KR101377617B1 - 항알러지 활성을 갖는 피14 단백질 및 이들을 포함하는 항알러지 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터페론 감마를 상승시키고 인터루킨-4의 생산을 억제함으로써 항알러지 활성을 나타내는 유산균 유래의 p14 단백질 및 이들을 포함하는 알러지 질환의 치료, 관리, 경감, 개선 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

항알러지 활성을 갖는 피14 단백질 및 이들을 포함하는 항알러지 약제학적 조성물{Anti-allergic Protein p14 and Anti-allergic Pharmaceutical Composition comprising the same}

본 발명은 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질 및 이들을 포함하는 알러지 질환의 치료, 관리, 경감, 개선 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

세계 인구의 약 20% 가량이 천식, 알러지성 비염, 음식 알러지, 아토피성 피부염 및 과민증과 같은 다양한 알러지성 질환으로 고생하고 있다. 사회가 복잡해지고 산업의 발달로 인하여 환경오염 및 수질오염이 증가하고, 식생활의 변화, 스트레스의 가중 등으로 최근 알러지성 질환은 급속도로 증가함으로써 좀 더 효과적인 치료방법 또는 약제에 대한 요구가 대두되어 왔다.

알러지는 외래 물질(알레르겐)에 대한 신체의 면역계의 과반응이다. 면역계에 의해 매개된 염증반응은 전형적으로 4가지 카테고리: I, II, III, 및 IV로 분류된다. 알러지 반응은 사람의 신체가 과민하여 IgE-형 항체를 전형적인 알레르겐에 대해 항체를 발생시키는 제I형 즉시 과민증의 반응에 속한다. 비만 세포는 알러지 반응의 캐스케이드에서 주요한 성분이다. 비만 세포는 결합 조직의 고정 세포이며 그들의 세포질 과립 내에 다수의 상이한 알레르겐성 화합물을 함유하며, 이들 중 가장 잘 알려진 것은 히스타민이다.

알러지에 대한 기존의 치료제로는 항히스타민제, 비만 세포 안정화제, 비-스테로이드성 항염증 약물이 주로 사용되고, 보다 중증의 경우에는 글루코코르티코이드 약물이 사용된다. 이들 가운데 항히스타민제는 국소 부종, 열감, 발적, 및 다른 염증 세포의 히스타민의 방출 부위에의 유인 및 축적을 유발하고 신경종말을 자극하여, 가려움증 또는 통증을 유발한다.

글루코코르티코이드와 같은 스테로이드성 약물은 만성 투여 시 약물-유도성 골다공증을 유발할 수 있고, 고혈압, 고혈당증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증과 같은 환자의 전반적인 건강상태를 위협하는 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

최근에 알러지성 질환의 증가로 인하여 다양한 연구들이 진행되고 있고, 급진적인 면역학의 발전으로 알러지성 질환의 규명 및 치료에 많은 진전이 있어 왔으나, 아직까지 알러지성 질환을 충분하게 치료할 수 있는 약물의 개발은 이루어지지 않고 있으며, 기존 알러지 질환 치료제들은 상술한 바와 같은 부작용을 내포하고 있어 부작용이 적으면서도 작용 효과가 탁월한 알러지 질환 치료제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 전술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 항-알러지 활성을 갖는 신규한 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 알러지 질환의 치료, 관리, 경감, 개선 또는 예방에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 알러지 질환의 치료 보조제로 이용가능한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질에 관한 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 상기 p14 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양상은 상기의 p14 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기의 p14 단백질을 포함하는 알러지 치료 또는 예방에 효과적인 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 락토바실러스 유래의 신규한 단백질을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서 이용되는 p14 단백질은 IFN-γ의 증가 및 IL-4 생산 억제 효과를 나타내어 우수한 알러지 질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 조성물은 생균(probiotic)또는 사균을 유효성분으로 하여 세포독성 및 부작용이 없고 효과 지속 시간이 길어 약제학적 조성물 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

또한 본 발명은 항알러지 효과가 있는 p14 단백질을 암호화하는 유전자를 제공함으로써 재조합 p14 단백질의 대량 생산을 가능하게 한다.

도 1은 추정된 CDS를 바탕으로 설계된 프라이머의 개략적인 구성도이다.
도 2는 대장균 발현 벡터에 CDS를 삽입하기 위한 PCR 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 제한 효소반응과 T4 리가제를 이용한 클로닝 결과이다.
도 4는 각각의 재조합 단백질이 과발현하는 콜로니를 선택하기 위해 이. 콜라이(E. coli) 콜로니를 각각 IPTG 유도 후 SDS-Page 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 선별된 콜로니에서 과발현하는 IPTG 유도 조건을 확립하기 위해 13 kDa, 14 kDa, 및 49 kDa 유전자가 삽입되어 있는 대장균을 시간대별 유도시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a-b는 대용량 배양을 통한 본 발명의 p14 단백질의 분리 정제 결과 및 투석결과를 나타낸 것이다.
도 7는 재조합 단백질의 P13 및 P14 단백질의 아미노산 동정을 통한 상동성 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 활성화된 마우스 비장세포에서의 본 발명의 p14 단백질 처리후의 INF-γ의 농도 변화를 나타낸 그래프이고, 도 8b는 활성화된 마우스 비장세포에서의 본 발명의 p14 단백질 처리후의 IL-4의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도9a-c는 시간대별로 마우스 마크로파아지 세포를 이용한 본 발명의 p14의 항알러지 효과를 보여 주는 그래프이다.
도 10은 아토피가 유발된 마우스에 대한 본 발명의 p14 단백질을 처리한 생체내(n vivo) 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 아토피가 유발된 마우스에 대한 본 발명의 p14 단백질 처리 후의 IgE의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 아토피가 유발된 마우스에 대한 본 발명의 p14 단백질 처리후의 IL-4의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 경우에 "알러지"라는 용어는 INF-γ매개된 알러지를 의미한다. 알러지 질환은 비염 (rhinitis), 부비동염(sinusitis), 아토피, 천식, 과민성 폐렴, 외인 알러지성 폐포염 (extrinsic allergic alveolitis), 결막염, 두드러기, 가려움, 햇빛 알러지, 습진, 피부염, 아나필락시스 (anaphylaxis), 혈관부종 (angioedema), 알러지성 및 편두통성 두통, 및 특정 소화기 질환들을 포함한다.

본 발명의 일구현예는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 상기의 서열번호 1의 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 여기서 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동일한 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동일한 생리활성"이란 동물체 내에서 항알러지 활성을 의미한다. 이러한 서열번호 1의 상기 단백질의 기능적 동등물의 일례는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질의 기능적 동등물이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 p14 단백질은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 유래인 것을 특징으로 한다. 이들의 구체적인 예로는 락토바실루스 파라카제이 LPC4 균주 (Lactobacillus paracasei LPC4) (KCTC 11866BP) 등을 들 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 유래의 p14 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 p14 단백질은 서열번호 4로 표시되는 유전자 서열에 의해 코딩될 수 있다. 특히 상기 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 유래의 p14 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 90%의 서열 상동성을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 p14 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 p14 단백질을 각각 코딩하는 지놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게, 상기 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열과 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 염기 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열번호 2의 상기 염기 서열의 변이체의 일례는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열의 유전자를 예로 들 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 p14 단백질은 약 14 kDa의 분자량을 갖는다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 p14 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본원에서 사용되는 경우에, "재조합"이라는 용어는 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내에 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명에서 상기 벡터로 형질전환될 수 있는 대장균 균주로는 BL21, BL21(DE3) 등이 있으며, 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 사용된 대장균 BL21(DE3)이다. 벡터를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는 CaCl₂ 버퍼를 이용한 적격 세포(competemt cell) 사용, 전기천공법(electroporation), 열 충격법(hear shock) 등의 당업계에 통상적으로 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 상기 형질전환 대장균을 배양하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균의 배양법을 이용할 수 있다.

본 발명의 p14 단백질은 알러지 유도 동물 모델에서 인터페론 감마를 상승시키고 인터루킨-4의 생산을 억제함으로써 알러지의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 (a)본 발명의 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질; 및 (b) 제약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체 또는 버퍼를 포함하는 항알러지 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 완충제, 희석제, 담체, 보조제 또는 다른 부형제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 그 밖에 약제학적 조성물에 적용하기에 적합한 임의의 약리학상 허용되는 완충제를 사용할 수 있다. 여러 가지 목적을 위해 다른 작용제가 조성물에 이용될 수 있다. 예를 들어, 완충제, 보존제, 공용매, 오일, 습윤제, 연화제, 안정화제 또는 항산화제를 이용할 수 있다. 이용할 수 있는 수용성 보존제로는 나트륨 비설페이트, 나트륨 티오설페이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살, 에틸 알콜, 메틸파라벤, 폴리비닐 알콜, 벤질 알콜 및 페닐에틸 알콜이 포함된다. 이러한 작용제는 약 0.001 내지 약 5 중량％의 개별적인 양으로 존재할 수 있다. 이용할 수 있는 적합한 수용성 완충제는 원하는 투여 경로에 대해 미국 식약청 ("US FDA")이 인증한 탄산나트륨, 붕산나트륨, 인산나트륨, 아세트산 나트륨, 중탄산나트륨 등이다. 이러한 작용제는 약 2 내지 약 11 사이의 시스템의 pH를 유지하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 따라서, 완충제는 전체 조성물의 중량 기준으로 약 5 중량％ 만큼 많을 수 있다. 또한, 염화나트륨 및 염화칼륨과 같은 전해질이 포함될 수 있다.

본 발명의 p14 단백질을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 p14 단백질은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 p14 단백질은 실제 임상 투여 시에 경구용의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 p14 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다.

본 발명의 항알러지 약제학적 조성물의 제조방법은 (i) p14 단백질; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 또는 버퍼를 배합하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명의 조성물의 제조 방법은 (i) 1종 이상의 항알러지 약제; (ii) p14 단백질; 및 (iii) 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 담체, 또는 버퍼를 배합하는 것을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 p14 단백질의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 p14 단백질의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 실시예에서 본 발명의 p14 단백질을 포함하는 조성물은 알러지 관련 질환의 보조 치료를 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 p14 단백질을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 본 발명의 유산균으로부터 분리된 p14 단백질 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 재조합 단백질의 확보

가. 제한효소 절단부위가 포함된 프라이머 디자인 및 제작

13 kDa, 14 kDa과 49 kDa 유전자를 대장균 발현 벡터인 pRSET A 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하기 위해 도 1과 같이 BamHI과 XhoI의 염기서열이 포함된프라이머를 디자인하여 제작하였다. 돌연변이되어 제한효소를 인식하지 못할 것을 대비해 염기 한 개 내지 두 개를 제한효소 인식부위와 인접하여 추가해서 디자인하였다. 리딩 프레임을 고려하여 프라이머를 디자인 한 후 상기 유전자를 pRSET A 벡터에 클로닝하였다 (도 1 참조).

나. 대장균 발현 벡터에 각각의 CDS를 삽입하기 위한 PCR 수행

제작된 프라이머를 이용하여 각각 55℃의 어닐링 온도에서 CDS들(Complementary DNA Strand)의 PCR 산물을 확인하였다. 반응용액에는 주형 3 ㎕ (10 ng/㎕), 프라이머 (10 pM), MgCl₂ (25mM), dNTP(2.5mM), Taq 폴리메라제(5U/㎕), 10×버퍼가 포함되었고, 반응조건은 초기변성 (95˚C) 반응을 2분 동안 진행시킨 후, 변성반응 (95˚C) 20초, 결합 반응 (55˚C) 35초, 연장반응 (72˚C), 20초로 30회 반복하여 수행하였다. 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 DNA를 주형으로 이용하고, PCR에 의한 돌연변이를 고려하여 high fidelity polymerase Taq invitrogen을 이용여 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 산물은 3종의 유전자 크기와 일치하는 각각 369, 372, 1494 bp 임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

다. 형질전환 수행

pRSET 벡터에 BamHI, XhoI과 EcoRI 제한효소를 이용하여 PCR 산물과 벡터를 37˚C에서 2시간 이상 절단하고, 아가로즈 겔에 전기영동후 EtBr 염색을 통해 밴드 강도를 기준으로 벡터: 삽입체(insert)의 비율을 1:3으로 연결하였다. 연결(ligation) 반응후 적격 세포 (DH5α)에 형질전환시켜 클로닝된 콜로니를 확보하였다(도 3 참조). 총 22개의 콜로니를 확인한 결과 콜로니 6, 7, 8, 10, 11, 13, 18, 20, 21의 9개에서 정확한 삽입이 확인되었다. 삽입이 확인된 각각의 13 kDa, 14 kDa, 및 49 kDa 재조합 단백질 발현 플라스미드를 이용하여 T7 프로모터 프라이머를 이용하여 유전자의 염기서열을 분석한 결과 100% 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

라. 13 kDa, 14 kDa, 및 49 kDa 재조합 단백질 발현의 확인

13 kDa, 14 kDa, 및 49 kDa BL21 균주에 형질전환시킨 후 발현이 높은 이. 콜라이(E. coli) 콜로니를 선별하기 위해 7~8개의 콜로니를 IPTG 1mM을 이용하여 4시간 유도시킨 후 15% 비스아크릴아마이드 겔에서 90 분간 80V에서 전기영동하였다 (Loading volume: 1 ㎖ induction, 25 ㎕ 1X sample buffer Boiling 5 min, 10 ㎕ loading). 그 결과, 13-1, 14-4와 49-8번이 비교적 많이 발현되는 것으로 확인되었다(도 4 참조).

마. 선별된 콜로니를 이용하여 다양한 조건으로의 유도(Induction) 수행

14 kDa 재조합 단백질의 경우 IPTG의 농도와 관계없이, 1시간 정도 IPTG 유도로 안정적 발현이 확인되었다. 3 ㎖ 콜로니를 LB 배양액에 O/N 배양 후 새로운 LB배양액 10 ㎖에 3 ㎖ 콜로니 배양액 중 0.5 ㎖ 접종시킨 후 2시간 이상 배양 후 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되면 IPTG를 이용하여 유도하고 시간대 별로 샘플을 회수하고, 그 후 15% 비스아크릴아마이드 겔에서 90 분간 80V에서 전기영동하였다 (Loading volume: 1 ㎖ induction, 25 ㎕ 1X sample buffer Boiling 5 min, 10 ㎕ loading). 13 kDa, 14 kDa, 및 49 kDa 단백질을 대장균에서 발현시키기 위해서 시간대 별로 유도를 수행한 결과 각각의 14 kDa 재조합 단백질만이 안정으로 발현됨을 확인하였다 (도 5 참조).

바. 대용량 배양을 통한 p14 재조합 단백질의 분리 정제

p14 단백질만 안정적으로 발현되는 결과(10 ㎖ 배양, 1mM　IPTG)를 바탕으로 대용량 배양 (300 ㎖)을 실시한 결과 유도(0.1 mM IPTG)가 안정적으로 되는 것을 확인하였다 (도 6a 참조). 또한 300 ㎖ 배양된 세포를 회수하여 BUGBUSTER MASTER MIX (Merk)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질에서 HIS taq BUGBUSTER NI-NTA HIS*BIND PURIFICATION KIT (Merk)를 이용하여 2 ㎖ 중 20 ㎕를 SDS-page한 결과 정제가 되었음을 확인하였다. 정제의 순도를 확인하기 위해 정제과정 중 HIS taq 컬럼에 통과되어 나온 액 (Flow thro㎍h), 세척과정에서 발생한 액 (wash fraction)과 정제된 단백질 (elution fraction)을 코마시 블루 250 염색으로 확인한 결과 정제가 양호하게 되었음을 확인하였다. 또한 동일한 방법으로 여러 차례 회수된 p14 단백질을 투석 과정을 통해서 그 단백질이 잘 유지되고 있음을 확인하였다 (도 6b 참조).

사. p14 재조합 단백질의 아미노산 서열분석(도 7 참조)

대장균에서 발현된 p14 재조합 단백질을 전기영동한 후에 코마시(Coomassie) 젤에서 밴드를 회수하여 Destaining 용액 (50% MeOH/D.W) 100 ㎕를 넣고 5분간 교반한 후 Destaining 용액을 완전히 제거한다. 그리고 200 mM ABC (ammonium bicarbonate, pH 7.8) 용액을 100 ㎕ 넣고 20분간 보관한 후 ABC 용액을 제거한 후, 100 ㎕의 아세토니트릴을 넣고 2분간 볼텍싱한다. 아세토니트릴 용액을 제거하고, 100 ㎕의 ABC 용액을 넣고 2분간 볼텍싱한다. ABC 용액을 제거한 후, 100 ㎕의 아세토니트릴을 넣고 2분간 볼텍싱한다. 위 과정을 총 3회 반복한다. 위 8의 마지막 단계에서 아세토니트릴을 완전히 제거하고, 상온에서 젤을 말린다. 건조된 젤에 20 ㎕의 트립신 용액 (0.2㎍)을 넣고 얼음에서 45분간 보관한다. 젤에 흡수된 트립신 용액외 나머지는 다시 제거한다. 70 ㎕의 50mM ABC 용액을 넣고, 37℃에서 12시간 이상 보관한다. Geload Tip과 Poros R2 레진을 이용하여 마이크로 스케일의 컬럼을 제작한다. 10 ㎖의 주사기를 이용하여 마이크로 컬럼에 압력을 줄 수 있게 주사기 앞쪽을 컬럼과 일치하도록 제작한다. 제작된 컬럼에 20 ㎕의 5% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼을 통과시킨다. (평형화) In-gel digestion에서 만들어진 펩타이드 용액 30 ㎕를 마이크로 컬럼에 넣고 주사기로 통과시킨다. (로딩) 20 ㎕의 5% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼을 통과시킨다. 1.5 ㎕의 50% 메탄올/49% H₂O/1% 포름산 용액을 넣고 주사기를 이용하여 컬럼내 펩타이드를 용출한다(세정). 1.5 ㎕의 용출물은 nanoelectrospray needle (EconoTipTM, New Objective, USA)에 넣고 Q-TOF 소스에 장착한다(elution). MS 기기: Hybrid Quadrupole-TOF LC/MS/MS Mass Spectrometer (AB Sciex Instruments, CA 94404 USA)를 이용하여 분리된 단백질의 아미노산 서열을 분석하였다. 분석결과 10, 14, 14개의 펩타이드 세개를 분석한 결과 p14 아미노산 서열과 일치함을 확인하였다(프로테인 웍스에서 수행함).

실험예 : p14 의 항알러지 효과 평가

가. 비장 세포를 이용한 항알러지 효과 확인

Balb/c 마우스에서 비장을 적출하여 세포만 분리하고, 분리한 비장 세포를 2x10⁶ 세포들/㎖ 로 각 웰에 분주하였다. 비장 세포(splenocytes)를 알러지 질환에서와 유사하게 활성화시키기 위해 Concanavalin A(ConA)를 1㎍/㎖로 처리하였다. 표적 단백질인 p13 및 p14 농도별로 각 웰에 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 원심분리기를 이용하여 상층액만을 분리하여 ELISA를 이용하여 측정하였다. 대조군으로서 본 발명의 p14 단백질을 포함하지 않는 PBS 용액 만을 처리하여 비교하였다. IL-4 싸이토카인의 농도 변화를 측정한 경우에는 p13과 p14 단백질을 동일한 비율로 혼합하여 처리(MIX)한 결과도 함께 비교하였다. T 헬퍼(Th)1 계열의 대표적인 싸이토카인 INF-γ와 Th1 계열의 대표적인 IL-4 싸이토카인의 농도 변화를 측정하여 도 8a 및 도 8b에 각각 나타내었다. 그 결과 도 8a-8b에서 확인되는 바와 같이, INF-γ는 p14 단백질에 의해 양이 증가하는 것을 확인하였고, IL-4는 Con A 단독처리군에 비해 p14 단백질 처리군에서 다소 감소하였다. 이러한 결과를 통해서 본 발명의 p14 단백질이 INF-γ를 상승시키고 IL-4의 생산을 억제함으로써 항알러지 활성을 발휘한다는 것을 확인할 수 있다.

나. 마우스 마크로파아지 세포를 이용한 항알러지 효과 확인

본 발명의 유산균 유래의 단백질 p14의 항알러지 효과를 확인하기 위해서, 마우스 마크로파아지 세포에 p14 단백질을 처리하여 NO의 발생량을 확인하는 실험을 진행하였다. 마우스 마크로파아지 세포에서의 NO의 증가는 면역세포의 활성증가 측면에서 항알러지 효과를 관찰하는 파라미터로 이용된다. 따라서 마우스 마크로파아지 (Raw 264.7) 세포를 이용한 NO의 발생량을 확인하였다. 정제한 14KD 단백질의 확인을 위하여 Raw 264.7 세포를 각 웰에 5*10E+5/웰의 양으로 공급하였다. LPS(lipopolysaccharide) 처리와 동시 재조합 단백질 14KD의 농도별 (10, 100, 1000 ng/㎖) 처리를 시행하고, 처리 후 시간대별 (24H:도 9a, 48H:도 9b, 72H:도 9c) 변화에 따른 NO 발생량을 측정하여 그 결과를 나타내었다. 도 9a-도 9c에 도시된 바와 같이, 모든 시간대에서 his tag이 제거된 p14에서 가장 높은 NO 발생량을 관찰하였다. 이러한 결과는 마우스 마크로파아지 (raw 264.7) 세포에서는 His tag 제거된 순수 p14에서 항알러지 효과가 있음을 입증하는 것이다. 이 실험에서 특이적으로 His tag이 제거되지 않은 p14 단백질과 비교해서 His tag이 제거된 p14 단백질(p14-E)의 NO 증가량이 높은 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 마우스 마크로파아지 세포에서는 His tag이 제거된 순수 p14 단백질에서 항알러지 효과가 있음을 보여주고 있다.

다. NC/Nga 마우스를 이용한 항알러지 효과 확인

본 발명의 유산균 유래의 단백질 p14의 항알러지 효과를 확인하기 위해서 아토피 피부염 질환 실험동물 모델인 NC/Nga 마우스의 목 부위부터 꼬리부위까지 이발기 및 제모제를 사용하여 제모하였다. 제모한 후, 제모 과정을 통해 발생할 수 있는 아토피 피부염 질환 외의 다른 피부질환 및 상처로부터 영향을 받지 않도록 하루 정도 방치하였다. 아세톤과 올리브 오일을 1:3 비율로 혼합한 후, 각 마리당 1% DNCB 를 200㎕ 씩 제모한 부위에 도포하여 아토피 피부염을 총 8회 유발시켜 아토피 질환을 유도하였다.

아토피 피부염을 유발한 후, p13 및 p14 단백질을 4㎍, 40㎍, 400㎍ 씩 NC/Nga 마우스 복강에 주 2회씩 총 4주간 투여하여 실험하였다. 음성 대조군(NC)은 거짓 대조군(sham group)에 해당되는 정상군이고, 양성 대조군(PC)은 DNCB에 의해 아토피성 피부염이 유발된 NC/Nga 마우스 그룹이다. 4주간 실험하면서 주 1회씩 마우스의 눈에서 혈액을 얻는 안와 채혈을 실시하였다.

4주 후, 마우스를 희생하여 환부를 조심스럽게 제모하여 육안으로 아토피 피부염 상태를 확인한 결과 양성 대조군에 비해 p13 및 p14 단백질 모두 아토피 피부염의 상태가 상당히 호전된 것을 확인하였다 (도 10 참조). 또한 아토피 피부염 유발 실험동물에서 주둥이나 앞발이 닿는 부위 (앞발 부위, 옆구리 부위 및 꼬리 부분) 는 p13 보다 p14 실험군 마우스가 더 호전된 상태를 확인하였다. 특히 병변의 육안 상태만을 확인해서는 p14 단백질이 아토피 피부염에 효과가 있는 것으로 확인되었다. 가려움으로 의해 긁는 행동에서 유발되는 2차 감염 증상도 p14 단백질이 현저하게 줄어든 것을 확인하였다.

면역글로불린 E (IgE)는 아토피 피부염 환자에서 그 수치가 정상인에 비해 비정상적으로 항진되는 현상이 수많은 국제학술지에서 보고되고 있으며, 실제 치료에서도 IgE를 낮추는 치료제를 사용하기 때문에, IgE 는 알러지 치료의 주요 지표로 알려져 있다. 인터루킨(IL)-4 역시 T 헬퍼(Th) 2 계열의 사이토카인으로 아토피 피부염 환자에서 IL-4, IL-5, IL-13과 같은 Th2 계열의 사이토카인이 전반적으로 정상인에 비해 항진된다는 보고가 여러 국제 학술지에 보고되고 있다. 그 중 대표적인 Th2 계열의 사이토카인이 IL-4이기 때문에, IgE와 IL-4가 아토피 피부염의 대표적인 중요 지표이다. 혈액 내 IgE 수준의 비교는 enzyme-linked immunoserological assay (ELISA) 방법을 이용하여 혈액으로부터 혈청을 분리하여 IgE의 변화를 확인하였다. IgE 수준을 비교한 결과, 양성 대조군에 비해 p13, p14 단백질 복강투여 군에서 IgE의 수준의 유의성 있는 감소를 확인하였다 (도 11 참조).

혈액 내 IL-4 수준의 비교 역시 위와 동일한 방법으로 IL-4의 수준을 비교 분석하였다. 그 결과 p13과 p14 단백질의 모든 군에서 양성대조군의 비교하여 혈액 내 IL-4 수준이 감소되는 경향을 확인하였다. (도 12 참조). 특히 p14 단백질 투여군에서 IL-4 수준이 p13 단백질 보다 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 p14 단백질은 생체내 (in vivo)에서 아토피 피부염을 개선시키는 우수한 효능을 제공할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

본 발명은 그 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항알러지 활성을 갖는 p14 단백질을 포함하는 항알러지 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 또는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 항알러지 약제학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 약 14kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 항알러지 약제학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체 또는 버퍼를 추가로 포함하는 항알러지 약제학적 조성물.

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