KR101365735B1

KR101365735B1 - 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR101365735B1
Application number: KR1020120041102A
Authority: KR
Inventors: 최영환; 최영현; 김윤한; 박세진; 박철; 김원재; 황혜진; 윤무경; 곽정호; 라자세커 시타라만
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2014-02-21
Also published as: KR20130118140A

Abstract

본 발명은 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 혈액종양의 치료 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 의약 조성물은 인체 혈액종양 세포에서 사멸 수용체인 DR4 및 사멸 수용체 리간드인 FasL의 발현을 상향 조절하고 카스파아제-8을 활성시키며 Bid 분해를 촉진시킴으로써 미토콘드리아 기능 이상을 통한 카스파아제-9 및 카스파아제-3의 활성화와 기질 단백질들의 분해를 유발하여 아폽토시스를 유발하는 효과가 있으므로 개선된 효과를 갖는 혈액종양의 치료 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating hematological malignancies including hexane extract of garlic fermented by yeast}

본 발명은 개선된 효과를 갖는 혈액종양의 치료 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다.

최근 산업의 발달과 식생활의 서구화에 따라 급격하게 증가하고 있는 암은 인체에서 정상적으로 조절되지 않고 침윤 및 전이를 유발하는 난치성 질병으로서 모든 사망원인 중 약 30% 정도를 차지하고 있다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 및 미국암학회(American Cancer Society, ACS)의 암 발생 통계를 기초로 살펴보면 2007년에는 약 760만 명 정도가 암으로 사망한 것으로 보고되고 있지만 아직도 암의 발생 및 치료기전이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다.

혈액종양은 화학적 항암제에 저항성이 있으므로 치료가 어려우며 재발의 확률도 매우 높은 것으로 보고되고 있다. 혈액종양의 치료를 위하여 사용되고 있는 다양한 종류의 항암제들은 개인에 따라서 약리작용이 다르게 나타나고 독성에 의한 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 혈액종양을 치료하는데 있어서 보다 더 효과적인 생리활성을 지닌 물질을 발굴하는 것이 중요하다.

암을 치료하는 방법 중 암세포의 죽음을 유발시키는 것이 효율적인 방법 중 하나로서 대두되고 있는데, 이러한 암세포의 죽음은 크게 네크로시스(necrosis)와 아폽토시스(apoptosis)의 과정으로 유발된다. 네크로시스는 세포를 둘러싼 환경이 급격하게 변하여 세포가 더 이상 적응할 수 없으면 세포의 팽창, 이온 농도의 변화 및 물의 유입 등과 같은 조절되지 않는 상태로 유발되는 세포의 죽음으로서 에너지 비의존적이며 네크로시스가 유발된 세포의 내용물이 유출 또는 방출되어 근처에 위치한 정상세포에 영향을 미치게 되며 면역 반응의 손상을 유발하기도 한다. 반면에 프로그램된 세포의 죽음으로 알려진 아폽토시스는 개체의 정상적인 발달과 분화에 관여하며, 태아의 형태형성, 난자의 배란, 신경세포의 시냅스 형성 등과 연관된 체내 비정상적인 세포들을 제거하는 기전으로서 개체의 발생단계나 DNA 손상, 바이러스 감염 등에 의한 유전적 조절 하에서 일어나는 정교한 인체방어기전이다. 이러한 아폽토시스의 균형은 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하지만, 아폽토시스 과정이 실패하게 되면 암과 같은 여러 가지 질병의 원인이 되므로 암화 과정의 여러 단계에서 암을 치료하는 중요한 표적이 되고 있다.

마늘은 항암, 항염증, 항균 등의 다양한 생리활성 효과를 나타내고 있으나, 그 효능을 높이기 위하여 외국에서는 aged garlic을 우리나라에서는 흑마늘을 이용하고 있는데, 초기에는 발효 마늘이라고 하였으나, 당화에 의한 것으로 증명되고 있다. 최근에는 발효가 마늘의 효능을 높일 수 있는 방법으로 생각되어 다양한 방법으로 마늘의 발효방법을 연구하였으나, 마늘의 항균작용 등으로 인하여 발효가 매우 어려운 것으로 알려지고 있다.

한국공개특허 제 2008-0074473호에는 항산화 기능과 항암활성을 가진 수용성 알릴황화합물이 강화된 발효숙성 흑마늘 제조방법에 대하여 개시하고 있다.

한국공개특허 제 2008-0074473호

본 발명은 혈액종양 세포에서 아폽토시스를 유발하여 개선된 효과를 갖는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 혈액종양은 림프종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병 및 림프구성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 바야누스, 사카로마이세스 우바룸 및 세네데스무스 엘립소이데우스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 헥산 추출물은 혈액종양 세포에서 아폽토시스를 유발하는 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

5. 위 4에 있어서, 상기 아폽토시스는 DR4(death receptor 4) 및 FasL의 발현 증가; Bid의 분해(cleavage) 촉진; 또는 카스파아제-3, 카스파아제-8 및 카스파아제-9의 활성화와 PARP, 베타카테닌 및 PLC-γ1의 분해 유발에 의한 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

6. 위 1에 있어서, 다른 혈액종양 치료제를 추가로 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

7. 위 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택된 제형인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

본 발명의 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 의약 조성물은 인체 혈액종양 세포에서 사멸 수용체인 DR4 및 사멸 수용체에 특이적인 단백질 리간드인 FasL 발현을 증가시키고, 카스파아제를 활성시키며 Bid 분해를 촉진시킴으로써 아폽토시스를 유발하는 효과가 있으므로 개선된 효과를 갖는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

도 1은 마늘 1kg을 분쇄하여 생수 1.5L와 이스트를 첨가하여 발효시키고, 14일 후에 마늘의 발효 현상을 찍은 사진이다.
도 2는 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF의 추출방법을 나타낸 것이다.
도 3은 마늘을 동결건조한 후 순차 추출한 GAHF, GAEF, GAMF 및 GA8MF 및 GAWF의 추출방법을 나타낸 것이다.
도 4는 발효마늘 추출물인 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF와 동결건조마늘 추출물인 GAHF, GAEF, GAMF, GA8MF 및 GAWF을 처리한 U937세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 5는 발효마늘 추출물인 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF를 처리한 U937 세포의 생존율 및 증식정도를 나타낸 것이다.
도 6은 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF를 처리한 U937 세포의 형태 및 핵의 형태를 나타낸 것이다.
도 7은 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF을 처리한 U937 세포의 아톱토시스 정도를 나타낸 것이다.
도 8은 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF을 처리한 U937 세포에서 아폽토시스 유발 관련 단백질의 발현정도를 나타낸 것이다.
도 9는 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF을 처리한 U937 세포에서 카스파아제-3, 카스파아제-8 및 카스파아제-9의 활성 변화와 기질 단백질인 PARP, 베타카테닌 및 PLCγ-1의 분해정도를 나타낸 것이다.
도 10은 N15HF가 유발하는 U937 세포의 아폽토시스에 있어서 카스파아제-3 억제제의 영향을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 효모로 발효된 마늘에서 유래한 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF의 추출 방법과 이렇게 추출된 N15HF(헥산추출물)가 혈액종양세포의 아폽토시스를 유발하는 것을 규명한 것에 기초한다.

본 발명의 효모로 발효된 마늘의 헥산추출물인 N15HF는 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용된 깐마늘(Allium sativum L. cv. Daeseo)은 경남 창녕에서 수확한 마늘을 2011년 5월에 주식회사 뉴그린식품 (Changnyong, Korea)에서 공급받았으며, -20℃에서 보관한 다음 한일 믹서기(HMF-3100S, Hanil Ltd, Korea)로 분쇄한 후 실험에 사용하였다.

발효균주로는 효모를 이용하고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 바야누스, 사카로마이세스 우바룸, 세네데스무스 엘립소이데우스일 수 있으며, 더 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(인스턴트 건조 효모, 인천, 전원식품), 사카로마이세스 세레비지애 KCTC7920, FF-8, TD03, CTB14, JY-209 및 TW50 일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

배양액은 100ml의 증류수를 30~45℃로 조정한 후 0.5~2g의 설탕과 1~5g의 효모를 첨가하여 약 10~50분간 30~45℃의 인큐베이터에서 배양한 다음, 분쇄마늘에 균일하게 접종한다. 이후 플라스틱 용기(5L)에 분쇄 생마늘 1kg과 1~2L의 생수를 잘 섞은 다음 배양한 효모를 첨가하여 뚜껑을 닫고 15~40℃에서 1~3주간 발효시킨다.

발효마늘 약 2~3L(생마늘 1kg 상당량)를 여과장치를 이용하여 감압 여과(No. 2 filter paper, Whatman, Maidstone, England)한다. 여과액은 진공농축기를 이용하여 약 1~1.5L로 농축한 후, n-헥산(1L×3), 에틸아세테이트(1L×3), 그리고 수포화 n-부탄올(BuOH, 1L×3)로 순차 용매분획한다. 얻어진 각 용매분획층들은 40~50℃에서 감압 농축하여 N15HF(헥산추출물), N15EF(에틸아세테이트추출물), N15BF(부탄올추출물) 및 N15WF(잔여물)를 얻는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 효모로 발효된 마늘의 헥산추출물을 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물일 수 있다.

상기의 혈액종양은 림프종, 다발성골수종, 골수성백혈병 및 림프구성 백혈병을 포함하고 상기 기재질병의 하위질환도 포함한다.

본 발명에서의 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물은 DR4(death receptor 4) 및 FasL의 발현증가, Bid의 분해(cleavage) 촉진 또는 카스파아제-3, 카스파아제-8 및 카스파아제-9를 활성화와 PARP, 베타카테닌 및 PLC-γ1의 분해 유발로 이루어진 군에서 선택된 효능에 의하여 혈액종양 세포에서 아폽토시스를 유발한다.

본 발명의 의약 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 의약 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B1, B2, B6, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘 및 이들의 혼합물 등의 무기 또는 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 혈액종양의 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 투여를 위해서 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화 할 수 있다. 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제 및 유제 등이 될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가로스, 벤토나이트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 의약 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 혈액종양 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 혈액종양의 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1. N15HF , N15EF , N15BF 및 N15WF 를 발효마늘에서 추출

깐마늘(Allium sativum L. cv. Daeseo)을 주식회사 뉴그린식품 (Changnyong, Korea)에서 공급받아서 믹서기(HMF-3100S, Hanil Ltd, Korea)로 분쇄한 후 실험에 사용하였다. 발효마늘 조제는 플라스틱 용기(5 L)에 분쇄 생마늘 1kg과 1,500ml의 생수를 잘 섞은 다음 전원식품에서 구입한 인스턴트 건조 효모(사카로마이세스 세레비지애)를 첨가하여 뚜껑을 받고 약 25℃에서 2주간 발효시켰다.

발효마늘 약 2.5ℓ(생마늘 1kg 상당량)를 여과장치를 이용하여 감압 여과(No.2 filter paper, Whatman, Maidstone, England)한 여과액을 진공농축기를 이용하여 약 1L로 농축한 후, n-헥산(1L×3), 에틸아세테이트(1L ×3), 그리고 수포화 n-부탄올(BuOH, 1L×3)로 순차 용매분획하였다. 각각의 매 분획층들은 45℃에서 감압 농축하여 N15HF(63mg), N15EF(384mg), N15BF(11.89g) 및 N15WF(96.30g)을 얻었다(도 2 참조).

실험예 1. N15HF 처리에 의한 U937 세포의 생존율 및 증식 억제 확인

인체 혈액종양 세포주인 U937 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 암세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10%의 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 및 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신(Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 성장 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장 배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.

U937 세포의 생존율을 측정하기 위하여 세포를 적정수로 분주한 다음 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

대조군으로는 동결건조마늘 100g을 분쇄하여 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 80% MeOH 및 물로 추출하여 얻은 헥산 추출물 273.9mg(GAHF), 에틸아세테이트 추출물 74.3 mg(GAEF), 메탄올 추출물 3.41g(GAMF), 80% 메탄올 추출물 12.86 g (GA8MF) 및 물 추출물 51.43g(GAWF)을 상기와 동일한 방법으로 처리하였다.

24시간 후 2,000rpm에서 5분간 원심분리하여 배지를 제거하고 인산완충식염수(PBS)를 각 well 당 1ml을 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 0.5% 트리판블루 용액(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 동량으로 첨가하여 2분간 처리하였다. 처리된 세포를 혈구계(hemocytometer)에 적용한 후 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였으며, 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.

또한 U937 세포의 성장억제 정도를 측정하기 위하여 MTT 분석법을 이용하였다. 먼저 세포에 발효마늘 추출물인 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF를 적정농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 MTT 시약을 0.5mg/ml 농도로 희석하여 200μl씩 분주하고 37℃에서 3시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 1ml씩 분주하여 well에 생성된 포마진을 모두 녹인 후 효소면역분석기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.

측정 결과, 동결건조마늘 추출물과 N15EF, N15BF 및 N15WF를 처리하였을 경우에는 10μg/ml 농도까지 생존율 및 증식에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 하지만 N15HF를 처리하였을 경우에는 4μg/ml 처리군에서부터 생존율 감소 및 증식 억제 현상이 유발되었으며 최고 농도인 10μg/ml 처리군에서는 약 60% 정도의 생존율 감소 및 증식억제 효과가 나타났다(도 4, 5 참조).

실험예 2. N15HF 처리에 의한 U937 세포 형태 변화 확인

N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF 처리에 의한 세포의 형태 변화 정도를 살펴보기 위하여 각각의 시료를 적정 농도로 희석 처리하여 배양하였다. 24시간 경과 후, 처리농도에 따른 성장 정도와 형태의 변화를 도립 현미경(inverted microscope)을 이용하여 200배의 배율로 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

그 결과, N15EF, N15BF 및 N15WF 처리군에서는 아무런 형태적인 변화가 관찰되지 않았지만 N15HF 처리군의 경우에는 처리농도의 증가에 따라서 전체적인 세포의 밀도가 감소하였고 심한 형태적 변형이 관찰되었으며 특히 아폽토시스 유발 시 특이하게 관찰되는 세포막 수포화 현상이 나타났다(도 6 A 참조).

실험예 3. N15HF 처리에 의한 U937 세포에서의 아폽토시스 유발 확인

아폽토시스가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF가 처리된 세포를 모은 다음 PBS로 세척하고 37% 파라포름알데히드 용액과 PBS를 1 : 9의 비율로 섞은 고정용액을 이용하여 실온에서 10분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 세척하고 2.5μg/ml 농도의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.

그 결과, 정상 배지에서 자란 암세포에서 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나 N15HF가 처리된 암세포의 경우는 전체적으로 N15HF 처리농도의 증가에 따른 밀도의 감소와 더불어 아폽토시스가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 아폽토시스체(apoptotic body)가 관찰되었다(도 6 B 참조).

또한 아폽토시스 유발의 증거 중 하나인 DNA 단편화 현상을 확인하기 위하여 각각의 시료가 처리된 세포를 모아서 상층액을 제거하고 라이시스 버퍼[5mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100]를 첨가하여 상온에서 세포를 용해시킨 다음 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 프로테이나제 K 용액을 처리하여 50℃에서 3시간 동안 반응시키고 동량의 페놀 : 클로로폼 : 이소아밀알콜 혼합 용액(25 : 24 : 1, Sigma)을 첨가하고 30분간 회전교반 시킨 다음 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상층액에 이소프로필알콜과 5 M NaCl을 첨가하여 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고 DNA를 추출하였다. 이렇게 추출된 DNA에 RNase A가 적당량 들어있는 TE 버퍼를 이용하여 녹여서 1.6% 아가로스 겔로 전기영동 시킨 후 브롬화에티듐(EtBr, Sigma)으로 염색하여 DNA 단편화 현상을 확인한 다음 자외선 하에서 사진 촬영하였다.

그 결과, N15HF 처리에 의하여 아폽토시스가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA 단편화 현상을 관찰할 수 있었으며, 이는 핵산내부가수분해효소(endonuclease)가 활성화되어 염색체 DNA가 단편화되었음을 의미하는 것이다(도 7 C 참조).

다음으로 N15HF 처리에 의한 아폽토시스 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF가 24시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 원심분리하여 상층액을 제거한 후 차가운 PBS를 이용하여 세척하였다. 준비된 세포에 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm 그물망을 이용하여 단일세포로 분리한 후 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에서 형광-활성 세포 선별 분석을 통해 아폽토시스가 유발된 세포들을 측정하였다.

측정 결과, 정상 배지에서 자란 암세포에서의 자연적인 아폽토시스 유발 빈도는 1.77%로 매우 낮았으나 N15HF 처리 농도가 증가할수록 저이배체 세포의 빈도가 증가하여 7.5 및 10μg/ml 처리군에서는 각각 18.72 및 24.74%에 해당하는 세포가 저이배체에 해당하는 세포로 나타났다. 하지만 N15EF, N15BF 및 N15WF 처리군의 경우에는 핵의 형태변화, DNA 단편화 현상 및 저이배체 세포 군집의 빈도에서 정상 배지군과 비교하여 큰 변화가 나타나지 않았다(도 7 A, B 참조). 이러한 결과들은 N15HF가 인체 혈액종양 세포인 U937 세포에서 유발하는 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화의 경우 아폽토시스 유발과 밀접한 연관이 있다는 것을 의미한다.

실험예 4. N15HF 처리에 의한 U937 세포에서 아폽토시스 유발 단백질들의 발현에 미치는 영향 확인

아폽토시스에 의한 세포 사멸에 있어서 Fas, DR4 및 DR5 등과 같은 사멸 수용체와 FasL 및 TRAIL 등과 같은 사멸 수용체 리간드가 관여하는 사멸 수용체 경로와 함께 Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad 및 Bid를 포함하는 Bcl-2 유전자군에 의해 유발되는 미토콘드리아 경로가 중요한 역할을 한다.

사멸 수용체 경로의 초기 이벤트에 관여하는 FasL는 type II 막전위 단백질(transmembrane protein)로서 종양괴사인자수용체(TNFR) superfamily인 Fas에 결합하여 면역 항상성(immune homeostasis)에 중요한 역할을 하고 아폽토시스를 유발한다. 또한 TRAIL은 모두 다섯 종류의 리간드와 결합을 하는데 정상세포의 경우는 오스테오프로테게린, DcR1 및 DcR2와 같은 세 종류의 디코이 수용체와 결합하므로 아폽토시스를 일으키지 못하지만 암세포에서는 DR4 및 DR5와 결합을 하여 아폽토시스를 일으키는 것으로 알려져 있다. 한편 미토콘드리아 경로의 초기 이벤트에 중요한 역할을 하며 미토콘드리아 외박에 존재하는 Bcl-2 단백질군은 Bcl-2 및 Bcl-XL 등과 같은 항-아폽토시스 유전자와 Bax, Bad 및 Bid 등과 같은 전-아폽토시스 유전자로 구성되어 있으며, 이들 사이에 균형이 깨어지게 되면 미토콘드리아의 기능이상을 통한 아폽토시스를 유발한다.

또한 아폽토시스에 관여하는 여러 인자들 중 최근 밝혀진 아폽토시스 단백질 억제자(inhibitor of apoptosis protein, IAP)군에 속하는 몇몇 단백질들은 카스파아제와 직접적으로 결합하여 카스파아제의 아폽토시스 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 N15HF가 상기의 유전자들을 조절함으로써 아폽토시스를 유도하는지 여부를 조사하였다.

N15HF, N15EF, N15BF 및 N15WF가 24시간 동안 처리된 세포를 모은 다음 적당량의 라이시스 버퍼 [25mM 트리스-Cl (pH 7.5), 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 1mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5mM 디티오트레이톨(DTT)]를 첨가하여 4^oC에서 1시간 동안 반응시킨 후, 14,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio Rad 단백질 정량 시약(BioRad Lab., Hercules, CA)을 이용하여 제조업자의 설명에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer(Bio-Rad)를 섞어서 단백질 샘플을 만들었다. 동량의 단백질 샘플을 도데실 황산나트륨(SDS)-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, 니트로셀룰로스 막(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 일렉트로블로팅에 의해 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 니트로셀룰로스 막에 탈지유를 처리하여 비특이적인 단백질들을 억제하고 지정된 일차 항체와 이차 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 ECL 검출 시스템을 적용시킨 다음 엑스-레이 필름에 감광시켜 특정단백질의 발현양을 분석하였다.

먼저 사멸 수용체 경로의 활성화에 관여하는 사멸 수용체 및 리간드들의 발현 정도를 확인한 결과, TRAIL, DR5 및 Fas의 발현에는 큰 변화가 나타나지 않았지만 DR4 및 FasL의 경우에는 N15HF 처리농도 의존적으로 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 다음으로 N15HF가 미토콘드리아 경로의 활성화에 관여하는 Bcl-2 유전자군들의 발현이 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과, 항-아폽토시스 유전자인 Bcl-2 및 Bcl-XL과 전-아폽토시스 유전자인 Bax 및 Bad의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하였지만, 전-아폽토시스 유전자로서 사멸 수용체 경로를 통한 카스파아제-8의 활성화로 인하여 단편화 현상이 유발되는 것으로 알려진 Bid 단백질의 경우 단편화된 형태인 tBid의 발현이 증가하는 것으로 조사되었다. 또한 아폽토시스 단백질 억제자군에 속하는 XIAP, cIAP-1, cIAP-2 및 survivin의 경우에는 N15HF 처리에 따른 발현 변화가 나타나지 않았다(도 8 참조). 이러한 결과들은 N15HF가 인체 혈액종양 세포인 U937 세포에서 사멸 수용체 경로를 통하여 아폽토시스를 유발한다는 것을 의미한다.

실험예 5. N15HF 처리에 의한 U937 세포에서의 카스파아제의 활성 여부와 기질단백질의 분해여부 확인

아폽토시스 유발에 있어서 여러 종류의 카스파아제가 관여하는 것으로 알려져 있는데 이러한 카스파아제는 세포가 정상적으로 성장 및 생존할 때 핵과 미토콘드리아의 외막에 불활성 상태인 전효소(proenzyme) 형태로 존재하고 있지만 아폽토시스를 유발하는 세포 내외의 자극에 의하여 활성화되어 표적 단백질들의 분해를 유발한다. 이러한 카스파아제는 개시 카스파아제인 카스파아제-8 및 -9와 실행 카스파아제인 카스파아제-3으로 나누어지며 세포 내외부의 다양한 신호전달에 의해서 활성화된 개시 카스파아제에 의하여 하위단계에 있는 실행 카스파아제가 활성화되면서 세포의 성장 및 생존에 중요한 역할을 하는 여려 종류의 기질 단백질들을 분해하여 아폽토시스를 유발하는 것으로 알려져 있다. 한편 카스파아제에 의하여 분해가 유발되는 기질 단백질로는 DNA 수선이나 유전자의 안정화에 관여하는 PARP, 세포 내 골격 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절 및 세포 유착에 관여하는 베타카테닌과 더불어 세포의 증식에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려진 PLC-γ1 등이 있으며, 이러한 기질 단백질들의 분해는 아폽토시스 유발의 생화학적 표식자로 사용이 되고 있다.

따라서, N15HF로 24시간 처리된 U937 세포에서 카스파아제-3, -8 및 -9의 발현 및 활성 정도와 기질 단백질들의 분해 유무를 조사하였다.

아폽토시스 유발에 있어서 중요한 작용을 하는 것으로 알려진 카스파아제의 효소 활성은 colorimetric 측정키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 지정된 시간 동안 약물의 존재 또는 부재 조건에서 배양된 세포를 모은 다음 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량하였다. 150μg의 단백질이 함유된 50μl의 샘플에 기질 100μM이 함유된 reaction buffer [40mM HEPES (pH 7.4), 20% 글리세롤 (v/v), 1mM 이디티에이, 0.2% NP-40 및 10mM DL-DTT] 50μl를 혼합하여 각 샘플당 총 부피가 100μl가 되도록 하였다. 여기에 카스파아제 종류에 따른 기질 5μl를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 효소면역분석기를 이용하여 405nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용된 기질은 카스파아제-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-나이트로아닐린(pNA)이었고 카스파아제-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)-pNA이었으며, 카스파아제-9은 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)-pNA였다.

측정 결과, 카스파아제-3 및 -8의 경우에는 활성형(active-form) 단백질의 발현이 N15HF 처리에 의하여 증가하는 것을 알 수 있었고 카스파아제-9의 경우에는 활성형 단백질의 발현은 나타나지 않았지만 불활성형인 전구 형태(pro-form)의 단백질의 발현이 감소하는 것으로 조사되었다(도 9 A 참조).

이상의 결과를 재확인하기 위하여 카스파아제의 활성 정도를 직접 분석한 결과, N15HF 처리에 의하여 카스파아제-3, -8 및 -9 모두 활성정도가 급격하게 증가되었다(도 9 B 참조). 다음으로 활성화된 카스파아제-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 몇 가지 기질 단백질의 발현에 미치는 N15HF의 영향을 조사한 결과, PARP, 베타카테닌 및 PLC-γ1 모두에서 주단백질의 발현감소 또는 분해된 단백질의 발현이 증가되는 것으로 조사되었다(도 9 A 참조). 이러한 결과들은 N15HF 처리에 따른 인체 혈액종양 세포인 U937 세포에서의 아폽토시스 유발이 DR4 및 FasL의 발현 증가로 인한 카스파아제-8의 활성화와 그에 따른 Bid의 단편화에 의하여 미토콘드리아의 기능 이상이 유발되어 카스파아제-9의 활성화 및 카스파아제-3의 활성화에 의한 기질 단백질들의 분해를 통하여 일어난다는 것을 알 수 있었으며, 특히 카스파아제-3의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6. 카스파아제 -3 활성 억제시 N15HF 에 의하여 유발된 U937 세포에서의 아폽토시스 억제 확인

상기의 결과를 살펴보면 인체 혈액종양 세포인 U937 세포에서 N15HF가 유발하는 아폽토시스에서 카스파아제-3의 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으므로 카스파아제-3의 활성을 억제하였을 경우에 아폽토시스가 억제되는 지를 여러 가지 방법으로 조사하였다.

먼저 아폽토시스체 및 저이배체의 발현 정도를 관찰한 결과, N15HF가 처리된 배지에서 자란 암세포의 경우는 아폽토시스체 및 저이배체의 발현이 증가되었지만 카스파아제-3 억제제인 z-DEVD-fmk를 1시간 선처리하여 카스파아제-3의 활성을 억제한 다음 N15HF을 처리하였을 경우에는 정상 배지에서 자란 암세포와 마찬가지로 아폽토시스체 및 저이배체가 거의 관찰되지 않았다(도 10 A,B 참조). 다음으로 N15HF에 의하여 유발된 증식억제 및 DNA 단편화 현상이 z-DEVD-fmk에 의하여 회복되는지를 확인한 결과, z-DEVD-fmk을 선처리하였을 경우 N15HF 처리에 의하여 유발된 증식억제 및 DNA 단편화 현상이 현저하게 회복되는 것으로 조사되었다(도 10 C,D 참조). 마지막으로 N15HF에 의한 카스파아제-3 및 기질 단백질들의 발현 변화와 카스파아제-3의 활성 증가의 경우에도 z-DEVD-fmk에 의하여 거의 완벽하게 회복되는 것으로 조사되었다(도 10 E,F 참조). 상기의 결과들은 인체 혈액종양 세포인 U937 세포에서 N15HF에 의하여 유발되는 아폽토시스의 경우에 카스파아제-3가 중요한 조절자로서 역할을 한다는 것을 보여준다.

Claims

사카로마이세스 속 효모로 발효된 마늘의 헥산 추출물을 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 혈액종양은 림프종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병 및 림프구성 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 바야누스 및 사카로마이세스 우바룸으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 헥산 추출물은 혈액종양 세포에서 아폽토시스를 유발하는 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 아폽토시스는 DR4(death receptor 4) 및 FasL의 발현 증가; Bid의 분해(cleavage) 촉진; 또는 카스파아제-3, 카스파아제-8 및 카스파아제-9의 활성화와 PARP, 베타카테닌 및 PLC-γ1의 분해 유발에 의한 것인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 헥산 추출물 이외의 혈액종양 치료제를 추가로 포함하는 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택된 제형인 혈액종양의 예방 또는 치료용 의약 조성물.