KR101380444B1 - 페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물의 산부가염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이들 염 또는 결정은, HGFR 저해 작용을 가지며, 우수한 물성(용해성, 안전성 등)을 구비하고 있기 때문에, 여러 가지 종양에 대한 항종양제, 혈관신생 저해제 또는 암전이 억제제로서 유용하다.

Description

페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법{SALT OF PHENOXYPYRIDINE DERIVATIVE OR CRYSTAL THEREOF AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 간세포 증식인자 수용체(Hepatocyte growth factor receptor; 이하, 「HGFR」이라고 약칭함) 저해 작용을 가지며, 항종양제, 암전이 억제제로서 유용한 페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
구체적으로는, N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(하기 화학식 (1); 이하, 「화합물 1」이라 함)의 산부가염 또는 그 결정 및 N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(하기 화학식 (2); 이하, 「화합물 2」라고 함)의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112008077687726-pct00001
췌장암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 신장암, 뇌종양, 난소암 등 여러 가지 종양에 있어서, HGFR의 과잉 발현이 보고되어 있다(비특허 문헌 1). 이들 종양 세포에 발현된 HGFR은 항상적으로 또는 간세포 증식인자(Hepatocyte growth factor; 이하, 「HGF」라고 약칭함)의 자극을 받아 세포내 영역의 티로신 키나아제 자기 인산화를 일으키기 때문에, 암 악성화(이상증식, 침윤 또는 전이능 항진)에 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다.
또한, HGFR은 혈관 내피세포에도 발현되고 있고, HGF가 HGFR을 자극하여 혈관 내피세포의 증식 및 유주(遊走)를 촉진시키기 때문에, 종양 혈관신생에 관여하는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 2).
또한, HGF 길항 펩티드인 NK4가 HGF-HGFR 시그널을 차단함으로써, 암세포의 침윤을 억제하고, 종양 혈관신생을 저해하는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 3, 4).
따라서, HGFR 저해 작용을 갖는 화합물은 항종양제, 혈관신생 저해제 또는 암전이 억제제로서 유용한 것이 기대된다.
그런데, HGFR 저해 작용을 갖는 페녹시피리딘 유도체 및 그 제조 방법이 특허 문헌 1에 개시되어 있지만, 화합물 1 및 화합물 2는 물론, 본 발명에 따른 화합물 1 및 화합물 2의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법은 개시도 시사도 되어 있지 않다.
특허 문헌 1 : 국제 공개 제2005/082855호 팜플렛
비특허 문헌 1 : Oncology Reports, 5, 1013-1024 (1998)
비특허 문헌 2 : Advances in Cancer Research, 67, 257-279 (1995)
비특허 문헌 3 : British Journal of Cancer, 84, 864-873 (2001)
비특허 문헌 4 : Cancer Sci., 94, 321-327 (2003)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은 HGFR 저해 작용을 가지며, 항종양제, 암전이 억제제로서 유용하고, 또한 물성면에서 우수하며, 의약품으로서의 유용성이 높은 페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 하기 <1> 내지 <26>을 제공한다.
<1> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 푸마르산, 호박산, 말산, 말레산 및 타르타르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염.
<2> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 말산염의 결정.
<3> 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 19.0° 및 23.5°에서 회절 피크를 갖는 <2>에 기재한 결정.
<4> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정.
<5> 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 12.2°, 17.7° 및 23.4°에서 회절 피크를 갖는 <4>에 기재한 결정.
<6> 13C 고체 핵자기 공명 스펙트럼에 있어서, 화학 시프트(±0.5 ppm) 175.7 ppm, 166.7 ppm, 154.9 ppm 및 45.7 ppm에서 피크를 갖는 <4>에 기재한 결정.
<7> N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염.
<8> N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염의 결정으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 에탄설폰산 및 벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염의 결정.
<9> N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 메탄설폰산염의 결정.
<10> 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 20.4° 및 21.7°에서 회절 피크를 갖는 <9>에 기재한 결정.
<11> N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 4-메틸벤젠설폰산염의 결정.
<12> 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 7.2°, 17.3° 및 23.6°에서 회절 피크를 갖는 <11>에 기재한 결정.
<13> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매 및 말산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 말산염의 결정의 제조 방법.
<14> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매, 물 및 타르타르산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정의 제조 방법.
<15> N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 물 및 타르타르산을 혼합하여 용액으로 한 후, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매를 첨가하여 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정의 제조 방법.
<16> N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매 및 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군에서 선택되는 산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 산부가염의 결정의 제조 방법.
<17> <2> 내지 <6> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 의약 조성물.
<18> <2> 내지 <6> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 항종양제.
<19> <2> 내지 <6> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 암전이 억제제.
<20> <8> 내지 <12> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 의약 조성물.
<21> <8> 내지 <12> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 항종양제.
<22> <8> 내지 <12> 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 암전이 억제제.
<23> <2> 내지 <6> 중 어느 한 항에 기재한 결정의 약리학적 유효량을 환자에게 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법.
<24> 암에 대한 예방 또는 치료제의 제조를 위한 <2> 내지 <6> 중 어느 한 항에 기재한 결정의 용도.
<25> <8> 내지 <12> 중 어느 한 항에 기재한 결정의 약리학적 유효량을 환자에게 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법;
<26> 암에 대한 예방 또는 치료제의 제조를 위한 <8> 내지 <12> 중 어느 한 항에 기재한 결정의 용도.
발명의 효과
본 발명에 따른 페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정은, 물성면(용해성, 안정성 등)에 있어서 우수한 성질을 가지며, 췌장암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 신장암, 뇌종양 및 난소암 등 여러 가지 종양에 대한 항종양제, 혈관신생 저해제 또는 암전이 억제제로서 유용하다.
도 1은 실시예 1-7(방법 1)에서 얻어진 화합물 1의 말산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1-8(방법 1)에서 얻어진 화합물 1의 타르타르산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 2-1에서 얻어진 화합물 2의 염산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2-2에서 얻어진 화합물 2의 브롬화수소산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 2-3에서 얻어진 화합물 2의 1/2 황산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 2-4(방법 1)에서 얻어진 화합물 2의 메탄설폰산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 2-5에서 얻어진 화합물 2의 에탄설폰산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 2-6에서 얻어진 화합물 2의 벤젠설폰산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 2-7(방법 1)에서 얻어진 화합물 2의 4-메틸벤젠설폰산염의 결정의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 1-7(방법 2)에서 얻어진 화합물 1의 말산염의 비정질의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예 1-8(방법 5)에서 얻어진 화합물 1의 타르타르산염의 비정질의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 12는 실시예 2-4(방법 2)에서 얻어진 화합물 2의 메탄설폰산염의 비정질 의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 2-7(방법 2)에서 얻어진 화합물 2의 4-메틸벤젠설폰산염의 비정질의 분말 X선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 14는 실시예 1-8(방법 4)에서 얻어진 화합물 1의 타르타르산염의 결정의 13C 고체 NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
이하에, 본 발명의 내용에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명의 산부가염은 1) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(화합물 1)의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 푸마르산, 호박산, 말산, 말레산 및 타르타르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염 및 2) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(화합물 2)의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염이다. 또한, 본 발명의 산부가염은 무용매화물이어도 좋고 수화물 등의 용매화물이어도 좋으며, 부가하고 있는 산의 분자수도 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 산부가염에는 하기 본 발명의 결정뿐만 아니라, 화합물 1 의 산부가염의 비정질 및 화합물 2의 산부가염의 비정질도 포함된다.
본 발명의 결정은, 1) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(화합물 1; 이하 동일함)의 말산염의 결정, 2) 화합물 1의 타르타르산염의 결정, 3) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(화합물 2; 이하 동일함)의 염산염의 결정, 4) 화합물 2의 브롬화수소산염의 결정, 5) 화합물 2의 1/2 황산염의 결정, 6) 화합물 2의 메탄설폰염의 결정, 7) 화합물 2의 에탄설폰산염의 결정, 8) 화합물 2의 벤젠설폰산염의 결정 및 9) 화합물 2의 4-메틸벤젠설폰산염의 결정이다. 또한, 화합물 1의 말산염의 결정에는 화합물 1의 D-말산염의 결정 및 L-말산염의 결정이 포함되고, 화합물 1의 타르타르산염의 결정에는 화합물 1의 D-타르타르산염의 결정 및 L-타르타르산염의 결정이 포함된다.
화합물 1의 말산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 19.0° 및 23.5°에서 회절 피크를 가지며, 바람직하게는, 10.8°, 12.3°, 14.3°, 17.7°, 19.0°, 19.7°, 21.7°, 22.0°, 23.5° 및 24.7°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 1의 타르타르산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 12.2°, 17.7° 및 23.4°에서 회절 피크를 가지며, 바람직하게는, 10.7°, 12.2°, 14.3°, 17.7°, 19.0°, 19.6°, 21.4°, 22.1°, 23.4° 및 24.8° 에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 염산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 7.4°, 10.3°, 12.0°, 13.9°, 15.0°, 16.5°, 24.7°, 25.1°, 25.9° 및 26.6°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 브롬화수소산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 8.3°, 10.4°, 12.2°, 14.0°, 16.2°, 17.7°, 19.5°, 20.4°, 25.3° 및 28.0°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 1/2 황산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 6.5°, 6.9°, 9.3°, 16.0°, 18.7°, 19.5°, 22.0°, 22.9°, 23.9° 및 26.7°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 메탄설폰산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 20.4° 및 21.7°에 회절 피크를 가지며, 바람직하게는, 7.9°, 9.9°, 13.9°, 17.7°, 19.1°, 20.4°, 21.7°, 22.4°, 23.3° 및 25.8°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 에탄설폰산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 6.7°, 10.1°, 12.7°, 13.7°, 16.9°, 18.5°, 19.4°, 21.5°, 22.1° 및 23.4°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 벤젠설폰산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 7.8°, 8.3°, 8.8°, 13.7°, 17.4°, 18.5°, 19.7°, 20.8°, 24.3° 및 24.6°에서 회절 피크를 갖는다.
화합물 2의 4-메틸벤젠설폰산염의 결정은, 분말 X선 회절에 있어서 회절 각도(2θ±0.2°) 7.2°, 17.3° 및 23.6°에서 회절 피크를 가지며, 바람직하게는, 7.2°, 13.4°, 17.3°, 18.8°, 19.3°, 20.6°, 21.1°, 23.6°, 24.6° 및 26.1°에서 회절 피크를 갖는다.
일반적으로, 분말 X선 회절에 있어서의 회절 각도(2θ)는 ±0.2°의 범위 내에서 오차가 생길 수 있기 때문에, 상기 회절 각도의 값은 ±0.2° 정도의 범위 내의 수치도 포함하는 것으로서 이해될 필요가 있다. 따라서, 분말 X선 회절에 있어서의 회절 각도가 완전히 일치하는 결정뿐만 아니라, 회절 각도가 ± 0.2°인 오차 범위 내에서 일치하는 결정도 본 발명에 포함된다.
화합물 1의 타르타르산염의 결정은, 13C 고체 핵자기 공명 스펙트럼(이하, 13C 고체 NMR 스펙트럼) 측정에 있어서, 화학 시프트(±0.5 ppm) 175.7 ppm, 166.7 ppm, 154.9 ppm 및 45.7 ppm에서 피크를 갖는다.
일반적으로, 13C 고체 NMR 스펙트럼에 있어서의 화학 시프트(ppm)는 어느 정도의 오차가 생길 수 있기 때문에, 13C 고체 NMR 스펙트럼에 있어서의 피크(화학 시프트)가 완전히 일치하는 결정뿐만 아니라, 통상의 측정 조건 또는 본 명세서와 실질적으로 동일한 조건으로 13C 고체 NMR 스펙트럼 측정을 행하여, 화학 시프트가 실질적으로 동등한 피크를 갖는 결정도 의미하지만, 구체적으로는 ±0.5 ppm 정도의 범위 내의 수치도 포함하는 것으로서 이해된다. 구체적으로는 예컨대, 13C 고체 NMR 스펙트럼에 있어서의 피크(화학 시프트)가 완전히 일치하는 결정뿐만 아니라, 피크(화학 시프트)가 ±0.5 ppm 정도의 오차로 일치하는 결정도 본 발명에 포함된다.
[일반 제조 방법]
본 발명에 따른 화합물 1 및 화합물 2의 염의 결정의 제조 방법을 이하에 상세히 설명한다.
1. 화합물 1의 말산염의 결정의 제조 방법
화합물 1, 용매 및 말산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 말산염의 결정을 제조할 수 있다.
보다 상세하게는, 예컨대, 화합물 1 및 용매를 실온에서 혼합하고, 실온 또는 가열 조건 하에서 말산을 첨가하여 용액으로 한 후, 이 용액을 4℃ 부근∼실온까지 서냉하여 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 말산염의 결정을 제조할 수 있다. 또한, 서냉시에 용액을 교반하는 것이 바람직하다.
용매로서는 예컨대 아세톤 등의 케톤류, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등의 알코올류를 이용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올이다.
용매량은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 화합물 1의 5∼30 배량 이용한다.
말산의 양은 화합물 1에 대하여 1.0 당량∼1.5 당량 이용할 수 있다.
가열 온도는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 40℃∼60℃이다.
가열 온도∼실온(내지 4℃ 부근)까지의 서냉은 5분∼24시간으로 행할 수 있다.
2. 화합물 1의 타르타르산염의 결정의 제조 방법
화합물 1, 용매 및 타르타르산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 타르타르산염의 결정을 제조할 수 있다.
보다 상세하게는, 예컨대, 1) 화합물 1 및 용매를 실온에서 혼합하고, 실온 또는 가열 조건 하에서 물 및 타르타르산을 첨가하여 용액으로 한 후, 이 용액을 4℃ 부근∼실온까지 서냉하여 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 타르타르산염의 결정을 제조할 수 있다. 또한, 서냉시에 용액을 교반하는 것이 바람직하다. 또는, 2) 화합물 1 및 물을 실온에서 혼합하고, 실온에서 타르타르산을 첨가하여 수용액으로 한 후, 이 수용액에 교반 하에서 용매를 첨가하여 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 타르타르산염의 결정을 제조할 수 있다. 또는, 3) 타르타르산 수용액에 화합물 1의 용액을 첨가하고, 이 용액에 교반 하에서 용매를 첨가하여 결정을 석출시킴으로써 화합물 1의 타르타르산염의 결정을 제조할 수 있다.
용매로서는 예컨대 아세톤 등의 케톤류, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등의 알코올류를 이용할 수 있고, 바람직하게는 아세톤, 에탄올이다.
용매량은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 화합물 1의 5∼30 배량 이용한다.
타르타르산의 양은 화합물 1에 대하여 1.0 당량∼1.5 당량 이용할 수 있다.
가열 온도는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 40℃∼60℃이다.
가열 온도로부터 실온(내지 4℃ 부근)까지의 서냉은 5분∼24시간으로 행할 수 있다.
3. 화합물 2의 산부가염의 결정의 제조 방법
화합물 2, 용매 및 산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시킴으로써 화합물 2의 산부가염의 결정을 제조할 수 있다.
보다 상세하게는, 예컨대, 화합물 2 및 용매를 실온에서 혼합하고, 실온 또는 가열 조건 하에서 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산을 첨가하여 용액으로 한 후, 이 용액을 4℃ 부근∼실온까지 서냉하여 결정을 석출시킴으로써 화합물 2의 산부가염의 결정을 제조할 수 있다. 또한, 서냉시에 용액을 교반하는 것이 바람직하다.
용매로서는 예컨대 아세톤 등의 케톤류, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등의 알코올류를 이용할 수 있고, 바람직하게는 에탄올이다. 또한, 경우에 의해, 용매에 물을 첨가하여 이용하여도 좋다.
용매량은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 화합물 2의 10∼20배량 이용한다.
산의 양은 화합물 2에 대하여 1.0 당량∼1.5 당량 이용할 수 있다.
가열 온도는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 40℃∼60℃이다.
가열 온도∼실온(내지 4℃ 부근)까지의 서냉은 5분∼24시간으로 행할 수 있다.
본 발명의 결정을 의약으로서 사용하는 경우, 통상, 본 발명의 결정과 적당한 첨가제를 혼화하고, 제제화한 것을 사용한다. 단, 상기는, 본 발명의 결정을 원체(原體)의 상태로 의약으로서 사용하는 것을 부정하는 것은 아니다.
상기 첨가제로서는 일반적으로 의약에 사용되는 부형제, 결합제, 활택제, 붕괴제, 착색제, 교미 교취제, 유화제, 계면활성제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 흡수촉진제 등을 들 수 있고, 소망에 따라, 이들을 적절하게 조합하여 사용할 수도 있다.
상기 부형제로서는 예컨대 젖당, 백당, 포도당, 콘스타치, 만니톨, 소르비톨, 전분, α화 전분, 덱스트린, 결정 셀룰로오스, 경질 무수규산, 규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산알루민산마그네슘, 인산수소칼슘 등을 들 수 있고,
상기 결합제로서는 예컨대 폴리비닐알코올, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스, 젤라틴, 셸락, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골 등을 들 수 있으며,
상기 활택제로서는 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 푸마르산스테아릴나트륨, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 콜로이드실리카 등을 들 수 있고,
상기 붕괴제로서는 예컨대 결정 셀룰로오스, 한천, 젤라틴, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 시트르산칼슘, 덱스트린, 펙틴, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 크로스카르멜로스나트륨, 카르복시메틸스타치, 카르복시메틸스타치나트륨 등을 들 수 있다.
상기 착색제로서는 예컨대 삼이산화철, 황색 삼이산화철, 카르민, 카라멜, β-카로틴, 산화티탄, 탈크, 인산리보플라빈나트륨, 황색 알루미늄레이크 등의 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것을 들 수 있고,
상기 교미 교취제로서는 코코아 분말, 박하뇌, 방향산(芳香散), 박하유, 용뇌, 계피 분말 등을 들 수 있으며,
상기 유화제 또는 계면활성제로서는 예컨대 스테아릴트리에탄올아민, 라우릴황산나트륨, 라우릴아미노프로피온산, 레시틴, 모노스테아르산글리세린, 자당 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르 등을 들 수 있고,
상기 용해 보조제로서는 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 안식향산벤질, 에탄올, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨, 폴리솔베이트 80, 니코틴산아미드 등을 들 수 있으며,
상기 현탁화제로서는 상기 계면활성제 이외에 예컨대 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 친수성 고분자를 들 수 있고,
상기 등장화제로서는 예컨대 포도당, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있으며,
상기 완충제로서는 예컨대 인산염, 아세트산염, 탄산염, 시트르산염 등의 완충액을 들 수 있고,
상기 방부제로서는 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로부탄올, 벤질알코올, 페네틸알코올, 디히드로아세트산산, 소르빈산 등을 들 수 있으며,
상기 항산화제로서는 예컨대 아황산염, 아스코르빈산, α-토코페롤 등을 들 수 있다.
또한, 상기 제제로서는 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제와 같은 경구제; 좌제, 연고제, 안연고제, 테이프제, 점안제, 점비제, 점이제, 파프제, 로션제와 같은 외용제 또는 주사제를 들 수 있다.
상기 경구제는 상기 첨가제를 적절하게 조합하여 제제화한다. 또한, 필요에 따 이들의 표면을 코팅하여도 좋다.
상기 외용제는 상기 첨가제 중, 특히 부형제, 결합제, 교미 교취제, 유화제, 계면활성제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 흡수촉진제를 적절하게 조합하여 제제화한다.
상기 주사제는 상기 첨가제 중, 특히 유화제, 계면활성제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 흡수촉진제를 적절하게 조합하여 제제화한다.
본 발명의 결정을 의약으로서 사용하는 경우, 그 사용량은 증상이나 연령에 따라 다르지만, 통상, 경구제의 경우에는, 0.1 ㎎ 내지 10 g(바람직하게는 1 ㎎ 내지 2 g), 외용제의 경우에는, 0.01 ㎎ 내지 10 g(바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 2 g), 주사제의 경우에는, 0.01 ㎎ 내지 10 g(바람직하게는 0.1 ㎎ 내지 2 g)을 1일에 1회 또는 2 내지 4회에 나누어 사용한다.
본 발명의 결정은, 항종양제, 혈관신생 저해제 또는 암전이 억제제로서 유용하다.
또한, 본 발명의 결정을 항종양제로서 이용하는 경우, 종양으로서, 예컨대 췌장암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 신장암, 뇌종양 또는 난소암을 들 수 있고, 특히 위암이 바람직하다.
실시예
본 발명에 따른 화합물의 염 또는 그 결정은, 예컨대 이하의 제조예, 실시예에 기재한 방법에 의해 제조할 수 있다. 단, 이들은 예시적인 것으로서, 본 발명의 화합물은 어떠한 경우도 이하의 구체예로 제한되는 것은 아니다.
제조예 중, 특별히 기재가 없는 경우에는, 정제용 실리카겔로서 YMC SIL-60-400/230W를 이용하였다.
(제조예 1-1) 에틸 4-클로로피리딘-2-카르복실레이트
4-클로로피리딘-2-카르복실산(39.4 g)과 염화티오닐(64 ㎖)의 혼합물을 질소 분위기 하의 100℃에서 6시간 가열 교반하였다. 반응액을 실온까지 냉각시켰다. 이것을 감압 농축시켜 톨루엔으로 공비(共沸)하였다. 빙냉 교반하고 있는 에탄올에 이 잔류물을 조금씩 첨가하였다. 반응액을 실온에서 25시간 30분 교반하였다. 반응액을 감압 농축시켰다. 잔류물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 이것을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조시킨 후의 유기층을 감압 농축시켜 갈색 유상물로서 표제 화합물(38.8 g, 83.6%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 1.46(3H, t, J=7.2Hz), 4.50(2H, q, J=7.2Hz), 7.49(1H, dd, J=2.0, 5.2Hz), 8.15(1H, d, J=2.0Hz), 8.67(1H, d, J=5.2Hz).
(제조예 1-2) 에틸 4-(3-플루오로-4-니트로페녹시)피리딘-2-카르복실레이트에틸
4-클로로피리딘-2-카르복실레이트(19.4 g)에 3-플루오로-4-니트로페놀(24.7 g), 클로로벤젠(7.0 ㎖)을 첨가하고, 이것을 질소 분위기 하의 120℃에서 4시간 가열 교반하였다. 반응액을 실온까지 냉각시켰다. 여기에 아세트산에틸(400 ㎖), 포화 탄산나트륨 수용액(400 ㎖)을 첨가하고, 이것을 실온에서 27시간 교반하였다. 교반을 멈추고, 수층을 분리하였다. 유기층에 다시 포화 탄산나트륨 수용액을 첨가하고, 이것을 실온에서 2일간 교반하였다. 교반을 멈추고, 수층을 분리하였다. 수층을 아세트산에틸(300 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 이것을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 이것을 감압 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출액; 헵탄:아세트산에틸=2:1∼1:1∼아세트산에틸)로 정제하였다. 목적물 분획을 농축시켜 갈색 유상물로서 표제 화합물(12.9 g, 40.2%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 1.45(3H, t, J=7.2Hz), 4.49(2H, q, J=7.2Hz), 6.97-7.01(2H, m), 7.16(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 7.79(1H, d, J=2.4Hz), 8.20(1H, m), 8.76(1H, d, J=5.6Hz).
ESI-MS(m/z): 329[M+Na]+.
(제조예 1-3) 4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-카르복실산
에틸 4-(3-플루오로-4-니트로페녹시)피리딘-2-카르복실레이트(8.56 g)의 에탄올(150 ㎖) 용액에 20% 수산화팔라듐탄소(1.0 g)를 넣고, 수소 분위기 하의 실온에서 반응액을 9시간 30분 교반하였다. 촉매를 여과 분별하였다. 여액에 4N 염산-아세트산에틸 용액(14 ㎖)을 첨가하고, 이것을 농축시켰다. 건고(乾固)시키기 전에 농축을 멈추었다. 이것에 물(75 ㎖), 아세톤(150 ㎖), 탄산수소나트륨(11.8 g)을 첨가하였다. 이것을 빙냉 하에서 교반하고, 벤질옥시카르보닐염화물(6.00 ㎖)을 첨가하였다. 반응액을 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축시켰다. 잔류물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이것을 감압 농축시키고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용출액; 헵탄:아세트산에틸=1:1∼1:2∼아세트산에틸)로 정제하였다. 목적물 분획을 감압 농축시켰다. 얻어진 고체에 헥산을 첨가하여 고체를 현탁시켰다. 잠시 정치시킨 후, 상청을 피펫으로 제거하였다. 이 잔류물을 건조시켜 담황색 고체로서 에틸 4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-카르복실레이트(7.51 g, 65.4%)를 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 1.43(3H, m), 4.45-4.52(2H, m), 5.24(2H, s), 6.87-6.92(2H, m), 6.99(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 7.35-7.45(6H, m), 7.65(1H, d, J=2.4Hz), 8.19(1H, m), 8.60(1H, d, J=5.6Hz).
에틸 4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페닐)피리딘-2-카르복실레이트(7.95 g)를 에탄올(120 ㎖)에 용해시키고, 물(25 ㎖)을 첨가하였다. 실온 교반 하에서 여기에 수산화리튬(783 ㎎)을 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 1N 염산(60 ㎖)을 첨가한 후, 감압 하에 농축시켰다. 농축시킨 후, 반응액 속에 석출된 결정을 여과하여 취하고, 물로 세정하였다. 결정을 아세트산에틸-테트라히드로푸란에 용해하고, 이것을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조시킨 후의 용액을 감압 농축시켰다. 얻어진 결정을 헥산에 현탁시키고, 이것을 여과하여 취하였다. 이 결정을 건조시켜 담황색 결정으로서 목적물(5.04 g, 72.0%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 5.18(2H, s),7.08(1H, m), 7.23(1H, m), 7.24-7.46(8 H, m), 7.75(1H, m), 8.59(1H, d, J=5.6Hz), 9.59(1H, s).
(제조예 1-4) tert-부틸[4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-일]카르밤산염
4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-카르복실산(5.04 g)의 tert-부탄올(50 ㎖) 현탁액에 실온에서 트리에틸아민(4.6 ㎖)을 첨가하여 교반하였다. 여기에 실온에서 디페닐포스포릴아지드(3.13 ㎖)를 첨가하여 질소 분위기 하의 실온에서 30분간 교반하였다. 그 후, 90℃에서 30분, 100℃에서 4시간 가열 교반하였다. 반응액을 실온까지 냉각시켰다. 여기에, 아세트산에틸(25 ㎖)을 첨가하여 빙냉 하에 반응액을 30분간 교반하였다. 석출된 결정을 여과하여 취하고, 이것을 디에틸에테르로 세정하였다. 이것을 실온에서 1시간 통기 건조시켜 무색 결 정으로서 표제 화합물(3.92 g, 65.5%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.42(9H, s), 5.17(2H, s), 6.62(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 7.01(1H, dd, J=2.2, 8.8Hz), 7.21(1H, dd, J=2.2, 11.2Hz), 7.35-7.42(6H, m), 7.70(1H, m), 8.14(1H, d, J=5.6Hz), 9.53(1H, s), 9.83(1H, s).
(제조예 1-5) 벤질[4-(2-아미노피리딘-4-일옥시)-2-플루오로페닐]카르밤산염
4N 염산-아세트산에틸 용액(120 ㎖) 빙욕 상에서 냉각시켰다. 여기에 교반 하에 tert-부틸[4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-일]카르밤산염(3.92 g)을 첨가하여 빙욕 상에서 10분간 교반하였다. 그 후, 반응액을 실온에서 3시간 30분 교반하였다. 반응액을 감압 농축시켰다. 여기에 아세트산에틸(150 ㎖), 포화 탄산수소나트륨 수용액(70 ㎖)을 첨가하여 분배하였다. 수층을 아세트산에틸(50 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조시킨 후의 유기층을 감압 농축시켰다. 얻어진 결정을 헥산-아세트산에틸 혼합 용매(5:1)에 현탁시켰다. 결정을 여과하여 취하고, 헥산-아세트산에틸 혼합 용매(5:1)로 세정하였다. 이것을 실온에서 흡인 건조시켜 담황색 결정으로서 표제 화합물(2.93 g, 95.9%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 4.49(2H, m), 5.23(2H, s), 5.95(1H, d, J=2.0Hz), 6.26(1H, dd, J=2.0, 6.0Hz), 6.84-6.90(2H, m), 7.00(1H, m), 7.34- 7.42(5H, m), 7.94(1H, d, J=6.0Hz), 8.10(1H, m).
ESI-MS(m/z): 354[M+H]+.
(제조예 1-6) 페닐 N-[4-(3-플루오로-4-{[1-(4-플루오로페닐카르바모일)시클로프로판카르보닐]아미노}페녹시)피리딘-2-일]-N-페녹시카르보닐카르밤산염
벤질 [4-(2-아미노피리딘-4-일옥시)-2-플루오로페닐]카르밤산염(1.25 g)의 테트라히드로푸란(100 ㎖) 용액에 트리에틸아민(1.48 ㎖), 페닐 클로로포르메이트(1.11 ㎖)를 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸, 1N 수산화나트륨 수용액에 분배하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증류 제거하고, 갈색 유상물로서 페닐 N-[4-(4-벤질옥시카르보닐아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-일]-N-페녹시카르보닐카르밤산염의 조체를 얻었다. (ESI-MS(m/z): 616[M+Na]+). 이것을 테트라히드로푸란(200 ㎖)에 용해시키고, 20% 수산화팔라듐(497 ㎎)을 첨가하여 수소 분위기 하의 실온에서 4시간 교반하였다. 촉매를 여과 분별하였다. 이것을 테트라히드로푸란으로 세정하였다. 여액을 20 ㎖가 될 때까지 농축시키고, 페닐 N-[4-(4-아미노-3-플루오로페녹시)피리딘-2-일]-N-페녹시카르보닐카르밤산염(ESI-MS(m/z): 482[M+Na]+, 941[2M+Na]+)의 테트라히드로푸란 용액을 얻었다. 이것을 N,N-디메틸포름아미드(50 ㎖)에 용해시켰다. 여기에 1-(4-플루오로페닐카르바모일)시클로프로판카르복실산(1.58 g), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포 스페이트(3.13 g), 트리에틸아민(0.987 ㎖)을 첨가하여 실온에서 13시간 30분 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸, 포화 식염수에 분배하였다. 유기층을 1N 수산화나트륨 수용액, 포화 식염수로 순차 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 이것을 농축시키고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헵탄:아세트산에틸=3:2∼1:1∼1:2)로 정제하여 무색 포상물(泡狀物)로서 표제 화합물(940 ㎎, 40.0%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 1.68-1.76(4H, m), 6.90(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 6.95(1H, m), 6.98(1H, m), 7.03-7.07(3H, m), 7.18(4H, d, J=8.4Hz), 7.25(2H, m), 7.38(4H, m), 7.48(2H, m), 8.27(1H, m), 8.46(1H, d, J=5.6Hz), 8.75(1H, s), 9.40(1H, s).
ESI-MS(m/z): 687[M+Na]+.
(제조예 1) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(화합물 1)
페닐 N-[4-(3-플루오로-4-{[1-(4-플루오로페닐카르바모일)시클로프로판카르보닐]아미노}페녹시)피리딘-2-일]-N-페녹시카르보닐카르밤산염(50.0 ㎎)의 N,N-디메틸포름아미드(2.0 ㎖) 용액에 1-메틸-4-(피페리딘-4-일)피페라진(68.7 ㎎)을 첨가하여 실온에서 12시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸과 1N 수산화나트륨 수용액에 분배하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 시켰다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(FUJI SILYSIA NH, 아세트산에틸∼아세트산에틸:메탄올=20:1∼10:1)로 정제하였다. 목적물 분획을 농축시켰다. 잔류물에 디에틸에테르:헥산=1:3을 첨가하여 석출된 침전을 여과하여 취하였다. 이것을 헥산으로 세정, 통기 건조시켜 백색 분말로서 표제 화합물(34.6 ㎎, 72.8%)을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (CDCl3)δ(ppm): 1.44(2H, m), 1.68(2H, m), 1.75(2H, m), 1.90(2H, m), 2.32(3H, s), 2.39-2.71(9H, m), 2.90(2H, m), 4.11(2H, m), 6.55(1H, dd, J=2.0, 5.6Hz), 6.92(2H, m), 7.04(2H, m), 7.26(1H, CDCl3로 커버됨), 7.50(2H, dd, J=4.8, 9.2Hz), 7.62(1H, d, J=2.0Hz), 8.06(1H, d, J=5.6Hz), 8.20(1H, m), 8.84(1H, s), 9.20(1H, s).
ESI-MS(m/z): 634[M+H]+, 656[M+Na]+.
(실시예 1-1) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 염산염
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(63.4 ㎎)를 아세톤(0.634 ㎖)에 현탁시키고, 실온에서 5N 염산(0.020 ㎖), 물(0.0117 ㎖)을 첨가하여 용액으로 하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 석 출물을 여과하여 취하고, 아세톤(0.317 ㎖, 2회)으로 세정하였다. 실온에서 30분간 통기 건조시키고, 60℃에서 1일 온풍 건조시킴으로써 표제 화합물(43.3 ㎎)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.40-1.80(6H, m), 2.00-3.80(16H, m), 4.20-4.40(2H, m), 6.93(1H, m), 7.12(1H, m), 7.18(2H, m), 7.25(1H, m), 7.37(1H, m), 7.59-7.63(2H, m), 8.04(1H, m), 8.13(1H, d, J=6.4Hz), 9.24(1H, s), 9.91(1H, brs), 10.76(1H, brs).
(실시예 1-2) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 브롬화수소산염
(방법 1)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(55.7 ㎎)를 아세톤(0.557 ㎖)에 현탁시키고, 실온에서 48% 브롬화수소산수(0.010 ㎖), 물(0.0178 ㎖)을 첨가하여 용액으로 하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 아세톤(0.557 ㎖, 2회)으로 세정하였다. 실온에서 30분간 통기 건조시키고, 60℃에서 2일 온풍 건조시킴으로써 표제 화합물(62.9 ㎎)을 백색 분말로서 얻었다.
(방법 2)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(55.7 ㎎)를 물(1.67 ㎖)에 현탁시키고, 실온에서 48% 브롬화수소산수(0.010 ㎖)를 첨가하여 수용액으로 하였다. 드라이아이스/에탄올욕을 이용하여 수용액을 동결시킨 후, 감압 하에서 27시간 동결 건조시킴으로써, 표제 화합물(70.7 ㎎)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.40-1.80(6H, m), 2.00-3.80(16H, m), 4.10-4.30(2H, m), 7.02(1H, m), 7.07(1H, m), 7.10-7.20(4H, m), 7.40(1H, m), 7.58-7.62(2H, m), 8.08(1H, m), 8.26(1H, d, J=6.4Hz), 9.86(1H, s), 10.81(1H, brs).
(실시예 1-3) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 황산염
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(31.7 ㎎)를 에탄올(0.317 ㎖)-물(0.0058 ㎖)에 현탁시키고, 실온에서 2.5M 황산(0.010 ㎖)을 첨가하여 용액으로 하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.158 ㎖, 2회)로 세정하였다. 실온에서 30분간 통기 건조시키고, 60℃에서 1일 온풍 건조시킴으로써 표제 화합물(26.5 ㎎)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.35(2H, m), 1.50-1.70(4H, m), 1.82(2H, m), 2.20-4.00(14H, m), 4.15(2H, m), 6.73(1H, m), 7.00-7.30(6H, m), 7.59-7.63(2H, m), 7.98(1H, m), 8.17(1H, m), 9.92(1H, s), 10.65(1H, brs).
(실시예 1-4) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 푸마르산염
Figure 112008077687726-pct00002
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(65.3 ㎎)를 2-프로판올(0.653 ㎖)에 현탁시키고, 여기에 푸마르산(6.0 ㎎)을 첨가하였다. 이 현탁액에 초음파 분해를 건 후, 이것을 50℃에서 5분간 교반하였다. 여기에, 물(0.0327 ㎖)을 첨가하여 같은 온도에서 교반하였다. 여기에 2-프로판올(0.653 ㎖), 물(0.0327 ㎖)을 첨가하여 같은 온도에서 교반하였다. 여기에 푸마르산(6.0 ㎎)을 첨가하여 같은 온도에서 교반하여 용액으로 한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 질소 분위기 하에 석출물을 여과하여 취하였다. 이것을 2시간 통기 건조시켜 표제 화합물(26.0 mg, 34%)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.28(2H, m), 1.58(4H, m), 1.73(2H, m), 2.25(3H, s), 2.26-2.63(9H, m), 2.74(2H, m), 4.10(2H, m), 6.59(2H, s), 6.60(1H, m), 7.01(1H, m), 7.17(2H, m), 7.23(1H, m), 7.40(1H, d, J=2.0Hz), 7.59-7.63(2H, m), 7.93(1H, m), 8.13(1H, d, J=5.6Hz), 9.23(1H, s), 9.97(1H, m), 10.55(1H, m).
(실시예 1-5) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 호박산염
Figure 112008077687726-pct00003
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(31.7 ㎎)를 에탄올(0.317 ㎖)에 현탁시키고, 실온에서 호박산(5.7 ㎎)을 첨가하여 실온에서 3일간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.158 ㎖)로 세정하였다. 실온에서 30분간 통기 건조시키고, 60℃에서 4시간 온풍 건조시킴으로써 표제 화합물(12.0 ㎎, 32%)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.27(2H, m), 1.50-1.70(4H, m), 1.72(2H, m), 2.20(4H, s), 2.30-2.80(14H, m), 4.10(2H, m), 6.61(1H, m), 7.01(1H, m), 7.14-7.25(3H, m), 7.39(1H, m), 7.59-7.64(2H, m), 7.93(1H, m), 8.13(1H, d, J=5.6Hz), 9.22(1H, s), 9.96(1H, m), 10.53(1H, s).
(실시예 1-6) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 말레산염
Figure 112008077687726-pct00004
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(65.3 ㎎)를 아세톤(1.306 ㎖)에 현탁시키고, 여기에 말레산(12.0 ㎎)을 첨가하였다. 이 현탁액에 초음파 분해를 건 후, 이것을 50℃에서 5분간 교반하여 용액으로 하였다. 이 용액을 실온으로 16시간 교반하여, 4℃로 4일간 교반하였다. 질소 기류 하에 석출물을 여과하여 취하였다. 이것을 아세톤(0.020 ㎖)으로 세정한 후, 실온에서 2시간 통기 건조시켜 표제 화합물(15.1 ㎎, 20%)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.30(2H, m), 1.69(4H, m), 1.74(2H, m), 2.14-3.50(14H, m), 4.34(2H, m), 6.04(2H, s), 6.62(1H, d, J=5.6Hz), 7.01(1H, m), 7.17(2H, m), 7.23(1H, m), 7.40(1H, s), 7.61(2H, m), 7.94(1H, m), 8.14(1H, d, J=5.6Hz), 9.28(1H, brs), 9.94(1H, m), 10.58(1H, m).
(실시예 1-7) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 (2S)-말산염
Figure 112008077687726-pct00005
(방법 1)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(31.4 ㎎)를 에탄올(0.317 ㎖)에 현탁시켰다. 이 현탁액에 실온에서 (2S)-말산(5.7 ㎎)을 첨가하고, 50℃에서 교반하여 용액으로 하였다. 반응액을 실온으로 되돌려 18시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.158 ㎖, 2회)로 세정하였다. 실온에서 30분간 통기 건조시키고, 60℃에서 1일 온풍 건조시킴으로써, 표제 화합물(26.0 ㎎, 68%)을 백색 결정으로서 얻었다.
(방법 2)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아 미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 (2S)-말산염의 결정(36.9 ㎎)을 물(0.740 ㎖)에 용해시켰다. 드라이아이스/에탄올욕을 이용하여 수용액을 동결시킨 후, 감압 하에서 67시간 동결 건조시킴으로써, 표제 화합물(34.2 ㎎, 93%)을 백색 비정질로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.29(2H, m), 1.50-1.70(4H, m), 1.74(2H, m), 2.20-2.80(16H, m), 4.03(1H, m), 4.12(2H, m), 6.61(1H, dd, J=2.4, 6.0Hz), 7.01(1H, m), 7.17(2H, m), 7.23(1H, m), 7.40(1H, d, J=2.4Hz), 7.59-7.63(2H, m), 7.93(1H, m), 8.13(1H, d, J=6.0Hz), 9.24(1H, s), 9.95(1H, m), 10.55(1H, s).
(실시예 1-8) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(2R,3R)-타르타르산염
Figure 112008077687726-pct00006
(방법 1)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아 미드(63.4 ㎎)를 아세톤(1.268 ㎖)에 현탁시키고, 이 현탁액에 물(0.1268 ㎖), L-(+)-타르타르산(15 ㎎)을 첨가하였다. 이것을 40℃에서 5분간 교반하여 용액으로 하고, 이 용액을 실온에서 23시간 30분 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 아세톤(1.0 ㎖)으로 세정하였다. 이것을 실온에서 6시간 30분 건조시켜 표제 화합물(69.1 ㎎, 88%)을 무색 결정으로서 얻었다.
(방법 2)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(634 ㎎)를 에탄올(11.7 ㎖)에 현탁시키고, 이 현탁액에 1M L-(+)-타르타르산 에탄올 용액(1.0 ㎖)을 첨가하였다. 이것을 50℃로 가열하고, 물(1.27 ㎖)을 첨가하여 50℃에서 10분간 교반하여 용액으로 하였다. 이 용액을 실온까지 서냉하면서 16시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(2.0 ㎖)로 세정하였다. 이것을 실온에서 통기 건조시켜 표제 화합물(550 ㎎, 70%)을 무색 결정으로서 얻었다.
(방법 3)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(600 ㎎)와 L-(+)-타르타르산(142 ㎎)의 혼합물에 물(1.20 ㎖)을 투입하여 교반하였다. 용해 확인 후, 아세톤(3.6 ㎖)을 투입하였다. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페 닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(2R,3R)-타르타르산염의 종결정을 첨가하여 1시간 30분 교반한 후에, 아세톤(2.4 ㎖)을 더 투입하였다. 실온에서 13시간 28분 교반한 후에, 아세톤(2.4 ㎖)을 투입하여 1시간 30분 더 교반한 후에, 아세톤(2.4 ㎖)을 투입하여 5시간 32분 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 아세톤과 물의 혼합 용매(9:1, 2 ㎖)로 세정하였다. 이것을 실온에서 통기 건조시켜 표제 화합물(673 ㎎, 90%)을 무색 결정으로서 얻었다.
(방법 4)
L-(+)-타르타르산(472 ㎎)에 물(2.4 ㎖)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 이 용액에 아세톤(8 ㎖)을 첨가한 후, N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(2 g)를 첨가하여 실온에서 교반하여 용해시켰다. 이 용액에 물(0.5 ㎖), 아세톤(1.5 ㎖)을 첨가하고, 아세톤(8 ㎖)을 더 첨가한 후, N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(2R,3R)-타르타르산염의 종결정(2 ㎎)을 첨가하여 실온에서 19시간 교반하였다. 아세톤(14 ㎖)을 첨가하여 실온에서 2시간 교반한 후에, 결정을 여과하여 건조시킴으로써, 표제 화합물(2.22 g)을 무색 결정으로서 얻었다.
(방법 5)
N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아 미드(2R,3R)-타르타르산염의 결정(50 ㎎)을 물(2.5 ㎖)에 용해시켰다. 드라이아이스/에탄올욕을 이용하여 수용액을 동결시킨 후, 30시간 감압 하에서 동결 건조시킴으로써, 표제 화합물(44.2 ㎎, 88%)의 백색 비정질을 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.29(2H, m), 1.68(4H, m), 1.74(2H, m), 2.35(3H, s), 2.40-2.70(9H, m), 2.77(2H, m), 4.07(2H, s), 4.12(2H, m), 6.61(1H, dd, J=2.4, 6.0Hz), 7.01(1H, m), 7.17(2H, m), 7.23(1H, m), 7.40(1H, d, J=2.4Hz), 7.59-7.63(2H, m), 7.92(1H, m), 8.14(1H, d, J=6.0Hz), 9.24(1H, s), 9.96(1H, m), 10.56(1H, s).
(실시예 1-9) N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(2S,3S)-타르타르산염
Figure 112008077687726-pct00007
D-(-)-타르타르산(284 ㎎)에 물(1.44 ㎖)을 첨가하여 실온에서 용해시켰다. 실온 교반 하에서 이 용액에 아세톤(4.8 ㎖), N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(1220 ㎎)를 첨가하여 용해시키고, 실온에서 6분 교반하였다. 이 용액에 물(0.3 ㎖), 아세톤(5.7 ㎖)을 첨가하여 실온에 서 1시간 교반하였다. 빙냉 하에서 1시간, 4℃에서 15시간 교반하였다. 물(1.5 ㎖)을 첨가하여 반응 혼합물을 감압 농축시켰다. 얻어진 잔류물에 아세톤(5 ㎖)을 첨가하여 감압 농축시키는 것을 2회 반복하였다. 계속해서 아세톤(9.6 ㎖)을 첨가하여 4℃에서 24시간 교반하였다. 석출된 결정을 여과하여 취하고, 아세톤(2.4 ㎖)으로 세정하였다. 이것을 건조시킴으로써, 표제 화합물(1.36 g, 92%)을 무색 결정으로서 얻었다.
(제조예 2-1) 1-(벤질옥시)-2,5-디플루오로-4-니트로벤젠
2,4,5-트리플루오로 니트로벤젠(9.48 g)과 벤질알코올(5.54 ㎖)의 N,N-디메틸포름아미드(40 ㎖) 용액에 탄산칼륨(11.1 g)을 첨가하여 실온에서 60시간 교반하였다. 반응액에 0℃에서 물(120 ㎖)을 첨가하고, 4℃에서 24시간 교반하였다. 석출된 결정을 여과하여 취하고, 물로 세정하였다. 이 결정을 감압 하에 건조시켜 표기 화합물(11.5 g, 81%)을 담황색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 5.35(2H, s), 7.40-7.50(5H, m), 7.64(1H, dd, J=7.2, 13.2Hz), 8.20(1H, dd, J=7.2, 10.8Hz).
(제조예 2-2) 4-아미노-2,5-디플루오로페놀
1-(벤질옥시)-2,5-디플루오로-4-니트로벤젠(9.21 g)의 메탄올(300 ㎖) 용액에 10% 팔라듐탄소(921 ㎎)를 첨가하여 수소 분위기 하의 실온에서 24시간 20분 교반하였다. 플라스크 내를 질소 분위기 하로 하여 반응을 정지시킨 후, 셀라이트를 이용하여 촉매를 여과하였다. 여액을 감압 하에 증류 제거하여 표기 화합물(4.96 g, 99%)을 갈색 고체로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 4.67(1H, s), 6.53-6.64(1H, m), 9.03(1H, s).
(제조예 2-3) 4-(4-아미노-2,5-디플루오로페녹시)피리딘-2-카르복시아미드
질소 기류 하에 4-아미노-2,5-디플루오로페놀(4.95 g)을 디메틸설폭시드(50 ㎖)에 용해시키고, 실온에서 tert-부톡시칼륨(4.05 g)을 첨가하여 25분간 교반하였다. 이 용액에 4-클로로피리딘-2-카르복시아미드(2.70 g)를 첨가하여 80℃에서 2시간 30분 교반하였다. 반응액을 실온까지 냉각시킨 후, 1N 수산화나트륨 수용액(74.25 ㎖)을 첨가하여 10시간 교반하였다. 석출된 고체를 여과하여 취하고, 얻어진 고체를 물로 세정하였다. 이 고체를 100℃에서 24시간 온풍 건조시킴으로써 표기 화합물(3.38 g, 74%)을 보라색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 5.57(2H, d, J=6.0Hz), 6.75-6.80(1H, m), 7.17-7.20(1H, m), 7.26(1H, dd, J=7.2, 10.8Hz), 7.38(1H, m), 7.73(1H, s), 8.14(1H, s), 8.52(1H, d, J=5.6Hz).
ESI-MS(m/z): 288[M+Na]+.
(제조예 2-4) N-(4-{[2-(아미노카르보닐)피리딘-4-일]옥시}-2,5-디플루오로페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-카르복시아미드
질소 분위기 하에 1-(4-플루오로페닐아미노카르보닐)시클로프로판카르복실 산(1.35 g)을 테트라히드로푸란(25.0 ㎖)에 용해시킨 후, 빙수욕 냉각 하에 트리에틸아민(1.06 ㎖)을 적가하여 15분간 교반하였다. 계속해서, 같은 온도에서 염화티오닐(0.439 ㎖)을 첨가하여 1시간 30분 교반하였다. 이 반응액에 같은 온도에서 4-(4-아미노-2,5-디플루오로페녹시)피리딘-2-카르복시아미드(1.0 g)와 테트라히드로푸란(12 ㎖), 트리에틸아민(1.06 ㎖)의 혼합물을 적가하여 0℃에서 24시간 45분 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸(70 ㎖)과 2N 수산화나트륨 수용액(15 ㎖)에 분배하였다. 유기층을 2N 수산화나트륨 수용액(15 ㎖)으로 2회, 1N 염산 수용액(15 ㎖)으로 3회, 포화 탄산수소나트륨 수용액(10 ㎖)으로 순차 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Fuji Silysia NH, 용출액; 헵탄:아세트산에틸=1:1∼1:2∼아세트산에틸)로 정제하여 목적물 분획을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 감압 건조시킴으로써, 표기 화합물(372.8 ㎎, 21%)을 백색 고체로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.28-1.33(4H, m), 7.12-7.22(2H, m), 7.22-7.28(1H, m), 7.41(1H, d, J=2.4Hz), 7.59-7.67(3H, m), 7.75(1H, m), 8.10-8.17(2H, m), 8.56(1H, d, J=5.6Hz), 9.80(1H, m), 11.02(1H, m).
(제조예 2-5) N-(4-{[2-(아미노피리딘-4-일)옥시]-2,5-디플루오로페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드
N-(4-{[2-(아미노카르보닐)피리딘-4-일]옥시}-2,5-디플루오로페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(372.8 ㎎)를 N,N-디메틸포름아미 드(5.0 ㎖)에 용해시켰다. 여기에 물(0.0713 ㎖), [비스(트리플루오로아세톡시)요오드]벤젠(679 ㎎), 피리딘(0.384 ㎖)을 실온에서 순차 첨가하여 3시간 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸(30 ㎖)과 1N 수산화나트륨 수용액(9 ㎖)에 분배하였다. 유기층을 분리하여 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 농축시키고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Fuji Silysia NH, 용출액; 헵탄:아세트산에틸=1:3∼아세트산에틸)에 의해 정제하였다. 목적물 분획을 감압 농축시키고, 잔류물을 감압 건조시킴으로써 표기 화합물(301.0 ㎎, 86%)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.54-1.68(4H, m),5.83(1H, d, J=2.4Hz), 5.99(2H, d, J=5.2Hz), 6.17(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 7.16-7.20(2H, m), 7.47-7.53(1H, m), 7.57-7.62(2H, m), 7.81(1H, d, J=5.6Hz), 8.02-8.10(1H, m), 9.77(1H, m), 10.99(1H, m).
ESI-MS(m/z): 443[M+H]+.
(제조예 2) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드
질소 분위기 하에 N-{4-[(2-아미노피리딘-4-일)옥시]-2,5-디플루오로페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(100.0 ㎎)를 테트라히드로푸란(1 ㎖)에 용해시킨 후, 0℃에서 트리에틸아민(0.0630 ㎖), 클로로포름산페 닐(0.0624 ㎖)을 순차 적가하여 30분간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸(5 ㎖)과 포화 탄산수소나트륨 수용액(5 ㎖)을 첨가하여 교반하였다. 유기층을 분리하여 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 농축시켰다. 잔류물을 N,N-디메틸포름아미드(1.0 ㎖)에 용해시켰다. 3-히드록시아제티딘염산염(99.0 ㎎), 트리에틸아민(0.315 ㎖)을 실온에서 첨가하여 22시간 5분 교반하였다. 반응액을 아세트산에틸(10 ㎖)과 포화 탄산수소나트륨 수용액(5 ㎖)으로 분배하였다. 유기층을 포화 식염수로 순차 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 농축시켰다. 얻어진 잔류물에 아세트산에틸(1 ㎖), 헵탄(1 ㎖)을 첨가하여 고체를 침강시켰다. 고체를 여과하여 취하였다. 얻어진 고체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Fuji Silysia NH, 용출액; 아세트산에틸∼아세트산에틸:메탄올=10:1)로 정제하고, 목적물 분획을 감압 하에 농축시킴으로써, 표기 화합물(71.1 ㎎, 58%)을 백색 분말로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.55-1.68(4H, m), 3.68(2H, dd, J=4.4, 8.4Hz), 4.10-4.14(2H, m), 4.34-4.40(1H, m),5.60(1H, d, J=6.4Hz), 6.64(1H, dd, J=2.4, 5.6Hz), 7.15-7.20(2H, m), 7.50(1H, d, J=2.4Hz), 7.52-7.62(3H, m), 8.05-8.14(1H, m), 8.13(1H, d, J=5.6Hz), 9.20(1H, s), 9.81(1H, m), 10.99(1H, m).
ESI-MS(neg.)(m/z): 540[M-H]-.
(실시예 2-1) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보 닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 염산염
Figure 112008077687726-pct00008
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(32.5 ㎎)를 아세톤(0.325 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 5N 염산(0.012 ㎖)을 첨가하였다. 물(0.151 ㎖)을 첨가한 후, 50℃에서 5분간 가열 교반하여 용액으로 하였다. 이 용액을 실온에서 30분간 교반한 후, 아세톤(0.325 ㎖)을 첨가하여 26시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 아세톤(0.163 ㎖, 2회)으로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킨 후, 60℃에서 12시간 온풍 건조시킴으로써, 표기 화합물(27.6 ㎎, 80%)을 백색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.50-1.80(4H, m), 3.50-4.30(4H, m), 4.45(1H, m), 7.02(1H, m), 7.10-7.25(3H, m), 7.55-7.65(2H, m), 7.68(1H, m), 8.18(1H, dd, J=7.2, 12.0Hz), 8.25(1H, d, J=6.4Hz), 9.78(1H, s), 10.29(1H, br), 11.20(1H, brs).
(실시예 2-2) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르 복시아미드 브롬화수소산염
Figure 112008077687726-pct00009
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(32.5 ㎎)를 에탄올(0.325 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 48% 브롬화수소산수(0.010 ㎖)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 23시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.163 ㎖, 2회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킨 후, 60℃에서 12시간 온풍 건조시킴으로써, 표기 화합물(30.7 ㎎, 82%)을 백색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.50-1.75(4H, m), 3.50-4.30(4H, m), 4.45(1H, m), 7.00(1H, m), 7.08(1H, m), 7.16-7.21(2H, m), 7.55-7.65(2H, m), 7.68(1H, m), 8.17(1H, dd, J=7.2, 12.0Hz), 8.23(1H, d, J=6.8Hz), 9.76(1H, s), 10.02(1H, br), 11.17(1H, brs).
(실시예 2-3) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 1/2황산염
Figure 112008077687726-pct00010
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(32.5 ㎎)를 에탄올(0.325 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 2.5M 황산(0.012 ㎖)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 24시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.163 ㎖, 2회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킨 후, 60℃에서 12시간 온풍 건조시킴으로써, 표기 화합물(31.2 ㎎, 88%)을 백색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.50-1.75(4H, m), 3.50-4.25(4H, m), 4.43(1H, m), 6.92(1H, m), 7.10-7.30(3H, m), 7.50-7.70(3H, m), 8.15(1H, dd, J=6.8, 12.0Hz), 8.21(1H, d, J=6.4Hz), 9.77(1H, s), 11.13(1H, brs).
(실시예 2-4) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 메탄설폰산염
Figure 112008077687726-pct00011
(방법 1)
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(30.0 ㎎)를 에탄올(0.300 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 메탄설폰산(0.004 ㎖)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 90시간 50분 교반하였다. 에탄올(1 ㎖)을 첨가한 후, 석출물을 여과하여 취하고, tert-부틸메틸에테르(1 ㎖, 3회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킴으로써, 표기 화합물(26.3 ㎎, 75%)을 백색 결정으로서 얻었다.
(방법 2)
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 메탄설폰산염의 결정(50.0 ㎎)에 물(1.0 ㎖), tert-부탄올(1.0 ㎖)을 실온에서 첨가하여 용해시켰다. 드라이아이스/에탄올욕을 이용하여 용액을 동결시킨 후, 감압 하에서 6일간 동결 건조시킴으로써, 표기 화합물(47.1 ㎎, 94%)을 백색 비정질로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.52-1.76(4H, m), 2.31(3H, s), 3.70-3.84(2H, m), 4.15-4.30(2H, m), 4.41-4.50(1H, m), 6.96-7.12(2H, m), 7.14-7.25(2H, m), 7.55-7.63(2H, m), 7.64-7.76(1H, m), 8.18(1H, dd, J=7.2, 12.0Hz), 8.26(1H, d, J=6.8Hz), 9.75(1H, s), 10.12(1H, brs), 11.19(1H, brs).
(실시예 2-5) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보 닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 에탄설폰산염
Figure 112008077687726-pct00012
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(32.5 ㎎)를 에탄올(0.325 ㎖)에 현탁시켰다. 실온으로써 에탄설폰산(0.006 ㎖)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 25시간 교반하였다. 석출물을 여과하여 취하고, 에탄올(0.163 ㎖, 2회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킨 후, 60℃에서 12시간 온풍 건조시킴으로써, 표기 화합물(25.5 ㎎, 65%)을 백색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.05(3H, t, J=7.2Hz), 1.50-1.75(4H, m), 2.37(2H, q, J=7.2Hz), 3.70-4.30(4H, m), 4.44(1H, m), 6.99(1H, m), 7.11(1H, m), 7.15-7.25(2H, m), 7.55-7.63(2H, m), 7.67(1H, m), 8.17(1H, dd, J=7.2, 12.0Hz), 8.24(1H, d, J=6.8Hz), 9.76(1H, s), 9.96(1H, br), 11.16(1H, brs).
(실시예 2-6) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 벤젠설폰산염
Figure 112008077687726-pct00013
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(31.6 ㎎)를 에탄올(0.316 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 벤젠설폰산(10.2 ㎎)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 17시간 50분 교반하였다. 에탄올(0.5 ㎖)을 첨가한 후, 석출물을 여과하여 취하고, tert-부틸메틸에테르(1 ㎖, 3회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킴으로써, 표기 화합물(30.4 ㎎, 74%)을 백색 결정으로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.55-1.72(4H, m), 3.70-3.81(2H, m), 4.15-4.26(2H, m), 4.40-4.49(1H, m), 7.00(1H, m), 7.08(1H, m), 7.14-7.23(2H, m), 7.28-7.35(3H, m), 7.55-7.63(4H, m), 7.67(1H, dd, J=7.2, 10.0Hz), 8.13-8.22(1H, m), 8.24(1H, d, J=6.4Hz), 9.75(1H, s), 10.01(1H, brs), 11.17(1H, brs).
(실시예 2-7) N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드4-메틸벤젠설폰산염
Figure 112008077687726-pct00014
(방법 1)
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드(34.2 ㎎)를 에탄올(0.342 ㎖)에 현탁시켰다. 실온에서 p-톨루엔설폰산 일수화물(13.2 ㎎)을 첨가하여 용액으로 한 후, 실온에서 90시간 25분 교반하였다. 에탄올(1 ㎖)을 첨가한 후, 석출물을 여과하여 취하고, tert-부틸메틸에테르(1 ㎖, 3회)로 세정하였다. 실온에서 1시간 통기 건조시킴으로써, 표기 화합물(33.0 ㎎, 73%)을 백색 결정으로서 얻었다.
(방법 2)
N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드4-메틸벤젠설폰산염의 결정(50.0 ㎎)에 물(6.0 ㎖), tert-부탄올(6.0 ㎖)을 첨가하여 용해시켰다. 드라이아이스/에탄올욕을 이용하여 용액을 동결시킨 후, 감압 하에서 6일간 동결 건조시킴으로써, 표기 화합물(45.1 ㎎, 90%)을 백색 비정질로서 얻었다.
1H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)δ(ppm): 1.55-1.72(4H, m), 2.29(3H, s), 3.70- 3.84(2H, m), 4.14-4.26(2H, m), 4.40-4.49(1H, m), 7.01(1H, m), 7.07(1H, m), 7.11(2H, d, J=8.0Hz), 7.15-7.24(2H, m), 7.47(2H, d, J=8.0Hz), 7.55-7.64(2H, m), 7.64-7.72(1H, m), 8.13-8.21(1H, m), 8.24(1H, d, J=6.8Hz), 9.75(1H, s), 10.04(1H, brs), 11.17(1H, brs).
(분말 X선 회절 측정)
실시예 1-7(방법 1), 1-8(방법 1), 2-1, 2-2, 2-3, 2-4(방법 1), 2-5, 2-6 및 2-7(방법 1)에서 얻어진 각 결정 및 실시예 1-7(방법 2), 1-8(방법 5), 2-4(방법 2) 및 2-7(방법 2)에서 얻어진 각 비정질에 대해서, 시료 약 5 ㎎을 유발로 분쇄한 후, 측정용 알루미늄 팬에 올려 이하의 조건으로 측정하였다.
사용 장치: X선 DSC 시스템: TTR-III(리가꾸덴키 가부시키가이샤 제조)
사용 X선: CuKα선
고니오미터: TTR-III 수평 고니오미터
카운터: 신틸레이션 카운터
관전압: 50 kV
관전류: 300 mA
스캔 스피드: 5°/분
주사축: 2θ/θ
주사 범위: 2θ＝5°∼35°
발산 슬릿: 0.5°
발산 세로 제한 슬릿: 2 ㎜
산란 슬릿: 개방
수광 슬릿: 개방
샘플링 폭: 0.02°
누계 횟수: 1
실시예 1-7(방법 1), 1-8(방법 1), 2-1, 2-2, 2-3, 2-4(방법 1), 2-5, 2-6 및 2-7(방법 1)에서 얻어진 각 결정 및 실시예 1-7(방법 2), 1-8(방법 5), 2-4(방법 2) 및 2-7(방법 2)에서 얻어진 각 비정질의 분말 X선 회절 패턴을 각각 도 1 내지 도 13에 도시하고, 상기 각 결정의 회절각(2θ)의 대표적인 피크 및 상대 강도를 각각 표 1 내지 표 9에 나타내었다.
2θ 상대 강도
10.8 37
12.3 57
14.3 49
17.7 100
19.0 90
19.7 61
21.7 54
22.0 35
23.5 69
24.7 40
2θ 상대 강도
10.7 36
12.2 59
14.3 39
17.7 100
19.0 84
19.6 55
21.4 45
22.1 43
23.4 60
24.8 46
2θ 상대 강도
7.4 29
10.3 100
12.0 38
13.9 37
15.0 40
16.5 37
24.7 69
25.1 78
25.9 50
26.6 39
2θ 상대 강도
8.3 21
10.4 75
12.2 22
14.0 34
16.2 37
17.7 30
19.5 63
20.4 35
25.3 100
28.0 34
2θ 상대 강도
6.5 98
6.9 73
9.3 100
16.0 54
18.7 46
19.5 68
22.0 71
22.9 45
23.9 55
26.7 40
2θ 상대 강도
7.9 34
9.9 41
13.9 53
17.7 69
19.1 55
20.4 85
21.7 82
22.4 48
23.3 100
25.8 41
2θ 상대 강도
6.7 100
10.1 41
12.7 17
13.7 15
16.9 38
18.5 42
19.4 27
21.5 34
22.1 35
23.4 15
2θ 상대 강도
7.8 100
8.3 87
8.8 58
13.7 36
17.4 63
18.5 74
19.7 63
20.8 51
24.3 36
24.6 38
2θ 상대 강도
7.2 86
13.4 43
17.3 59
18.8 29
19.3 37
20.6 53
21.1 42
23.6 100
24.6 58
26.1 51
(13C 고체 NMR 스펙트럼의 측정)
실시예 1-8(방법 4)에서 얻어진 결정의 13C 고체 NMR 스펙트럼의 측정을 이하의 측정 조건으로 행하였다.
측정 장치: AVANCE 400 MHz(블루카)
프로브: 7 ㎜-CP/MAS(블루카)
NMR 셀 직경: 7 ㎜
셀 회전수: 5000 회전/초
측정법: CPTOSS법
관측 핵: 13C(공명 주파수: 100.6248425 MHz)
대기 시간: 3초
접촉 시간: 1000 마이크로초
누계 횟수: 5910회
외부 표준: 글리신의 카르보닐 탄소의 화학 시프트를 176.03 ppm으로 하였다.
실시예 1-8(방법 4)에서 얻어진 결정의 13C 고체 NMR 스펙트럼을 도 14에 나타내고, 화학 시프트를 표 10에 나타내었다.
화학 시프트(ppm)
180.5 122.5 61.2
179.5 120.8 52.1
175.7 119.7 49.0
172.1 115.4 46.8
166.7 114.4 45.7
157.1 109.4 43.3
154.9 97.1 41.5
151.1 75.6 28.7
148.1 74.8 28.0
135.2 73.6 26.9
125.4 63.6 20.8
[약리 시험예]
화합물 1 및 화합물 2의 생화학적 활성 및 의약으로서의 작용 효과(간세포 증식인자 수용체 저해 활성, 항종양 활성, 혈관신생 저해 활성 및 암전이 억제 활성)는 이하의 방법에 따라 평가하였다.
또한, 이하의 약리 시험예에서 사용되는 약호 또는 용어의 일람을 하기에 나타낸다.
<약호 일람>
HGFR(간세포 증식인자 수용체, Hepatocyte growth factor receptor)
DNA(디옥시리보핵산, Deoxyribonucleic acid)
인간 태반(human placenta)
PCR(Polymerase chain reaction)
VEGFR2(혈관내피 증식인자 수용체 2, Vascular endothelial growth factor receptor2)
FGFR1(선유아세포 증식인자 수용체 1, Fibroblast growth factor receptor1)
PDGFRβ(혈소판 유래 증식인자 수용체 β, Platelet derived growth factor receptorβ)
EGFR(상피 증식인자 수용체, Epidermal growth factor receptor)
FBS(소 태아 혈청, Fetal bovine serum, )
PBS(인산 완충 생리식염수, Phosphate buffered saline)
완충액(트리스(Tris), Tris(hydroxymethyl)aminomethane)
PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드, Phenylmethylsulfonyl fluoride)
NP-40(노니데트 P-40, Nonidet P-40)
EGTA(글리콜에테르디아민사아세트산, O,O-Bis(2-aminoethyleneglycol)-N,N,N’,N’-Tetraacetic acid)
SDS(도데실황산나트륨, Sodium Dodecylsulfate)
BSA(소 혈청 알부민, Bovine Serum Albumin)
완충액(헤페스(Hepes), N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid])
ATP(아데노신5’-삼인산, Adenosine 5’-Triphosphate)
EDTA(에틸렌디아민사아세트산, Ethylenediaminetetraacetic acid)
HTRF(시간 분해 형광, Homogenous Time-Resolved Fluorescence)
HRP(양고추냉이 과산화효소, Horseradish peroxidase)
ELISA(효소 면역 항체법, Enzyme-linked immunosorbent assay)
약리 시험예 1: 수용체형 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용
1. 수용체형 티로신 키나아제의 클로닝 및 재조합 바큐로바이러스 용액의 조제
HGFR(Genbank 취득 번호 J02958)의 세포질 도메인은 리신 974부터 시작되고, 또한 종지 코돈을 포함하는 1.3 kb의 DNA 단편으로서, Park 연구진[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84(18), 6379-6383, 1987]에 의해 기재되어 있다. 이 DNA 단편을, human placental cDNA library(클론텍사에서 구입)로부터, 2종류의 프라이머(배열 번호 1: 5’-CCGGCCGGATCCAAAAAGAGAAAGCAAATTAAA-3’및 배열 번호 2: 5’-TTAATTCTGCAGCTATGATGTCTCCCAGAAGGA-3’, 인비트로젠사에서 구입)에 의해 PCR법(TaKaRa Ex TaqTM Kit, TaKaRa에서 구입)을 이용하여 단리하였다. 이 DNA 단편을 바큐로바이러스 트랜스플레이스 벡터[pFast BacTM-HT(GIBCO BRL사에서 구입)]에 클로닝하여 재조합 구축물을 얻었다. 이것을 곤충 세포[Spodoptera frugiperda9(Sf9)]로 트랜스펙트시켜 HGFR 재조합 바큐로바이러스 용액을 조제하였다(재조합 바큐로바이러스의 조제는 표준 텍스트[Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(GIBCO BRL사)에 발견됨]. 다른 수용체형 티로신 키나아제의 클로닝 및 재조합 바큐로바이러스 용액은 상기한 방법에 있어서 HGFR 대신에 리신 791부터 시작하는 세포질 단편(VEGFR2, Genbank 취득 번호 L04947), 리신 398부터 시작하는 세포질 단편(FGFR1, Genbank 취득 번호 X52833) 또는 리신 558부터 시작하는 세포질 단편(PDGFRβ, Genbank 취득 번호 M21616)을 이용하여 조제하였다. 또한, EGFR는 시그마사(제품 번호 E-2645)에서 구입하였다.
2. 수용체형 티로신 키나아제의 발현 및 정제
2% FBS를 함유하는 SF-900II 배지(인비트로젠사에서 구입)에 현탁시킨 Sf9 세포(3×108개)에, 전술한 HGFR 재조합 바큐로바이러스 용액(4 ㎖)을 첨가하여 27℃에서 48시간 진탕 배양하였다. 이 HGFR 재조합 바큐로바이러스 감염 세포를 4℃에서 1000 rpm으로 5분간 원심하여 상청을 제거하였다. 침전된 감염 세포를 80 ㎖의 빙냉시킨 PBS에 현탁시키고, 4℃에서 1000 rpm으로 5분간 원심하여 상청을 제거하였다. 침전된 감염 세포를 40 ㎖의 빙냉시킨 Lysis Buffer(50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 5 mM 2-머캅토에탄올, 100 mM KCl, 1 mM PMSF, 1%(v/v) NP-40)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 4℃에서 12000 rpm으로 30분간 원심하여 상청을 얻었다.
이 상청을 30 ㎖의 Buffer A(20 mM Tris-HCl(pH 8.5), 5 mM 2-머캅토에탄올, 500 mM KCl, 20 mM 이미다졸, 10%(v/v) 글리세롤)로 평형화한 Ni-NTA 아가로스 칼럼(3 ㎖, 키아젠사에서 구입)에 첨가하였다. 이 칼럼을 30 ㎖의 Buffer A, 6 ㎖의 Buffer B(20 mM Tris-HCl(pH 8.5), 5 mM 2-머캅토에탄올, 1 M KCl, 10%(v/v) 글리세롤), 6 ㎖의 Buffer A로 순차 세정하였다. 계속해서, 이것에, 6 ㎖의 Buffer C(20 mM Tris-HCl(pH 8.5), 5 mM 2-머캅토에탄올, 100 mM KCl, 100 mM 이미다졸, 10%(v/v) 글리세롤)를 첨가하여 용출액을 얻었다. 이 용출액을 투석막(Spectrum Laboratories사에서 구입)에 넣고, 1 ℓ의 투석 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10%(v/v) 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨, 0.1 mM Na3VO4, 0.1 mM EGTA)로 4℃에서 밤새도록 투석한 후, 사용할 때까지 -80℃로 보존하였다. 투석 후의 용출액의 일부를 SDS 전기영동에 제공하여 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색에 있어서 분자량 약 60 kDa로 검출되는 리콤비넌트 단백질(His6-HGFR, N말에 히스티딘 6개를 융합시킨 HGFR의 세포질 도메인)을, BSA(시그마사에서 구입)를 표준 물질로서 단백을 정량하였다. VEGFR2의 세포질 도메인, FGFR1의 세포질 도메인 또는 PDGFRβ의 세포질 도메인에 대해서도 동일한 방법을 이용하여 N말에 히스티딘 6개를 융합시킨 각각의 리콤비넌트 단백질(His6-VEGFR2, His6-FGFR1 또는 His6-PDGFRβ)을 얻었다.
3. HGFR 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용의 측정
96웰 바닥이 둥근 플레이트(NUNC사에서 구입, 제품 번호 163320)의 각 웰에 10 ㎕ 키나아제 반응액(200 mM Hepes(pH 7.4), 80 mM MgCl2, 16 mM MnCl2, 2 mM Na3VO4), 250 ng의 비오틴 결합 폴리(Glu4:Tyr1)(biotin-poly(GT), 일본 셰링사에서 구입)(증류수로 15배 희석한 것)를 6 ㎕), 30 ng의 His6-HGFR(0.4% BSA 용액으로 60배 희석한 것을 10 ㎕) 및 디메틸설폭시드에 용해시킨 피검 물질(0.1% BSA로 100배 희석한 것을 4 ㎕)을 첨가하여 전량을 30 ㎕로 하였다. 거기에, 증류수로 희석한 4 μM ATP(시그마사에서 구입)를 10 ㎕ 첨가하여 30℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 10 ㎕의 500 mM EDTA(pH 8.0)(와코쥰야쿠코교에서 구입)를 첨가하여 키나아제 반응 용액을 얻었다.
티로신 인산화 biotin-poly(GT)의 검출은 시간 분해 형광(HTRF)법을 이용하였다(Analytical Biochemistry, 269, 94-104, 1999). 즉, 20 ㎕의 상기 키나아제 반응 용액 및 30 ㎕의 희석 용액(50 mM Hepes(pH 7.4), 20 mM MgCl2, 4 mM MnCl2, 0.5 mM Na3VO4, 0.1% BSA, 100 mM EDTA)을 96웰 흑색 하프 플레이트(COSTAR사에서 구입, 제품 번호 3694)의 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 유로퓸 크립테이트를 라벨링한 항포스포티로신 항체(Eu(K)-PY20, 일본 셰링사에서 구입) 7.5 ng(20 mM Hepes(pH 7.0), 0.5 MKF, 0.1% BSA로 250배 희석한 것을 25 ㎕) 및 XL665를 라벨링한 스트렙토아비딘(XL665-SA, 일본 셰링사에서 구입) 250 ng(20 mM Hepes(pH 7.0), 0.5M KF, 0.1% BSA로 62.5배 희석한 것을 25 ㎕)을 첨가하여 즉시 디스커버리 HTRF 마이크로 플레이트 분석기(팩커드사 제조)로 각 웰의 여기 파장 337 ㎚로 조사했을 때의 665 ㎚ 및 620 ㎚의 형광 강도를 측정하였다. Biotin-poly(GT)의 티로신 인산화율은 일본 셰링사의 HTRF 표준 실험법 텍스트에 기재되어 있는 deltaF%값을 이용하여 산출하였다. 즉, 피검 물질을 첨가하지 않고 His6-HGFR을 첨가한 웰의 deltaF%값을 100%, 피검 물질 및 His6-HGFR을 첨가하지 않은 웰의 deltaF%값을 0%로 하여 피검 물질을 첨가한 각 웰의 deltaF%값의 비율(%)을 구하였다. 이 비율(%)에 의해 HGFR 키나아제 활성을 50% 저해하는 데 필요한 피검 물질의 농도(IC50)를 산출하였다.
화합물 1의 IC50은 0.053 μM, 화합물 2의 IC50은 0.004 μM이었다.
4. HGFR 이외의 수용체형 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용의 측정
VEGFR2, FGFR1 또는 EGFR 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용은 HGFR의 대신에 각각 His6-VEGFR2를 15 ng, His6-FGFR1을 15 ng 또는 EGFR를 23 ng 이용하여 전술한 HGFR 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용과 동일한 방법으로 측정하였다.
한편, PDGFRβ 티로신 키나아제 활성에 대한 저해 작용은 50 ng의 His6-PDGFRβ를 이용하여 전술한 방법으로 키나아제 반응액을 얻은 후, 이하의 방법으로 티로신 인산화 biotin-poly(GT)를 검출하여 평가하였다.
96-웰 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(PIERCE사에서 구입, 제품 번호 15129)의 각 웰에 34 ㎕의 키나아제 반응액 및 16 ㎕의 희석 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰을 150 ㎕의 세정액(20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA)으로 3회 세정하고, 항포스포티로신 PY20)-HRP conjugate(Transduction Laboratories사에서 구입, 제조번호 P-11625) 70 ㎕(20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20, 1% BSA로 2000배로 희석)을 첨가하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰을 150 ㎕의 세정액으로 3회 세정하고, 100 ㎕의 TMB Membrane Peroxidase Substrate(후나코시사에서 구입, 제조번호 50-5077-03)를 첨가하였다. 이것을 실온에서 10분간 인큐베이션한 후, 각 웰에 100 ㎕의 1 M 인산을 첨가하여 즉시 플레이트 리더 MTP-500(코로나덴키사 제조)에 의해 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 피검 물질을 첨가하지 않고 His6-PDGFRβ를 첨가한 웰의 흡광도를 100%, 피검 물질 및 His6-PDGFRβ를 첨가하지 않은 웰의 흡광도를 0%로 하여 피검 물질을 첨가한 각 웰의 흡광도율(%)을 구하였다. 이 흡광도율(%)에 의해 PDGFRβ 키나아제 활성을 50% 저해하는 데 필요한 피검 물질의 농도(IC50)를 산출하였다.
약리 시험예 2: 인간 위암세포(MKN-45)에 대한 증식 저해 작용
인간 위암세포(MKN-45)를, 1% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지(시그마사에서 구입)에 현탁시켰다. 그 세포 현탁액(1×104개/㎖)을 세포 배양용 96웰 플레이트(NUNC사에서 구입, 제품 번호 167008)에 0.1 ㎖/well 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 안(37℃)에서 밤새 배양하였다. 배양한 후, 각 웰에 1% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 희석한 피검 물질을 0.1 ㎖ 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 안(37℃)에서 3일간 더 배양하였다. 배양한 후, 각 웰에 Cell Counting Kit-8(DOJINDO사에서 구입, 제품 번호 343-07623)을 10 ㎕ 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 안(37℃)에서 약 1시간 30분 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 측정 파장을 450 ㎚, 대조 파장을 660 ㎚로 하여 각 웰의 흡광도를 플레이트 리더 MTP-500(코로나덴키사 제조)을 이용하여 측정하였다. 피검 물질을 첨가하지 않은 웰의 흡광도에 대한 피검 물질을 첨가한 각 웰의 흡광도의 비율(%)을 구하고, 이 비율로부터 세포 증식을 50% 저해하는 데 필요한 피검 물질의 농도(IC50)를 구하였다.
화합물 1의 IC50은 0.017 μM, 화합물 2의 IC50은 0.005 μM이었다.
약리 시험예 3: ELISA법을 이용하는 HGFR 자기 인산화 저해 작용
1. 세포 추출액의 조제
인간 위암세포(MKN-45)를, 1% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지(시그마사에서 구입)에 현탁시켰다. 그 세포 현탁액(1×105개/㎖)을 세포 배양용 96웰 플레이트(NUNC사에서 구입, 제품 번호 167008)에 0.1 ㎖/well 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 안(37℃)에서 밤새 배양하였다. 배양한 후, 각 웰로부터 상청을 제거하고, 0.05 ㎖의 1% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지를 첨가하였다. 거기에, 디메틸설폭시드에 용해시킨 피검 물질(1% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지로 희석)을 0.05 ㎖ 첨가하여 5% CO2 인큐베이터 안(37℃)에서 1시간 배양하였다. 각 웰로부터 상청을 제거하고, 각 웰을 PBS 150 ㎕로 세정하고, 거기에 가용화 완충액(50 mM Hepes(pH 7.4), 150 mM NaCl, 10%(v/v) 글리세롤, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA(pH 8.0), 100 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ Aprotinin, 50 ㎍/㎖ Leupeptin, 1 ㎍/㎖ Pepstatin A, 1 mM Na3VO4)을 100 ㎕ 첨가하였다. 이 플레이트를 4℃에서 1시간 진탕하여 세포 추출액을 조제하였다.
2. 항포스포티로신 항체 고상화 플레이트의 제작
ELISA용 96웰 플레이트(COSTAR사에서 구입, 제품 번호 3369)에 50 ㎍/㎖의 항포스포티로신 항체(PY20, Transduction Laboratory사에서 구입, 제품 번호 P-11120)를 포함하는 60 mM 중탄산염 완충액(bicarbonate buffer; pH 9.6)을 50 ㎕ 첨가하였다. 이 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
3. HGFR 자기 인산화 저해 작용의 측정
2.에서 조제한 플레이트의 각 웰을 200 ㎕의 PBS로 3회 세정하고, 거기에 150 ㎕의 3% BSA/PBS를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 각 웰을 200 ㎕의 PBS로 3회 세정하고, 거기에 전술한 세포 추출액을 50 ㎕ 첨가하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 각 웰을 250 ㎕의 세정액(0.1% BSA, 20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 3회 세정하고, 반응액(1% BSA, 20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 2000배 희석한 항HGFR 항체(h-Met(C-12), 산타크루즈사에서 구입, 제품 번호 sc-10)를 70 ㎕ 첨가하였다. 이것을 실온에서 1시간 인큐베이션하여 250 ㎕의 세정액으로 3회 세정한 후, 반응액으로 2000배 희석한 페록시다아제 표지 항토끼 Ig 항체(셀시그널링사에서 구입, 제품 번호 7074)를 70 ㎕를 첨가하였다. 또한, 그것을 실온에서 1시간 인큐베이션하고, 각 웰을 250 ㎕의 세정액으로 3회 세정한 후, 70 ㎕의 TMB Membrane Peroxidase Substrate(후나코시사에서 구입, 제조번호 50-5077-03)를 첨가하였다. 이것을 실온에서 10분간 인큐베이션한 후, 각 웰에 70 ㎕의 1M 인산을 첨가하고, 즉시 플레이트 리더 MTP-500(코로나덴키사 제조)으로 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 피검 물질을 첨가하지 않은 세포 추출액을 첨가한 웰의 흡광도를 100%의 HGFR 자기 인산화 활성, 50 ㎕의 가용화 완충액을 첨가한 웰의 흡광도를 0%의 HGFR 자기 인산화 활성으로 하여 각 웰의 HGFR 자기 인산화 활성(%)을 구하였다. 피검 물질의 농도를 여러 단계로 바꾸어 각각의 경우에 있어서의 HGFR 자기 인산화 활성(%)을 구하고, 피검 물질의 HGFR 자기 인산화 활성을 50% 저해하는 데 필요한 피검 물질의 농도(IC50)를 구하였다.
화합물 1의 IC50은 0.016 μM, 화합물 2의 IC50은 0.0084 μM이었다.
본 발명에 따른 페녹시피리딘 유도체의 염 또는 그 결정은, 물성면에서 우수한 성질을 가지며, 췌장암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 신장암, 뇌종양 및 난소암 등 여러 가지 종양에 대한 항종양제, 혈관신생 저해제 또는 암전이 억제제로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Eisai R&D Manamgement Co., Ltd. <120> PHENOXYPYRIDINE DERIVATIVE SALTS AND CRYSTALS THEREOF, AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME <130> FP07-0062-01 <150> US 11/508,322 <151> 2006-08-23 <150> JP 2007-036690 <151> 2007-02-16 <150> US 60/890,769 <151> 2007-02-20 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 1 ccggccggat ccaaaaagag aaagcaaatt aaa 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 2 ttaattctgc agctatgatg tctcccagaa gga 33

Claims (22)

  1. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 푸마르산, 호박산, 말산, 말레산 및 타르타르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염.
  2. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 말산염의 결정.
  3. 제2항에 있어서, 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 19.0° 및 23.5°에서 회절 피크를 갖는 결정.
  4. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정.
  5. 제4항에 있어서, 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 12.2°, 17.7° 및 23.4°에서 회절 피크를 갖는 결정.
  6. 제4항에 있어서, 13C 고체 핵자기 공명 스펙트럼에 있어서, 화학 시프트(±0.5 ppm) 175.7 ppm, 166.7 ppm, 154.9 ppm 및 45.7 ppm에서 피크를 갖는 결정.
  7. N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염으로서, 그 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염.
  8. N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드의 산부가염의 결정으로서, 이 산이 염산, 브롬화수소산, 황산, 에탄설폰산 및 벤젠설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산부가염의 결정.
  9. N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 메탄설폰산염의 결정.
  10. 제9항에 있어서, 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 17.7°, 20.4° 및 21.7°에서 회절 피크를 갖는 결정.
  11. N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 4-메틸벤젠설폰산염의 결정.
  12. 제11항에 있어서, 분말 X선 회절에 있어서, 회절 각도(2θ±0.2°) 7.2°, 17.3° 및 23.6°에서 회절 피크를 갖는 결정.
  13. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매 및 말산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 말산염의 결정의 제조 방법.
  14. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매, 물 및 타르타르산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4- (4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정의 제조 방법.
  15. N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 물 및 타르타르산을 혼합하여 용액으로 한 후, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매를 첨가하여 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-(2-플루오로-4-{[2-({[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카르보닐}아미노)피리딘-4-일]옥시}페닐)-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 타르타르산염의 결정의 제조 방법.
  16. N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드, 케톤류 및 알코올류로부터 선택되는 용매 및 염산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산 및 4-메틸벤젠설폰산으로 이루어진 군에서 선택되는 산을 혼합하여 용액으로 한 후, 결정을 석출시키는 것을 특징으로 하는 N-{2,5-디플루오로-4-[(2-{[(3-히드록시아제티딘-1-일)카르보닐]아미노}피리딘-4-일)옥시]페닐}-N’-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복시아미드 산부가염의 결정의 제조 방법.
  17. 삭제
  18. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 항종양제.
  19. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 암전이 억제제.
  20. 삭제
  21. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 항종양제.
  22. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재한 결정을 함유하는 암전이 억제제.
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