oven)에서 내부온도 105℃의 조건으로 건조시킨 후 증발잔사의 양으로 계산하였고, 각 분석값은 3회 반복실험을 실시하여 얻은 평균값으로 산출하였다.

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물의 유기산 산도는 식품공전의 방법에 따라 시료 1g을 끓여서 식힌 증류수 100㎖, 페놀프탈레인 지시약 0.5㎖을 가한 후 0.1N NaOH 소비량으로 계산하였다. 각 분석치는 3회 반복실험을 실시하여 얻은 평균값으로 산출하였다.

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물의 pH는 pH meter(Orion 3 Star pH Benchtop, Singapore)를 이용하여 실온에서 시료 10㎖을 취해 3회 반복 측정한 후 평균값으로 산출하였다.

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물의 물 불용성성분은 AOAC법으로 측정하였다(AOAC 2000). 이를 위해 각 홍삼 추출물 1g을 취하여 증류수 15㎖에 용해하여 유리여과기에 여과하고 염소가 나오지 않을 때까지 증류수로 세척하였고, 105℃에서 3시간 건조하여 항량을 구한 뒤 시료의 양에 대한 침전물의 백분율로 계산하였다.

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물의 조사포닌의 분석을 위해서는 시료 10g에 메탄올 100㎖를 가하여 1시간 동안 교반한 후 메탄올을 이용하여 여과액과 섞은 후 감압농축하였다. 이후 농축된 잔류물에 증류수 50㎖과 수포화부탄올 50~70㎖를 가하여 추출하였으며 이 과정을 3회 반복하였다. 이후 부탄올층을 감압농축하였으며 에테르(ether) 50㎖를 넣고 환류냉각기(35℃)에서 30분간 가열하여 탈지하였다. 에테르를 제거한 후 잔류물은 105℃에서 1시간 건조시켰으며 이후 데시케이터에서 냉각시킨 후 무게를 측정하였다. 각 분석치는 3회 반복하여 얻은 평균값으로 산출하였다.

상기 결과들은 표 1에 개시하였는데, 표 1의 결과를 참고하면, FFE(falling film evaporator)공법으로 농축한 실시예 1-1의 Rg1 강화 홍삼 추출물은 일반적 추출물과 비교했을 때 고형분, 산도, pH, 불용성 침전물 측정 결과 모두에서 유의적 차이를 나타내지 않았다. 특히, 불용성 침전물은 과다 발생했을 때 품질에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서 이용한 FFE 공법은 홍삼 추출물의 의 일반적 품질특성에는 직접적인 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다.

한편, 실시예 1-1 및 실시예 1-2의 홍삼 추출물의 조사포닌 함량의 변화를 분석한 결과, FFE 공법으로 농축한 실시예 1-1의 홍삼 추출물의 경우에는 실시예 1-2의 홍삼 추출물에 비해 조사포닌 함량이 5㎎/g 증가되었다. 추출 및 일반적인 감압농축 과정시 분해가 많이 일어나는 진세노사이드 Rg1의 경우 FFE 추출 공법을 통한 초고속 감압농축 방법을 이용한 경우 분해가 억제됨으로써 이는 조사포닌 함량의 증가로 이어진 것으로 사료되었다.

분석대상	실시예 1-1의 FFE 홍삼 추출물	실시예 1-2의 일반 홍삼 추출물
고형분 (중량%)	65.30 ± 0.10	65.40 ± 0.10
유기산 산도 (중량%)	0.12 ± 0.05	0.10 ± 0.05
pH	4.90 ± 0.10	4.80 ± 0.10
물 불용성성분 (중량%)	0.80 ± 0.00	0.80 ± 0.10
조사포닌 함량 (㎎/g)	75 ± 7	80 ± 5

실시예 2-2. HPLC 분석

실시예 1-1 및 실시예 1-2의 진세노사이드 분석을 위하여 사용된 기기는 Agilent HPLC로 Thermo Sycronis C18 column(4.6×250, 5μm)을 사용하였으며 주입량은 20㎕, 유속은 1.6㎖/min, 컬럼 온도는 35℃, 자외선 흡광 파장은 203㎚로 설정하여 분석하였다. 이동상으로는 solvent A(물)와 solvent B(아세토니트릴)를 초음파 세척기로 탈기하여 사용하였으며, 기울기용리조건(gradient system)을 이용하여 분석하였다(표 2). 한편, 진세노사이드(ginsenosides) Rg1, Rb1, Rg3 표준품은 엠보연구소(Embo Lab. Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 아세토니트릴(Acetonitrile, Avantor Central Valley. PA, USA)과 물(Water, JT Baker, USA)은 HPLC용을 사용하였다.

Instrument Column	Thermo Sycronis C₁₈ column (4.6 × 250, 5μm)
Column Temp.	35℃
Pump	Agilent 1260 Quat pump
Detector	Agilent 1260 VWD
Mobile phase	A : Water B : Acetonitrile
Gradient	Time : 0 / 5/ 13/ 85/ 90/ 95/ 98/ 100 A(%) : 80/ 80/ 75/ 55/ 10/ 55/ 80/ 80
Flow rate	1.6㎖/min
Injection volume	20㎕

각 홍삼 추출물의 진세노사이드 함량 결과는 상기 진세노사이드 표준물질에 근거하여 정량분석하였으며 이에 대한 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

진세노사이드	실시예 1-1의 FFE 홍삼 추출물	실시예 1-2의 일반 홍삼 추출물
Rg1 (㎎/g)	1.89	0.47
Rb1 (㎎/g)	6.19	3.29

표 3을 확인하면, 실시예 1-2의 일반 홍삼 추출물에 비해 FFE 공법을 통해 제조한 실시예 1-1의 홍삼 추출물이 Rg1과 Rb1의 함량이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 진세노사이드 Rg1은 추출 및 일반적인 감압농축 과정시 분해가 많이 일어나는 것으로 알려져 있으며, 본 실험에서 사용한 FFE 공법을 통한 초고속 감압농축 방법을 이용한 경우 농축 시간의 최소화에 따라 열수 및 에탄올 추출물 모두에서 Rg1 분해를 억제함으로써 함량이 증가된 것으로 사료되었다. 한편, 홍삼을 에탄올 70% 수용액으로 추출한 후, FFE 공법을 이용하여 감압농축을 한 경우에도, 일반 감압농축방법으로 제조한 70% 에탄올 수용액 추출물(Rg1은 1.05㎎/g, Rb1는 8.25㎎/g)에 비해 Rg1과 Rb1의 함량이 현저하게 증가되는 것으로 나타났으며, Rg1은 6.25㎎/g, Rb1는 10.82㎎/g까지 증가되는 것으로 나타났다. 이 때, 에탄올 70% 수용액 추출물은 실시예 1-1의 방법에서 물을 이용하여 85℃에 추출하는 대신, 40℃의 에탄올 70% 수용액을 이용하여 추출하였으며 통상적인 방법으로 에탄올을 증류하여 사용하였다.

한편, 이후의 홍삼 나노캡슐은 모두 실시예 1-1의 홍삼 추출물을 이용하여 제조하였다.

<실시예 3. 홍삼 추출물, PGA, 후코이단의 혈소판 응집 억제 효과 확인>

실시예 1-1의 홍삼 추출물, 키토산, PGA, 후코이단에 의한 혈소판 응집 억제 효과를 측정하였다.

혈소판 응집 억제 효과는 aggregometer(Chronolog Co.)를 이용하여 혈소판이 응집될 때 발생하는 분산용액의 탁도(light transmission)의 변화정도를 통해 측정하였다. 먼저 혈액을 토끼의 이개중심동맥에서 주사바늘을 이용하여 채혈하였다. 사용된 토끼는 체중이 2~3kg인 수컷으로 동물실험실에서 사육하며 2주에 1회씩 순환혈액량의 10%인 권장 최대 채혈량(recommended maximum volume of blood collected)을 넘지 않게 채혈하였고 이때 항응고제는 ACD(anticoagulant citrate dextrose)를 사용하였다. 혈액은 원심분리를 통해 PRP(platelet rich plasma)와 혈구를 분리하였고, 다시 PRP를 원심분리하여 혈소판(platelet)과 PPP(platelet poor plasma)로 분리하였다. 침전된 혈소판은 HEPES 완충액을 이용하여 세척한 뒤 다시 HEPES 완충액에 분산시키고 CaCl₂의 농도가 200mM이 되게 보정하여 혈소판 응집 억제 실험에 사용될 혈소판 분산액으로 제조하였다. 이 후, 상기 혈소판 분산액을 혈구계수기를 이용하여 혈소판 농도를 3x10⁸cells/㎖로 맞추고 마그네틱 바가 들어있는 큐벳에 넣어 37℃로 가온한 뒤 마그네틱 바를 돌려주면서 측정할 시료를 넣어주었다. 시료가 처리된 혈소판 분산액에 혈소판의 응집을 유발하는 콜라겐(collagen, 5㎍/㎖)을 넣어 대조군으로 사용된 완충액(buffer) 대비 혈소판 응집 정도에 따른 탁도의 변화를 측정하였다. 이 때, 혈소판 분산액은 290㎕, 시료 10㎕, 콜라겐 1.5㎕의 부피로 첨가되었다.

한편, 실시예 1-1의 홍삼 추출물, PGA, 후코이단을 시료로 이용하여 혈소판 응집 억제 효과를 확인한 바, 실시예 1-1의 홍삼 추출물의 농도 10㎎/㎖에서 혈소판 응집 억제 효과는, 농도 증가에 따라 무처리군 100% 응집을 기준으로 85%의 혈소판 응집 억제효과를 보였다. 그러나, PGA와 후코이단은 홍삼 추출물과 동일한 농도에서는, 모두 5%의 응집 억제 효과가 나타나 거의 응집 억제 효과가 없는 것으로 나타났다.

한편, 후코이단을 혈소판 분산액을 이용하여 혈소판 응집 억제 효과를 측정했을 때 실험과정 중 혈소판 응집을 유발하는 콜라겐을 첨가하기 전에 후코이단에 의한 혈소판 응고가 나타났다. 이러한 현상은 혈소판 분산액 속에 CaCl₂를 넣어주는 과정에서 유리된 Ca²⁺ 이온과 음전하를 띄는 후코이단이 결합하면서 혈소판의 응집을 유발한 것으로 추정된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 후코이단을 혈소판 분산액(washed platelet suspension) 대신 PRP(platelet rich plasma)를 이용하여 측정하였다.

<실시예 4. 키토산/후코이단 나노캡슐과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 키토산 농도에 따른 혈소판 응집 억제 효과 확인>

나노캡슐의 키토산 농도를 최적화하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하여 키토산 농도를 확정하였다(홍삼 추출물 미포함). 나노캡슐의 주요 피복물질인 키토산의 농도별 혈소판 응집 억제 효과를 분석하기 위해 다양한 키토산 농도에서 키토산/후코이단 나노캡슐과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조한 후 콜라겐 5㎍/㎖에 의해 응집이 유도된 혈소판에 처리하여 혈소판 응집 정도를 측정하였다(실험방법 실시예 3 참조).

키토산/후코이단 나노캡슐과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하기 위해서는, 키토산 용액을 계속 교반(800rpm)하면서 peristaltic pump를 이용하여 PGA 또는/및 후코이단을 일정 속도(1.0㎖/min)로 떨어뜨려 키토산/후코이단 나노캡슐과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하였다.

한편, 키토산/PGA 나노캡슐은 키토산 4㎎/㎖ 이하의 농도에서 나노입자 특성이 좋지 않아 본 실험에서는 키토산/PGA 나노캡슐을 제외하고 키토산/후코이단과 키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 두 종류의 나노캡슐로 실험을 진행하였다. 후코이단과 PGA 농도는 각각 60㎍/㎖과 50㎍/㎖으로 고정하여 나노캡슐을 제조하였다. 그 결과 두 나노캡슐 모두 키토산의 농도가 증가될수록 혈소판 응집력이 오히려 촉진되는 현상이 관측되었다(응집효과가 더 증가함, 도 2). 이는 양전하의 키토산이 음전하인 혈소판과 이온적 상호작용을 통해 응집을 유발한 것으로 추정된다. 따라서 키토산에 의한 혈소판 응집력이 가장 낮으면서 입자 제조가 가능한 키토산의 농도 2㎎/㎖을 선택하여 이후 실험에 사용하였다.

<실시예 5. 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 제조>

본 발명의 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하기 위한 조건을 수립하기 위해 먼저 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐을 제조하였다. 이를 위해, 키토산 용액에 홍삼 추출물을 800rpm에서 5분 동안 교반하고, 계속 교반하면서 상기 키토산과 홍삼 추출물의 분산액 혼합용액에 peristaltic pump를 이용하여 후코이단을 일정 속도(1.0㎖/min)로 떨어뜨려 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐을 제조하였다.

후코이단 농도 변화에 따른 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 물리적 특성을 측정하기 위하여 홍삼 추출물 농도는 10㎎/㎖, 수용성 키토산 농도는 2.0㎎/㎖로 각각 고정하고 후코이단 농도를 0.1~250㎍/㎖로 조절하여 나노캡슐을 제조하고 제타전위, 입자크기, 입자분산도, 산란강도의 입자특성을 분석하였다.

나노캡슐의 나노입자크기(particle size)를 비롯하여 입자의 분산도(polydispersity index, PDI), 산란강도(derived count rate, DCR) 및 제타전위(zeta potential) 등의 입자특성은 나노입도분석기(Marvern Zetasizer Nano ZS)를 이용하여 측정하였으며, 이후의 실시예에서는 모두 동일한 조건으로 나노캡슐의 특성을 분석하였다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 제타전위

제타전위는 나노캡슐 표면의 전기적 이중층에서의 전위를 의미하며 콜로이드 시스템의 안정성을 나타내는 지표이다. 일반적으로 제타전위는 절대값 30mV 이상이면 안정하고 그 이하로 내려갈수록 불안정하다고 판단한다.

후코이단 농도변화에 따른 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 제타전위 측정 결과(도 3), 후코이단의 농도가 증가함에 따라서 전반적으로 제타전위가 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 이러한 경향은 특히 후코이단 농도 10~ 250㎍/㎖ 구간에서 더욱 뚜렷하게 확인되었다. 그러나 후코이단 농도가 250㎍/㎖을 초과하였을 때는 입자들이 응집되어 입도분석이 불가능하였다. 이상과 같이 제타전위 측정 결과, 후코이단 농도와 상관없이 모든 키토산/후코이단 나노캡슐의 제타전위가 10mV 이하의 결과를 보여 전체적으로 낮은 입자 안정성을 보였다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 입자 분산도

후코이단 농도증가에 따른 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 입자 분산도는, 도 4에서와 같이 후코이단 농도가 0.1~150㎍/㎖ 범위까지는 후코이단 농도가 증가됨에 따라 유의적 차이 없이 안정된 입자 분산도를 나타냈다. 그러나 후코이단 농도 200㎍/㎖ 이상부터는 유의적으로 입자 분산도가 증가하였다. 입자의 분산도는 나노캡슐을 제조할 때 형성된 입자의 크기가 다양하여 평균 입자크기를 기준으로 하였을 때 편차가 크다는 것을 의미하는데, 후코이단의 농도가 증가함에 따라 균일하지 못한 입자가 형성되는 것을 나타났다. 가장 입자분산도가 크게 나타났던 후코이단 농도 250㎍/㎖ 이상에서 가장 불균일한 입자분포를 나타내며 응집 또한 발생하여 육안으로도 관찰할 수 있는 크기의 침전물이 관찰되었다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 입자크기

후코이단 농도변화에 따른 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 입자크기 경향은 입자 분산도의 경향과 거의 일치하였다(도 5). 후코이단 농도가 0.1~100㎍/㎖ 범위까지는 후코이단 농도가 증가됨에 따라 유의적 차이 없이 약 500㎚의 안정된 입자 분산도를 나타냈다. 그러나 100㎍/㎖ 이상의 후코이단 농도에서는 농도가 증가함에 따라 입자크기가 유의적으로 증가하여, 250㎍/㎖에서는 1000㎚ 정도의 입자가 형성되었고 그 이상의 농도에서는 입자간의 응집으로 인해 침전물이 생겨 안정적인 나노분산액을 제조할 수 없는 것으로 판단되었다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 산란강도

산란강도는 입자로부터 산란되어 나오는 빛의 intensity의 양으로 입자의 크기나 제조된 입자의 수가 증가되었을 때 산란강도 역시 증가되기 때문에, 산란강도와 입자크기 결과를 가지고 제조된 입자의 수를 예측할 수 있다. 후코이단 농도에 따른 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 산란강도의 변화(도 6)는 입자크기나 입자 분산도와는 달리 다소 복잡한 양상을 나타냈다. 가장 낮은 산란강도를 나타냈던 후코이단 2.5㎍/㎖의 농도를 제외하면, 전반적으로 후코이단의 농도가 0.1~10㎍/㎖까지 증가됨에 따라 뚜렷한 경향없이 유사한 산란강도를 나타내다가 100㎍/㎖의 농도에서 가장 높은 산란강도를 나타냈고, 그 이상의 농도에서는 산란강도가 유의적으로 감소되는 경향을 나타냈다. 전술한 바와 같이 산란강도는 입자로부터 산란되어 나오는 intensity의 양으로 형성된 입자의 크기가 증가되거나 입자의 수가 증가되었을 때 증가된다. 따라서 후코이단 농도 100㎍/㎖에서는 비교적 안정적인 입자 분산도를 나타내며 작은 크기의 나노캡슐을 형성함에도 불구하고 가장 높은 산란강도를 나타내어 가장 효과적으로 나노캡슐이 형성되었다고 판단된다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐에서 후코이단 농도의 최적화

상기 결과들, 특히, 도 5의 결과를 참고하여, 표 4와 같은 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐에서 후코이단 농도의 최적화 조건을 확정하였다.

최적화 조건	후코이단 (㎍/㎖)	Particle size (㎚)
홍삼/키토산/후코이단-Min	10	440
홍삼/키토산/후코이단-Max	250	1020

<실시예 6. 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 제조>

본 발명의 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하기 위한 조건을 수립하기 위해 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐을 제조하였다. 이를 위해, 키토산 용액에 홍삼 추출물을 800rpm으로 5분간 교반하면서 분산시킨 후, 계속 교반하면서 상기 키토산과 홍삼 추출물의 분산액 혼합용액에 peristaltic pump를 이용하여 PGA를 일정 속도(1.0㎖/min)로 떨어뜨려 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐을 제조하였다.

PGA 농도변화에 따른 홍삼 추출물을 함유한 키토산/PGA 나노캡슐의 물리적 특성을 측정하기 위하여 홍삼 추출물과 키토산 농도를 각각 10㎎/㎖와 2.0㎎/㎖로 고정하고 PGA는 0.1㎍/㎖~2.0㎎/㎖의 농도범위에서 나노캡슐을 제조하여 제타전위, 입자크기, 입자의 분산도, 산란강도 등의 입자특성을 분석하였다.

홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 제타전위

PGA 농도변화에 따른 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 제타전위 측정 결과(도 7), PGA의 농도가 0.6㎎/㎖ 이상에서 농도가 증가함에 따라 제타전위가 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다. PGA 농도 0.1㎍/㎖~0.4㎎/㎖ 구간에서는 PGA 농도와 관계없이 제타전위가 5mV 정도를 나타내어 입자형성이 안정적이지 못한 것으로 나타났으나(data not shown), PGA 농도 0.6㎎/㎖ 이상에서는 농도가 증가함에 따라 제타전위가 증가하여 입자가 안정화되는 경향을 나타내었다. 반면, PGA의 농도가 1.6㎎/㎖를 초과했을 때는 나노 입자가 서로 응집하여 침전이 생기는 현상이 발생하여 정상적인 나노 분산액이 형성되지 않았다.

홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자 분산도

PGA 농도변화에 따른 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자 분산도 측정 결과, 도 8에서와 같이 PGA의 농도가 0.6~0.8㎎/㎖일 때, 농도가 증가함에 따라 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자의 분산도가 감소하여 0.8㎎/㎖일 때 분산도가 0.118로 가장 낮은 결과를 나타내었다. 반면, PGA 농도가 0.8㎎/㎖ 이상으로 증가함에 따라서는 분산도가 유의적으로 증가하는 경향성을 나타내었다. 일반적으로 나노캡슐의 분산도는 0.3 이하에서 안정적이고 낮을수록 안정하다고 판단하고 있으므로 모든 실험조건에서 입자가 안정적으로 분산되어 있으며 특히, 0.8㎎/㎖일 때 가장 안정적인 입자가 형성되었다고 판단된다.

홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자크기

PGA 농도 변화에 따른 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자크기는 도 9와 같다. 제타전위 결과를 통해 입자가 안정적으로 형성되었던 PGA 농도인 0.6~1.6㎎/㎖ 구간에서 입자크기를 측정했을 때 농도가 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하여 PGA 1.2㎎/㎖에서 331㎚로 가장 작은 입자를 형성하였고, 그 이상의 농도에서는 농도가 증가함에 따라 다시 유의적으로 입자크기가 증가하는 경향을 나타내었다.

홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 산란강도

PGA 농도변화에 따른 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 제타전위 측정 결과(도 10), PGA 농도 변화에 따른 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 산란강도는 PGA 농도 0.6㎎/㎖에서 농도가 증가함에 따라 증가하여 1.2㎎/㎖에서 가장 높은 결과를 나타내었고 그 이상의 농도에서는 농도가 증가함에 따라 다시 감소하는 결과를 나타내었다. 따라서 PGA 1.2㎎/㎖에서 입자를 제조했을 때 입자크기가 작아짐에도 불구하고 가장 높은 산란강도를 나타내어 약 300㎚의 작은 나노캡슐들이 효과적으로 형성된다고 판단된다.

홍삼/키토산/PGA 나노캡슐에서의 PGA 농도의 최적화

상기 결과들, 특히, 도 9의 결과를 참고하여, 표 5와 같은 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐에서 후코이단 농도의 최적화 조건을 확정하였다.

최적화 조건	PGA (㎎/㎖)	Particle size (㎚)
홍삼/키토산/PGA-Min	1.2	331
홍삼/키토산/PGA-Max	0.8	805

<실시예 7. 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제조>

상기 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐(실시예 5) 및 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐(실시예 6)을 제조하여 PGA와 후코이단의 농도가 나노캡슐의 특성에 미치는 영향을 분석한 후, 이를 참고하여 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하였고, 상기 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 이용하여 반응표면분석(Responce surface analysis by least-square regression, RSREG)을 수행하여, 홍삼/키토산/PGA/후코이단 나노캡슐 제조조건을 최적화하였다.

이를 위해, 키토산 용액에 홍삼 추출물을 800rpm으로 5분간 교반하면서 분산시킨 후, 계속 교반하면서 상기 키토산과 홍삼 추출물의 혼합용액 분산액에 peristaltic pump를 이용하여 PGA와 후코이단 혼합액을 일정 속도(1.0㎖/min)로 떨어뜨려 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하였다. 이 때, 홍삼 추출물 농도는 10㎎/㎖, 키토산 농도는 2㎎/㎖로 고정하였다(도 1).

중심합성설계에 의한 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐 제조

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제조조건을 최적화하기 위한 반응표면분석에서 홍삼 함유 나노캡슐의 특성에 영향을 미치는 주요 변수로 PGA(X₁)과 후코이단(X₂) 농도를 독립변수로 설정하고 이에 따른 입자특성인 제타전위(Y₁)와 PDI(Y₂), 입자크기(Y₃), 산란강도(Y₄)를 종속변수로 설정하였다.

홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐(실시예 5)과 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐(실시예 6)을 각각 제조하여 PGA와 후코이단의 농도가 나노캡슐의 특성에 미치는 영향을 분석한 결과, PGA 0.6~1.6㎎/㎖의 범위에서 PGA 농도에 따른 입자특성의 변화가 가장 잘 관측되었으며, 후코이단 농도에 따라서는 뚜렷한 입자특성의 경향을 나타내지는 않았으나 250㎍/㎖이상의 농도에서는 형성된 입자들의 응집 현상이 관측되었다.

따라서, 반응표면분석을 위한 독립변수 각각의 수준은 표 6과 같이 설정하고 각 변수들은 -2, -1, 0, 1, 2의 다섯 수준으로 하였다. 또한 중심합성설계(central composite design)에 의한 10개의 다양한 제조조건에서 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조하여 각 실험군에서 제타전위, 입자의 분산도, 입자크기와 산란강도를 각각 측정하였다(표 7). 즉, 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제조조건을 최적화하기 위한 반응표면분석에서, 상기 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 특성에 영향을 미치는 주요 변수로 PGA(X₁)과 후코이단(X₂) 농도를 독립변수로 설정하고 이에 따른 입자특성인 제타전위(Y₁)와 PDI(Y₂), 입자크기(Y₃), 산란강도(Y₄)를 종속변수로 설정하였다. 각 변수들은 다섯 단계로 설정하며 설계한 실험군 각각의 방출량을 통계분석하며 독립변수들과 종속변수인 입자특성(Y_i)에 대한 표본 회귀모형식은 다음과 같다.

Variables	Coaded	Coaded level					ΔX
Variables	X_i	-2	-1	0	1	2	ΔX
PGA (㎎/㎖)	X₁	0.6	0.85	1.1	1.35	1.6	0.25
후코이단 (㎎/㎖)	X₂	0	0.06	0.12	0.18	0.24	0.06

하기 표 7은 중심합성설계(central composite design)에 의한 10개의 다양한 제조조건에서 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐을 제조한 후, 측정한 제타전위, 입자의 분산도, 입자크기와 산란강도 결과를 나타낸다.

Run num -ber	Coded variables		제타전위	입자분산도	입자크기 (㎚)	산란강도
Run num -ber	X₁ ¹⁾	X₂ ¹⁾	Y₁	Y₂	Y₃	Y₄
1	1	1	22.1 ± 1.2	0.258 ± 0.020	407 ± 27	198,723 ± 32,490
2	1	-1	21.7 ± 1.7	0.176 ± 0.022	373 ± 18	303,170 ± 11,008
3	-1	1	17.3 ± 1.4	0.072 ± 0.020	325 ± 21	470,931 ± 42,474
4	-1	-1	15.8 ± 1.7	0.044 ± 0.036	540 ± 50	168,700 ± 20,114
5	0	0	18.9 ± 0.9	0.109 ± 0.012	306 ± 8	443,870 ± 2,514
6	0	0	18.9 ± 0.8	0.100 ± 0.018	302 ± 12	456,063 ± 31,375
7	2	0	23.3 ± 1.1	0.292 ± 0.026	483 ± 32	183,600 ± 27,849
8	-2	0	12.4 ± 0.7	0.062 ± 0.019	774 ± 46	79,994 ± 6,695
9	0	2	19.2 ± 1.6	0.142 ± 0.017	310 ± 9	450,611 ± 23,143
10	0	-2	19.8 ± 2.0	0.099 ± 0.025	326 ± 15	299,159 ± 25,807
¹⁾X₁: PGA 농도, X₂: 후코이단 농도

한편, 피복물질인 PGA와 후코이단의 농도가 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제타전위에 미치는 영향을 분석하기 위하여 PGA 농도와 후코이단 농도를 각각 독립변수 X₁과 X₂로 제타전위 결과를 종속변수로 설정하여 반응표면분석을 수행한 결과 다음의 다항 회귀식 1을 얻을 수 있었다.

[다항 회귀식 1]

Zeta potential (mV) = - 0.5153 + 23.3733X₁ ^** + 13.2222X₂ - 4.7000X₁ ² + 32.9861X₂ ²- 18.3333X₂X₁

상기 다항 회귀식 1에서 **는 개별항이 전체 결과에 미치는 유의적인 영향을 나타내는 것으로 *가 하나일 때는 유의수준 0.05 수준에서, **일 때는 유의수준 0.01 수준에서의 높은 영향을 나타내고 있음을 의미한다. 이 후의 다항 회귀식에도 동일하게 표현한다.

반응표면분석에 의한 PGA와 후코이단 농도가 제타전위에 미치는 영향을 측정하였을 때 다항 회귀식의 결정계수(coefficient of determination, R²)는 0.9840이며 유의확률은 0.0011로 고도의 유의수준인 0.01보다 낮아 가정된 모형반응이 통계적으로 적합한 것으로 나타났다. PGA와 후코이단이 개별적으로 제타전위에 미치는 영향의 유의성은 각각 0.0005와 0.6921로 산출되었으며 PGA 농도가 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제타전위에 높은 영향을 미치는 요인으로 나타난 반면 후코이단은 제타전위 변화에 유의적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제타전위에 대한 PGA와 후코이단의 영향을 3차원 그래프와 등고선 그래프를 통하여 도식화하였다(도 11). 전반적으로 PGA 농도가 증가함에 따라 제타전위는 증가하는 경향을 보여 PGA의 농도변화가 제타전위에 유의적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 후코이단의 농도가 증가함에 따라서는 PGA의 농도가 낮을 때는 제타전위도 다소 증가하는 경향을 보였으나 PGA의 농도가 높을 때는 후코이단 농도 증가에 따라 제타전위가 다소 감소하는 경향을 나타내기는 하였으나 영향을 미치는 정도는 매우 미미하였다. 반응표면분석에서 최적조건(optimum condition)을 찾는 정준분석(canonical analysis) 결과 제조조건에 따른 제타전위의 임계점(stationary point)이 안장점(saddle point)에 위치하고 있다고 나타났으며 그에 따라 능선분석(ridge test)을 실시하였다. 그 결과 최대값은 PGA 농도 1.572383㎎/㎖, 후코이단 농도 0.080671㎎/㎖일 때 제타전위가 23.57mV로 나타났고 최소값은 PGA 농도 0.604598㎎/㎖, 후코이단 농도 0.103763㎎/㎖일 때 제타전위가 12.48mV로 산출되었다.

한편, PGA와 후코이단이 나노캡슐의 입자 분산도에 미치는 영향을 확인하기 위해, 피복물질인 PGA와 후코이단의 농도가 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 입자분산도(PDI) 값에 미치는 영향을 분석하기 위하여, PGA 농도와 후코이단 농도를 각각 독립변수 X₁과 X₂로 제타전위 결과를 종속변수로 설정하여 반응표면분석을 수행한 결과 아래의 다항 회귀식 2를 얻을 수 있었다.

[다항 회귀식 2]

Polydispersity index = 0.2603 - 0.4593X₁ - 0.9327X₂ + 0.2776X₁ ² ^* + 0.9000X₂X₁ + 0.8953X₂ ²

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 나노입자의 분산도

반응표면분석에 의해 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 나노입자의 분산도에 PGA와 후코이단 농도가 미치는 영향을 측정한 결과 다항 회귀식의 결정계수는 0.9623으로 나타났고 유의확률은 0.006으로 나타나 가정된 모형반응이 통계적으로 적합한 것으로 나타났다. 입자 분산도에 미치는 PGA와 후코이단의 개별적인 영향은 유의수준이 각각 0.003과 0.2160으로 나타나 PGA 농도는 입자 분산도에 유의적인 영향을 미치는데 반해서, 후코이단에 의한 유의적 영향은 관측되지 않았다.

입자 분산도에 대한 PGA와 후코이단의 영향을 3차원 그래프와 등고선 그래프로 나타낸 결과, PGA와 후코이단의 농도가 증가함에 따라 입자분산도가 증가되는 경향을 나타냈다(도 12). PGA와 후코이단 농도변화에 따른 입자 분산도 변화에 대한 정준분석을 수행한 결과 임계점은 최저점으로 나왔고 이때의 입자 분산도 값은 0.017로 산출되었다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 PGA와 후코이단이 나노캡슐의 입자크기에 미치는 영향

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 PGA와 후코이단이 나노캡슐의 입자크기에 미치는 영향을 확인하기 위해, PGA 농도와 후코이단 농도를 독립변수 X₁과 X₂로 놓고 입자크기 결과를 그에 대한 종속변수로 설정하여 반응표면분석을 실시한 결과 다음의 다항 회귀식 3을 얻을 수 있었다.

[다항 회귀식 3]

Particle size (㎚) = 2691.6238^** - 3519.0476X₁ ^** - 4986.4286X₂ + 1272.1429X₁ ^2** + 4150X₂X₁ + 523.3135X₂ ²

반응표면분석에 의해 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 분산도에 PGA와 후코이단 농도가 미치는 영향을 측정한 결과 다항 회귀식의 결정계수는 0.9369으로 나타났고 유의확률은 0.0163으로 나타나 가정된 모형반응이 통계적으로 적합한 것으로 나타났다. 입자 분산도에 미치는 PGA와 후코이단의 개별적인 영향은 유의수준이 각각 0.0103과 0.2541로 나타나 PGA 농도는 입자 분산도에 유의적인 영향을 미치는데 반해서, 후코이단에 의한 유의적 영향은 관측되지 않았다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 입자크기에 대한 PGA와 후코이단의 영향

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 입자크기에 대한 PGA와 후코이단의 영향을 3차원 그래프와 등고선 그래프로 나타낸 결과(도 13), PGA가 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐의 입자크기에 미치는 경향과 같이 PGA 농도가 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하다가 다시 증가하는 경향을 나타냈다. 그러나 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐의 입자크기는 100㎍/㎖ 이하의 후코이단 농도에서는 약 500㎚의 안정된 입자크기를 나타냈던 것에 반해서, 110~130㎍/㎖ 범위의 후코이단 농도에서 300㎚ 이하의 작은 입자크기가 관측되었다. 따라서 키토산에 PGA와 후코이단이 혼합되었을 때는 키토산과 PGA와 후코이단이 각기 단독으로 입자가 형성되는 것과는 달리 서로 상호보완적으로 입자형성에 관여하는 것으로 판단된다.

또한, PGA와 후코이단의 농도변화에 따른 입자크기 변화에 대한 정준분석을 실시한 결과 임계점은 안장점에 있는 것으로 확인되어 능선분석을 실시하였다. 반응표면분석 분석 결과 나노캡슐의 입자크기 최소값은 PGA와 후코이단이 각각 1.33㎎/㎖과 13.81㎍/㎖일 때 268.83㎚으로 산출되었으며, 나노캡슐 입자크기 최대값은 PGA와 후코이단이 각각 0.63㎎/㎖과 80.63㎍/㎖일 때 795.37㎚로 예측되었다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 PGA와 후코이단이 나노캡슐의 산란강도에 미치는 영향

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐에서 산란강도에 미치는 피복물질 PGA와 후코이단의 영향을 분석하기 PGA 농도와 후코이단 농도를 독립변수 X₁와 X₂로 하고 산란강도값을 종속변수로 설정하여 반응표면분석을 수행한 결과 아래의 다항 회귀식 4를 얻을 수 있었다.

[다항 회귀식 4]

Derived count rate = -2,095,958^* + 3,469,777X₁ ^** + 9,086,937X₂ ^* - 1,196,938X₁ ^2* - 6,777,967X₁X₂ ^* - 3,899,058X₂ ²

반응표면분석에 의한 PGA와 후코이단 농도가 산란강도에 미치는 영향을 측정하였을 때 다항 회귀식의 결정계수는 0.8916, 유의확률은 0.046으로 나와 가정된 모형반응이 통계적으로 유의한 것으로 나타났다. PGA와 후코이단의 개별적인 농도가 산란강도에 미치는 영향은 유의수준이 각각 0.0304와 0.0954로 확인되어 다른 종속변수들과 마찬가지로 PGA 농도는 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 산란강도에 유의적인 영향을 미치는 반면, 후코이단 농도에 의한 유의적 영향은 확인되지 않았다.

PGA와 후코이단의 농도변화가 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 산란강도에 미치는 영향을 반응표면분석 회귀식에 근거하여 3차원 그래프와 등고선 그래프를 작성하였다(도 14). 그래프의 형태는 입자크기를 나타낸 그래프와 반대 경향을 나타내고 있으며 PGA 농도가 증가함에 따라 산란강도는 증가하다가 감소하는 경향을 보였다. 또한 PGA 농도가 낮을 때는 후코이단 농도 증가에 따라 산란강도가 증가되었고, PGA 농도가 높을 때에는 산란강도가 감소되는 경향을 나타냈다.

PGA와 후코이단 농도변화가 나노캡슐의 산란강도에 미치는 변화에 대해 정준분석을 실시한 결과 임계점은 안장점에 있는 것을 나타났고 그에 따라 능선분석을 실시한 결과 PGA와 후코이단 농도가 각각 0.8756와 0.2272㎎/㎖일 때 539,465의 최대 산란강도가 나타날 것으로 예측되었다.

이상과 같이 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 입자특성에 영향을 미치는 피복물질 PGA와 후코이단 농도를 독립변수로 정하고 그에 따른 종속변수 제타전위, 입자 분산도, 입자크기, 산란강도 값의 변화를 반응표면분석법을 이용하여 측정하였다. 모든 실험모델이 높은 유의수준을 보여 통계적으로 적합한 실험임을 확인할 수 있었고, 전반적으로 모든 종속변수에 대해서 상대적으로 PGA만이 유의적인 영향이 관측되어 입자형성에 가장 큰 영향을 미치는 조건으로 나타났다. 제타전위와 입자분산도가 독립변수 PGA와 후코이단의 농도가 증가함에 따라 함께 증가한 반면 입자크기는 감소하다가 특정 농도 이후 증가하는 경향을 나타냈고, 산란강도는 증가하다가 감소하는 경향을 나타냈다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 구성성분 중량비

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 제조가 가능한 각 구성성분의 농도는 실시예 5~6의 조건 및 상기 표 7의 조건을 종합하여, 홍삼 추출물의 농도는 2~15㎎/㎖, 키토산의 농도는 2~4㎎/㎖, 후코이단의 농도는 0.001~0.25㎎/㎖, PGA의 농도는 0.6~1.6㎎/㎖인 것으로 확인된다.

한편, 표 7에서 제조된 조건들의 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐 분산액내의 각 구성성분의 중량비는, 각 성분의 농도비와 동일하다고 할 수 있으며, 홍삼 추출물을 100으로 기준할 때, 홍삼 추출물 : 키토산 : 후코이단 : PGA가 100 : 20~40 : 0.01~2.5 : 6~16 중량비로 확인된다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 포집효율

나노캡슐 내에 함유된 홍삼추출물의 포집효율을 측정하기 위하여 제조된 나노캡슐 분산액을 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 원심분리에 의해 분리된 상층액은 나노캡슐화되지 않은 홍삼추출물로 간주하여 HPLC를 이용하여 정량분석하였다. 홍삼추출물의 포집효율 분석을 위하여 홍삼의 ginsenoside Rg1과 Rb1를 지표성분으로 이용하였으며, 포집효율(entrapment efficiency, EE) 산출을 위해서는 Rg1과 Rb1의 합을 이용하였다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 최소와 최대 입자크기의 나노캡슐을 제조한 후 포집효율을 측정한 결과, 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min 나노캡슐은 Rg1 7%, Rb1 28%, Rg1 및 Rb1 혼합에서 22%로 확인되었으며, 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max 나노캡슐은 Rg1 6%, Rb1 29%, Rg1 및 Rb1 혼합에서 21%를 나타냈다.

또한, 표 7에 개시된 10종의 홍삼 나노캡슐의 포집효율은 전체적으로 Rg1 5~10%, Rb1 25~30%, Rg1 및 Rb1 혼합에서 20~25%의 포집효율을 나타내는 것으로 확인되어 각 입자들의 포집효율이 비슷한 것으로 나타났다.

홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 최적화

따라서, 상기 실험들을 종합하여, 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐 제조 시에 PGA와 후코이단의 농도변화에 따른 입자크기 변화에 대한 반응표면분석을 실시한 결과, 상기 언급한 조건인 PGA 1.33㎎/㎖과 후코이단 13.81㎍/㎖에서 최소입자크기의 나노캡슐이, PGA 0.63㎎/㎖과 후코이단 80.63㎍/㎖에서 최대입자크기의 나노캡슐이 제조될 것으로 예측되었다. 따라서 이 같은 조건에서 홍삼 함유 나노캡슐을 각각 제조한 후 입자특성을 관측하였다(표 8). 제조된 나노캡슐의 최소와 최대 입자크기는 각각 302±6과 933±35㎚로 측정되었다. 또한 최소 및 최대 입자크기에서의 입도분포는 각각 0.136, 0.084, 제타전위는 각각 21.5, 11.4mV 그리고 산란강도는 각각 245991, 36674와 같다. 따라서 최소 입자크기의 제타전위가 최대 입자크기의 나노캡슐보다 안정된 것으로 확인되었다.

최적화 조건	PGA (㎎/㎖)	후코이단 (㎍/㎖)	Particle size (㎚)
홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	1.33	13.81	302
홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	0.63	80.63	933

<실시예 8. 홍삼 나노캡슐의 혈소판 응집 억제 효과 확인>

나노캡슐화에 따른 혈소판 응집 억제 효과를 측정하기 위해, 실시예 5의 홍삼/키토산/PGA-Min 나노캡슐과 실시예 6의 홍삼/키토산/후코이단-Min 나노캡슐 제조 직후 이들 분산액을 이용하여 혈소판 응집 억제 효과(실시예 3 참조)를 확인하였다.

그러나 측정 결과, 실시예 1-1의 홍삼 추출물(10㎎/㎖의 수용액 분산물, 이후의 나노캡슐 실험에서 동일 농도의 홍삼 추출물 이용)의 혈소판 응집 억제 효과는 85% 인 것에 반해, 이들 홍삼 나노캡슐들의 혈소판 응집 억제 효과는 5% 이내로서, 거의 없는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 혈소판 응집을 억제시킬 수 있는 홍삼 추출물이 캡슐화 과정을 통해 포집(blocking)됨으로써 혈소판 응집 억제활성이 발현되지 못한 것으로 추정된다. 한편, 실시예 7에서 제조된 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min 나노캡슐도 혈소판 응집 억제 효과 결과는 다른 조건의 홍삼 나노캡슐과 그 결과가 비슷하였다.

이에, 본 발명의 홍삼 나노캡슐의 체내 섭취 후 혈소판 응집 억제 효과를 측정하기 위하여 위장환경(simulated gastric fluid, SGF)과 소장환경(simulated intestinal fluid, SIF), 즉, pH 2.0와 7.0으로 나노캡슐 분산액의 pH를 보정한 후 혈소판 응집실험을 수행하였다. 이를 위해 실시예 5 내지 7에서 제조한 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐(홍삼/키토산/후코이단-Min, 홍삼/키토산/후코이단-Max), 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐(홍삼/키토산/PGA-Min, 홍삼/키토산/PGA-Max), 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐(홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min, 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max)의 나노캡슐 분산액을 이용하여 혈소판 응집 억제 효과를 측정하였다.

먼저 위장조건인 pH 2.0으로 보정하였을 때, 실시예 1-1의 홍삼 추출물의 활성을 100%로 기준하여 나노캡슐의 활성을 측정한 결과 표 9에서와 같이 모든 종류의 나노캡슐에서 나노캡슐화하지 않은 홍삼 추출물보다 뛰어난 혈소판 응집 억제 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 산성인 위장조건에서 키토산을 주 피복물질로 한 나노캡슐로부터 내부의 홍삼이 서서히 방출되는데다가, 또한 홍삼의 활성성분인 Rg1의 특성상 산성인 위장조건에서 불안정한 반면, 나노캡슐 내부에 포집되어있던 홍삼 추출물의 Rg1은 상대적으로 캡슐 피복물질들에 의해 산성의 외부환경으로부터 보호되기 때문인 것으로 추정된다.

나노캡슐 종류별로 혈소판 응집 억제 효과를 비교하면, 홍삼/키토산/PGA나 키토산/후코이단 나노캡슐에 비해서 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐이 가장 높은 혈소판 응집 억제 효과를 나타냈다. 또한, 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐의 경우, 캡슐의 입자크기가 작았을 때 더 높은 혈소판 응집 억제 효과를 나타냈다.

조건		위장환경에서의 혈소판 응집 억제 효과(%)
실시예 1-1	홍삼 추출물 (10㎎/㎖ 분산액)	25
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Min	45
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Max	42
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Min	43
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Max	41
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	82
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	80

소장에서의 혈소판 응집 억제 효과를 분석하기 위하여 나노분산액을 먼저 위장조건인 pH 2.0으로 조정하고 2시간 후 다시 소장조건인 pH 7.0으로 조정하여 혈소판 응집 억제 효과를 분석한 바(표 10), 위장조건에서 가장 혈소판 응집 억제 효과가 우수했던 최소 입자크기의 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐이 가장 우수한 혈소판 응집 억제 효과를 나타냈다. 따라서 혈소판 응집 억제 효과의 측면에서는 유사 위장 및 소장조건 모두에서 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐이 가장 효과적인 것으로 판단된다.

조건		소장환경에서의 혈소판 응집 억제 효과(%)
실시예 1-1	홍삼 추출물 (10㎎/㎖ 분산액)	22
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Min	24
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Max	32
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Min	20
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Max	32
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	63
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	56

< 실시예 9. 홍삼 나노캡슐의 세로토닌 분비 억제 효과 확인>

세로토닌(serotonin)은 혈소판이 응집될 때 분비되는 물질로 혈소판 분산액에 홍삼 함유 나노캡슐 분산액을 처리한 뒤 응집시켜 분비되는 세로토닌의 분비량을 측정함으로서 시료가 혈소판 응집에 미치는 영향을 평가하였다.

세로토닌의 분비량을 측정하기 위해 serotonin creatinine sulfate를 희석하여 표준곡선을 작성하였으며, 표준곡선은 serotonin creatinine sulfate를 1N HCl에 용해시킨 뒤 물로 희석하여 0.1~1mM로 제조하고 OPT(o-phthalaldehyde) 용액을 넣어 형광발색을 시킨 뒤 excitation 360㎚, emission 475㎚에서 형광분석을 하였을 때 가장 안정적인 결과값을 나타냈다. 세로토닌 표준곡선은 도 15와 같으며 검량식 [Y = 7,608,453X - 228,083]를 도출하였고 이때의 결정계수(R²)는 0.96으로 혈소판에 의한 세로토닌 분비량 측정에 적합한 것으로 확인되었다.

이를 위해 실시예 5 내지 7에서 제조한 홍삼/키토산/후코이단 나노캡슐(홍삼/키토산/후코이단-Min, 홍삼/키토산/후코이단-Max), 홍삼/키토산/PGA 나노캡슐(홍삼/키토산/PGA-Min, 홍삼/키토산/PGA-Max), 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐(홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min, 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max)의 나노캡슐 분산액을 유사 위장 및 소장 환경에서 세로토닌 분비 억제 효과를 비교하였다.

산성인 위장 조건 pH 2.0에서 나노캡슐화 하지 않은 홍삼 추출물을 처리한 혈소판이 응집될 때 분비된 세로토닌의 양과 비교했을 때(표 11), 먼저 나노캡슐 크기에 따른 경향을 비교해보면 모든 나노캡슐에서 입자크기가 작았을 때 세로토닌 분비가 보다 억제되는 현상이 관측되었다. 또한, 혈소판 응집 억제 효과와 세로토닌 분비 억제 효과 모두 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐이 가장 효과적인 것으로 판단된다.

조건		위장환경에서의 세로토닌 분비율 (μM)
무처리군		1.20
실시예 1-1	홍삼 추출물 (10㎎/㎖ 분산액)	0.98
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Min	0.90
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Max	0.92
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Min	0.80
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Max	0.85
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	0.50
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	0.58

중성인 유사 소장환경에서 홍삼 나노캡슐의 혈행개선능을 측정하기 위해 나노캡슐 분산액을 pH 2.0으로 조정하고 2시간 후 다시 pH 7.0으로 조정하여 혈소판 분산액에 처리한 뒤 세로토닌 분비량을 측정하였다(표 12). 나노캡슐의 크기에 따라서는 위장조건에서의 결과와 마찬가지로 나노캡슐의 입자크기가 작았을 때 세로토닌 분비량이 감소되었으며, 나노캡슐의 종류별로 비교해보면, 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐 처리시에 세로토닌 분비량이 가장 낮았다. 이상과 같이 위장과 소장 조건에서의 세로토닌 분비 억제 효과의 측면에서도 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐이 효과적인 것으로 판단된다.

조건		소장환경에서의 세로토닌 분비율 (μM)
무처리군		1.75
실시예 1-1	홍삼 추출물 (10㎎/㎖ 분산액)	1.30
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Min	1.20
실시예 5	홍삼/키토산/후코이단-Max	1.45
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Min	1.10
실시예 6	홍삼/키토산/PGA-Max	1.02
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	0.50
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	0.55

한편, PGA나 후코이단이 코팅효과 이외에 혈행개선 효과를 나타내는지를 확인하였으나, 상기 캡슐 제조 조건에 사용된 단일 농도에서는 전혀 혈소판 응집 억제효과나 세로토닌 분비 억제 효과가 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 또한, PGA나 후코이단이 홍삼 추출물과 동일한 정도의 혈행개선 효과를 나타나기 위해서는, PGA와 후코이단이 동일 농도의 홍삼추출물보다 매우 효과를 나타내는 것으로 확인되어 동일한 효과를 나타내기 위해서는 17배 농도 이상의 PGA와 후코이단을 첨가해야 하는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 실시예 9 및 10에서와 같은 실시예 7의 홍삼 나노캡슐의 혈행개선 활성은 홍삼 추출물의 코팅 효과에서 기인한 것일 뿐, PGA나 후코이단의 혼합으로 인한 효과가 아님을 예상할 수 있었다.

<실시예 10. 홍삼 나노캡슐의 쓴맛 차폐 효과 확인>

실시예 1-1의 홍삼 추출물(10㎎/㎖ 분산액)과 실시예 7에서 제조한 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐(홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min, 홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max)을 직접 복용하여 홍삼의 쓴맛이 나는지를 확인하였다. 이때의 나노캡슐은 분산액으로 제조한 것을 바로 이용하였다.

10~60대의 남녀노소 50인에게 홍삼 쓴맛이 차폐되는 정도를 5점 타점법(아주좋음:5, 좋음:4, 보통:3, 나쁨:2, 아주나쁨:1)으로 기재하도록 한 바, 표 13처럼 본 발명의 홍삼/키토산/후코이단/PGA 나노캡슐은 홍삼의 쓴맛 성분이 거의 차단되어 복용하기에 용이한 제제임을 알 수 있었다.

조건		쓴맛 차폐 효과
실시예 1-1	홍삼 추출물 분산액	1.9
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Min	4.2
실시예 7	홍삼/키토산/후코이단/PGA-Max	4.3
아주좋음:5, 좋음:4, 보통:3, 나쁨:2, 아주나쁨:1

Claims

홍삼 추출물을, 상기 홍삼 추출물 100 중량부 기준으로 키토산 20~40 중량부, 후코이단 0.01~2.5 중량부 및 폴리글루탐산(poly-γ-glutamic acid, PGA) 6~16 중량부의 혼합코팅물로 피복한 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐.
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제1항에 있어서,
상기 홍삼 나노캡슐은 250~1000㎚의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐.
제1항의 홍삼 나노캡슐을 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항의 홍삼 나노캡슐을 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
(1공정) 키토산 용액에 홍삼 추출물을 분산시킨 후 교반하는 단계; 및,
(2공정) 상기 키토산 및 홍삼 추출물의 혼합물 분산액에 폴리글루탐산(poly-γ-glutamic acid, PGA) 및 후코이단 혼합액을 떨어뜨리는 단계;
를 포함하는 홍삼 추출물을 키토산, 후코이단 및 폴리글루탐산의 혼합코팅물로 피복한 홍삼 나노캡슐을 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 1공정의 홍삼 추출물의 농도는 2~15㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐을 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 1공정의 키토산의 농도는 2~4㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐을 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 2공정의 폴리글루탐산 및 후코이단 혼합액 내의 후코이단의 농도는 0.001~0.25㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐을 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 2공정의 폴리글루탐산 및 후코이단 혼합액 내의 폴리글루탐산의 농도는 0.6~1.6㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 홍삼 나노캡슐을 제조하는 방법.