KR101342485B1

KR101342485B1 - Anti-aging, anti-wrinkle, whitening and anti-inflammatory tripeptide and cosmetic composition containing the same

Info

Publication number: KR101342485B1
Application number: KR1020120021032A
Authority: KR
Inventors: 이윤섭; 최혜정; 최하영; 김명옥
Original assignee: 미원상사주식회사
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2013-12-17
Also published as: KR20130099480A; WO2013129801A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선, 미백, 항염용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트리펩타이드는 콜라겐 분해효소인 MMPs생성 억제, 콜라겐 생합성 증진효과로 인한 주름 개선효과와 더불어 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성을 억제 함으로써 피부 색소 침착현상을 방지하는 등의 미백 효과 및 염증 억제 효과를 나타냄으로써 주름, 미백 및 염증개선에 탁월한 효능을 갖는 화장료를 제공한다. 특히, 상기 주름개선 및 미백용의 트리펩타이드는 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태 등의 다양한 기초 화장료 조성물에 첨가하여 사용할 수 있으며 피부자극이 없고 피부안정성도 우수한 특징을 갖는다.
화학식 1
R¹-X-Leu-Phe
(상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1 중의 X로 표시되는 부분은 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며, C-말단은 카르복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)The present invention relates to a novel tripeptide represented by the following formula (1) and skin anti-aging and skin wrinkle improvement, whitening, anti-inflammatory cosmetic composition containing the same as an active ingredient. The tripeptide according to the present invention inhibits the production of MMPs, which is a collagen degrading enzyme, improves wrinkles due to collagen biosynthesis enhancing effects, inhibits tyrosinase activity, and inhibits melanin, thereby inhibiting skin pigmentation and inhibiting skin pigmentation. By providing an effect, it provides a cosmetic having excellent efficacy in improving wrinkles, whitening and inflammation. In particular, the tripeptide for wrinkle improvement and whitening is added to various basic cosmetic compositions such as skins, lotions, creams, foundations, essences, gels, packs, forking, body oils, lipsticks, mascaras, makeup bases or soap forms. It can be used and has no skin irritation and excellent skin stability.
Formula 1
R ¹ -X-Leu-Phe
(In Formula 1, R ¹ is an alkenyl group selected from hydrogen or an acyl group having 1 to 18 carbon atoms or at least one double bond, Leu is D-Leu or L-Leu, Phe is D-Phe or L-Phe may also be selected from among amino acids, in particular 20 natural amino acids and non-natural amino acids, phenylglycine, and the C-terminus is a carboxylic acid or amide Can be a form)

Description

Anti-aging, anti-wrinkle, whitening and anti-inflammatory cosmetic composition containing tripeptide {Anti-aging, anti-wrinkle, whitening and anti-inflammatory tripeptide and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선, 미백, 항염용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 본 발명은 노화방지 및 주름 개선용 화장품 적용에 가장 중요한 요소인 콜라겐 분해 효소의 합성 및 발현 억제와 콜라겐 생합성에 우수한 효과를 보일 뿐 아니라 미백 화장품 적용에 중요한 요소인 멜라닌 합성 및 티로시나제 활성을 효과적으로 저해하고 자외선에 의해 증가하는 싸이토카인을 감소시킴으로써 노화방지, 주름 개선, 미백 및 항염효능을 가지는 신규한 트리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a tripeptide and skin anti-aging and skin wrinkle improvement, whitening, anti-inflammatory cosmetic composition containing the same as an active ingredient, and more particularly, the present invention is the most important factor in the application of anti-aging and wrinkle improvement cosmetics It not only shows excellent effects on the synthesis and expression of phosphorus collagen degrading enzymes and collagen biosynthesis, but also effectively inhibits melanin synthesis and tyrosinase activity, which are important factors for whitening cosmetics application, and reduces the cytokine increased by ultraviolet rays, thereby preventing aging, improving wrinkles, It relates to a novel tripeptide having a whitening and anti-inflammatory effect and a cosmetic composition containing the same as an active ingredient.

피부 노화는 유전적, 환경적 노출(UV 조사, 기계적인 충격), 호르몬 변화, 대사적 과정(활성산소종, 당, 알데하이드와 같은 반응성이 큰 화합물)에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들은 피부의 구조, 기능, 겉모습의 축적된 변화를 초래한다. 인간의 피부 노화는 크게 생물학적 과정에 따라 시간이 지나면서 나타나는 내적 노화와 지속적인 빛 노출, 스트레스, 흡연 등과 같은 환경에 의한 외적 노화(광노화)로 구분된다. 임상학적으로 내적 노화된 피부에서는 얇고 건조하고 창백하며 탄성을 잃고 많은 잔주름을 띄는 특징을 지니는 반면 빛, 흡연 등 외적 환경에 의해 노화가 진행된 피부의 경우 깊은 주름, 반점의 착색과 거친 피부가 관찰되는 등 피부에 더 큰 영향을 가하게 된다. 비록 연대학적으로 나이든 피부와 광노화된 피부는 형태학적 조직학적으로 차이가 있어 외관이 확연히 구분되지만 최근 연구 결과들에 의하면 두 노화들이 모두 콜라겐 분해효소(MMPs)의 발현 촉진, 프로콜라겐의 합성 감소, 결합조직의 손상과 같은 신호전달 경로를 포함한 중요한 분자적 특징을 공유한다고 보고 되어 있다. 환경에 의한 영향은 내적인 요인보다 피부에 미적 질이나 조직에 더욱 더 명백한 변이를 주는데, 가장 치명적인 외부적 요인은 UV 조사이다. 이러한 분자적 메커니즘의 일치는 UV 조사가 인간 피부의 연대학적 나이에 의한 노화의 중요 측면들을 가속화하는 것으로 여겨진다. Skin aging is affected by genetic and environmental exposures (UV irradiation, mechanical shock), hormonal changes, and metabolic processes (reactive compounds such as reactive oxygen species, sugars, and aldehydes). These factors cause cumulative changes in the structure, function, and appearance of the skin. Human skin aging is largely divided into internal aging that occurs over time according to biological processes and external aging (photoaging) caused by the environment such as continuous light exposure, stress, and smoking. In clinically internally aged skin, the skin is thin, dry, pale, loses its elasticity, and has many fine wrinkles.In the case of aging skin due to external environment such as light and smoking, deep wrinkles, spots, and rough skin are observed. It will have a greater effect on your back skin. Although aging and photo-aged skin are distinctly morphologically histologically distinct, their appearance is clearly distinguished, but recent studies show that both aging promotes the expression of collagen degrading enzymes (MMPs), reduces the synthesis of procollagen, It is reported to share important molecular features, including signaling pathways such as connective tissue damage. Environmental influences cause a more pronounced variation in skin aesthetics and tissue than internal factors, the most lethal external factor being UV radiation. The consensus of this molecular mechanism is believed that UV irradiation accelerates important aspects of aging by chronological age of human skin.

피부에 손상을 가하는 환경적 요인 중에서 가장 피부에 유해한 요소인 자외선은 전자기파 스펙트럼에서 200nm 와 400nm 사이의 파장대를 말하며, 파장의 길이에 따라 UVA(320-400 nm), UVB(280-320nm) 와 UVC(200-280nm)로 나누어 진다. UVC는 오존층에 의해 차단되기 때문에 인간 피부에 해롭게 작용하는 태양복사는 UVA와 UVB이다. UVA 복사는 UVB 복사보다 덜 강하지만 피부 침투성이 높은 특징을 가지고 있고 UVA에 의한 피부 손상은 선번(sunburn), 암, 피부노화 등이 알려져 있다. 인간의 건강과 관련하여 가장 위험한 환경적 발암 인자로 알려져 있는 UVB 복사는 홍반과 선번(sunburn) 이외에도 유전자 손상과 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 광노화에 의해 손상된 피부의 가장 큰 변화는 피부의 깊은 부분인 진피에서 일어나며 연결 조직의 분해, 콜라겐 함량의 감소와 변형된 엘라스틱 섬유의 축적을 유발한다.Among the environmental factors that damage the skin, UV, which is the most harmful factor to the skin, refers to a wavelength band between 200 nm and 400 nm in the electromagnetic spectrum. Depending on the length of the wavelength, UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) and UVC Divided by (200-280nm). Because UVC is blocked by the ozone layer, the sun's radiation that harms human skin is UVA and UVB. UVA radiation is less intense than UVB radiation, but has high skin permeability, and UVA skin damage is known to include sunburn, cancer, and skin aging. UVB radiation, the most dangerous environmental carcinogen associated with human health, is known to cause gene damage and skin cancer in addition to erythema and sunburn. The biggest changes in skin damaged by photoaging occur in the dermis, the deeper part of the skin, leading to breakdown of connective tissue, a decrease in collagen content and the accumulation of modified elastic fibers.

조직학적 관점에서 피부노화는 피부의 진피에서 메트릭스를 형성하는 세포 외 조직(Extracellular matrix proteins) 조성의 변화로 나타난다. 진피 세포 외 조직 중 콜라겐 단백질들은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부 노화와 주름형성에 밀접한 관련이 있다. 건강한 진피의 주요 가교 구성 성분들은 타입Ⅰ 콜라겐과 타입Ⅲ 콜라겐이다. 하지만 광노화에 의해 손상된 피부에서는 이 두 콜라겐의 전구체가 확연히 감소하였고 이들의 감소가 임상학적 심각성과 연관되어 있다. 콜라겐의 분해는 노화가 진행되면서 분해되기도 하나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가하면서 콜라겐 합성이 감소하게 되어 주름이 형성된다. 콜라겐 분해효소들(MMPs)은 아연-의존적인 세포 내 단백분해 효소로 진피의 세포 외 구조의 성분들을 분해시키거나 재구조화시킬 수 있는 물질로서 그 중 MMP-1은 진피의 콜라겐에 작용하여 분절시킨다. 따라서 이 효소의 합성 양과 활성도의 조절이 주름에 중요한 요인으로 작용한다. From a histological point of view, skin aging is a change in the composition of extracellular matrix proteins that form a matrix in the dermis of the skin. Collagen proteins in the dermal extracellular tissues impart strength and tension to the skin, which protects the skin from external stimuli or forces. It accounts for 90% of the dermal layer. Collagen reduction is closely related to skin aging and wrinkle formation . The main crosslinking components of healthy dermis are type I collagen and type III collagen. However, in skin damaged by photoaging, the precursors of these two collagens are markedly reduced and their decrease is associated with clinical severity. Degradation of collagen may be degraded as aging progresses, but when exposed to stimuli such as ultraviolet rays, the biosynthesis of collagen degrading enzymes (MMPs) increases and collagen synthesis decreases, forming wrinkles. Collagen degrading enzymes (MMPs) are zinc-dependent intracellular proteases that can degrade or restructure components of the extracellular structure of the dermis, of which MMP-1 acts to segment collagen in the dermis. . Therefore, regulation of the amount and activity of this enzyme is important for wrinkles.

피부 주름 개선 물질로 가장 대표적인 것이 레티놀(Retinol)과 레티노이드라고 명명되는 그 유도체들로써 건선, 노화, 암, 여드름 등 다방면에서 좋은 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 또한 이 레티노이드는 피부에 도포하였을 때 콜라겐분해효소(MMP-1)를 저해함으로서 콜라겐의 손실을 방지하고 콜라겐 형성을 자극함으로써 내인성 및 광노화를 방지하고 회복시키는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 효과에도 불구하고 피부에 도포하였을 때 홍반, 가려움, 건선, scaling 등의 국소적 피부자극 반응을 일으킨다고 알려져 있다. 따라서 생체에 안전하고 기존의 물질보다 콜라겐분해효소(MMP-1)를 억제하고 콜라겐 합성능이 좋은 새로운 주름개선 물질 개발이 요구되고 있다.Retinol and retinoids, the most representative of which are skin wrinkle improving substances, are known to be effective in various fields such as psoriasis, aging, cancer, and acne. In addition, the retinoids are known to prevent collagen loss by stimulating collagen formation by inhibiting collagenase (MMP-1) when applied to the skin to prevent and restore endogenous and photoaging. Despite these effects, however, it is known to cause local skin irritation reactions such as erythema, itching, psoriasis, and scaling when applied to the skin. Therefore, there is a need for developing a new anti-wrinkle substance which is safer in vivo and suppresses collagenase (MMP-1) than the existing substance and has good collagen synthesis ability.

UV 조사에 의한 피부의 손상은 주름 형성뿐만 아니라 염증반응도 일으키는 것으로 알려져 있다. 피부 손상과 관련된 생물학적 메커니즘에 의해 피부는 Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b), Interleukin 6(IL-6)을 포함한 수많은 싸이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있다. 만성적인 염증과 여러 암 생성의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다. 가장 주요한 외부자극 중 하나는 UVB 조사이다. UVB 조사는 케라티노사이트가 tumour necrosis factor- α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1 β), IL-6, IL-10 와 IL-8을 세포 외로 분비하도록 자극한다. 태양광에 노출된 피부에서 이러한 싸이토카인들의 분비는 지속적인 염증반응을 촉진시킨다. 따라서 UV자극에 의해 손상되는 피부 노화와 더불어 지속적인 싸이토카인들에 의한 염증반응을 억제하는 물질의 개발이 요구되고 있다.Damage to the skin by UV irradiation is known to cause inflammation as well as wrinkle formation. Due to the biological mechanisms involved in skin damage, skin is known to secrete numerous cytokines, including Interleukin-1a (IL-1a), Interleukin-1b (IL-1b), and Interleukin 6 (IL-6). The relationship between chronic inflammation and the production of multiple cancers is not only well known, but has also been shown in many tumor experiments. Keratinocytes induced to produce cytokines by various external stimuli lose cytokine control and eventually cause various skin diseases including cancer. One of the main external stimuli is UVB irradiation. UVB irradiation stimulates keratinocytes to secrete extracellular extracellular tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1 β), IL-6, IL-10 and IL-8. In sun-exposed skin, the release of these cytokines promotes a sustained inflammatory response. Therefore, there is a need for the development of a substance that inhibits the inflammatory response caused by cytokines and skin aging damaged by UV stimulation.

피부의 색소 침착은 호르몬, 유전적 영향, 화장품, 간의 손상, 약물, 임신, 자외선 조사 등에 의해 나타날 수 있으나 이 중 가장 영향력 있게 작용하는 것이 자외선 조사에 의해 형성된 멜라닌의 축적이다. 멜라닌이라고 알려진 어두운 색소는 피부 표피의 가장 안쪽에 있는 멜라노사이트 세포내에 멜라노좀이라고 하는 특정 소기관에서 생합성 되는데 이 멜라노좀에는 멜라닌 생합성 효소인 티로시나제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 가 존재한다. 멜라닌 생합성 기작은 티로시나제라고 불리는 효소에 의해 멜라노사이트 세포안에 존재하는 L-타이로신의 산화에 의해 시작된다. L-타이로신의 수산화 반응에 의해 DOPA(3,4-다이하이드록시페닐알라닌)를 생성시키고 이것이 다시 반응성이 큰 도파퀴논(Dopaquinone)으로 변하면서, 피부 색소 침착 현상의 원인이 되며 미적으로 문제가 되는 멜라닌을 형성하는 여러 단계의 복잡한 반응들이 자동적으로 이루어진다. 티로시나제는 흑갈색의 유멜라닌과 적색의 페오멜라닌의 합성에 중요한 효소로 소포체의 멜라노소멀 리보좀에서 합성되고 골지체에서 글리코실화 된 후 멜라노좀에 비활성상태로 소낭에 싸여 운반된다. 생성된 멜라닌 색소는 멜라노사이트에서 표피를 구성하고 있는 케라티노사이트(keratinucyte)로 전이되는데 이 과정에서 과잉 생산된 멜라닌은 피부에 침착되거나 기미, 주근깨 등을 형성하게 된다.Pigmentation of the skin may be caused by hormones, genetic effects, cosmetics, liver damage, drugs, pregnancy, UV irradiation, etc. The most influential one is the accumulation of melanin formed by UV irradiation. Dark pigments, known as melanin, are biosynthesized in specific organelles called melanosomes in the innermost melanocytes of the skin's epidermis, which contain melanin biosynthetic enzymes tyrosinase, TRP-1, and TRP-2. The melanin biosynthesis mechanism is initiated by the oxidation of L-tyrosine present in melanocytes by an enzyme called tyrosinase. The production of DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) by the hydroxylation of L-tyrosine, which in turn transforms into highly reactive dopaquinone, causing melanin pigmentation and aesthetic problem The complex reactions of the various stages that form the reaction take place automatically. Tyrosinase is an important enzyme for the synthesis of dark brown eumelanin and red peomelanin. It is synthesized in melanosomal ribosomes of the endoplasmic reticulum, glycosylated in the Golgi apparatus, and then transported wrapped in the vesicles in an inactive state to the melanosomes. The produced melanin pigment is transferred from the melanocytes to the keratinocytes (keratinucyte) constituting the epidermis. In this process, the over-produced melanin is deposited on the skin, blemishes, freckles and the like.

사람들이 나이가 들어가면서 광노화에 의한 피부 색소 침착이 점점 일반화 되어감에 따라 소비자들이 이를 해결하기 위한 요구가 증가하고 있다. 미백 원료로서 가장 대표적인 것은 하이드로퀴논, 코직엑시드, 알부틴, 아스코빅엑시드 등이 티로시나제 활성을 억제함으로써 미백효과를 갖고 있지만 이들 물질의 피부에 대한 안전성과 안정성, 실질적 효능이 문제가 되고 있다. 하이드로퀴논의 경우 좋은 미백효과를 나타내지만 피부자극을 일으키고 멜라노사이트에 독성을 일으킨다. 코직엑시드는 멜라노사이트의 덴드라이트와 멜라닌 함량을 감소시킬 뿐만 아니라 항산화제로도 작용하여 널리 사용되고 있으나 자극에 의한 피부염을 일으킨다고 알려져 있다. As people age, photopigmentation due to photoaging is becoming more common, and there is an increasing demand for consumers to address it. Hydroquinone, kojic acid, arbutin, ascorbic acid and the like are most representative as a whitening raw material, but they have a whitening effect by inhibiting tyrosinase activity, but the safety, stability, and practical efficacy of these substances on the skin are problematic. Hydroquinone has good whitening effect but causes skin irritation and toxicity to melanocytes. Cojixex not only reduces the dendrite and melanin content of melanocytes but also acts as an antioxidant, but is known to cause irritation dermatitis.

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J Biol Chem 2001; 276: 11933-11938 [문헌 24] Menon IA, Haberman HF. Mechanisms of action of melanins. Br J Dermatol 1977; 97: 109-112.24. Menon IA, Haberman HF. Mechanisms of action of melanins. Br J Dermatol 1977; 97: 109-112. [문헌 25] Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation. Pigment Cell Res 2003; 16: 101-110.25. Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation. Pigment Cell Res 2003; 16: 101-110. [문헌 26] Breathnach AS. Melanin hyperpigmentation of skin: melasma, topical treatment with azelaic acid, and other therapies. Cutis 1996; 57(suppl 1): 36-45.[26] Breathnach AS. Melanin hyperpigmentation of skin: melasma, topical treatment with azelaic acid, and other therapies. Cutis 1996; 57 (suppl 1): 36-45. [문헌 27] Piamphongsant T. Treatment of melasma: a review with personal experience. Int J Dermatol 1998; 37: 897-903.[Prior 27] Piamphongsant T. 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이러한 배경하에 본 발명자들은 화합물 트리펩타이드의 노화방지 및 주름 개선, 미백, 항염효과를 확인하기 위하여 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 콜라겐과 콜라겐 분해효소(MMPs)의 생합성 능력을 검색하였고, 멜라닌생성세포(melanoma) 세포주와 멜라닌자극호르몬을 이용한 in vitro assay계를 확립하여 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제효과능력을 확인하였으며 케라티노사이트(Keratinocyte)와 UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 증가한 싸이토카인들의 감소를 확인함으로써 화합물 트리펩타이드가 주름개선효과, 미백 및 항염에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Under this background, the present inventors have found that in using a fiber skin neuroblastoma (human skin fibroblst) cell line with UVA / UVB lamp to identify the anti-aging and anti-wrinkle, whitening, anti-inflammatory effects of compounds tripeptide An in vitro assay system was established to detect the biosynthetic capacity of collagen and collagen degrading enzymes (MMPs), using melanoma cell line and melanin stimulating hormone. in vitro assay system to establish was confirmed melanin production suppression effect, tyrosinase activity inhibition effect ability cake in using keratinocytes (Keratinocyte) and UVB lamp By establishing an in vitro assay system to confirm the reduction of increased cytokines, the present invention was completed by confirming that the compound tripeptides have an effect on wrinkle improvement, whitening and anti-inflammatory.

이에 본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 피부침투성이나 안정성이 뛰어난 신규한 트리펩타이드 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선, 미백 및 항염효과를 나타내는 피부 외용약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.The present invention is to solve the problems of the prior art as described above is an object of the present invention is harmless to the human body and exhibits a novel tripeptide having excellent skin permeability or stability and anti-aging, wrinkle improvement, whitening and anti-inflammatory effect containing the same It is to provide a skin external pharmaceutical composition and a cosmetic composition.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 트리펩타이드는 하기 화학식 1로 표시된다. The tripeptide according to the present invention for achieving the above object is represented by the following formula (1).

화학식 1Formula 1

R¹-X-Leu-PheR ¹ -X-Leu-Phe

(상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 탄소수 1~18의 아실기 중에서 선택되거나 또는 적어도 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알케닐기이며, Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe이 될 수 있다. 또한 화학식 1 중의 X로 표시되는 부분은 아미노산, 특히 20개의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(Phenylglycine)중에서 선택될 수 있으며, C-말단은 카르복실산 또는 아마이드 형태가 될 수 있다.)
(In Formula 1, R ¹ is an alkenyl group selected from hydrogen or an acyl group having 1 to 18 carbon atoms or at least one double bond, Leu is D-Leu or L-Leu, Phe is D-Phe or L-Phe may also be selected from among amino acids, in particular 20 natural amino acids and non-natural amino acids, phenylglycine, and the C-terminus is a carboxylic acid or amide Can be a form)

본 발명은 또한 상기한 트리펩타이드를 유효성분으로 하는 항노화, 주름개선, 미백 및 항염용 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 상기한 트리펩타이드가 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001~1% 중량으로 포함되는 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides an anti-aging, anti-wrinkle, whitening and anti-inflammatory cosmetic composition or pharmaceutical composition using the above-described tripeptide as an active ingredient. In particular, the above-described tripeptide provides a cosmetic composition or pharmaceutical composition containing 0.0001 to 1% by weight based on the total weight of the composition.

또한, 본 발명은 상기한 트리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태 중 어느 하나인 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention is a cosmetic composition which is any one of the skin, lotion, cream, foundation, essence, gel, pack, forclination, body oil, lipstick, mascara, makeup base or soap form containing the above-described tripeptide as an active ingredient Or a pharmaceutical composition.

본 발명은 피부자극이 없고 피부안정성이 우수한 신규한 트리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1생성 억제, 콜라겐 생합성 증진효과로 인한 주름 개선효과와 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성을 억제함으로써 피부 색소 침착현상을 방지하는 등의 미백 효과 및 염증 억제 효과를 나타냄을 확인하였고, 이에 이것을 주름, 미백 및 염증개선에 탁월한 효능을 갖는 피부 약학 조성물 및 화장료 조성물로 사용하는 것이다.In the present invention, a composition containing a novel tripeptide having no skin irritation and excellent skin stability as an active ingredient inhibits MMP-1 production, collagen biosynthesis, and inhibits tyrosinase activity and melanin production by inhibiting MMP-1 production, which is a collagen degrading enzyme. It was confirmed that it exhibits a whitening effect and inflammation inhibitory effect, such as to prevent skin pigmentation phenomenon by using it as a skin pharmaceutical composition and cosmetic composition having excellent efficacy in improving wrinkles, whitening and inflammation.

도 1은 트리펩타이드(A350_4)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도2는 본 발명의 실시예로서 도1에서 확인한 안전한 농도에서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 MMP-1 저해능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 4는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 의헤 증가한 MMP-1 생성량의 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 5는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 감소한 Procollagen1의 합성 증진능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 6은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 MMP-1 mRNA 발현 억제능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 7은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 mRNA 발현 감소능력을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 8은 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 저해능력을 레티닐팔미테이트와 트리펩타이드(A350_4)를 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 9는 발명의 실시예로서 UVA 조사에 의해 증가한 MMP-1 생성량의 저해능력을 레티놀과 트리펩타이드(A350_4)를 비교 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 10은 본 발명의 실시예로서 지방산 트리펩타이드가 a-MSH 처리 후 증가한 티로시나제 활성을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 11은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 처리 후 증가한 멜라닌 함량을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 12는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 처리 후 증가한 cAMP 함량을 감소시킨 결과를 나타낸 도표이다.
도 13은 본 발명의 실시예로서 휴먼 멜라노사이트에서 트리펩타이드(A350_4)의 멜라닌관련 유전자의mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 14는 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 의해 증가한 IL-1a, IL-1b와 IL- 6 싸이토카인 mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.
도 15는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 주름 수, 주름 길이, 주름 면적의 감소를 임상실험에서 확인한 결과를 나타낸 도표이다.
도 16은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 주름개선효과를 임상실험에서 영상 이미지를 통해 확인한 결과를 확인한 사진이다.
도 17은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 L^*값으로 수치화 한 결과를 나타낸 도표이다.
도 18은 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 ITA^*값으로 수치화 한 결과를 나타낸 도표이다.
도 19는 본 발명의 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)에 의한 미백효과를 임상실험에서 영상 이미지를 통해 확인한 결과를 확인한 사진이다.1 is a result confirming the cytotoxicity of tripeptide ( A350_4 ).
Figure 2 is a diagram showing the results of testing the MMP-1 inhibitory ability by tripeptide ( A350_4 ) at a safe concentration confirmed in Figure 1 as an embodiment of the present invention.
3 is a diagram showing the results of testing the inhibitory ability of the increased amount of MMP-1 produced by UVA irradiation of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
4 is a diagram showing the results of testing the inhibitory ability of the increased amount of MMP-1 produced by UVB irradiation of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
Figure 5 is a diagram showing the results of testing the ability to enhance the synthesis of Procollagen1 reduced by UVA irradiation of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a diagram showing the results of testing the inhibitory ability of MMP-1 mRNA expression of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
Figure 7 is a diagram showing the results of testing the ability to reduce MMP-1 mRNA expression increased by UVA irradiation of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a table showing the results of comparative tests of retinyl palmitate and tripeptide ( A350_4 ) for inhibition of MMP-1 production increased by UVA irradiation as an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a table showing the results of comparative tests of retinol and tripeptide ( A350_4 ) for the inhibition of MMP-1 production increased by UVA irradiation as an embodiment of the invention.
10 is a diagram showing the results of reducing the fatty acid tripeptides increased tyrosinase activity after a-MSH treatment as an embodiment of the present invention.
11 is a diagram showing the result of reducing the melanin content increased after a-MSH treatment of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
12 is a diagram showing the result of reducing the increased cAMP content after a-MSH treatment of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention.
Figure 13 is a diagram showing the results of testing the mRNA expression inhibition of the melanin-related gene of the tripeptide ( A350_4 ) in human melanocytes as an embodiment of the present invention.
14 is a diagram showing the results of testing the inhibitory ability of IL-1a, IL-1b and IL-6 cytokine mRNA expression increased by UVB irradiation of tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the invention.
15 is a chart showing the results of the reduction in the number of wrinkles, wrinkle length, wrinkle area by the tripeptide ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention in clinical trials.
16 is a photograph confirming the result of confirming the wrinkle improvement effect by the tripeptide ( A350_4 ) through the image image in the clinical experiment as an embodiment of the present invention.
FIG. 17 is a diagram showing the results of quantifying the whitening effect of the tripeptide ( A350_4 ) by L ^* value in a clinical experiment as an embodiment of the present invention.
FIG. 18 is a diagram showing the results of quantifying the whitening effect by tripeptides ( A350_4 ) as ITA ^* values in clinical trials as an embodiment of the present invention.
19 is a photograph confirming the results of confirming the whitening effect by the tripeptide ( A350_4 ) through the image image in the clinical experiment as an embodiment of the present invention.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 트리펩타이드를 제공한다.The present invention provides a tripeptide represented by the formula (1).

화학식 1Formula 1

R¹-X-Leu-PheR ¹ -X-Leu-Phe

화학식 1에서 표시되는 R¹의 구체적인 예로는 수소 또는 아세틸, 프로파노일, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 도데카노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 옥타데카노일 등과 같은 아실기가 포함될 수 있다. 특히 R¹은 수소, 아세틸, 옥타노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일 또는 옥타데카노일 중에서 선택되는 것이 바람직하고, R¹이 테트라데카노일, 헥사데카노일 또는 옥타데카노일중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다. Specific examples of R ¹ represented by the formula (1) include hydrogen or acetyl, propanoyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl, octanoyl, nonanoyl, decanoyl, dodecanoyl, tetradecanoyl, hexadecanoyl, Acyl groups such as octadecanoyl may be included. In particular, R ¹ is preferably selected from hydrogen, acetyl, octanoyl, tetradecanoyl, hexadecanoyl or octadecanoyl, and more preferably R ¹ is selected from tetradecanoyl, hexadecanoyl or octadecanoyl. .

화학식 1 중의 X로 표시되는 아미노산은 20종의 자연계 아미노산과 비자연계 아미노산인 페닐글리신(phenylglycine) 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 글루타믹산(glutamic acid), 발린(valine), 트리오닌(thrionine), 알지닌(arginine), 라이신(lysine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 이소루신(isoleucine), 히스티딘(histidine), 티로신(tyrosine), 메타이오닌(methionine), 시스틴(cystein), 트립토판(tryptopane) 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine) , 페닐글리신(phenylglycine) 등이 있으며, 이 중 바람직하게는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 프롤린(proline), 루신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 아스파틱산(aspartic acid), 라이신(lysine), 메타이오닌(methionine), 아스파라긴(asparagine), 알지닌(arginine), 티로신(tyrosine) 중에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 글리신(glycine), 루신(leucine), 메타이오닌(methionine)인 경우이다.The amino acid represented by X in Formula 1 may be selected from 20 natural amino acids and phenylglycine which is an unnatural amino acid. For example, glycine, alanine, serine, aspartic acid, glutamic acid, valine, trionine, arginine , Lysine, proline, leucine, phenylalanine, isoleucine, histidine, tyrosine, metaionine, cysteine, tryptophan (tryptopane) asparagine (asparagine), glutamine (glutamine), phenylglycine and the like, preferably of these, glycine (glycine), alanine (alanine), valine (proline), proline (proline), leucine (leucine) ), Phenylalanine (phenylalanine), aspartic acid (aspartic acid), lysine (lysine), metaionine (methionine), asparagine (asparagine), arginine (arginine), tyrosine (tyrosine), and most preferably Is glycine, leucine, and metaionine.

화학식 1에 표시되는 트리펩타이드의 아미노산 중 Leu 는 D-Leu 또는 L-Leu, Phe는 D-Phe 또는 L-Phe중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 L-Leu와 L-Phe으로 구성된다. 트리펩타이드의C-말단은 카복실산 또는 아마이드 형태가 선택될 수 있으며, 바람직하게는 카복실산 형태를 가진다.Among the amino acids of the tripeptide represented by Formula 1, Leu may be selected from D-Leu or L-Leu, and Phe may be selected from D-Phe or L-Phe, and preferably L-Leu and L-Phe. The C-terminus of the tripeptide may be selected from the carboxylic acid or amide form, and preferably has the carboxylic acid form.

본 발명에 따른 트리펩타이드는 통상적인 펩타이드 합성기를 사용한 고체상 방법에 의하여 합성될 수 있다. 통상적으로, 사용되는 아미노산은 N-말단이 보호된 형태 그리고 반응성 측쇄가 보호된 형태로 사용된다. N-말단을 보호하는 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)가 일반적으로 사용된다. 반응성 측쇄를 보호하기 위한 보호기로는 트리페닐메틸, 부틸옥시카르보닐, t-부틸에스테르, 펜타메틸크로만-6-술포닐 등이 사용된다. 본 발명에서 사용되는 아미노산은 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)로 N-말단이 보호될 수 있다. The tripeptide according to the present invention can be synthesized by a solid phase method using a conventional peptide synthesizer. Typically, the amino acid used is used in the form in which the N-terminal is protected and the reactive side chain is protected. As the protecting group for protecting the N-terminus, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) is generally used. As a protecting group for protecting the reactive side chain, triphenylmethyl, butyloxycarbonyl, t-butyl ester, pentamethylchroman-6-sulfonyl and the like are used. The amino acid used in the present invention may be protected at the N-terminus by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc).

고체상 반응을 위하여 사용되는 수지는 폴리펩타이드의 C-말단의 형태가 카복실산인지 아마이드 형태인지에 따라 다르게 적용한다. C-말단의 형태가 카복실산인 경우는 2-클로로트리틸 클로라이드(2-Chlorotrityl chloride, CTC), 4-벤질옥시벤질알콜(Wang), 하이드록시메틸페녹시아세틸(HMPA) 수지가 사용될 수 있으며, C-말단의 형태가 아마이드인 경우는 수지의 말단이 아민기로 만들어진 것으로서, 예를 들어 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Trialkoxybenzhydrylamine, Rink amide), 메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지가 사용될 수 있다. The resin used for the solid phase reaction is applied differently depending on whether the C-terminal form of the polypeptide is carboxylic acid or amide form. When the C-terminus is a carboxylic acid, 2-chlorotrityl chloride (CTC), 4-benzyloxybenzyl alcohol (Wang), hydroxymethylphenoxyacetyl (HMPA) resin may be used. When the C-terminus is in the form of an amide, the terminal of the resin is made of an amine group. For example, trialkoxybenzhydrylamine (Rink amide), methylbenzhydrylamine (MBHA) resin may be used.

위의 모든 수지를 사용함에 있어서 펩타이드는 C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성된다. 커플링시 아미노산의 카르복실기를 활성제로 활성화시키고, 커플링 후 N-말단의 보호기는 피페리딘으로 제거되고, 다음 커플링이 수행된다. 카르복실기 활성제로는 HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)가 함께 이용 될 수 있고, N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)와 첨가 보조제로 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용될 수 있다. 본 발명에서는 3개의 아미노산이 커플링 된 후에는 N-말단의 아민기는 원하는 아실기를 가지는 아실 활성체, 예를 들어, 아실안하이드라이드(acyl anhydride)와 DMAP(4-(N,N-dimethylamino)pyridine))를 함께 반응하여 N-말단에서 아마이드 결합을 형성하거나 카르복실산(Fatty acid)과 N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)이 함께 사용되어 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 그런 후 트리플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 절단용액에 의하여 폴리펩타이드 유사체는 고체 수지로부터 분리되고 또한 그것의 측쇄에 결합된 보호기가 제거된다.
In using all of the above resins, peptides are synthesized from the C-terminus to the N-terminus. Upon coupling, the carboxyl group of the amino acid is activated with an activator, and after coupling, the N-terminal protecting group is removed with piperidine and the next coupling is performed. Examples of the carboxyl group activator include HATU ( N - [(dimethylamino) - 1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridin-1-ylmethylene] -N- methylmethanaminium hexafluorophosphate N- (1-hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt) or HBTU ( N - [(1 H- benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene] -N- methylmethanaminium hexafluorophosphate N- oxide ( N, N- diisopropylethylamine) may be used together with 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), and N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) or 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) may be used together. In the present invention, after the three amino acids are coupled, the N-terminal amine group has an acyl activator having a desired acyl group, for example, acyl anhydride and DMAP (4- ( N, N -dimethylamino) pyridine)) to form an amide bond at the N-terminus or to carboxylic acid (Fatty acid), N, N -diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole ( HOAt) or 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) may be used together to form an amide bond. The polypeptide analogue is then separated from the solid resin by the cleavage solution comprising trifluoroacetic acid (TFA) and the protecting group bound to its side chain is removed.

본 발명은 또한 이러한 트리펩타이드를 포함하는 항노화제 조성물을 제공한다. The present invention also provides an anti-aging agent composition comprising such tripeptides.

화학식 1의 화합물은 항노화용 화장료에 0.0001~1중량%로 함유하는 것이 바람직하며, 0.001~0.5중량%로 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 활성이 미미하고, 1 중량% 이상인 경우에는 사용량에 따른 경제성이 결여될 경향이 높아진다. The compound of Formula 1 is preferably contained in an anti-aging cosmetics at 0.0001 to 1% by weight, more preferably 0.001 to 0.5% by weight. If the content is less than 0.0001% by weight, the activity is insignificant, and if the content is 1% by weight or more, the economical tendency is insufficient.

상기 화학식 1의 트리펩타이드를 포함하는 화장료는 이미 알려진 화장료 제조방법에 의해 화장료를 제조할 수 있고, 일반적인 피부 화장료에 한정되지 않고 의약부외품, 외용 의약품에도 적용할 수 있다. 이들의 제형은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 포클린징, 바디오일, 립스틱, 마스카라, 메이크업베이스 또는 비누형태로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그리고 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 트리펩타이드 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형, 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
Cosmetics comprising the tripeptide of Formula 1 may be prepared by a known cosmetic preparation method, and is not limited to general skin cosmetics, and may be applied to quasi-drugs and external medicines. These formulations may be prepared in any of the formulations commonly prepared, for example in the form of skins, lotions, creams, foundations, essences, gels, packs, pocleaning, body oils, lipsticks, mascaras, makeup bases or soaps. It may be prepared as, but is not limited thereto. And in the cosmetic composition of each formulation, other components in addition to the above-described tripeptide can be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the formulation, purpose of use, and the like of other cosmetics.

이하, 다음은 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention configured as described above will be described in more detail through examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments.

<실시예 1> 시료준비 (합성 및 분리정제)
Example 1 Sample Preparation (Synthesis and Separation Purification)

R¹-X-Leu-PheR ¹ -X-Leu-Phe

시료로 합성한 화합물Compound synthesized as a sample CompoundCompound NoNo .. SequenceSequence CompoundCompound NoNo .. SequenceSequence A350_1A350_1 myr-ALFmyr-ALF A350_11A350_11 myr-VLFmyr-VLF A350_2A350_2 myr-DLFmyr-DLF A350_12A350_12 myr-YLFmyr-YLF A350_3A350_3 myr-FLFmyr-FLF A350_13A350_13 myr-CLFmyr-CLF A350_4A350_4 myr-GLFmyr-GLF A350_14A350_14 myr-ELFmyr-ELF A350_5A350_5 myr-KLFmyr-KLF A350_15A350_15 myr-HLFmyr-HLF A350_6A350_6 myr-LLFmyr-LLF A350_16A350_16 myr-ILFmyr-ILF A350_7A350_7 myr-MLFmyr-MLF A350_17A350_17 myr-QLFmyr-QLF A350_8A350_8 myr-NLFmyr-NLF A350_18A350_18 myr-SLFmyr-SLF A350_9A350_9 myr-PLFmyr-PLF A350_19A350_19 myr-TLFmyr-TLF A350_10A350_10 myr-RLFmyr-RLF A350_20A350_20 myr-WLFmyr-WLF

상기 표 1에서 myr은 테트라데카노일 그룹, 즉 미리스토일(myristoyl) 그룹을 의미한다.
In Table 1, myr refers to a tetradecanoyl group, that is, a myristoyl group.

위의 표 1에 제시된 본 발명의 트리펩타이드를 합성하기 위해 메리필드(Merrifield)의 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법(J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149-2154)을 이용하였다. 발명의 펩타이드 합성을 위해 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC) 수지를 이용하여 합성을 시작하였으며, 첫 단계의 Fmoc(9-fluorenylmethoxy carbonyl) 아미노산은 N,N-디이소프로필데틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIEA)를 사용하여 디클로로메탄(dichloromethane, DCM) 용매 하에서 커플링한다. 그 다음 단계의 Fmoc아미노산부터는HATU(N-[(dimethylamino-)-1H -1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 혹은 HBTU(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)에 DIEA(N,N-diisopropylethylamine)를 함께 사용하여 커플링을 해나가는 방법으로 펩타이드의 사슬을 연장시켰다. 이때, C-말단에서부터 N-말단 방향으로 합성해 나가며, 아미노 말단에 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거(Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press. 848)하고 DMF(Dimethylforamide)으로 여러번 씻어준 다음 커플링 해나가는 방법으로 진행된다. 마지막으로 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% piperidine 용액으로 Fmoc기를 제거하고 카르복실산과 N, N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 함께 사용하여 아실기를 커플링한 다음 DMF로 여러번 세척하여 건조시켰다. 여기에 TFA(Trifuloroacetic acid)-H₂O-Triisopropylsilane(95:2.5:2.5, v/v/v) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기(Protecting group)의 제거 및 resin으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침천시켰다. 상기의 방법으로 얻은 crude 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 구배용매조성으로 RP-HPLC(2996 Detector, 515 Pump, Waters)을 이용하여 순도를 확인하였으며, 순도확인 결과 95%이하의 펩타이드는 Prep-LC로 분리 정제하여 95% 이상의 펩타이드를 얻었다. 이 펩타이드의 정확한 성분확인을 위하여 Elemental Analyzer(EA1112, CE Instrument, Italy)로 원소분석을 한 결과, 펩타이드의 원소별 함유량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 원소별 함유량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다. 이때 C-말단이 아마이드 형태의 화합물인 경우 트리알콕시벤즈하이드릴아민 (Rink amide) 수지를 이용하였으며, 2-클로로트리틸 클로라이드(CTC)를 이용한 펩타이드 합성시의 첫번째 커플링 방법을 제외한 다음 단계방법부터 동일하게 커플링을 진행하였다.
Merrifield's Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) method (J. Am. Chem. Soc., 85 (14), 2149-2154) was used to synthesize the tripeptides of the present invention shown in Table 1 above. It was. Synthesis was initiated using 2-chlorotrityl chloride (CTC) resin to synthesize the peptides of the invention. The first step Fmoc (9-fluorenylmethoxy carbonyl) amino acid was N, N -diisopropyldethylamine ( N, N- diisopropylethylamine, DIEA) in dichloromethane (DCM) solvent. The next step, Fmocamino acid, is from HATU ( N -[(dimethylamino-)-1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridin-1-ylmethylene] -N -methylmethanaminium hexafluorophosphate N -oxide) 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt) or HBTU ( N -[(1 H -benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene] -N -methylmethanaminium hexafluorophosphate N -oxide) and 1-hydroxybenzo Triazole (HOBt) was used together with DIEA ( N, N -diisopropylethylamine) to extend the chain of the peptide by coupling. At this time, the synthesis from the C-terminal to the N-terminal direction, after coupling the Fmoc-amino acid to the amino terminal, and remove the Fmoc group with 20% piperidine solution (Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide (1 ed.). CRC Press. 848), washing with DMF (Dimethylforamide) several times, and then coupling. Finally, after coupling the Fmoc-amino acid, the Fmoc group was removed with a 20% piperidine solution, carboxylic acid, N, N' -diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole ( HOAt) was used together to couple acyl groups and then washed several times with DMF to dry. To this, trifuloroacetic acid (TFA) -H ₂ O-Triisopropylsilane (95: 2.5: 2.5, v / v / v) solution was added and reacted for 2 to 3 hours to remove the protecting group and to separate the peptide from the resin. The peptide was precipitated with diethylether. Crude peptide obtained by the above method was confirmed the purity by using RP-HPLC (2996 Detector, 515 Pump, Waters) as a gradient solvent composition of acetonitrile (acetonitrile) and water containing 0.1% TFA, the purity was 95% The following peptides were separated and purified by Prep-LC to obtain more than 95% peptide. Elemental analysis was performed with an Elemental Analyzer (EA1112, CE Instrument, Italy) to confirm the exact components of the peptide. As a result, the contents of the peptides were consistent with the content of each element calculated from the amino acid sequence, confirming that the peptide had the correct amino acid sequence Respectively. In this case, when the C-terminus is an amide compound, a trialkoxybenzhydrylamine (Rink amide) resin was used, except for the first coupling method in the synthesis of peptide using 2-chlorotrityl chloride (CTC). Coupling proceeded in the same way.

<실시예 2> 피부노화 방지 및 피부주름 개선 효과
<Example 2> skin aging and skin wrinkle improvement

인간의 진피 세포를 이용하여 실시예 1 에서 합성한 트리펩타이드의 피부 노화 방지 효과와 피부주름 개선 효과를 실험하였다.Human dermal cells were tested for the anti-aging and skin wrinkle improvement effects of the tripeptide synthesized in Example 1.

피부에 주름이 생성되는 것은 피부가 노화가 진행되거나 자외선 같은 자극에 노출되게 되면서 콜라겐 분해효소들(MMPs)의 생합성이 증가함에 따라 콜라겐 합성이 감소하기 때문이다. 따라서 MMP-1과 같은 콜라겐 분해효소의 생합성양을 감소 시키고 자외선에 의해 급감하는 Type Ⅰ procollagen1 양을 증진 시키는 것으로 피부 주름을 예방, 개선할 수 있다.Wrinkles in the skin are due to a decrease in collagen synthesis as the skin ages and is exposed to irritation such as ultraviolet rays, increasing the biosynthesis of collagen degrading enzymes (MMPs). Therefore, it is possible to prevent and improve skin wrinkles by reducing the amount of biosynthesis of collagen degrading enzymes such as MMP-1 and by increasing the amount of Type I procollagen1 which is rapidly reduced by ultraviolet rays.

본 실험은 피부 섬유아세포종(human skin fibroblast, Hs68) 세포주와 트리펩타이드를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 MMP-1의 생합성 양과 mRNA 발현양을 평가함으로서 트리펩타이드의 피부 노화 방지 효과를 확인하였고, 피부 섬유아세포종(human skin fibroblst, Hs68) 세포주와 UVA/UVB lamp를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의한 노화에 미치는 트리펩타이드의 활성을 측정함으로써 피부주름 개선 효과를 측정하였다.
This experiment was performed using human skin fibroblast (Hs68) cell line and tripeptides in The in vitro assay system was established to evaluate the amount of MMP-1 biosynthesis and mRNA expression, which confirmed the anti-aging effect of tripeptides. The human skin fibroblst (Hs68) cell line and UVA / UVB lamp were used in By establishing an in vitro assay system, the effect of improving wrinkles was measured by measuring the activity of tripeptides on aging by ultraviolet irradiation.

(1) 세포주 및 세포배양(1) Cell line and cell culture

실험에 사용된 세포주는 human skin fibroblast Hs68세포(ATCC, USA)를 사용하였다. Hs68 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). Hs68 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.
The cell line used in the experiment was human skin fibroblast Hs68 cells (ATCC, USA). Hs68 cells were Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% FBS (Gibco Co), 100 μg / ml streptomycin, and 100 U / ml penicillin at 37 ° C. and 5% CO ₂ . Incubator; Thermo-scientific, USA. After Hs68 cells were sufficiently grown in 100 cm ² flasks (Corning, USA), the surface of the cultured cells was washed with PBS at intervals of three days, followed by treatment with a 0.25% trypsin-EDTA solution for 3 minutes in an incubator, followed by trypsin-EDTA solution. The cells were discarded and stored at 37 ° C. for 5 minutes to detach cells. The detached cells were subcultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ at a split ratio of 1: 5 by transferring 10 ml of DMEM containing 10% FBS to a new culture vessel.

(2 ) 세포 (2) cells 생존률Survival rate 측정 Measure

Hs68 (Human skin fibroblast)를 1*10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하고 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양하였다. 배양상등액을 제거하고 무혈청배지 100㎕와 MTT용액 (3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5디페닐테트라졸리움브로마이드)(5mg/㎖)을 각각 10㎕씩 넣고 3시간 동안 배양 후 배지를 제거한다. 각 well 에 100㎕ 의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)용액을 첨가하고 포마젠(Formazan)을 용해시킨 후 마이크로 플레이트 판독기(Microplate reader, Tecan)을 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 1과 같이 세포 생존률(%)을 환산하였다.
Dispense Hs68 (Human skin fibroblast) into a 96 well plate at a concentration of 1 * 10 ⁴ cells / well, incubate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO ₂ , and replace the serum-free medium with the diluted sample. Further incubation for 48 hours. Remove the culture supernatant and add 10 µl of serum-free medium and 10 µl of MTT solution (3- (4,5-dimethyldiazol-2-yl) -2,5 diphenyltetrazolium bromide) (5mg / ml). After incubation for 3 hours, the medium is removed. 100 μl of DMSO (dimethyl sulfoxide) solution was added to each well, and formazan was dissolved. The absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader (Tecan). Survival% was converted.

[수학식1] [ Equation 1 ]

세포 생존률(%) = (S_p)/S_c×100Cell survival rate (%) = (S _p ) / S _c x 100

S_s: 시료를 처리한 군의 흡광도 S _s : absorbance of the group treated with the sample

S_c: 시료를 처리하지 않은 군의 흡광도
S _c : absorbance of the untreated group

아래의 표2는 트리펩타이드를 2ppm 처리한 후 세포독성 실험한 결과를 나타낸 것이다. 대부분의 트리펩타이드는 2ppm 농도에서 독성을 보이지 않는 것을 확인하였다.
Table 2 below shows the results of cytotoxicity test after 2ppm treatment of tripeptide. Most tripeptides were found to be nontoxic at 2 ppm concentration.

각 화합물에 의한 세포독성Cytotoxicity by each compound Compound No.Compound No. SequenceSequence Cell viability(%)Cell viability (%) Compound No.Compound No. SequenceSequence Cell viability(%)Cell viability (%) A350_1A350_1 myr-ALFmyr-ALF 100100 A350_11A350_11 myr-VLFmyr-VLF 9797 A350_2A350_2 myr-DLFmyr-DLF 101101 A350_12A350_12 myr-YLFmyr-YLF 102102 A350_3A350_3 myr-FLFmyr-FLF 9999 A350_13A350_13 myr-CLFmyr-CLF 9696 A350_4A350_4 myr-GLFmyr-GLF 102102 A350_14A350_14 myr-ELFmyr-ELF 9999 A350_5A350_5 myr-KLFmyr-KLF 101101 A350_15A350_15 myr-HLFmyr-HLF 9090 A350_6A350_6 myr-LLFmyr-LLF 9898 A350_16A350_16 myr-ILFmyr-ILF 9898 A350_7A350_7 myr-MLFmyr-MLF 9999 A350_17A350_17 myr-QLFmyr-QLF 9797 A350_8A350_8 myr-NLFmyr-NLF 9898 A350_18A350_18 myr-SLFmyr-SLF 7878 A350_9A350_9 myr-PLFmyr-PLF 100100 A350_19A350_19 myr-TLFmyr-TLF 100100 A350_10A350_10 myr-RLFmyr-RLF 101101 A350_20A350_20 myr-WLFmyr-WLF 102102

도1은 위의 표1과 표2에서 보여주는 것과 같이 세포독성이 없고 MMP-1 저해 효과가 가장 좋았던 화합물A350_3, 화합물A350_4, 화합물A350_6, 화합물A350_7 중 하나인 A350_4의 세포독성을 다양한 농도에서 실험한 결과를 나타낸 도표이다. 도1에 나타난 바와 같이, MTT 분석결과 1내지 10ppm까지 95% 이상의 세포 생존률을 보여 화합물A350_4가 안전한 원료임을 확인하였다.
Figure 1 is a test in the above table 1 and no cytotoxicity, as shown in Table 2 MMP-1 inhibitory effect was the best compound A350_3, compound A350_4, compound A350_6, various concentrations of the cytotoxicity of which is one of the compounds A350_7 A350_4 A chart showing the results. As shown in Figure 1, MTT assay showed a cell viability of 95% or more from 1 to 10ppm to confirm that Compound A350_4 is a safe raw material.

(3 ) 트리펩타이드의 (3) tripeptides MMPMMP -1 생성 억제 효과-1 production inhibitory effect

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline(PBS)으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체용액를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕의 1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정하였다. MMP-1 생성 억제율(%)은 아래의 수학식 2와 같이 환산하였다.
Human skin fibroblasts (Hs68) were dispensed in 6 well plates at a concentration of 1 * 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours until they grew 70-80%. . The serum-free medium diluted with the sample is replaced with the culture medium, followed by further incubation for 48 hours. 100 μl of the supernatant obtained by separating the culture medium from the dead cells by centrifugation was placed in an anti-MMP-1 antibody coated 96well plate (Merck, USA; Cat #: MK101) and darkened. Incubated at 37 ° C. for 2 hours. After removing the culture medium, wash it with phosphate buffer saline (PBS) supplemented with 0.05% Tween 20 and incubate for 1 hour with 100 μl HRP-conjugated secondary antibody solution. After washing four times with phosphate buffered saline supplemented with 0.05% Tween 20, 100 μl of TMB solution is added and reacted at room temperature for 15 minutes. 100 μl of 1 M sulfuric acid is added to terminate the reaction. Absorbance was measured at 450/595 nm using a microplate reader (Tecan). MMP-1 production inhibition rate (%) was converted as shown in Equation 2 below.

[수학식2] [ Equation 2 ]

MMP-1 생성 억제율(%) = [1 - (M_s)/M_c]×100MMP-1 production inhibition rate (%) = [1 - (M _s ) / M _c ] x 100

M_s: 시료를 처리한 군의 흡광도 M _s : Absorbance of the group treated with the sample

M_c: 컨트롤 군의 흡광도
M _c : Absorbance of the control group

아래의 표3은 본 발명의 일 실시예로서 20개의 트리펩타이드 중 MMP-1 저해 효과를 보이는 12가지의 트리펩타이드에 의한 MMP-1 생성율 억제율을 나타낸 표이다. 2ppm으로 처리한 후 MMP-1 생성량을 ELISA assay로 측정한 결과 12개의 트리펩타이드에서 MMP-1을 확연히 억제시키는 것을 확인하였다.
Table 3 below shows the inhibition rate of MMP-1 production by 12 tripeptides showing MMP-1 inhibitory effect among 20 tripeptides as one embodiment of the present invention. After treatment with 2ppm, MMP-1 production was measured by ELISA assay, and it was confirmed that MMP-1 was significantly inhibited in 12 tripeptides.

각 화합물의 MMP-1 생성 억제율MMP-1 production inhibition rate of each compound Compound No.Compound No. SequenceSequence MMP-1 억제율(%)MMP-1 inhibition rate (%) Compound No.Compound No. SequenceSequence MMP-1 억제율(%)MMP-1 inhibition rate (%) A350_1A350_1 myr-ALFmyr-ALF 3030 A350_7A350_7 myr-MLFmyr-MLF 4949 A350_2A350_2 myr-DLFmyr-DLF 1010 A350_8A350_8 myr-NLFmyr-NLF 2323 A350_3A350_3 myr-FLFmyr-FLF 3838 A350_9A350_9 myr-PLFmyr-PLF 1414 A350_4A350_4 myr-GLFmyr-GLF 4141 A350_10A350_10 myr-RLFmyr-RLF 66 A350_5A350_5 myr-KLFmyr-KLF 77 A350_11A350_11 myr-VLFmyr-VLF 2323 A350_6A350_6 myr-LLFmyr-LLF 4949 A350_12A350_12 myr-YLFmyr-YLF 2222

도 2는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 세포독성이 없고 MMP-1 저해 효과가 가장 좋았던 화합물A350_3, 화합물A350_4, 화합물A350_6, 화합물A350_7 중 하나인 A350_4를 양성대조군인 레티노익산과 비교 한 후 MMP-1 합성 억제능 시험 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 A350_4의 농도가 0.8, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 억제효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 합성 억제효과를 보인 2ppm(48%)에서는 Retinoic acid(41%)보다 더 큰 MMP-1 억제효과를 보였다.
Figure 2 is a comparison with an embodiment of the present invention there is no cytotoxicity to the method MMP-1 inhibitory effect was the best compound A350_3, compound A350_4, compound A350_6, the retinoic acid positive control for one of A350_4 of compound A350_7 This is a table showing the results of MMP-1 synthesis inhibitory test. As a result of the experiment, as the concentration of A350_4 increased to 0.8, 1.5, and 2ppm, MMP-1 inhibitory effect was increased, and 2ppm (48%) showed the greatest inhibitory effect on MMP-1 synthesis than Retinoic acid (41%). It showed a greater MMP-1 inhibitory effect.

(4) 트리펩타이드의 (4) tripeptides UVAUVA /Of UVBUVB 조사에 의한 By investigation MMPMMP -1 생성 억제 효과-1 production inhibitory effect

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 50 mJ/cm²자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배양이 끝난 배지를 원심분리기로 죽은 세포와 분리하여 얻은 상등액 100㎕를 MMP-1 항체가 코팅된 (anti-MMP-1 antibody coated) 96well plate(머크 사, 미국. Cat#: MK101)에 넣고 어두운 곳에서 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척한 후 100 ㎕ HRP-conjugate 된 2차 항체를 넣어 1시간 동안 배양한다. 0.05% Tween20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 4회 세척 후 100 ㎕ TMB 용액을 넣어 실온에서 15분간 반응시킨 후 100 ㎕1M 황산을 넣어 반응을 종료시킨다. 마이크로 플레이트 판독기(microplate reader, Tecan)을 이용하여 450/595nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 3과 같이 MMP-1 생성 억제율(%)을 환산하였다.
Human skin fibroblasts (Hs68) were dispensed in 6 well plates at a concentration of 1 * 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours until they grew 70-80%. . 1 ml of PBS was added to each well plate, and 50 mJ / cm ² ultraviolet rays were irradiated with a UVB irradiator (vilber loumet, France). Remove the phosphate buffer saline (PBS) and replace the serum-free medium with diluted sample and incubate for 48 hours. 100 μl of the supernatant obtained by separating the culture medium from the dead cells by centrifugation was placed in an anti-MMP-1 antibody coated 96well plate (Merck, USA; Cat #: MK101) and darkened. Incubated at 37 ° C. for 2 hours. Remove the culture medium, wash 4 times with Phosphate buffer saline with 0.05% Tween20, and incubate for 1 hour with 100 μl HRP-conjugate secondary antibody. After washing 4 times with Phosphate buffer saline to which 0.05% Tween20 was added, 100 μl TMB solution was added and reacted at room temperature for 15 minutes. Then, 100 μl 1M sulfuric acid was added to terminate the reaction. Absorbance was measured at 450/595 nm using a microplate reader (Tecan), and MMP-1 production inhibition rate (%) was converted as shown in Equation 3 below.

[수학식3] [ Equation 3 ]

MMP-1 생성 억제율(%) = [(M_u-M_s)/( M_u -M_c)]×100% Inhibition of MMP-1 production = [(M _u -M _s ) / (M _u -M _c )] × 100

M_c: 컨트롤군의 흡광도M _c : absorbance of the control group

M_u: UVA 또는 UVB를 조사한 군의 흡광도M _u : absorbance of group irradiated with UVA or UVB

M_S: UVA또는 UVB 조사 후 시료를 처리한 군의 흡광도
M _S : absorbance of the group treated with UVA or UVB

아래의 표4는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 UVA 조사 자극에 의해 증가한 MMP-1 생성에 대해 트리펩타이드들의 MMP-1 생성 억제능을 시험한 결과를 나타낸 표이다. 각 트리펩타이드의 처리 농도는 2ppm 이다.
Table 4 below shows the results of testing the inhibitory ability of the MMP-1 production of tripeptides against MMP-1 production by UVA irradiation stimulation by the above method as an embodiment of the present invention. The treatment concentration of each tripeptide is 2 ppm.

각 화합물의 MMP-1 생성 억제율 MMP-1 production inhibition rate of each compound Compound No.Compound No. SequenceSequence MMP-1 억제율(%)MMP-1 inhibition rate (%) Compound No.Compound No. SequenceSequence MMP-1 억제율(%)MMP-1 inhibition rate (%) A350_1A350_1 myr-ALFmyr-ALF 7575 A350_7A350_7 myr-MLFmyr-MLF 133133 A350_2A350_2 myr-DLFmyr-DLF 3737 A350_8A350_8 myr-NLFmyr-NLF -11-11 A350_3A350_3 myr-FLFmyr-FLF 9191 A350_9A350_9 myr-PLFmyr-PLF 6464 A350_4A350_4 myr-GLFmyr-GLF 133133 A350_10A350_10 myr-RLFmyr-RLF -11-11 A350_5A350_5 myr-KLFmyr-KLF 1616 A350_11A350_11 myr-VLFmyr-VLF 1717 A350_6A350_6 myr-LLFmyr-LLF 148148 A350_12A350_12 myr-YLFmyr-YLF 102102

도 3은 본 발명의 일 실시예로서 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대한 MMP-1 합성 억제효과를 시험한 결과이고, 도 4는 트리펩타이드(A350_4)의 UVB 조사에 대한 MMP-1 합성 억제 효과를 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 도3, 4에서 보여주는 것과 같이 UVA 에 의해 증가한 MMP-1을 트리펩타이드(A350_4) 2ppm에서 46.5%, retinoic acid에서 43% 감소시키는 것을 확인하였고 UVB 에 의해 급증한 MMP-1 에 대해서도 트리펩타이드(A350_4) 2ppm에서 82%, retinoic acid에서 83% 감소시키는 것을 확인하였다.
3 is a result of testing the inhibitory effect of MMP-1 synthesis on UVA irradiation of tripeptides ( A350_4 ) as an embodiment of the present invention, Figure 4 is MMP-1 synthesis inhibition on UVB irradiation of tripeptides ( A350_4 ) A chart showing the results of testing the effects. As a result of the experiment as shown in Figures 3 and 4, it was confirmed that the MMP-1 increased by UVA was reduced by 46.5% at 2ppm of tripeptides ( A350_4 ) and 43% by retinoic acid. In addition, the tripeptide ( A350_4 ) was found to decrease 82% in 2ppm, 83% in retinoic acid.

(5) 트리펩타이드(A350_4)의 (5) tripeptides (A350_4) UVAUVA 조사에 의해 감소한 프로콜라겐 합성 증진 효과 Procollagen Synthesis Enhancement Effect Reduced by Irradiation

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVA 조사장치(Sankyo, Japan)에 의해 30 J/cm² 자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48 시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 세포 용해 완충액(lysis buffer)(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10％ glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 12 mM bglycerophosphate, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 mg/ml aprotinin, and 1％ NP40)으로 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 26,000 g에서 15분간 원심분리하여 세포 추출물을 분리한 후BCA법으로 단백질 양을 측정하여 동량을 맞추고 95℃에서 5분간 가열하여 단백질을 변성시킨 후 20㎍을 10% SDS-PAGE전기영동을 걸어준다. 전기영동을 걸어준 젤을 나이트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 단백질을 이동(transfer)시킨 후 TBST 버퍼에 용해시킨 5% 스킴밀크에서 1시간 동안 배양시킨 후 프로콜라겐 1(Santa Cruze Biotechnology, CA) 항체를 TBST 버퍼에 1:100으로 희석한 용액에 3시간 동안 쉐이킹 하면서 배양시킨다. 항체용액을 제거하고 0.05% Tween 20을 첨가한 Phosphate buffer saline으로 5분씩 3회 세척한 후 HRP-conjugate 된 2차 항체를 TBST 버퍼에 1:2000으로 희석한 용액에1시간 동안 배양한다. 멤브레인을 세척한 후, ECL 용액을 뿌려 imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA]를 이용하여 측정하였다.Human skin fibroblasts (Hs68) were dispensed in 6 well plates at a concentration of 1 * 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours until they grew 70-80%. . 1 ml of PBS was added to each well plate and 30 J / cm ² by UVA irradiator (Sankyo, Japan). Ultraviolet rays were irradiated. Remove the phosphate buffer saline (PBS) and replace the serum-free medium with diluted sample and incubate for 48 hours. After removal of medium, cell lysis buffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM NaF, 12 mM bglycerophosphate, 1 mM DTT, 1 mM Cells were lysed with PMSF, 5 mg / ml aprotinin, and 1% NP40). After centrifuging the lysed cells at 26,000 g for 15 minutes to separate the cell extract, measure the amount of protein by BCA method, adjust the same amount, and denature the protein by heating at 95 ℃ for 5 minutes, and then 20 ㎍ 10% SDS-PAGE Walk Yeongdong. Electrophoresis gels were transferred to nitrocellulose membranes, and then incubated for 1 hour in 5% skim milk dissolved in TBST buffer, followed by procollagen 1 (Santa Cruze Biotechnology, CA). The antibodies are incubated with shaking for 3 hours in a solution diluted 1: 100 in TBST buffer. After removing the antibody solution and washing three times with Phosphate buffer saline added with 0.05% Tween 20 for 5 minutes, the HRP-conjugate secondary antibody was incubated in a solution diluted 1: 2000 in TBST buffer for 1 hour. After washing the membrane, spray the ECL solution with imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA].

이 때 대조군에는 항-튜불린 항체(Sigma)를 이용하였다.An anti-tubulin antibody (Sigma) was used as a control.

도5는 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대해 감소한 type Ⅰ procollagen1 생합성 증진 효과를 실험한 도표이다. 음성대조군(negative control)은 UVA를 조사한 군으로 프로콜라겐 생성량을 1로 기준하고 UVA 조사 후 시험물질인 트리펩타이드(A350_4)와 양성대조군인 레티노익산을 처리한 군에 대해 상대적인 효과를 나타냈다. 도5에 나타난 바와 같이, 트리펩타이드(A350_4) 처리 군은 UVA 단독 조사군에 비해 프로콜라겐 생합성양이 3.87 배 증가 했으며 레티노익산에서도 동일한 결과를 보였다. 따라서 트리펩타이드(A350_4)가 UVA 조사에 의해 감소한 프로콜라겐 생합성양을 촉진한다는 것을 확인하였다.
FIG. 5 is a diagram illustrating the effect of reducing type I procollagen1 biosynthesis on the UVA irradiation of tripeptide ( A350_4 ) by the above method as an embodiment of the present invention. Negative control group was UVA-irradiated group and showed relative effects on the group treated with tripeptide ( A350_4 ) and the positive control group retinoic acid after UVA irradiation. As shown in Figure 5, the tripeptide ( A350_4 ) treated group increased 3.87 times the amount of procollagen biosynthesis compared to the UVA alone irradiated group and showed the same results in retinoic acid. Therefore, it was confirmed that the tripeptide ( A350_4 ) promotes the amount of procollagen biosynthesis reduced by UVA irradiation.

(6) 트리펩타이드(A350_4)의 (6) tripeptides (A350_4) MMPMMP -- 1발현1 expression 억제 효과 Inhibitory effect

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 phosphate buffer saline(PBS) 1㎖씩을 넣어 배지를 세척한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. MMP-1, Type Ⅰ procollagen1의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-1의 primer sequence는 표 5와 같다. 각 primer를 각각 1 ㎕ (0.5 ㎍/㎕)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 60℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다.Human skin fibroblasts (Hs68) were dispensed in 6 well plates at a concentration of 1 * 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours until they grew 70-80%. . Add 1 ml of phosphate buffer saline (PBS) to each well plate, wash the medium, replace the serum-free medium with diluted sample, and incubate for 24 hours. After removing the medium, RNA was isolated using an RNA extraction kit (Invitrogen, Korea), and cDNA was synthesized. RT-PCR was performed on the synthesized cDNA to measure the mRNA expression level of MMP-1, Type I procollagen1. The primer sequences of GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and MMP-1 used are shown in Table 5. 1 μl (0.5 μg / μl) of each primer was added to the synthesized cDNA together with DEPC-Water to PCR-premix tube (Bionia, Korea). Denaturation was performed at 95 ℃ for 30 seconds and annealing at 60 ℃. At 30 seconds, the extension proceeded to 30 cycles for 2 minutes at 72 ℃. The PCR product was confirmed to be non-specific PCR product or primer dimer in 1% agarose gel and the amount of product was confirmed by EC3 UV illuminator (UVP, USA).

도 6은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 양성대조군인 레티노익산과 비교하여 트리펩타이드(A350_4)의 MMP-1 mRNA 발현 억제능을 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 상기와 같이 실험한 결과 트리펩타이드(A350_4)의 농도가 0.8, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 mRNA 발현 저해효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 mRNA 발현 저해효과를 보인 2ppm에서는 레티노익산과 같은 효과를 보였다.
Figure 6 is a diagram showing the results of testing the inhibitory ability of the tripeptides ( A350_4 ) MMP-1 mRNA expression in comparison with the positive control group retinoic acid as an embodiment of the present invention. As a result of the experiment, as the concentration of tripeptide ( A350_4 ) increased to 0.8, 1.5, and 2ppm, MMP-1 mRNA expression inhibitory effect was increased, and at the 2ppm showing the largest MMP-1 mRNA expression inhibitory effect, such as retinoic acid It showed an effect.

유전자이름 Gene name ForwardForward primerprimer (5’ 3’)(5 ’3’) ReverseReverse primerprimer (3’ 5’)(3 ’5’) MMP-1MMP-1 ATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGAATT CTA CTG ATA TCG GGG CTT TGA ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG ATG TCC TTG GGG TAT CCG TGT AG GAPDHGAPDH CAA AAG GGT CAT CAT CTC TGCAA AAG GGT CAT CAT CTC TG CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGCCT GCT TCA CCA CCT TCT TG

(7) 트리펩타이드(A350_4)의 (7) tripeptides (A350_4) UVAUVA 조사에 의해 증가한 Increased by count MMPMMP -- 1발현1 expression 억제 효과 Inhibitory effect

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양하였다. 각 well plate에 PBS 1㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 80mJ/cm²자외선을 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. MMP-1, Procollaen 1의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-1의 primer sequence는 표5과 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 60℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다.
Human skin fibroblasts (Hs68) were dispensed in 6 well plates at a concentration of 1 * 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours until they grew 70-80%. . 1 ml of PBS was added to each well plate, and 80mJ / cm ² ultraviolet rays were irradiated with a UVB irradiation device (vilber loumet, France). Remove the phosphate buffer saline (PBS), replace the serum-free medium with diluted sample, and incubate for 24 hours. After removing the medium, RNA was isolated using an RNA extraction kit (Invitrogen, Korea), and cDNA was synthesized. RT-PCR was performed on the synthesized cDNA to measure mRNA expression levels of MMP-1 and Procollaen 1. The primer sequences of GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and MMP-1 used are shown in Table 5. 1 μL (0.5 μg / μL) of each primer was added and the synthesized cDNA was added to the PCR-premix tube (Bionia, Korea) with DEPC-Water. Denaturation was performed at 95 ℃ for 30 seconds and annealing at 60 ℃. At 30 seconds, the extension proceeded to 30 cycles for 2 minutes at 72 ℃. The PCR product was confirmed to be non-specific PCR product or primer dimer in 1% agarose gel and the amount of product was confirmed by EC3 UV illuminator (UVP, USA).

도7은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 UVA조사에 대해 증가한 MMP-1 mRNA 발현 억제 효과를 실험한 도표이다. FIG. 7 is a diagram illustrating an effect of inhibiting increased MMP-1 mRNA expression against UVA irradiation of tripeptide ( A350_4 ) by the above method as an embodiment of the present invention.

상기와 같이 실험한 결과 트리펩타이드(A350_4)의 농도가 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2ppm으로 증가할수록 MMP-1 mRNA 발현 저해효과가 커짐을 보였고 가장 큰 MMP-1 mRNA 발현 저해효과를 보인 2ppm에서는 양성대조군인 레티노익산 보다 더 큰 저해효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
As a result of the experiment, as the concentration of tripeptide ( A350_4 ) increased to 0.6, 0.8, 1, 1.5, 2ppm, MMP-1 mRNA expression inhibitory effect was increased, and at 2ppm showing the largest MMP-1 mRNA expression inhibitory effect It was confirmed that the inhibitory effect was greater than the positive control retinoic acid.

도 8과 9는 본 발명의 일 실시예로서 기존에 항노화 화장료에 사용되는 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate)와 레티놀(retinal)과의 비교효과 및 시너지 효과를 실험한 도표이다. 도 8, 9에서 보듯이 레티닐팔미테이트나 레티놀의 경우 트리펩타이드(A350_4)와 같은 강력한 억제효과를 보여주지 않으나 함께 사용시 약간의 시너지 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.
8 and 9 are diagrams illustrating the comparative and synergistic effects of retinyl palmitate and retinol used in anti-aging cosmetics as an embodiment of the present invention. As shown in Figures 8 and 9, in the case of retinyl palmitate or retinol did not show a strong inhibitory effect, such as tripeptide ( A350_4 ), it could be confirmed that some synergistic effects when used together.

<실시예 3> 피부 미백효과Example 3 Skin Whitening Effect

멜라닌 생성 세포를 이용하여 트리펩타이드의 미백효능을 실험하였다. The whitening effect of tripeptide was tested using melanocytes.

피부가 흑화를 일으키는 것은 피부의 멜라닌 생성세포에서 멜라닌을 만들어 표피로 내보내기 때문으로 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생성과 그 기전을 차단시킨다면, 멜라닌이 만들어 지지 않아 피부 흑화는 나타나지 않는다. 따라서 멜라닌 생성과 멜라닌 합성의 주요단계에 관여하는 티로시나제 효소의 활성도는 미백을 측정하는 중요한 척도로 사용된다. Skin blackening causes melanin-producing melanin in the skin and exports it to the epidermis. If you block melanin-producing melanogenesis and its mechanism, melanin is not produced and skin blackening does not appear. Thus, the activity of tyrosinase enzymes involved in the major stages of melanogenesis and melanin synthesis is used as an important measure of whitening.

본 실험은 멜라닌생성세포(melanoma) 세포주와 멜라닌자극호르몬을 이용한 in vitro assay계를 확립하여 트리펩타이드에 의한 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제효과를 측정함으로써 피부 미백 효과를 확인하였다.
This experiment was carried out using melanoma cell line and melanin stimulating hormone. in An in vitro assay system was established to determine the skin whitening effect by measuring the melanin production inhibitory effect and the tyrosinase inhibitory effect by tripeptides.

(1) 세포주 및 세포배양(1) Cell line and cell culture

실험에 사용된 세포주는 melanoma B16F10 세포와 human primary melanocyte HEMn-LP 세포(Cascade Biologics, USA)를 사용하였다 B16F10 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HEMn-LP 세포는 1% HMGS (Cascade Biologics, USA)이 혼합된 99% Medium 254 (Cascade Biologics, USA) 배지를 이용하여 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다 (Incubator; Thermo-scientific, USA). B16F10, HEMn-LP 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.
The cell lines used in this experiment were melanoma B16F10 cells and human primary melanocyte HEMn-LP cells (Cascade Biologics, USA). B16F10 cells were treated with 10% FBS (Gibco Co), 100 μg at 37 ° C and 5% CO ₂ . Culture was incubated using DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) with / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin (Incubator; Thermo-scientific, USA). HEMn-LP cells were cultured at 37 ° C., 5% CO ₂ using 99% Medium 254 (Cascade Biologics, USA) medium mixed with 1% HMGS (Cascade Biologics, USA) (Incubator; Thermo -scientific, USA). After B16F10 and HEMn-LP cells were sufficiently grown in 100 cm ² flasks (Corning, USA), the cultured cell surfaces were washed with PBS at intervals of three days, followed by treatment with an incubator for 3 minutes in a 0.25% trypsin-EDTA solution. The trypsin-EDTA solution was discarded and stored at 37 ° C. for 5 minutes to detach cells. The detached cells were subcultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ at a split ratio of 1: 5 by transferring 10 ml of DMEM containing 10% FBS to a new culture vessel.

(2) (2) 티로시나제Tyrosinase 활성억제를 통한 미백효과 실험 Whitening effect experiment through activity inhibition

6 well plate의 각 well에 B16F10 멜라닌 생성세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 1x10⁵cell/well (Final volume 3ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리 하였다. B16F10 melanocytes (or HEMn-LP melanocytes) were added to each well of a 6 well plate in 1x10 ⁵ cell / well (Final volume 3ml), incubated for 24 hours in a 37 ° C, 5% CO ₂ incubator. The medium of the wells was removed and replaced with fresh DMEM. Whitening efficacy samples were prepared for each well by concentration and pretreated for 30 minutes.

이어서 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의 1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 1,300rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF이 함유된 100mM sodium phosphate buffer (pH6.8))를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 1,300rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. BCA protein assay kit (PIERCE, USA)를 이용하여 총단백질 정량을 하였고, 같은 양으로 정량된 시료를 96 well plate의 각 웰에 40ml씩 넣고, 이어서 2mg/ml로 실험 전 phosphate buffer (pH 6.8)에 바로 녹인 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 120ml씩 넣었다. 37°C에서 30분~60분간 반응시킨 뒤, ELISA 리더를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군을 기준으로 타이로시나제 활성억제율(%)을 다음 [수학식 4]에 의하여 구하였다. 음성대조군은 시료대신 DMSO를 처리하여 샘플로 사용하였다.
Subsequently, 1 ppm of α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) was treated and incubated for 48 hours. Thereafter, the culture medium was removed, 1 ml of PBS was added thereto, and each well was scraped with a cell scraper to separate cells, and then transferred to each 1.5 ml tube. Subsequently, the supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C and 1,300 rpm for 3 minutes, and the cell pellet was recovered and 200 ml of lysis buffer (1 mM Triton X-100, 100 mM sodium phosphate buffer containing 1 mM PMSF (pH6.8). )) The cells were lysed by vortex at intervals of 10 minutes for 30 minutes, and then centrifuged at 4 ° C and 1,300 rpm for 30 minutes to transfer the supernatant to a new 1.5 ml tube. Total protein was quantified using a BCA protein assay kit (PIERCE, USA), and the same amount of the sample was put into each well of a 96 well plate in 40 ml, followed by 2 mg / ml in phosphate buffer (pH 6.8). 120 ml of L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) dissolved immediately was added. After reacting for 30 to 60 minutes at 37 ° C, absorbance was measured at 475 nm using an ELISA reader. Based on the negative control group, tyrosinase activity inhibition rate (%) was calculated by the following [Equation 4]. The negative control group was used as a sample treated with DMSO instead of a sample.

도 10은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 a-MSH 에 의해 증가한 티로시나제의 활성 억제 효과를 나타낸 도표이다.
10 is a diagram showing the effect of inhibiting the activity of tyrosinase increased by a-MSH of tripeptide ( A350_4 ) by the above method as an embodiment of the present invention.

[수학식 4]&Quot; (4) "

티로시나제활성 억제율(%) = [(T_m -T_s)/( T_m -T_c)]×100% Tyrosinase activity inhibition = [(T _m -T _s ) / (T _m -T _c )] × 100

T_c: 컨트롤군의 흡광도T _c : absorbance of the control group

T_m: α-MSH 처리군의 흡광도T _m : absorbance of α-MSH treated group

T_S: 시료와 α-MSH를 처리한 군의 흡광도
T _S : absorbance of the sample and the group treated with α-MSH

(3) 멜라닌 생성억제 효과 측정(3) measuring melanin production inhibitory effect

6 well plate 의 각 웰에 B16F10 멜라닌 생성세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 1x10⁵cell/well (Final volume 3ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리 하였다. B16F10 melanocytes (or HEMn-LP melanocytes) were added to each well of a 6 well plate in 1x10 ⁵ cell / well (Final volume 3ml), incubated in 37 ° C, 5% CO ₂ incubator for 24 hours, and then The medium of the wells was removed and replaced with fresh DMEM. Whitening efficacy samples were prepared for each well by concentration and pretreated for 30 minutes.

이후 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 1,300rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF, 50mM Tris-HCl (pH7.0), 2mM EDTA(pH8.0), 150mM NaCl)를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 1,300rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포펠렛을 회수하여 60°C에서 약 3시간 건조시킨 뒤, 10% DMSO가 첨가된 2N NaOH를 150ml씩 넣어 60°C에서 1시간 동안 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 96 well plate 의 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100ml씩 넣어 ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료대신 DMSO로 처리하였다. 멜라닌 생성억제율(%)은 다음 [수학식 5]에 의하여 구하였다.
Since 1ppm of α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) was treated and incubated for 48 hours. Thereafter, the culture medium was removed, 1 ml of PBS was added thereto, and each well was scraped off with a cell scraper to separate the cells, and then transferred to each 1.5 ml tube. Subsequently, the supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C. and 1,300 rpm for 3 minutes, and cell pellets were recovered to obtain 200 ml of Lysis buffer (1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0). 2 mM EDTA (pH 8.0), 150 mM NaCl) was added. After vortexing for 30 minutes at 10 minute intervals, the cells were lysed, centrifuged at 4 ° C and 1,300 rpm for 30 minutes to remove supernatant, and cell pellets were collected and dried at 60 ° C for about 3 hours, followed by 10% 150 ml of 2N NaOH added with DMSO was added to lyse melanin at 60 ° C for 1 hour. 100 ml of the supernatant obtained by dissolving each well of a 96 well plate was measured at 405 nm using an ELISA reader. Negative controls were treated with DMSO instead of samples. Melanin production inhibition rate (%) was calculated by the following [Equation 5].

도 11은 본 발명의 일 실시예로서 상기의 방법으로 트리펩타이드(A350_4)의 α-MSH 에 의해 증가한 멜라닌의 생성 억제 효과를 나타낸 도표이다.
11 is a diagram showing the effect of inhibiting the production of melanin increased by α-MSH of tripeptide ( A350_4 ) by the above method as an embodiment of the present invention.

[수학식 5]&Quot; (5) "

멜라닌 생성 억제율(%) = [(M_m -M_s)/( M_m -M_c)]×100% Melanogenesis inhibition = [(M _m -M _s ) / (M _m -M _c )] × 100

M_c: 컨트롤군의 멜라닌양M _c : melanin in the control group

M_m: α-MSH 처리군의 멜라닌양M _m : Melanin content in α-MSH treatment group

M_S: 시료와 α-MSH를 처리한 군의 멜라닌양
M _S : amount of melanin in the group treated with the sample and α-MSH

(4) (4) cAMPcAMP 생성 억제효과 Production inhibitory effect

cAMP ELISA kit (Assay Design, USA)을 이용하여 세포 내에 방출된 cAMP양을 측정하였다. 피부흑화의 세포전달시 발생되는 cAMP의 양을 얼마나 억제하는지 그 양을 ELISA법을 통해 측정하여 그 결과를 도12에 나타내었다. The amount of cAMP released into the cells was measured using a cAMP ELISA kit (Assay Design, USA). How much inhibition of the amount of cAMP generated during cell transfer of skin darkening was measured by ELISA method and the result is shown in FIG. 12.

상기 실험결과, 트리펩타이드(A350_4)에서 cAMP의 억제효과를 보임을 확인하였다.
As a result of the experiment, it was confirmed that the inhibitory effect of cAMP in the tripeptide ( A350_4 ).

(5) 피부 (5) skin 흑화Blackening 관련 유전자의 Of related genes mRNAmRNA 억제효능 Inhibitory effect

60mm 접시에 B16F10 멜라닌 생성 세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 5x10⁵ cell/웰 (Final volume 5ml)로 넣고, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 시료를 농도별로 만들어 30분간 전처리하였다. B16F10 melanin producing cells (or HEMn-LP melanocytes) in a 60 mm dish were placed in 5x10 ⁵ cells / well (Final volume 5ml), incubated for 24 hours in 37 ° C, 5% CO ₂ incubator, and then the medium of each well was Removed and replaced with fresh DMEM. Samples were prepared by concentration in each well and pretreated for 30 minutes.

이후 α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 1ml로 워싱한 뒤, easy-spin^TM (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. PCR Primer는 mouse 의 beta-actin, tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, POMC를 제작하였고, 94°C 1분, 55°C 1분, 72°C 2분의 조건으로 30회 증폭하였다. PCR product는 1% agarose gel에 로딩하여 30분간 전기영동하고 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. 멜라닌 합성에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자를 선정하였고, 그 Primer 서열은 표 6와 같다.
Since 1ppm of α-Melanocyte stimulating hormone (α-MSH) was treated and incubated for 48 hours. Thereafter, the culture medium was removed, washed with 1 ml of PBS, and RNA was extracted using an easy-spin ^TM (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea). PCR primers were prepared beta-actin, tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, POMC of the mouse, and amplified 30 times under the conditions of 94 ° C 1 minute, 55 ° C 1 minute, 72 ° C 2 minutes. PCR products were loaded on 1% agarose gel and electrophoresed for 30 minutes and identified using EC3 UV illuminator (UVP, USA). Genes that play an important role in melanin synthesis were selected and their Primer sequences are shown in Table 6.

PCR primerPCR primer 유전자 이름Gene name ForwardForward primerprimer (5’3’) (5’3 ’) ReverseReverse primerprimer (5’3’) (5’3 ’) TyrosinaseTyrosinase GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGTGGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATCTGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC MITFMITF GGA GCA GAG CAG GGC AGAGGA GCA GAG CAG GGC AGA CAT GCA CGA CGC TCG AGACAT GCA CGA CGC TCG AGA POMCPOMC AGC AAC CCG CCC AAG GAGC AAC CCG CCC AAG G GCG TCT GGC TCT TCT CGGGCG TCT GGC TCT TCT CGG TRP1TRP1 GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTCGCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCTAAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT TRP2TRP2 GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCCGGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCCCGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC Beta-actinBeta-actin TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA CTGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC GTAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G

[표 6]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 도13에 기재하였다. The results of measuring the inhibitory effect of the genes mentioned in [Table 6] are shown in FIG.

상기와 같이 실험한 결과 화합물 트리펩타이드(A350_4)는 Tyrosinase 및 TRP1, TRP2, POMC, MITF의 mRNA를 효과적으로 억제시켰고, 이는 트리펩타이드(A350_4)가 우수한 미백 성분임을 확인할 수 있다.
As a result of the experiment as described above, the compound tripeptides ( A350_4 ) effectively inhibited the mRNAs of tyrosinase and TRP1, TRP2, POMC, and MITF, which can confirm that the tripeptides ( A350_4 ) are excellent whitening components.

<실시예 4> 피부 항염효과Example 4 Skin Anti-inflammatory Effect

인간의 표피 케라티노사이트 세포를 이용하여 화합물 트리펩타이드의 항염 효과를 실험하였다. 피부의 만성적인 염증과 여러 암 생성과의 관계는 잘 알려져 있을 뿐만 아니라 여러 종양 실험에서도 잘 나타나있다. 여러 외부자극에 의해 싸이토카인들을 생산하도록 유도된 케라티노사이트는 싸이토카인 조절능력을 잃게 되고 결국 암을 포함한 여러 피부 질환을 일으키게 된다.Human epidermal keratinocyte cells were used to test the anti-inflammatory effects of compound tripeptides. The relationship between chronic inflammation of the skin and the production of multiple cancers is well known and has been shown in many tumor experiments. Keratinocytes induced to produce cytokines by various external stimuli lose cytokine control and eventually cause various skin diseases including cancer.

본 실험은 피부 표피 케라티노사이트(human keratinocyte, HaCaT) 세포주와 UVB 램프를 이용한 in vitro assay계를 확립하여 자외선 조사에 의해 발현하는 대표적인 싸이토카인인 Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b)와 Interleukin 6(IL-6) mRNA 발현양을 평가함으로써 트리펩타이드의 염증 억제 효과를 확인하였다.
This experiment skin epidermal keratinocytes (human keratinocyte, HaCaT) in cell lines and using the UVB lamp In vitro assay system was established to evaluate the expression of Interleukin-1a (IL-1a), Interleukin-1b (IL-1b) and Interleukin 6 (IL-6) mRNA, which are representative cytokines expressed by UV irradiation. The inhibitory effect was confirmed.

(1) 세포주 및 세포배양(1) Cell line and cell culture

실험에 사용된 세포주는 Human Keratinocyte의 일종인 HaCaT 세포를 사용하였다 HaCaT 세포는 37°C, 5% CO₂의 조건에서 10% FBS (Gibco Co), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/㎖ 페니실린 (penicillin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 사용하여 배양하였다(Incubator; Thermo-scientific, USA). HaCaT 세포는 100 cm²플라스크 (Corning, USA)에서 충분히 증식시킨 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 PBS로 씻어준 후 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 배양기에서 3분간 처리한 다음 트립신-EDTA 용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착시켰다. 탈착된 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM 10 ㎖을 새로운 배양용기에 옮겨 1:5의 분할율 (split ratio)로 37℃, 5% CO₂의 조건에서 계대배양하였다.
The cell line used in the experiment was HaCaT cells, a kind of human Keratinocyte. HaCaT cells were 10% FBS (Gibco Co), 100 μg / ml streptomycin, 100 U at 37 ° C and 5% CO ₂ . Culture was incubated using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with / ml penicillin added (Incubator; Thermo-scientific, USA). HaCaT cells were fully grown in 100 cm ² flasks (Corning, USA), and then washed with PBS at 3 days of culture.The cells were washed with PBS, treated with 0.25% trypsin-EDTA solution for 3 minutes in the incubator, and then trypsin-EDTA solution. The cells were discarded and stored at 37 ° C. for 5 minutes to detach cells. The detached cells were subcultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ at a split ratio of 1: 5 by transferring 10 ml of DMEM containing 10% FBS to a new culture vessel.

(2) (2) UVBUVB 자극에 의한 피부 염증 관련 유전자의 Of genes related to skin inflammation caused by stimulation mRNAmRNA 억제효능 Inhibitory effect

Human Keratinocyte (HaCaT)세포를 6*10⁵cells/well 농도로 60mm 접시에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 항염효능 시료를 농도 별로 만들어 4시간 전처리 하였다.. 각 well plate에 PBS 3㎖씩을 넣은 후 UVB 조사장치(vilber loumet, France)에 의해 100mJ/cm² UVB를 조사하였다. Phosphate buffer saline(PBS)를 제거한 후 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지를 제거 후 RNA extraction kit(invitrogen, 한국)을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하였다. Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6) mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Interleukin-1α(IL-1α), Interleukin-1β(IL-1β), Interleukin 6(IL-6)의 primer sequence는 표7과 같다. 각 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아, 한국)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 56℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분 동안 30cycle로 진행하였다. PCR 생성물은 1% agarose gel에 로딩하여 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 gapdh수치로 나누어 정량 하였다.
Human Keratinocyte (HaCaT) cells were dispensed in a 60mm dish at a concentration of 6 * 10 ⁵ cells / well and incubated for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO ₂ until they grew to 70-80%. Was removed and replaced with fresh serum-free DMEM. Anti-inflammatory effect samples were prepared in each well and pretreated for 4 hours. 3 ml of PBS was added to each well plate and 100mJ / cm ² by UVB irradiation (vilber loumet, France). UVB was irradiated. Remove the phosphate buffer saline (PBS), replace the serum-free medium with diluted sample, and incubate for 24 hours. After removing the medium, RNA was isolated using an RNA extraction kit (Invitrogen, Korea), and cDNA was synthesized. RT-PCR was performed on cDNA synthesized to measure the expression levels of Interleukin-1α (IL-1α), Interleukin-1β (IL-1β), and Interleukin 6 (IL-6) mRNA. The primer sequences of GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Interleukin-1α (IL-1α), Interleukin-1β (IL-1β), and Interleukin 6 (IL-6) are shown in Table 7. Add μL (0.5 μg / μL) and add to the PCR-premix tube (Bionia, Korea) with DEPC-Water to the synthesized cDNA. Denaturation at 95 ℃ for 30 seconds, annealing at 56 ℃ for 30 seconds, extension The reaction was carried out in 30 cycles for 2 minutes at 72 ° C. PCR products were loaded on 1% agarose gel to confirm that there were no non-specific PCR products or primer dimers, and the amount of the product was determined using EC3 UV illuminator (UVP, USA). The amount of mRNA quantified by densitometer was quantified by dividing by gapdh value.

피부 염증 관련 유전자의 PCR primer 서열PCR primer sequence of skin inflammation related gene 유전자 이름Gene name ForwardForward primerprimer (5’→3’) (5 ’→ 3’) ReverseReverse primerprimer (5’→3’) (5 ’→ 3’) IL-1αIL-1? CTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TCCTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC CTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC CCTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C IL-1βIL-1β TGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCATGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCA AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG GAAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG G IL-6IL-6 GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTGCC TTC GGT CCA GTT GCC TT GCA GAA TGA GAT GAG TTG TCGCA GAA TGA GAT GAG TTG TC GAPDHGAPDH CAA AAG GGT CAT CAT CTC TGCAA AAG GGT CAT CAT CTC TG CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGCCT GCT TCA CCA CCT TCT TG

[표 7]에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 다음 도14에 기재하였다. The results of measuring the inhibitory effect of the genes mentioned in [Table 7] are shown in FIG.

상기와 같이 실험한 결과 화합물 트리펩타이드(A350_4)는 UVB 조사에 의해 증가된 싸이토카인인 IL-1α ,IL-1β 와 IL-6의mRNA를 효과적으로 억제시켰고, 이는 트리펩타이드(A350_4)가 우수한 항염 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다.
As a result of the experiment, the compound tripeptide ( A350_4 ) effectively inhibited the mRNAs of the cytokines IL-1α, IL-1β and IL-6 increased by UVB irradiation, and the tripeptides ( A350_4 ) had excellent anti-inflammatory effects. You can see it.

<실시예 5> 임상에서의 주름 개선 효과 및 미백효과
<Example 5> wrinkle improvement and whitening effect in the clinical

아래 표8에 나타낸 조성으로 로션을 제조하여 인체에 대한 주름 개선 효과와 미백 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
The lotion was prepared with the composition shown in Table 8 below, and the wrinkle improvement and whitening effects on the human body were evaluated through actual use tests.

주름 개선 및 미백효과 평가를 위한 로션 FormulationLotion Formulation for Wrinkle Improvement and Whitening Evaluation 유상Paid 수상Awards 성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) Mineral OilMineral Oil 6.06.0 GlycerinGlycerin 4.04.0 Stearic acidStearic acid 2.72.7 Methyl parabenMethyl paraben 0.50.5 Cetyl alcoholCetyl alcohol 2.02.0 TEATEA 0.50.5 Propyl parabenPropyl paraben 0.050.05 Distilled waterDistilled water 82.649682.6496 Tween 60Tween 60 1.21.2 Aracel 83Aracel 83 0.40.4 화합물 A350_4 Compound A350_4 0.00040.0004

(1) 트리펩타이드(A350_4)의 주름개선 효과 평가(1) Evaluation of wrinkle improvement effect of tripeptide (A350_4)

33명의 45-60세의 건강한 동양 여성들에게 트리펩타이드(A350_4) 4ppm을 함유하는 로션을 매일 아침 저녁 2회씩 적당량을 눈가 주름을 포함한 한쪽 얼굴에 3개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선효과를 Replica analysis(주름 평가법)방법을 통해 전체 주름 수, 주름 길이, 주름 면적을 측정하여 수치화 하였고, 영상분석을 통해 평가하였다. 이 시험은 태국의 임상전문 업체인 Spincontrol Asia를 통해 진행 되었으며, 그 결과를 도15, 도16에 나타내었다.Thirty-three healthy Asian women aged 45-60 years old were given an appropriate lotion containing 4 ppm of tripeptides ( A350_4 ) twice daily each morning for three months in a row including one eye wrinkle. The wrinkle improvement effect of each subject was quantified by measuring the total number of wrinkles, the length of the wrinkles, and the area of the wrinkles by a replica analysis method, and evaluated through image analysis. This test was conducted through Spincontrol Asia, a Thai clinical company, and the results are shown in FIGS. 15 and 16.

도15 및 도16으로부터 트리펩타이드(A350_4)를 함유한 화장료의 피부주름 개선 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
15 and 16, it was confirmed that the skin wrinkle improvement effect of the cosmetics containing tripeptide ( A350_4 ) was very excellent.

(2) 트리펩타이드(A350_4)의 미백 효과 평가(2) Evaluation of the whitening effect of tripeptide (A350_4)

30명의 45-60세의 건강한 동양 여성들에게 트리펩타이드(A350_4) 4ppm을 함유하는 로션을 매일 아침 저녁 2회씩 적당량을 눈가 주름을 포함한 한쪽 얼굴에 3개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 색소침착 변화는 크로마메터(Chromameter CR-300, Minolta, Japan)로 측정하여, L^*(Luminosity)와 ITA^* (Arc tan) 값으로 수치화 하였고, 영상분석을 통해 평가하였다. L^*와 ITA^*값의 감소는 피부 흑화가 증가되었다는 것을 알려준다. 이 시험은 태국의 임상전문 업체인 Spincontrol Asia를 통해 진행되었으며, 그 결과를 도17, 도18, 및 도19에 나타내었다.Thirty healthy healthy women aged 45-60 years old were given an appropriate lotion of 4 ppm of tripeptides ( A350_4 ) twice daily each morning for three months in a row including one eye wrinkle. The pigmentation change of each subject was measured by chromameter (Chromameter CR-300, Minolta, Japan), and quantified by L ^* (Luminosity) and ITA ^* (Arc tan) values, and evaluated through image analysis. Decreasing L ^* and ITA ^* values indicate increased skin blackening. This test was conducted through Spincontrol Asia, a Thai clinical company, and the results are shown in FIGS. 17, 18, and 19.

도17, 도18 및 도19로 부터, 트리펩타이드(A350_4)를 함유한 화장료의 피부 미백 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
17, 18 and 19, it was confirmed that the skin whitening effect of the cosmetic containing tripeptide ( A350_4 ) is very excellent.

이상에서 본 발명의 우수한 주름개선 효과등과 안전성은 앞서 기술한 실시예와 구체예에 대해서 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 당연한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Although the above-described excellent wrinkle improvement effect and safety of the present invention have been described in detail with respect to the above-described embodiments and embodiments, it is natural for those skilled in the art that various modifications and changes are possible within the technical spirit of the present invention. And modifications belong to the appended claims.

Claims

A tripeptide represented by the following formula (1).
Formula 1
R ¹ -X-Leu-Phe
(In Formula 1, R ¹ is tetradecanoyl, Leu may be D-Leu or L-Leu, Phe may be D-Phe or L-Phe. In addition, the part represented by X in Formula 1 is glycine ( glycine, alanine, valine, proline, leucine, phenylalanine, aspartic acid, lysine, methionine, asparagine ), Arginine and tyrosine, and the C-terminus may be in carboxylic or amide form.)

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The method of claim 1,
X is a tripeptide, characterized in that selected from amino acids consisting of glycine (glycine), leucine (leucine), metaionine (methionine).

The method of claim 1,
Among the amino acids of the above-described tripeptide, Leu is L-Leu, Phe is L-Phe, and the C-terminus is a polypeptide according to the carboxylic acid form.

An anti-aging, anti-wrinkle, whitening or anti-inflammatory cosmetic composition comprising the tripeptide according to any one of claims 1, 5 and 6 as an active ingredient.

The method of claim 7, wherein
The composition is a cosmetic composition having a skin, lotion, cream, foundation, essence, gel, pack, for cleansing, body oil, lipstick, mascara, makeup base or soap form.

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The method of claim 7, wherein
Cosmetic composition comprising the tripeptide is 0.0001 ~ 1% by weight based on the total weight of the composition.