KR101364428B1 - 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 함유하는 암 치료제 - Google Patents
암 특이적 막 항원에 대한 항체를 함유하는 암 치료제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 과제는, 트라스투주맵의 무효예를 감소시키는 것을 가능하게 하는 신규한 방법으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 함유하는 암 치료제를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 암 치료제가 제공된다.
Description
본 발명은 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 함유하는 암 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 암 치료제와 병용되는 세포 제거기 및 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템에 관한 것이다.
최근 일본에서의 유방암의 이환수 및 사망수의 증가는 현저하다. 유방암은 지금까지 에스트로겐 수용체(ER)와 프로게스테론 수용체(PgR)의 발현 상황에 따라 수술 이외의 치료법이 결정되는 경향이 있었다. 호르몬 요법, 항암제 요법 등의 약품 요법이 유용하며, 성공률, 생존율의 개선이 관찰되고 있다. 그러나, 인간 상피 성장 인자 수용체 관련 2(human epidermal growth factor receptor-related 2: HER2) 양성 유방암의 약 50%는 호르몬 수용체 음성으로서 호르몬 요법의 대상에서 제외되었다. 최근에는 HER2 양성 유방암에 대한 트라스투주맵을 중심으로 하는 항체 요법 등의 분자 표적 요법이 행해져 그 유용성이 나타나고 있어, 향후의 유력한 치료법으로서 기대되고 있다.
유방암 세포는 다양한 증식 인자와 그 수용체를 발현하여 증식과 관련한 신호 전달계를 형성하고 있다. 1984년에 동정된 암 유전자 HER2는 그 하나이며, 인간 상피 성장 인자 수용체(human epidermal growth factor receptor)(EGFR, HER) 패밀리의 일원이다. 수용체는 세포막 관통형의 당단백으로서, 구조적인 유사성으로부터 HER1, HER2, HER3, HER4가 존재한다(비특허 문헌 1). EGF 수용체 패밀리는 이량체 형성을 통해 신호 전달에 기여하고 있으며, 리간드가 결합한 수용체가 다른 하나의 수용체와 이량체를 형성함으로써 신호 전달에 기여한다고 여겨지고 있다.
HER2 수용체를 규정하는 HER2/neu는 원발암유전자(proto-oncogene)의 하나라고 생각되며, 17번 염색체(17q21.1)에 존재한다(비특허 문헌 2). 유방암을 비롯하여 난소암, 폐암, 위암 등 다양한 암에 있어서 HER2/neu 유전자의 증폭 및 과잉 발현이 인정되고 있다. HER2 양성 유방암은 유방암 전체의 20%∼30%를 차지한다. 성인의 정상 조직에서는 이 유전자의 발현은 매우 약하다. 그 자연 경과는 특이하고, 전신 요법을 시행하지 않는 경우에는 재발이 빠르며, 1987년에 HER2의 증폭이 유방암의 예후 불량과 서로 관련이 있음이 보고된 이래, 많은 연구에서 HER2 양성 전이 유방암에서는 경과가 불량한 것이 명백해졌다.
1986년에 항HER2 모노클로날 항체가 neu 형질전환 세포의 악성 형질을 저해하는 것이 나타나, HER2를 표적으로 하는 트라스투주맵이 개발되기에 이르렀다. 트라스투주맵의 원형이 된 HER2 수용체의 세포 외 도메인에 대한 마우스 모노클로날 항체 mu4D5는 시험관내(in vitro)에서 HER2 양성의 종양 세포주에 대해 증식 억제 작용이 인정되고 있다(비특허 문헌 3). 또한, HER2 양성 인간 유방암 세포주인 SKBR3에 대한 마우스 비장 세포의 항체 의존성 세포 상해(antibody-dependent cell cytotoxicity: ADCC)는 마우스 모노클로날 항체로 증강되고 있으며, 생체내(in vivo)에서는 ADCC 활성도 항종양 효과에 기여하고 있다는 보고도 있다(비특허 문헌 4). 그러나 임상 응용함에 있어서, 마우스 항체를 그대로 사용하면 인간 항마우스 항체(human anti-mouse antibody: HAMA)의 출현이 문제가 된다. 따라서, HER2 수용체의 세포외 도메인에 대한 마우스 모노클로날 항체의 항원 결합 부위인 가변부만을 인간 IgG1의 정상부에 이식한 인간화 항체로서 제작된 것이 트라스투주맵(상품명: 허셉틴(herceptin: 등록상표))이다.
HER2는 PI3K나 MAPK를 포함하는 다양한 신호 전달 경로 네트워크를 야기하는데, 트라스투주맵은 HER2 수용체에 결합함으로써 이 신호 전달 경로를 억제하고, 세포 주기의 정지나 아폽토시스(apoptosis), 혈관 신생 억제 등을 유도하여, 직접적으로 종양 세포 증식 억제 작용을 나타내는 것으로 생각된다. 또한, Src 티로신 키나아제의 저해와 그에 수반되는 PTEN의 활성화, Akt의 탈인산화도 보고되고 있다. 나아가, 종양 세포와 결합한 트라스투주맵의 Fc 부분에 NK 세포를 비롯한 면역 세포에서 발현되는 Fc 수용체가 결합하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는(ADCC 활성) 것도 개시되어 있다(비특허 문헌 5∼8). 이들의 직접적 종양 세포 증식 억제 작용과 ADCC 활성의 2가지가 트라스투주맵의 주요한 작용 메커니즘이라고 여겨지고 있다.
트라스투주맵은 HER2를 표적으로 하고 있으며, 그 치료 효과는 HER2 단백의 발현 정도에 따라 크게 달라진다. 측정법이나 재료 등에 의해 그 양성률은 크게 다른 것이 알려져 있는데, HER2 단백의 과잉 발현, DNA의 증폭을 조사하기 위해, 면역 조직 화학 방법(immunohistochemical method: IHC법)과 형광 인시추 하이브리드화(fluoresence in situ hybridization: FISH)가 널리 행해지고 있다. 또한, 트라스투주맵은 수술 후 보조 요법에 이용하면 높은 효과를 얻을 수 있음이 HERA 시험을 비롯한 복수의 대규모 임상 시험에서 밝혀졌다.
지금까지의 다양한 검토로부터, 트라스투주맵 투여에 의해 HER2를 저해하면 유방암의 자연 경과에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 그러나, 트라스투주맵은 HER2 과잉 발현 유방암의 모든 자연 경과를 변경하는 것이 아님도 알고 있으며, 초회 트라스투주맵 단제 투여에 반응하는 증례는, HER2 과잉 발현 유방암의 약 1/3 이하라고 알려져 있다. 이와 마찬가지로 현미경적 전이암의 경우, 상당한 비율의 종양이 트라스투주맵에 내성인 것이 시사된다. 그러나, 트라스투주맵 내성의 메커니즘에 대해서는 명확하게는 해명되어 있지 않다. 현재 시점에서 내성 메커니즘으로서 (1) 트라스투주맵의 도달이 불충분하기 때문에 HER2의 세포외 영역의 저해가 충분하지 않은 것, (2) HER2 발현의 감소, (3) 하류에 있는 HER2 기능 조절 인자가 변화하고 있는 것(p27kip1의 저하, PTEN의 소실 또는 불활성화 등), (4) 대체 경로에 의한 신호 전달이 생기는 것(인슐린 유사 성장 인자 I 수용체(insulin-like growth factor I receptor: IGF1R)의 과잉 발현), (5) 면역능의 저하, 특히 ADCC 활성의 저하 등의 가능성이 시사되고 있다.
상기 (5)에 기재한 면역능과 내성 메커니즘에 관한 검토는 그다지 활발하지 않다. 최근, 트라스투주맵의 주요한 작용 메커니즘의 하나인 ADCC 활성에 관련된 인자인 NK 세포에 대해 그 기능이 밝혀지고 있다. NK 세포에는 억제성의 수용체가 발현되어 있으며, 그 하나로서 동정된 것이 렉틴 유사 수용체 킬러 세포 렉틴 유사 수용체(killer cell lectin-like receptor G1: KLRG1)이다. 지금까지 NK 세포에 관해 밝혀진 억제성 수용체의 리간드의 대부분은 MHC 클래스 I 분자와 관련된 것이었지만, 2006년에 M. Ito 등에 의해 KLRG1의 리간드가 MHC 클래스 I 분자 이외인 것이 보고되었다.
KLRG1은 래트 호염기구성 백혈병 세포주 RBL-2H3에서 발현되는 기능 분자 MAFA(비만 세포 기능 관련 항원: mast cell function-associated antigen)로서 발견되었다(비특허 문헌 9). 이 KLRG1은 RBL-2H3 세포에서는 항KLRG1 항체로 KLRG1을 가교함으로써 Fc 수용체 자극에 의한 탈과립 반응이 억제된다. 래트 KLRG1의 cDNA 클로닝으로부터, 세포외 영역에 C형 렉틴 유사의 구조를 가지며, 세포내 영역에 ITIM(면역수용체 티로신에 기초한 억제 모티프: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)을 갖는 II형 막 관통 단백질의 호모 이량체인 것이 Pecht 등에 의해 보고되어 있다(비특허 문헌 10). 인간 및 마우스에서는 KLRG1이 NK 세포 또는 T 세포의 일부에서 발현되는데(비특허 문헌 11∼13), 정상인에서는 말초혈 NK 세포의 약 50%에서 발현이 관찰되는 것을 알 수 있다.
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트라스투주맵 치료는 재발 치료에서 재발 예방 목적의 수술 후 보조 요법, 수술 전 치료로 적응이 확대되고 있으며, 더 많은 HER2 양성암의 근치성 향상에의 발전이 기대된다. 적응이 확대된 것에 의해, 트라스투주맵 투여 대상예가 크게 증가할 것이 예상된다. 그러나, 현 상황에서는 대상 증례 중에는 다수의 트라스투주맵 투여 무효군이 존재한다. 본 발명은 트라스투주맵의 무효예를 감소시키는 것을 가능하게 하는 신규한 방법으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 함유하는 암 치료제를 제공하는 것을 해결할 과제로 하였다. 본 발명은 또한, 상기 암 치료제와 병용되는 세포 제거기 및 상기 세포 제거기와 상기 암 치료제의 병용 치료 시스템을 제공하는 것을 해결할 과제로 하였다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 항HER2 모노클로날 항체(트라스투주맵)를 투여할 때 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 종래에는 항HER2 모노클로날 항체의 투여가 무효이던 생체에 있어서도 항암 효과를 발휘할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명에 따르면 이하의 발명이 제공된다.
[1] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 상기 암 치료제.
[2] 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키는 처리가, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기에 의해 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행인 [1]에 기재된 암 치료제.
[3] 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성이 증강되는 것인 [1] 또는 [2]에 기재된 암 치료제.
[4] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[5] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵(trastuzumab)인 [4]에 기재된 암 치료제.
[6] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[7] KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[8] KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[9] 상피성 암이 유방암인 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[10] 상피성 암이 위암인 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[11] 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, 상기 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[12] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 [11]에 기재된 암 치료제.
[13] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 [11]에 기재된 암 치료제.
[14] 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[15] 상기 수불용성 담체가 부직포인 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 암 치료제.
[16] KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 투여하기 전 또는 투여하고 있는 동안에, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하기 위한 세포 제거기.
[17] 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키는 것인 [16]에 기재된 세포 제거기.
[18] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 [16] 또는 [17]에 기재된 세포 제거기.
[19] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵인 [18]에 기재된 세포 제거기.
[20] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 [16] 또는 [17]에 기재된 세포 제거기.
[21] KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 [16] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[22] KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 [16] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[23] 상피성 암이 유방암인 [16] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[24] 상피성 암이 위암인 [16] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[25] 생체의 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 [16] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[26] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 [25]에 기재된 세포 제거기.
[27] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 [25]에 기재된 세포 제거기.
[28] 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 [25] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[29] 상기 수불용성 담체가 부직포인 [25] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 세포 제거기.
[30] (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 세포 제거기와, (ii) 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행 중 또는 시행 후에 투여하는 암 치료제를 포함하는, 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템.
[31] 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성이 증강되는 것인 [30]에 기재된 병용 치료 시스템.
[32] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 [30] 또는 [31]에 기재된 병용 치료 시스템.
[33] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵인 [32]에 기재된 병용 치료 시스템.
[34] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 [30] 또는 [31]에 기재된 병용 치료 시스템.
[35] KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 [30] 내지 [34] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[36] KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 [30] 내지 [35] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[37] 상피성 암이 유방암인 [30] 내지 [36] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[38] 상피성 암이 위암인 [30] 내지 [36] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[39] 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 [30] 내지 [38] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[40] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 [39]에 기재된 병용 치료 시스템.
[41] KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 [39]에 기재된 병용 치료 시스템.
[42] 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 [39] 내지 [41] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[43] 상기 수불용성 담체가 부직포인 [39] 내지 [41] 중 어느 하나에 기재된 병용 치료 시스템.
[44] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키는 공정(a); 및 상기 생체에, 상기 상피성 암 세포에서 발현되는 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체로서 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를 투여하는 공정(b)을 포함하는 상기 상피성 암의 생체를 처치하는 방법.
[45] 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기를 이용하여 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 암 치료제.
또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 세포 상해제로서, 상기 암 세포 상해제는 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대해 사용되며, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기에 의해 KLRG1 양성 면역 세포가 선택적으로 제거된 단핵구와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 암 세포 상해제가 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 세포 상해제와, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포와 단핵구를 포함하는 세포 집단을 접촉시키기 전 또는 접촉시키고 있는 동안에 상기 세포 집단으로부터 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하기 위한 세포 제거기가 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포와 단핵구를 포함하는 세포 집단으로부터 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 세포 제거기와, (ii) 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 세포 상해제로서, 상기 세포 제거기에 의해 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 조작의 시행 중 또는 시행 후의 상기 세포 집단에 투여하는 암 세포 상해제를 포함하는, 세포 제거기와 암 세포 상해제의 병용 처리 시스템이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기와, (ii) 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈로부터 상기 세포 제거기에 의해 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 단계와, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체로서 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를 상기 생체에 투여하는 단계가 기재된 설명서를 포함하는, 상기 암 치료제의 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키는 세포 제거기가 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기와, (ii) 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체로서 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제와, (iii) 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈로부터 상기 세포 제거기에 의해 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 단계와, 상기 암 치료제를 상기 생체에 투여하는 단계가 기재된 설명서를 포함하는, 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체와, KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 단핵구와, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 상피성 암 세포에 대한 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키는 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 치료 방법으로서, 상기 생체에, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 투여하는 것 및 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것을 포함하는 상기 치료 방법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키기 위한, KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 단핵구의 용도로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체와, KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 단핵구와, 상기 상피성 암 세포를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 단핵구의 용도가 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되는 암 치료제로서, 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 상기 암 치료제의 제조를 위한, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체의 용도가 제공된다.
또한 본 발명에 따르면, (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 세포 제거기와, (ii) 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행 중 또는 시행 후에 투여하는 암 치료제를 포함하는, 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템의 제조를 위한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체의 용도가 제공된다.
본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 투여해도 종래에는 항암 효과가 발휘되지 않았던 생체에 있어서도, 유효한 항암 효과를 얻는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체와, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포와 단핵구를 포함하는 세포 집단을 접촉시켜도 종래에는 상피성 암 세포에 대한 세포 장애 활성이 발휘되지 않은 경우에 있어서도 충분한 세포 장애 활성을 얻는 것이 가능하다.
도 1은 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 SKBR3에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 SKBR3을 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 가하였다. 또한 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원(two-way) ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤 항체 투여군, B: 트라스투주맵 투여군.
도 2는 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 HCC1569를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 가하였다. 또한 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: 트라스투주맵.
도 3은 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성에서의 E-카데린, N-카데린 양자 억제의 효과를 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 siRNA로 카데린을 넉다운시킨 HCC1569를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 가하였다. 또한 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: E-카데린 및 N-카데린을 더블 넉다운시킨 HCC1569.
도 4는 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 HCC1569(T)를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 소팅(sorting)하여 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구(E)를 가하고, 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: HCC1569.
도 5는 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 SKBR3의 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 SKBR3(T)를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 소팅하여 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구(E)를 가하였다. 그 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: SKBR3.
도 6은 유방암 세포 SKBR3에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현 유무의 효과를 나타낸다. 1×106개의 종양 세포 SKBR3(T)를 50 ㎕의 Na2 51CrO4와 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 1.5시간 공배양하고, 표지된 SKBR3 5×103개를 96웰 플레이트에 파종하고, 단핵구(E)를 T:E가 1:0, 1:1, 1:20, 1:50이 되도록 각 웰에 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 4시간 공배양한 후, 종양 세포로부터 방출된 51Cr의 방사 활성을 측정하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. A: 미처리 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 후의 말초혈 단핵구.
도 7은 유방암 세포 HCC1569에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현 유무의 효과를 나타낸다. 1×106개의 종양 세포 HCC1569(T)를 50 ㎕의 Na2 51CrO4와 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 1.5시간 공배양하고, 표지된 HCC1569 5×103개를 96웰 플레이트에 파종하고, 단핵구(E)를 T:E가 1:0, 1:1, 1:20, 1:50이 되도록 각 웰에 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 4시간 공배양한 후, 종양 세포로부터 방출된 51Cr의 방사 활성을 측정하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. A: 미처리 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 후의 말초혈 단핵구.
도 8은 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 MKN-7에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 실험은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구.
도 9는 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 NCI-N87에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 실험은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구.
도 10은 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구에 의한, NOD/SCID 마우스에 접종된 유방암 세포 HCC1569의 증식 억제 작용을 나타낸다.
도 2는 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 HCC1569를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 가하였다. 또한 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: 트라스투주맵.
도 3은 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성에서의 E-카데린, N-카데린 양자 억제의 효과를 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 siRNA로 카데린을 넉다운시킨 HCC1569를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 가하였다. 또한 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: E-카데린 및 N-카데린을 더블 넉다운시킨 HCC1569.
도 4는 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 HCC1569(T)를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 소팅(sorting)하여 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구(E)를 가하고, 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: HCC1569.
도 5는 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 SKBR3의 세포 상해성을 나타낸다. 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포 SKBR3(T)를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구를 소팅하여 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구(E)를 가하였다. 그 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 컨트롤, B: SKBR3.
도 6은 유방암 세포 SKBR3에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현 유무의 효과를 나타낸다. 1×106개의 종양 세포 SKBR3(T)를 50 ㎕의 Na2 51CrO4와 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 1.5시간 공배양하고, 표지된 SKBR3 5×103개를 96웰 플레이트에 파종하고, 단핵구(E)를 T:E가 1:0, 1:1, 1:20, 1:50이 되도록 각 웰에 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 4시간 공배양한 후, 종양 세포로부터 방출된 51Cr의 방사 활성을 측정하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. A: 미처리 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 후의 말초혈 단핵구.
도 7은 유방암 세포 HCC1569에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현 유무의 효과를 나타낸다. 1×106개의 종양 세포 HCC1569(T)를 50 ㎕의 Na2 51CrO4와 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 1.5시간 공배양하고, 표지된 HCC1569 5×103개를 96웰 플레이트에 파종하고, 단핵구(E)를 T:E가 1:0, 1:1, 1:20, 1:50이 되도록 각 웰에 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 4시간 공배양한 후, 종양 세포로부터 방출된 51Cr의 방사 활성을 측정하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. A: 미처리 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 후의 말초혈 단핵구.
도 8은 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 MKN-7에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 실험은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구.
도 9는 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 NCI-N87에 대한 세포 상해성을 나타낸다. 실험은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다. 3중 측정의 평균치와 표준 편차를 나타내었다. 통계 해석은 이원 ANOVA에 의해 행하였다. A: 말초혈 단핵구, B: KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구.
도 10은 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구에 의한, NOD/SCID 마우스에 접종된 유방암 세포 HCC1569의 증식 억제 작용을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 암 치료제는 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 한다.
상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키는 처리는, 바람직하게는, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기에 의해 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행이다.
또한, 본 명세서 중의 「혈액 정화 요법의 시행」에는 혈액 정화 요법의 시행 중 및 시행 후가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 생체는 살아 있는 생물체를 널리 포함하며, 인간 및 인간 이외의 동물 중 어느 것이어도 좋으나, 바람직하게는 인간이며, 구체적으로는, 상피성 암환자를 들 수 있다.
본 발명의 암 치료제의 투여 개시 시기는, 바람직하게는, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기에 의해 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행 중 또는 시행 후이다. 「혈액 정화 요법의 시행 후」란 혈액 정화 요법의 시행 직후로부터 혈액 정화 요법의 효과가 지속되고 있는 기간을 말한다. 「혈액 정화 요법의 시행 중」이란 혈액 정화 요법이 시작되고 나서 종료될 때까지의 기간을 말한다. 혈액 정화 요법이 연속적으로 복수회 행해지는 경우에는 초회의 혈액 정화 요법부터 최종회의 혈액 정화 요법까지의 연속된 일련의 기간을 말한다.
예컨대, 주 1회의 혈액 정화를 3개월 연속 실시하는 프로토콜을 1쿨(cours)로 하여, 1쿨 내지 2쿨의 치료를 행하는 혈액 정화 요법의 경우, 「혈액 정화 요법의 시행 중」이란 이 1쿨 내지 2쿨의 기간을 말한다.
본 발명에서 말하는 상피성 암으로는, 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 식도암, 대장암, 십이지장암, 췌장암, 두경부암, 담낭암, 담관암, 타액선암 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 유방암 및 위암이다.
상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원으로는, HER2, 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 뮤신(mucin) 1(MUC-1), 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule: EpCAM), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR), 암 항원(cancer antigen) 125(CA125) 등을 들 수 있다. 바람직하게는, HER2 및 CEA이다.
상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체로는, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항HER2 항체 및 항CEA 항체이다. 항HER2 항체의 바람직한 예로는 트라스투주맵을 들 수 있다.
본 발명에서는, 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한다. KLRG1 양성 면역 세포의 종류는 특별히 한정되지 않지만, KLRG1 양성 NK 세포, KLRG1 양성 T 세포 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 KLRG1 양성 NK 세포이다.
KLRG1에 대한 리간드의 예로는, E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 리간드를 들 수 있다.
본 발명에서는, 바람직하게는, 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명에 있어서, 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 유입구 및 유출구를 가지며, 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것이 가능한 수단을 갖는 장치를 사용하여 말초혈을 상기 유입구로부터 유통시키고, 상기 유출구로부터 유출되는 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 말초혈을 회수함으로써 혈액으로부터 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다. 그리고, 유출구로부터 유출되는 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거한 말초혈을 체내로 되돌림으로써 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것이 가능한 수단으로는, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체를 사용할 수 있다. KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질로는, KLRG1에 대한 항체나 그 단편, 또는 KLRG1에 대한 리간드인 E-카데린, N-카데린, R-카데린이나 이들의 단편 등을 사용할 수 있다. 수불용성 담체로는, 특별히 한정은 없으며, 각종 담체를 사용할 수 있고, 다공질체, 평막, 부직포, 직포, 입자(자기 입자 등) 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 자기 입자 또는 부직포이다. 수불용성 담체가 부직포인 경우, 필라멘트는 모노필라멘트여도 멀티필라멘트여도 무방하며, 다공질 필라멘트여도 이형 필라멘트여도 무방하다.
수불용성 담체의 형상이 입상인 경우, 구형, 다각구형 등 어떠한 형상이어도 유용하게 사용된다. 또한 표면은 평활해도 요철이 있어도 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있는 표면이라면 유용하게 사용된다. 또한, 입경은 50 ㎛ 이상 10 mm 이하가 바람직하다. 입경은 50 ㎛ 미만이면 입자의 유출 방지가 어려워지는 경향이 있으므로 바람직하지 않다. 입경이 10 mm보다 큰 경우 충분한 표면적을 얻을 수 없게 되는 경향이 있으므로 바람직하지 않다. 입경은 바람직하게는, 80 ㎛ 이상 8 mm 미만, 가장 바람직하게는 100 ㎛ 이상 6 mm 미만이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 수불용성 담체의 재질로는, 혈구에 손상을 잘 부여하지 않는 것이면 특별히 한정은 없으며, 각종 재질을 사용할 수 있고, 유기 고분자, 무기 고분자, 금속 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도 유기 고분자는 절단 등의 가공성이 뛰어나기 때문에 바람직한 소재이다. 유기 고분자 등의 재질은 셀룰로오스, 셀룰로오스 모노아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트, 셀룰로오스 트리아세테이트 등의 셀룰로오스 및/또는 그 유도체 등의 천연 고분자, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 폴리올레핀, 폴리불화 비닐리덴, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리술폰, 폴리아크릴로니트릴 등의 고분자 재료를 예시할 수 있다. 또한, 이들에 친수성을 부여할 목적으로 표면을 코팅, 방사선 그래프트 등의 방법에 의해 친수성 고분자 재료로 수식한 재료도 유용하게 사용된다.
본 발명에서는, 예컨대, 혈액 유입구 및 혈액 유출구를 갖는 컬럼에 상기한 바와 같은 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체가 충전된 장치에 말초혈을 상기 유입구로부터 유통시킴으로써 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다. 또한, 상기 흡착 컬럼을 혈액 정화 요법 등에 사용되는 체외 순환 시스템에 접속함으로써 본 발명을 실시할 수 있다.
상기한 바와 같은 체외 순환에 의한 본 발명의 처치는, 대상자 및 대상자의 질환의 상태 등에 따라서도 달라지는데, 일반적으로 1회당 유속 30 ml/분의 조건으로 30분∼90시간 혈액 순환함으로써 행할 수 있다. 유속 및 시간은, 예컨대 채용하는 담체의 양이나 흡착 특성 등을 바탕으로 적당히 설정할 수 있다. 또한, 상기 체외 순환에 의한 본 발명의 처치는, 암 특이적 막 항원에 대한 항체를 투여하기 전 또는 투여하고 있는 동안 중 어느 경우에나 행해도 좋다. 항체 투여 전에 체외 순환 처치를 행하는 경우에는, 항체 투여는 체외 순환 처치 후, 체외 순환 처치의 효과가 지속되고 있는 동안에 행한다. 「항체를 투여하고 있는 동안」이란, 항체의 투여가 시작되고 나서 종료될 때까지의 기간을 말한다. 항체의 투여가 연속적으로 복수회 행해지는 경우에는, 초회의 항체 투여로부터 최종회의 항체 투여까지의 연속된 일련의 기간을 말한다. 예컨대, 2∼3주 동안에 1회의 투여를 3개월 연속 실시하는 프로토콜을 1쿨로 하여, 1쿨 내지 2쿨의 치료를 행하는 항체의 경우, 「항체를 투여하고 있는 동안」이란 이 1쿨 내지 2쿨의 기간을 말한다.
또한 본 발명에 따르면, 배치식으로 접촉 처리한 처리 혈액을 얻고, 그 일단 풀링(pooling)한 혈액을 정맥 내 투여하는 것도 가능하다. 이 경우에도, 실질적으로 상기 체외 순환에 의한 처치의 경우에 준하여 행할 수 있다. 또한, 채혈량 및 처리된 혈액의 투여량은 일반적으로 1일당 150∼450 ml 정도이다.
혈액을 처리할 때에는, 혈액의 항응고 목적으로 항응고제를 혈액 중에 가할 수 있다. 항응고제를 예시하면, 항응고 활성을 갖는 화합물이라면 특별히 한정되지 않지만, 헤파린, 저분자 헤파린, 메실산 나파모스타트(nafamostat), 메실산 가벡세이트(gabexate), 아가트로반(argatroban), 시트르산 나트륨 등을 적합한 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 헤파린 또는 메실산 나파모스타트가 양호하게 사용된다.
또한 본 발명에 있어서는, (1) 채혈 수단, (2) 혈액 유통 수단, (3) 혈액의 유입구 및 유출구를 가지며, 혈액으로부터 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것이 가능한 수단을 갖는 장치 및 (4) 반혈 수단을 포함하는 체외 순환 시스템을 이용하여 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
채혈 수단이란 혈액을 추출하는 부분을 말하며, 예시하면 스파이크 바늘, 병 바늘, 채혈 바늘, 카테터(catheter) 등을 들 수 있다. 반혈 수단이란 혈액을 반혈하는 부분을 말하며, 채혈 수단과 동일한 것을 예시할 수 있다. 혈액 유통 수단이란, 예컨대, 혈액이 흐르는 도관 등을 들 수 있다. 도관의 형상은 중공이라면 어느 형상이어도 좋다. 또한 도관은 혈액에 큰 해를 미치지 않는 재질이라면 어느 것이어도 좋으며, 예컨대, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 재질을 포함하는 재료를 들 수 있다.
본 발명에서의 「KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기」로는, 본 명세서 중 상기한 바와 같은 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체 등의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것이 가능한 수단을 갖는 장치를 사용할 수 있다. 본 발명에서의 「KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기」는 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 투여하기 전 또는 투여하고 있는 동안에 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하기 위해 사용할 수 있다.
또한 본 발명에서는, (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 세포 제거기와, (ii) 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행 중 또는 시행 후에 투여하는 상기 암 치료제를 조합함으로써 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템을 구축할 수 있다.
나아가 본 발명에 따르면, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키는 공정(a)과, 상기 생체에, 상기 상피성 암 세포에서 발현되는 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체로서 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를 투여하는 공정(b)을 포함하는 상기 상피성 암의 생체를 처치하는 방법이 제공된다.
「KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 감소시키는」이란, KLRG1 음성 면역 세포의 흡착률(A)보다 KLRG1 양성 면역 세포의 흡착률(B)이 높은 것을 의미한다. B＞A이면 되는데, 바람직하게는 B/A＞2이고, 보다 바람직하게는 B/A＞3이며, 가장 바람직하게는 B/A＞4이다.
본 발명의 방법에서, 치료제의 투여는, 바람직하게는, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여 KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 흡착기에 의해 상기 말초혈로부터 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 감소시키는 공정 (a)의 시행 중 또는 시행 후이다. 「공정 (a)의 시행 후」란, 공정 (a)의 시행 직후로부터 공정 (a)의 효과가 지속되고 있는 기간을 말한다. 「공정 (a)의 시행 중」이란 공정 (a)가 시작되고 나서 종료될 때까지의 기간을 말한다. 공정 (a)가 일련의 처치로서 복수회 행해지는 경우에는, 초회의 공정 (a)의 처치부터 최종회의 공정 (a)의 처치까지의 연속된 일련의 기간을 말한다. 예컨대, 주 1회의 체외 순환 처치를 3개월 연속 실시하는 프로토콜을 1쿨로 하여, 1쿨 내지 2쿨의 치료를 행하는 공정 (a)의 처치의 경우, 「공정 (a)의 시행 중」이란 이 1쿨 내지 2쿨의 기간을 말한다.
암 치료제의 투여와 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 감소시키는 처치가 각각 일련의 공정으로서 복수회 행해지는 경우에는, 암 치료제의 모든 투여는 공정 (a)의 첫회 시행부터 최종회 시행 동안 또는 최종회 시행 후에 행해지는 것이 바람직하다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더 상세하게 설명하는데, 본 발명은 실시예에 의해 한정되지 않는다.
실시예
실시예 1
(A) 방법
(1) 세포주
HER2 양성 인간 유방암 세포주 SKBR3과 HCC1569는 ATCC로부터 구입하였다. SKBR3은 Pan-카데린 음성이고, E, N-카데린 음성인 것을 확인하였다. 한편 HCC1569는 Pan-카데린 양성이고, E, N-카데린 모두 양성인 것을 확인하였다. SKBR3에 대해서는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Sigma Aldrich, MO, USA)에 소 태자 혈청(FBS, Invitrogen corporation, USA), 페니실린 및 스트렙토마이신을 가하여 배양하였다. HCC1569에 대해서는 RPMI-1640 배지(Sigma Aldrich, MO, USA)에 돼지 태자 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 가하여 배양에 사용하였다.
(2) siRNA
CDH1 및 CDH2siRNA는 Silencer Select Pre-designed siRNA(Ambion Inc.USA)를 구입하여 사용하였다. 컨트롤로서 Silencer Select Negative control#1 siRNA(Ambicon)를 사용하였다. siRNA의 최종 농도는 5 nM로 하였다. 합성 siRNA의 세포 도입에는 DamaFECT Transfection Reagents 2(Darmacon Inc.USA)를 사용하였다.
유방암 세포주 HCC1569에 대해, 6웰 플레이트를 사용하여, 1웰당 5×105개의 세포를 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 싱글 넉다운할 분자에 대해서는 2 μM의 각 siRNA 2 ㎕를 198 ㎕의 OPTI-MEM(Invitrogen Inc. USA)에 가한 것과 reagent 4 ㎕와 196 ㎕의 OPTI-MEM을 가한 것을 혼합하고, 실온에서 20분간 인큐베이트함으로써 콤플렉스를 형성시켰다. 더블 넉다운할 분자에 대해서는 2 μM의 각 siRNA 2 ㎕를 196 ㎕의 OPTI-MEM에 가한 것과 reagent 8 ㎕와 192 ㎕의 OPTI-MEM을 가하고 싱글 넉다운하는 것과 동일하게 처리하였다. 전날에 배양하던 6웰 플레이트 중의 배양액을 흡인하고, OPTI-MEM 1,600 ㎕를 가하였다. 그 후 콤플렉스를 200 ㎕씩 각 웰에 가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 48시간 후에 세포로부터 mRNA를 추출하고, 정량적 리얼 타임(Quantitative real time) RT-PCR에 의해 RNAi의 효과를 해석하였다.
RNA 추출은 TRizol Reagent(Invitrogen)을 사용하였다. 6웰 플레이트를 PBS로 씻고, Trizol을 1 ml 가하고, 셀 스크레이퍼로 긁어내고 1.5 ml 튜브로 옮겼다. 다음에, 1 ml의 Trizol에 0.2 ml의 클로로포름을 가하여, 15,000 rpm으로 5분 원심하였다. 3층으로 분리된 것 중 가장 상층을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로판올/0.5 ml/ml를 가하여 15,000 rpm으로 5분 원심하였다. 상청을 제외하고, 펠릿을 75% 에탄올로 세정하고, 실온에서 건조시켰다. Rnase 비함유 물 10 ㎕를 가하여, 실온에서 30분 정치하여 펠릿을 녹였다. 그 후, RNA의 발현을 정량적 리얼 타임 RT-PCR법으로 측정하였다.
역전사 반응에는 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)를 사용하였다. 1 ㎍ 총 RNA에 PrimeScript Buffer(리얼 타임용) 2 ㎕, PrimeScript RT Enzyme MixI 0.5 ㎕, Random 6 mers 0.5 ㎕, Rnase 비함유 dH20 6 ㎕를 가하여, 37℃, 15분 역전사 반응을 행하여 cDNA를 얻었다.
검량선을 작성하기 위해 사용하는 기지의 농도나 카피 수를 갖는 샘플을 제작하기 위해 CDH1, CDH2, GAPDH의 프라이머를 사용하여, 정상 상태에서 배양한 HCC1569를 템플릿으로 하여 PCR 산물을 얻었다. 검량선을 작성하기 위해 5종류의 서로 다른 희석률의 스탠더드 샘플을 준비하였다. GAPDH를 내인성 레퍼런스 유전자로 하였다.
정량적 리얼 타임 RT-PCR은 Smart Cycler II System(TaKaRa, Japan)을 사용하였다. 하나의 반응 튜브당 SYBR Green I 12.5 ㎕, 10 μM 프라이머(정방향 및 역방향) 1 ㎕, 역전사 반응으로 얻은 각 cDNA 2 ㎕, 증류수 8.5 ㎕를 혼합한 것을 가하였다.
PCR 산물의 정량은 형광 색소인 SYBR Green의 형광량에 의해 이루어진다. SYBR Green의 형광량에 의해 PCR 산물의 증폭 곡선이 그려지는데, 그 증폭 곡선이 역치와 교차하는 사이클 수를 역치 사이클(Threshhold cycle: Cγ)로 하여, 검량선을 사용함으로써 타겟 RNA량을 추측할 수 있다. 타겟 유전자의 Cγ치는 내인성 레퍼런스 유전자(GAPDH)와의 비교에 의해 표준화하였다.
(3) 트라스투주맵과 항체
트라스투주맵은 중외 제약으로부터 구입하였다. 컨트롤 항체로서 마우스 IgGκ 이소타입(BioLegend, USA)을 구입하여 사용하였다. NK 세포 상의 KLRG1 수용체의 인식에는 토끼 항인간 KLRG1 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하였다.
(4) 말초혈 단핵구의 처리
정상인으로부터 말초혈을 채취하고, 피콜ㆍ하이팩을 사용한 비중 원심법(배큐테이너(vacutainer) 채혈관(BD, USA)을 이용하여 3,300 rpm, 30분간 원심을 행한다)으로 단핵구층을 회수하였다. 회수한 말초혈 단핵구를 토끼 항인간 KLRG1 항체와 염소 항토끼 IgG 마이크로비드(MiltenyiBiotec GmbH, Gladbach, Germany)로 표지하고, MACS MS 컬럼으로 KLRG1 발현 세포를 제거하였다.
(5) 말초혈 단핵구에 의한 세포 상해성의 검토
HER2 양성 유방암 세포주 SKBR3(Pan-카데린 음성) 및 HCC1569(Pan-카데린 양성: E-카데린 양성, N-카데린 양성)의 두 종류의 세포를 이용하여 이하의 검토를 행하였다.
(5-1) 각 세포에 대해, 35 mm 디쉬에 1×105씩 종양 세포(T)를 파종하고, 24시간 후에 트라스투주맵 및 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구(E)를 가하고, 그 24시간 후에 생 종양 세포수를 계측하였다. 또한, 트라스투주맵은 0, 0.021, 0.105 mg/ml로 가하는 농도를 바꾸어 검토하였다. 또한 말초혈 단핵구는 T:E를 1:0, 1:1, 1:20로 하여 검토를 행하였다.
(5-2) HER2 양성 유방암 세포주 HCC1569(Pan-카데린 양성: E-카데린 음성, N-카데린 양성)에 대해 E-카데린(CDH1) 또는/및 N-카데린(CDH2)을 넉다운하고, (5-1)과 동일한 검토를 행하였다.
(5-3) KLRG1 발현의 유무에 의해 말초혈 단핵구를 소팅하고, KLRG1 양성 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 이용하여 (5-1)과 동일한 검토를 행하였다.
(6) ADCC 어세이(assay)
말초혈 단핵구에 의한 ADCC 어세이는 51Cr 방출 시험에 의해 검토하였다. 이펙터 세포(E)는 정상인으로부터 채취한 말초혈 단핵구, 표적 세포(T)는 SKBR3, HCC1569, siRNA CDH1 또는 siRNA CDH2를 도입하여 E-카데린 또는 N-카데린을 넉다운한 HCC1569 세포주이다. 1×106개의 표적 세포를 50 ㎕의 Na2 51CrO4(Perkin Elmer, Japan)과 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 1.5시간 공배양하고, 표적 세포를 51Cr 크롬산으로 표지하였다. 표지한 표적 세포 5×103개를 배양액 50 ㎕에 현탁하고 96웰 U바닥 플레이트에 파종하고, 단핵구를 T:E가 1:0, 1:1, 1:20, 1:50이 되도록 각 웰에 가하였다. 또한 트라스투주맵 21 ㎍/ml, 또는 컨트롤로서 마우스 IgG1 항체 21 ㎍/ml, 배양액만을 각각 100 ㎕씩 각 웰에 가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 4시간 공배양하였다. 배양 후 1,500 rpm으로 5분간 원심하여, 50 ㎕의 상청을 채취하고 방사 활성을 γ 카운터로 측정하였다. 다음 식으로 %특이적 51Cr 방출치를 산출하여 ADCC 활성으로 하였다.
ADCC 활성=100×(이펙터 세포를 가했을 때의 51Cr 유리-이펙터 세포를 가하지 않을 때의 51Cr 자연 유리)/(이펙터 세포는 가하지 않고 Triton X를 가했을 때 생기는 최대 51Cr 유리-이펙터 세포를 가하지 않을 때의 51Cr 자연 유리).
(B) 결과
(1) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 SKBR3에 대한 세포 상해성(도 1)
트라스투주맵 저항예를 유효예로 하기 위해, NK 세포에 의한 ADCC 활성의 확인과 억제 해제의 방법에 대해 검토를 행하였다. 그 결과, SKBR3(Pan-카데린 음성)에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하고, 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율의 저하가 인정되었다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율은 저하를 나타내었다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우에서도, 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우 종양 세포 생존율은 저하하여, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율은 저하를 나타내었다. 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 인정되지 않으나, 종양 세포 생존율은 저하하는 경향이 인정되었다. 이 결과로부터, 카데린의 발현을 수반하지 않는 SKBR3에서는 트라스투주맵의 농도와 관계없이 말초혈 단핵구의 수 의존적으로 종양 세포 생존율은 저하하는 것이 나타났다(도 1).
(2) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569에 대한 세포 상해성(도 2)
HCC1569(Pan-카데린 양성: E-카데린 음성, N-카데린 양성)에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하고, 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우와 마찬가지로 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 이 경향은 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우에도 동일하며, 종양 세포량의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 이 결과로보다 카데린 발현을 수반하는 HCC1569에서는 트라스투주맵의 농도 및 말초혈 단핵구의 수와 관계없이 종양 세포 생존율의 변화를 인정되지 않는 것이 명백해졌다(도 2).
(3) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성에서의 E-카데린, N-카데린 양자 억제의 효과(도 3)
E-카데린(CDH1) 및 N-카데린(CDH2)을 더블 넉다운한 HCC1569에 있어서는, 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 생 종양 세포 생존율에 대해 통계학적 유의차는 인정되지 않았다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml 및 0.105 mg/ml로 한 경우, 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율의 저하가 인정되었다. 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 통계학적 유의차는 없지만, 종양 세포 생존율은 저하하는 경향이 인정되었다(도 3).
이들 종양 세포의 검토에 의해, Pan-카데린 음성의 종양 세포에서는 트라스투주맵의 농도와 관계없이, 말초혈 단핵구의 수 의존적으로 종양 세포 생존율은 저하하는 것이 명백해졌다. 또한, Pan-카데린 양성의 종양 세포에 있어서는, 트라스투주맵의 농도와 관계없이, 말초혈 단핵구의 수 의존적으로 생 종양 세포수가 감소하는 경향이 인정되지 않았다.
(4) 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 HCC1569의 세포 상해성(도 4)
KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 이용하여 동일한 실험을 행하였다.
아무 것도 처리하지 않는 카데린의 발현이 있는 HCC1569에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율의 저하를 나타내었다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율은 저하를 나타내었다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우, 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율의 저하가 인정되었고, 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율은 저하를 나타내었다(도 4).
(5) 트라스투주맵과 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 유방암 세포 SKBR3의 세포 상해성(도 5)
카데린 발현을 수반하지 않는 SKBR3에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 인정되지 않았다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 생 종양 세포수는 감소하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율은 저하를 나타내었다. 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 인정되지 않으나, 종양 세포의 생존율은 저하하는 경향이 인정되었다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우에서도, 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 유의하게 종양 세포 생존율의 저하가 인정되었고, 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 인정되지 않으나, 종양 세포의 생존율은 저하하는 경향이 인정되었다(도 5).
(6) 유방암 세포 SKBR3에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현의 유무의 효과(도 6) 및 유방암 세포 HCC1569에 대한 ADCC 활성에 있어서, 말초혈 단핵구에서의 KLRG1 발현의 유무의 효과(도 7)
또한 확인을 위해 행한 4h-51Cr 방출 시험에 있어서도, SKBR3은 KLRG1 발현 세포의 유무와 관계없이, 말초혈 단핵구의 수에 의존하여 세포 상해 활성이 인정되었다(도 6). 미처리 HCC1569는 미처리 말초혈 단핵구를 이용하여 검토한 경우, 말초혈 단핵구 수와 관계없이 ADCC 활성은 인정되지 않았다. 그러나, 미처리 HCC1569에서는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 이용한 검토에서 트라스투주맵에 의한 ADCC 활성이 인정되었으며, 이는 말초혈 단핵구의 수에 의존하는 것이었다(도 7).
(C) 총괄
HER2 양성 인간 유방암 세포주 중 E-카데린 또는 N-카데린 양성 세포주는 트라스투주맵에 대해 내성을 보인다. 그러나, E, N-카데린의 발현을 감약시킴으로써 이들 세포주의 트라스투주맵에 대한 내성은 감약되었다. 트라스투주맵의 작용 메커니즘 중 카데린이 관여하는 점을 검토하면, 트라스투주맵의 주요한 작용 메커니즘의 하나인 ADCC 활성에 관여하고 있음을 확인할 수 있으며, 트라스투주맵에 대한 내성에 관해 면역학적 기구가 강하게 관여하고 있음이 추측되었다. 또한, NK 세포 중의 E, N-카데린을 리간드로 하는 억제성 수용체인 KLRG1을 발현하는 NK 세포를 제거함으로써 트라스투주맵에 대한 내성은 소실하는 것이 나타났다.
실시예 2
<활성화 부직포의 작성＞
유리로 된 플라스크에 N-히드록시메틸 2-요오드아세트아미드 0.6 g, 진한 황산 5.7 ml 및 니트로벤젠 7.2 ml를 가하여 상온에서 교반 용해하고, 파라포름알데히드 0.036 g을 더 가하여 교반하였다. 여기에 폴리프로필렌으로 이루어지는 부직포(평균 섬유 직경 3.8 ㎛, 평량 80 g/m2, 두께 약 0.55 mm) 0.3 g을 넣어 상온에서 24시간 차광 반응하였다. 24시간 반응 후 부직포를 꺼내고, 에탄올 및 순수로 세정하고, 이것을 진공 건조하여 활성화 부직포를 얻었다.
이 활성화 부직포를 직경 0.68 cm의 원으로 절단한 것 4장을 칼슘, 마그네슘을 포함하지 않는 인산 완충액(이하, 「PBS(-)」라고 약칭함)에 친화성 컬럼으로 정제한 토끼 항인간 KLRG1 폴리클로날 항체(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. 이하, 「항KLRG1 항체」라고 약칭함)를 0.4 ml(항KLRG1 항체 16 ㎍/0.4 ml)에 상온에서 1시간 침지 후 냉장(2∼8℃)에서 약 24시간 더 침지하여, 항KLRG1 항체를 고정하였다. 이 항KLRG1 항체를 고정한 활성화 부직포를 입구와 출구를 갖는 용적 약 1 ml의 용기에 적층하고, 용기의 입구측으로부터 PBS(-) 3 ml로 세정하였다. 다음 0.2% 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트/PBS(-) 용액(이하, 「Tween 20 용액」이라고 약칭함) 0.4 ml를 가하고 상온에서 2.5시간 침지한 후, PBS(-) 3 ml로 세정하여, KLRG1 양성 세포 흡착재를 얻었다.
상기 KLRG1 양성 세포 흡착재(평균 섬유 직경 3.8 ㎛, 평량 80 g/m2, 두께 약 0.5 mm) 4장과, 충전액으로서 10 mm 아스코르브산 PBS(-) 용액(아스코르브산의 분자량 176)을 입구와 출구를 갖는 용적 약 1 ml의 용기에 충전하여, KLRG1 양성 세포 흡착기를 제작하였다.
<KLRG1 양성 세포의 흡착 성능 평가＞
ACD-A(acid citrate dextrose solution-A)를 가한 인간 신선 혈액 2.0 ml(혈액: ACD-A=8:1)를 시린지 펌프로 KLRG1 양성 세포 흡착기의 입구로부터 유속 1.0 ml/min으로 송액하고, 컬럼 출구로부터 처리 후의 혈액을 회수하였다. 컬럼에 흘리기 전의 ACD-A를 가한 인간 신선 혈액과 컬럼 출구로부터 회수한 혈액을 각각 PBS(-)로 1:1로 희석한 것을 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare사 제조) 위에 중층하고, 400×g로 30분간 원심하여 단핵구 부유액을 채취하였다. 이 단핵구 부유액 중의 NK 세포에서의 KLRG1 양성 세포를 직접 또는 간접적으로 형광 표지한 항인간 CD3 항체, 항인간 CD56 항체, 항인간 KLRG1 항체를 이용하여 FACSCaliburTM(Becton Dickinson사 제조)로 측정하였다. 그 결과, CD3-CD56+인 NK 세포 중의 KLRG1 양성 세포(이하 「KLRG1+ NK 세포」라고 약칭함)의 흡착률은 93.2%였다. 또한 이때의 CD3-CD56+인 NK 세포 중의 KLRG1 음성 세포(이하 「KLRG1- NK 세포」라고 약칭함)의 흡착률은 19.1%, 림프구의 흡착률은 16.9%, 혈소판의 흡착률은 15.8%로서, KLRG1+ NK 세포를 특이적으로 흡착할 수 있었다(표 1).
실시예 3
KLRG1 양성 세포 흡착재를 평균 섬유 직경이 16.9 ㎛, 평량 80 g/m2, 두께 약 0.8 mm의 부직포를 이용하여 제작하고, 상기 부직포 12장을 충전하여 KLRG1 양성 세포 흡착기를 제작하였다. 다음에, ACD-A를 가한 인간 신선 혈액 2.0 ml(혈액:ACD-A=8:1)를 시린지 펌프로 KLRG1 양성 세포 흡착기의 입구로부터 유속 0.2 ml/min으로 송액한 것 이외에는 실시예 2와 동일한 방법으로 KLRG1 양성 세포의 흡착 성능 평가를 행하였다. 그 결과, KLRG1+ NK 세포의 흡착률은 83.9%였다. 또한 이때의 KLRG1- NK 세포의 흡착률은 10.5%, 림프구의 흡착률은 5.7%, 혈소판의 흡착률은 7.7%로서, KLRG1+ NK 세포를 특이적으로 흡착할 수 있었다(표 1).
실시예 4
인간 KLRG1에 대해 교차 반응하는 항마우스 KLRG1 모노클로날 항체를 이용하여 KLRG1 양성 세포 흡착재를 제작한 것 이외에는, 실시예 2와 동일한 방법으로 KLRG1 양성 세포 흡착기를 제작하였다. 다음, ACD-A를 가한 인간 신선 혈액 2.0 ml(혈액:ACD-A=8:1)를 시린지 펌프로 KLRG1 양성 세포 흡착기의 입구로부터 유속 0.2 ml/min으로 송액한 것 이외에는 실시예 2와 동일한 방법으로 KLRG1 양성 세포의 흡착 성능 평가를 행하였다. 그 결과, KLRG1+ NK 세포의 흡착률은 90.3%였다. 또한 이때의 KLRG1- NK 세포의 흡착률은 0.0%, 림프구의 흡착률은 27.8%, 혈소판의 흡착률은 0.0%로서, KLRG1+ NK 세포를 특이적으로 흡착할 수 있었다(표 1).
실시예 5
토끼 항인간 KLRG1 폴리클로날 항체 대신 인간 E-카데린(Cat. No: 648-EC, R&D Systems, Inc.)을 고정한 활성화 부직포를 사용한 것 이외에는 실시예 2와 동일한 방법으로 KLRG1 양성 세포 흡착기를 제작하였다. 다음, ACD-A를 가한 인간 신선 혈액 2.0 ml(혈액:ACD-A=8:1)를 시린지 펌프로 KLRG1 양성 세포 흡착기의 입구로부터 유속 0.2 ml/min으로 송액하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 KLRG1 양성 세포의 흡착 성능 평가를 행하였다. 그 결과, KLRG1+ NK 세포의 흡착률은 32.7%였다. 또한 이 때의 KLRG1- NK 세포의 흡착률은 8.8%, 림프구의 흡착률은 22.2%, 혈소판의 흡착률은 26.4%로서, KLRG1+ NK 세포를 특이적으로 흡착할 수 있었다(표 1).
실시예 6
(A) 방법
(1) 세포주
HER2 양성 인간 위암 세포주 MKN-7은 RIKEN CELL BANK로부터 제공을 받았다. HER2 양성 인간 위암 세포주 NCI-N87은 ATCC로부터 구입하였다. MKN-7은 Pan-카데린 음성이고, E-카데린 음성인 것을 확인하였다. 한편 NCI-N87은 Pan-카데린 양성이고, E-카데린 양성인 것을 확인하였다. MKN-7 및 NCI-N87에 대해서는 RPMI-1640 배지(Sigma Aldrich, MO, USA)에 소 태자 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신을 가하여 배양하였다. 그 밖은 실시예 1과 동일한 방법으로 행하였다.
(B) 결과
(1) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 MKN-7에 대한 세포 상해성(도 8)
MKN-7(Pan-카데린 음성)에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않으면 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 없었다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 없으나, 종양 세포 생존율은 저하하는 경향이 인정되었다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우, 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양하면 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 이 결과로부터, 카데린의 발현을 수반하지 않는 MKN-7에서는 트라스투주맵의 농도와 관계없이 말초혈 단핵구의 수 의존적으로 종양 세포 생존율은 저하하는 것이 나타났다(도 8A).
KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 이용하여 동일한 실험을 행하였다.
트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 없었다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 생 종양 세포수는 감소하여, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 종양 세포의 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 종양 세포의 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 없으나, 종양 세포의 생존율이 저하하는 경향이 인정되었다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우, 종양 세포의 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양하면 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 종양 세포의 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 이 결과로부터, 카데린의 발현을 수반하지 않는 MKN-7에서는 트라스투주맵의 농도와 관계없이 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구의 수 의존적으로 종양 세포 생존율은 저하하는 것이 나타났다(도 8B).
(2) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구 또는 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구에 의한 위암 세포 NCI-N87에 대한 세포 상해성(도 9)
NCI-N87(Pan-카데린 양성: E-카데린 양성)에서는 트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 1배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우와 마찬가지로 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 종양 세포의 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 이 경향은 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우에도 마찬가지이며, 종양 세포량의 1배 또는 20배량의 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 이 결과로부터 카데린 발현을 수반하는 NCI-N87에서는 트라스투주맵의 농도 및 말초혈 단핵구의 수와 관계없이 종양 세포 생존율은 변화를 하지 않음이 명백해졌다(도 9A).
KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 이용하여 동일한 실험을 행하였다.
트라스투주맵의 농도를 0, 0.021 mg/ml, 0.105 mg/ml로 바꾼 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않는 경우에는 어느 농도에서도 종양 세포 생존율에 변화는 없었다. 또한, 트라스투주맵 농도를 0으로 한 경우, 종양 세포의 1배 또는 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양해도 종양 세포의 생존율에 변화는 없었다. 그러나, 트라스투주맵 농도를 0.021 mg/ml로 하여 종양 세포의 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 통계학적 유의차는 없으나, 종양 세포의 생존율이 저하하는 경향이 인정되었다. 종양 세포의 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 트라스투주맵 농도를 0.105 mg/ml로 한 경우, 종양 세포의 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양하면 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다. 종양 세포의 20배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우, 종양 세포 생존율은 더 저하하여 말초혈 단핵구를 공배양하지 않은 경우 및 1배량의 KLRG1 발현 세포를 제거한 말초혈 단핵구를 공배양한 경우에 대해 종양 세포 생존율은 유의하게 저하하였다(도 9B).
(C) 총괄
HER2 양성 인간 유방암 세포주와 마찬가지로, HER2 양성 인간 위암 세포주에 있어서도 E-카데린 양성 세포주가 트라스투주맵에 대해 내성을 보이며, E-카데린 음성 세포주가 트라스투주맵에 대해 감수성을 보이는 것이 확인되었다. 트라스투주맵의 감수성 발현에는 말초혈 단핵구의 존재가 필수적이었으므로 ADCC 활성의 관여가 추정되었다. E-카데린을 리간드로 하는 억제성 수용체인 KLRG1을 발현하는 NK 세포를 말초혈 단핵구로부터 제거하는 것에 의해 E-카데린 양성 세포주의 트라스투주맵에 대한 내성은 소실하는 것이 나타났다.
실시예 7
(A) 방법
(1) 마우스
6주령의 암컷의 NOD/SCID(non-obese diabetic/severe combined immune deficient) 마우스는 일본 클레아 주식회사(CLEA Japan, Inc)로부터 구입하였다. 모든 동물은 인정된 프로토콜에 기초한 시설의 가이드라인을 따라 유지되고 취급되었다.
(2) 트라스투주맵과 말초혈 단핵구의 투여
0.2 ml의 PBS에 5.0×106개의 HER2 양성 Pan-카데린 양성 인간 유방암 세포주 HCC1569를 현탁하고, NOD/SCID 마우스의 피하에 접종하였다. 이 담암 마우스를 다음의 5군으로 나누었다. 1) 무처치군(컨트롤군), 2) KLRG1 양성 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구 투여군, 3) 트라스투주맵 투여군, 4) 인간 말초혈 단핵구와 트라스투주맵 양자를 투여한 군, 5) KLRG1 양성 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구와 트라스투주맵 양자를 투여한 군. 트라스투주맵은 마우스의 체중 1 g당 0.005 mg 복강 내 투여하고, 인간 말초혈 단핵구는 마우스 1마리당 5.0×106개 복강 내 투여하였다. 트라스투주맵과 인간 말초혈 단핵구의 투여는 HCC1569의 접종 후 4주간부터 시작되어 주 1회 4주간 계속되었다.
(3) 종양 체적의 측정
종양 체적은 1주일에 한 번, 캘리퍼(caliper)를 이용하여 종양의 길이와 폭과 두께를 측정하고, 다음 식에 따라 산출되었다.
종양 체적(mm3) = (길이)×(폭)×(두께)
(B) 결과
HCC1569의 접종 후 28일(4주간)과 56일(8주간)의 종양 체적의 데이터를 도 10에 나타내었다. HCC1569의 접종 후 28일과 접종 후 56일의 데이터를 비교하면, 무처치군, KLRG1 양성 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구 투여군, 트라스투주맵 투여군 및 인간 말초혈 단핵구와 트라스투주맵 양자를 투여한 군에서는 모두 종양 체적은 증가하였다. KLRG1 양성 세포를 감소시킨 인간 말초혈 단핵구와 트라스투주맵 양자를 투여한 군에서는 종양 체적의 증가는 인정되지 않았다.
실시예 8
(A) 방법
(1) 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기
실시예 2의 활성화 부직포를 직경 0.48 cm의 원으로 절단한 것 6장과 항마우스 KLRG1 모노클로날 항체(eBioscience)를 이용하여, 실시예 2의 방법에 의해 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착재를 제작하였다. 또한 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착재를 실시예 2의 방법에 의해 입구와 출구를 갖는 용적 약 0.05 ml의 용기에 충전하여, 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기를 제작하였다.
(2) 마우스 KLRG1 양성 세포의 흡착 성능 평가
ACD-A(acid citrate dextrose solution-A; Terumo(주))를 가한 마우스 신선 혈액 3.0 ml(혈액:ACD-A=8:1)을 시린지 펌프로 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기의 입구로부터 유속 0.064 ml/min으로 송액하고, 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기의 출구로부터 처리 후의 혈액을 회수하였다. 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기에 의해 처리하기 전의 혈액 및 처리 후의 혈액을 형광 표지된 항마우스 CD3 항체, 항마우스 CD49b 항체, 항마우스 KLRG1 항체에 의해 염색하고, CD3 음성 및 CD49b 양성의 세포를 NK 세포로 하여 유세포 분석기(Cytomics FC 500, Beckman Coulter)에 의해 해석하였다.
(B) 결과
CD3 음성, CD49b 양성 및 KLRG1 양성인 마우스 KLRG1 양성 NK 세포의 흡착률은 98.4%였다. 또한 CD3 음성, CD49b 양성 및 KLRG1 음성인 마우스 KLRG1 음성 NK 세포의 흡착률은 45.4%, 마우스 림프구의 흡착률은 26.3%, 마우스 혈소판의 흡착률은 -2.5%로서, 마우스혈로부터 마우스 KLRG1 양성 세포를 특이적으로 흡착할 수 있었다(표 2).
실시예 9
(A) 방법
(1) 마우스 체외 순환용 기기의 설계
마우스 체외 순환용 회로는 내경 0.5 mm 및 외경 4 mm의 실리콘 튜브와 외경 0.6 mm 및 내경 0.3 mm의 우레탄 튜브 2개 및 미니피팅(VPY106, 아이시스)을 조합하여 제작하였다. 상기 회로의 내용량은 0.09 ml로 하였다. 체외 순환의 동력으로는 페리스타 펌프(SJ-1211H형, 아토)를 사용했고, 유속은 0.064 ml/min으로 하였다. 체외 순환 중 상기 회로 중의 미니피팅으로부터 ACD-A를 마이크로 시린지 펌프로 0.008 ml/min으로 지속 투여하기로 하였다. 실시예 8의 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기를 상기 회로에 접속한 후, ACD-A와 생리 식염수를 11:14로 혼합한 용액을 송액하고, 15분간의 프라이밍하는 것으로 하였다.
(2) 마우스
누드 마우스(BALB/c-nu/nu, 6주령, 암컷, 일본 SLC)의 피하에 0.2 ml의 PBS에 현탁한 5.0×106개의 HER2 양성 Pan-카데린 양성 인간 유방암 세포주 HCC1569를 접종하였다. 4주간 후, 이 담암 마우스를 다음의 3군으로 나누어 각 처리를 실시하였다. a) 무처치군(컨트롤군), b) 트라스투주맵 투여군, c) 전체 혈액량의 2배량을 체외 순환에 의해 처리하고 트라스투주맵을 투여하는 군, 각 군 n=6으로 하였다. 체외 순환 및 트라스투주맵 투여는 주당 1회 3주간 실시하고, 트라스투주맵은 마우스의 체중 1 g당 0.005 mg 복강 내 투여하였다. 모든 마우스는 인정된 프로토콜에 기초한 시설의 가이드라인에 따라 유지되고 취급되었다.
(3) 마우스 체외 순환 실시 방법
상기 담암 마우스에 이소플루란에 의해 마취를 가하고, 피부를 절개하여 양 경정맥을 노출시켰다. 이 양 경정맥에 서플로 F&F(Surflo F&F)(Terumo)를 유치하여 탈혈 및 반혈구로 하여 상기 회로와 접속하였다. 실험 동물의 혈액학(세키 마사토시 등, 라이프 사이언스사, 1981년)을 참고로 각 마우스의 전체 혈액량을 산출하고, 전체 혈액량의 2배를 체외 순환으로 처리하였다. 체외 순환 후에는 생리 식염수를 2분 30초 송액하여 상기 마우스 KLRG1 양성 세포 흡착기 및 상기 회로 내의 혈액을 마우스에 반혈하였다. 또한, 상처낸 곳은 지혈 후 봉합하였다.
(4) 종양 체적의 측정
종양 체적의 측정은 실시예 7(3)과 동일한 방법으로 실시하였다.
(B) 결과
각 군 처리 전 및 처리 1∼3주간 후의 종양 체적과 처리 전에 대한 처리 후의 종양 체적의 증가율의 n=6(3주 경과 후의 c만 n=5)의 평균치를 표 3에 나타내었다.
무처리군(표 3a)에서는 처리 전의 종양 체적에 대해 1주 경과 후에 185%, 2주 경과 후에 307%, 3주 경과 후에 615%로 증가하였다. 트라스투주맵 투여군(표 3b)에서도 마찬가지로 종양 체적은 증가 경향을 나타냈으며, 1주 경과 후에 145%, 2주 경과 후에 306%, 3주 경과 후에 655%로 증가하였다.
한편, 전체 혈액량의 2배량을 체외 순환에 의해 처리하고, 트라스투주맵을 투여한 군(표 3c)에서는 1주 경과 후에 83%, 2주 경과 후에 141%, 3주 경과 후에 177%였다. 전체 혈액량의 2배량을 체외 순환에 의해 처리하고, 트라스투주맵을 투여한 군(표 3c)은 1주 경과 후에 종양 체적의 감소 경향을 보였으며, 또한 3주 경과 후에 있어서 무처리군(표 3a) 및 트라스투주맵 투여군(표 3b)에 대해 유의하게 종양 증가를 억제하였다(각각 p=0.018, p=0.038).
이상의 실험 결과로부터 명백한 바와 같이, 체외 순환 처리와 항체 의약의 병용에 의해 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 명백하게 유의한 항암 작용이 인정되었다.
Claims (45)
- 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 암 치료제.
- 제1항에 있어서, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키는 처리가, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기에 의해 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행인 암 치료제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성이 증강되는 것인 암 치료제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 암 치료제.
- 제4항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵(trastuzumab)인 암 치료제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 암 치료제.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 암 치료제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 암 치료제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 유방암인 암 치료제.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 위암인 암 치료제.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, 상기 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 암 치료제.
- 제11항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 암 치료제.
- 제11항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 암 치료제.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 암 치료제.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 부직포인 암 치료제.
- KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제를, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 투여하기 전 또는 투여하고 있는 동안에, 상기 생체의 말초혈을 체외 순환하여, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하기 위한 세포 제거기.
- 제16항에 있어서, 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키는 것인 세포 제거기.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 세포 제거기.
- 제18항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵인 세포 제거기.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 세포 제거기.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 세포 제거기.
- 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 세포 제거기.
- 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 유방암인 세포 제거기.
- 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 위암인 세포 제거기.
- 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 생체의 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 세포 제거기.
- 제25항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 세포 제거기.
- 제25항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 세포 제거기.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 세포 제거기.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 부직포인 세포 제거기.
- (i) KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기로서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체의 말초혈을 체외 순환하여 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 세포 제거기와, (ii) 상기 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 혈액 정화 요법의 시행 중 또는 시행 후에 투여하는 암 치료제를 포함하는, 세포 제거기와 암 치료제의 병용 치료 시스템.
- 제30항에 있어서, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거함으로써, 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암 세포에 대한, 상기 암 특이적 막 항원에 대한 항체의 항체 의존성 세포 장애 활성이 증강되는 것인 병용 치료 시스템.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 HER2인 병용 치료 시스템.
- 제32항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한 항체가 트라스투주맵인 병용 치료 시스템.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원이 CEA인 병용 치료 시스템.
- 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1 양성 면역 세포가 KLRG1 양성 NK 세포인 병용 치료 시스템.
- 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, KLRG1에 대한 리간드가 E-카데린, N-카데린, R-카데린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 병용 치료 시스템.
- 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 유방암인 병용 치료 시스템.
- 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상피성 암이 위암인 병용 치료 시스템.
- 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 생체의 말초혈을 체외 순환하여, 상기 말초혈을 KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질을 고정화한 수불용성 담체에 접촉시켜, 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 선택적으로 제거하는 것인 병용 치료 시스템.
- 제39항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 KLRG1에 대한 항체인 병용 치료 시스템.
- 제39항에 있어서, KLRG1에 대해 친화성을 갖는 물질이 E-카데린인 병용 치료 시스템.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 자기 입자인 병용 치료 시스템.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수불용성 담체가 부직포인 병용 치료 시스템.
- 삭제
- 상피성 암 세포에서 발현되는 암 특이적 막 항원에 대한, 항체 의존성 세포 장애 활성을 갖는 항체를 함유하는 암 치료제로서, 상기 암 치료제는 상기 암 특이적 막 항원이 양성이고 KLRG1에 대한 리간드가 양성인 상피성 암의 생체에 대해 사용되며, 상기 암 치료제의 투여 개시 시기가 상기 생체의 말초혈 중의 KLRG1 양성 면역 세포를 KLRG1 음성 면역 세포보다 KLRG1 양성 면역 세포에 대해 높은 친화성을 갖는 세포 제거기를 이용하여 상기 생체 외에서 선택적으로 감소시키고 있는 동안 또는 감소시킨 후인 것을 특징으로 하는 암 치료제.
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