KR101337769B1 - 신규 리파아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, Tetrasphaera 속의 균이 생산하는, 분자량 약 32kDa 의 신규 리파아제, 그것을 코드하는 유전자를 제공한다. 이 리파아제는, 중사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있다. 본 발명은 또, Tetrasphaera 속에 속하는 균이 생산하고, 중사슬 지방산 및 장사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있는, 분자량 약 40kDa 의 신규 리파아제 및 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 제공한다. 그리고 본 발명은 Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주도 제공한다. 본 발명의 리파아제는 고정화 효소로서 이용할 수 있어, 소화약, 플레이버제의 제조, 임상 검사 시약, 세제용 효소, 유지의 제조, 농약·의약품의 광학 활성 중간체의 제조 등의 분야에서 유용하다.
Description
본 발명은 신규 리파아제에 관한 것이다. 본 리파아제는 Tetrasphaera 속의 신주 (新株) 의 균체에 의해서 생산된다. 본 리파아제는 중사슬 지방산 및/또는 장사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있다. 본 리파아제는 음이온 교환 수지나 소수성 수지에 흡착에 의해 고정화시킬 수 있어, 고정화 효소로서 이용할 수 있다. 본 리파아제는, 소화약, 플레이버제의 제조, 임상 검사 시약, 세제용 효소, 유지의 제조, 농약·의약품의 광학 활성 중간체의 제조 등의 분야에서 유용하다.
리파아제는 각종 에스테르의 합성이나 분해, 에스테르 교환, 라세미체의 광학 분할을 위한 우수한 생체 촉매임이 실증되어 왔다. 실제로 소화약, 플레이버제의 제조, 임상 검사 시약, 세제용 효소, 유지의 제조, 농약·의약품의 광학 활성 중간체의 제조에 이용되어 왔다.
리파아제는 동물의 췌장 리파아제가 잘 알려져 있는데, 공업적으로 자주 이용되는 것은 주로 미생물 유래의 리파아제이다. 이들 리파아제의 대부분은 유전자도 클로닝되어, 아미노산 배열도 알려져 있다 (Candida rugosa : 비특허 문헌 1. Rhizopus delemar : 비특허 문헌 2. Bacillus subtilis : 비특허 문헌 3. Staphylococcus aureus : 비특허 문헌 4. Pseudomonas aeruginosa : 비특허 문헌 5).
사상균이나 Bacillus 속, Stapylococcus 속, Pseudomonas 속 등이 생산하는 리파아제가 공업적으로 사용되고 있다. 이러한 리파아제는 기본적으로 고급 지방산 (탄소수가 16 이상의 지방산) 을 기질로 하고 있고, 또한 단쇄 지방산 (탄소수 6 이하) 을 기질로 하는 것은 에스테라제이다. 중사슬 지방산을 잘 인식하며, 가수 분해뿐만 아니라 에스테르화 활성을 나타내는 리파아제는 알려져 있지 않다.
중사슬 지방산이 결합한 트리글리세리드는 췌장 리파아제에 의해 가수 분해될 뿐만 아니라, 위의 리파아제에 의해서도 가수 분해되어, 트리글리세리드의 소화·흡수에도 우위임이 개시되어 있다 (비특허 문헌 6). 또한, 중사슬 지방산은 흡수된 후, 소장의 장관 세포에서 트리글리세리드로 재합성되는 일이 적고, 문맥으로부터 간장으로 운반되어, 에너지로서 연소된다. 한편, 고급 지방산은 장관 세포에서 재합성되어, 림프로부터 흡수되고, 간장으로 운반되어, 경우에 따라서는 지방으로서 축적된다. 즉, 고급 지방산은 체내 축적성이 있고, 중사슬 지방산은 축적성이 없다. 이렇게 해서, 중사슬 지방산 트리글리세리드와 통상적인 식용 유지와의 에스테르 교환에 의해 건강에 좋은 유지가 제조되고 있다.
비특허 문헌 1 : Kawaguchi et al., Nature, 341, 164-166 (1989)
비특허 문헌 2 : Haas et al., Gene, 109, 107-113 (1991)
비특허 문헌 3 : Dartois et al., B. B. A., 1131, 253-260 (1992)
비특허 문헌 4 : Lee et al., J. Bacteriol., 164, 288-293 (1985)
비특허 문헌 5 : Wohlfarth et al., J. General Microbiology, 138, 1325-1335, (1992)
비특허 문헌 6 : I. Ikeda, Y. Tomari, M. Sugano, S. Watanabe, and J. Nagata : Lipids, 26, 369-373 (1991)
그러나, 트리글리세리드가 아닌 중사슬 지방산 에스테르는 지금까지 리파아제로 공업적으로 제조된 일이 없다. 중사슬 지방산은 지방 축적성이 없기 때문에, 중사슬 지방산으로 에스테르화된 식품 소재는 비만 등의 문제가 적은 소재가 된다.
본 발명자들은 리파아제에 관해서 예의 연구해 왔다. 그리고, Tetrasphaera 속의 신주의 균체의 배양 상청으로부터 분자량 약 32kDa 및 약 40kDa 의 신규 리파아제를 단리·정제하고, 또한 이들 리파아제가 중사슬 지방산을 기질로서 잘 인식하는 신규한 것임을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
I. 신규 리파아제
본 발명은, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는 분자량 약 32kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 호모로그, 즉 하기의 (A1), (B1), (C1), (D1), (E1), (F1) 또는 (G1) 을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다 :
(A1) 서열 번호 : 10 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 적어도 25∼801 번의 염기 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 ;
(B1) (A1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(C1) (A1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(D1) (A1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(E1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(F1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(G1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 : 10 에는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주가 생산하는 분자량 약 32kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열이, 서열 번호 : 11 에는, 동 리파아제의 아미노산 배열이 나타나 있다. 또한, 서열 번호 : 15 에는, 동 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA의 염기 배열이, 서열 번호 : 16 에는, 서열 번호 : 11 보다 상류의 배열을 함유하는 아미노산 배열이 나타나 있다.
본 명세서에서 서열 번호 : 10 에 관해서 「25∼801 번의 염기 배열」이라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 서열 번호 : 15 에 관해서 「388∼1164 번의 염기 배열」로 바꿔 말할 수 있고, 본 명세서에서 「서열 번호 : 11 의 아미노산 배열」이라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 「서열 번호 : 16 의 48∼306 번의 아미노산 배열」로 바꿔 말할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 서열 번호 : 10 에 기재된 적어도 25∼801 번의 염기 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 : 15 의 염기 배열의 적어도 388∼1164 번의 염기 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 번호 : 15 의 염기 배열의 247∼1167 번의 염기 배열로 이루어지는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드) 로 대체 가능하고 ; 또한, 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 (또는 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드) 은, 서열 번호 : 16 의 아미노산 배열의 전부 또는 일부로 이루어지는 단백질 (바람직하게는, 32∼306 번의 아미노산 배열, 보다 바람직하게는 48∼306 번의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질) 로 이루어지는 단백질 (또는 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드) 로 대체 가능하다. 이러한 것도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열 번호 : 16 의 1∼47 번째 아미노산 배열은 프리프로 배열 (pre-pro sequence) 인 것으로 생각된다. 1∼31 번째는 분비 시그널인 프리 배열로서 기능하고, 32∼47 번째가 분비 후, 필시 별도의 단백질의 작용에 의해 절단되는 프로 배열인 것으로 추정된다. 따라서, 리파아제로서 작용하는 데에 필수적인 성숙 단백질은 48 번째 이후의 배열로, 대장균 등, 이종(異種) 발현계에서 동 리파아제를 발현시키는 경우에는, 프리프로 배열을 제거하여 발현시키는 것이 적절한 것으로 생각된다.
본 발명의 분자량 약 32kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 호모로그의 바람직한 예는, 이하의 것이다 :
ㆍ 하기의 (A1'), (B1'), (C1'), (D1'), (E1'), (F1') 또는 (G1') 인, 폴리뉴클레오티드 :
(A1') 서열 번호 : 10 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 25∼801 번의 염기 배열로 이루어지는 일부인 폴리뉴클레오티드 ;
(B1') (A1') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(C1') (A1') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(D1') (A1') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(E1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(F1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(G1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
ㆍ하기의 (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2) 또는 (G2) 을 함유하는, 폴리뉴클레오티드 :
(A2) 서열 번호 : 15 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 적어도 247∼1167 번의 염기 배열 혹은 388∼1164 번의 염기 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 ;
(B2) (A2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(C2) (A2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(D2) (A2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(E2) 서열 번호 : 16 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 적어도 48∼306 번의 아미노산 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(F2) (E2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(G2) (E2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
ㆍ하기의 (A2'), (B2'), (C2'), (D2'), (E2'), (F2') 또는 (G2') 인, 폴리뉴클레오티드 :
(A2') 서열 번호 : 15 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 247∼1167 번의 염기 배열 혹은 388∼1164 번의 염기 배열로 이루어지는 일부인 폴리뉴클레오티드.
(B2') (A2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(C2') (A2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(D2') (A2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(E2') 서열 번호 : 16 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 적어도 48∼306 번의 아미노산 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(F2') (E2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(G2') (E2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은, 또한, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는 분자량 약 40kDa 의 리파아제를 코드하는 유전자 또는 그 호모로그, 즉 하기의 (H2), (I2), (J2), (K2), (L2), (M2) 또는 (N2) 을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다 :
(H2) 서열 번호 : 28 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 적어도 414∼1688 번의 염기 배열 혹은 498∼1685 번의 염기 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 ;
(I2) (H2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(J2) (H2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(K2) (H2) 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(L2) 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 적어도 29∼424 번의 아미노산 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(M2) (L2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(N2) (L2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 : 28 에는 Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주가 생산하는 분자량 약 40kDa 의 리파아제를 코드하는 유전자의 염기 배열이, 서열 번호 : 29 에는 동 리파아제의 아미노산 배열이 나타나 있다.
본 발명의 분자량 약 40kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 호모로그의 바람직한 예는, 이하의 것이다 :
ㆍ하기의 (H2'), (I2'), (J2'), (K2'), (L2'), (M2') 또는 (N2') 인, 폴리뉴클레오티드 :
(H2') 서열 번호 : 28 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 414∼1688 번의 염기 배열 혹은 498∼1685 번의 염기 배열로 이루어지는 일부인 폴리뉴클레오티드 ;
(I2') (H2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(J2') (H2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(K2') (H2') 에 기재된 폴리뉴클레오티드의 염기 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(L2') 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 29∼424 번의 아미노산 배열로 이루어지는 일부인 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(M2') (L2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 ;
(N2') (L2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
본 명세서에서 말하는 「리파아제」란, 특별한 경우를 제외하고, 글리세롤에스테르를 가수 분해하여 지방산을 유리하는 효소를 말한다. 본 명세서에서, 어떠한 단백질이 「리파아제 활성을 갖는다」고 할 때 (또는「리파아제」라고 할 때) 는, 특별한 경우를 제외하고, 그 단백질 (또는 리파아제) 은 적어도 글리세롤과 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖고, 바람직하게는 중사슬 지방산의 에스테르 및/또는 장사슬 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖고, 보다 바람직하게는 중사슬 지방산의 에스테르 및 장사슬 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖는다. 리파아제 활성을 갖는 단백질 (또는 리파아제) 은, 지방산의 전이 반응 (에스테르화 반응 또는 에스테르 교환 반응) 을 촉매하는 활성을 갖는 것이 바람직하고, 중사슬 지방산의 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는 것이 보다 바람직하다.
어떠한 단백질이, 글리세롤과 중사슬 지방산 또는 장사슬 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖는가 아닌가는, 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기재한 4-메틸움벨리페릴카프릴레이트 (MU-C8) 또는 4-메틸움벨리페릴올레이트 (MU-C18) 의 분해 활성을 측정하는 시험에 사용함으로써 평가할 수 있다. 또한, 어떠한 단백질이 중사슬 지방산의 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는가 아닌가는, 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 기재한 3-페닐-1-프로판올 또는 1-페닐-2-프로판올과 트리카프릴린 (MCT) 의 에스테르화 반응 실험에 사용함으로써 평가할 수 있다.
본 명세서에서는, 특별한 경우를 제외하고, 어떠한 단백질 (또는 리파아제) 이 어떠한 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖는 경우, 또는 어떠한 지방산의 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는 경우, 그 지방산을 「기질로서 인식할 수 있다」라고도 한다.
본 발명의 Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는 분자량 약 32kDa 의 단백질 및 분자량 약 40kDa 의 단백질은, 적어도, 4-메틸움벨리페릴카프릴레이트 (MU-C8) 의 분해 활성을 가지며, 또한 후자는 4-메틸움벨리페릴올레이트 (MU-C18) 의 분해 활성을 갖고, 트리카프릴린 및 3-페닐-1-프로판올 또는 1-페닐-2-프로판올로부터 각각의 카프릴산 에스테르를 생성할 수 있음이 확인되어 있다 (실시예 1 참조). 따라서, 양자 모두 리파아제 활성을 갖는다고 할 수 있으며, 전자는, 보다 상세하게는 중사슬 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖는다 (중사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있다) 고 할 수 있으며, 후자는, 보다 상세하게는 중사슬 지방산 및 장사슬 지방산의 에스테르를 가수 분해하는 활성을 갖는다 (중사슬 지방산 및 장사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있다) 고 할 수 있고, 또한 중사슬 지방산의 전이 반응 (특히, 에스테르화 반응) 을 촉매하는 활성을 갖는다고 할 수 있다.
본 명세서에서 「중사슬 지방산」이라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 탄소수가 7∼15 인 포화 지방산 또는 불포화 지방산을 말한다. 중사슬 지방산에는, 카프릴산, 카프르산 및 라우르산이 포함된다.
본 명세서에서 「장사슬 지방산」이라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 탄소수가 16 이상인 포화 지방산 또는 불포화 지방산을 말한다. 장사슬 지방산에는, 팔미트산, 스테아르산, 팔미톨레산, 올레산, 리놀레산, α-리놀렌산 및 γ-리놀렌산이 포함된다.
본 명세서에서 글리세롤과 지방산에 관하여, 「에스테르」라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 트리아실글리세롤뿐만 아니라, 디아실글리세롤 또는 모노아실글리세롤 (뒤의 양자를 합하여 부분 아실글리세롤이라고도 한다.) 일 수 있다.
본 발명에서 말하는 「스트린젠트한 조건」이란, 특별한 경우를 제외하고, 6M 우레아, 0.4% SDS, 0.5×SSC 의 조건 또는 이것과 동등한 하이브리다이제이션 조건을 가리키고, 또한 필요에 따라서, 본 발명에는, 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들어, 6M 우레아, 0.4% SDS, 0.1×SSC 또는 이것과 동등한 하이브리다이제이션 조건을 적용해도 된다. 각각의 조건에 있어서, 온도는 약 40℃ 이상으로 할 수 있고, 보다 스트린젠시가 높은 조건이 필요하면, 예를 들어 약 50℃, 또는 약 65℃ 로 해도 된다.
또한, 본 발명에서 「1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기 배열」이라고 할 때의 치환 등 되는 뉴클레오티드의 개수는, 그 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 코드하는 단백질이 원하는 기능을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 1∼9 개 또는 1∼4 개 정도이거나, 동일 또는 성질이 비슷한 아미노산 배열을 코드하는 치환 등이면, 더 많은 개수의 치환 등이 있을 수 있다. 또한, 본 발명에서 「1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열」이라고 할 때의 치환 등 되는 아미노산의 개수는, 그 아미노산 배열을 갖는 단백질이 원하는 기능을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 1∼9 개 또는 1∼4 개 정도이거나, 성질이 비슷한 아미노산으로의 치환 등이면, 더 많은 개수의 치환 등이 있을 수 있다. 이러한 염기 배열 또는 아미노산 배열에 관련된 폴리뉴클레오티드를 조제하기 위한 수단은, 당업자에는 잘 알려져 있다.
염기 배열에 관하여, 높은 동일성이란, 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 배열의 동일성을 가리킨다.
아미노산 배열에 관하여, 높은 동일성이란, 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 배열의 동일성을 가리킨다. 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열의, 공지된 리파아제의 아미노산 배열과의 동일성은, 실시예의 표 4 에 나타나 있다. 또한, 서열 번호 : 28 에 기재된 아미노산 배열의 공지 배열과의 동일성에 관해서는, 실시예 8 에 서술되어 있다.
폴리뉴클레오티드배열 또는 아미노산 배열의 동일성에 관한 검색·해석은, 당업자에는 주지되어 있는 알고리즘 또는 프로그램 (예를 들어, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW) 에 의해 실시할 수 있다. 프로그램을 사용하는 경우의 파라미터는, 당업자이면 적절히 설정할 수 있고, 또한 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용해도 된다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법도 또한, 당업자에는 주지이다.
본 명세서에서 단백질 또는 리파아제에 관해서 분자량을 나타낼 때에는, 특별한 경우를 제외하고, SDS-PAGE 를 사용하여 결정한 값을 말한다 (실시예 1, 도 2 참조).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 천연물로부터 하이브리다이제이션 기술, 폴리메라아제 연쇄 반응 (PCR) 기술 등을 이용하여 얻을 수 있다.
구체적으로는, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균으로부터, 게놈 DNA (gDNA) 를 통상적인 방법 (예를 들어, DNeasy Tissue Kit (QIAGEN)) 에 의해 조제하거나, 또는 동 균체로부터 전체 RNA 를 통상적인 방법 (예를 들어, RNeasy Plant isolation Kit (QIAGEN)) 에 의해 조제하고, 그리고 전체 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응 (1st strand cDNA 합성) 을, 통상적인 방법 (예를 들어, SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)) 에 의해 조제하다.
목적하는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 32kDa 의 리파아제 단백질의 N-말단의 배열에 기초하여, 5' 측의 프라이머를 설계한다. 그리고, 상기 N 말단 아미노산 잔기와 동일성을 나타내는 비교적 근연 (近緣) 의 Streptomyces 속 균 등에 유래하는 추정 단백질로 보존된 배열을 바탕으로, 3' 측의 프라이머를 설계한다. lip32 유전자 단편을, #375 주 cDNA 를 주형으로, 상기 프라이머 세트를 사용한 디제네레이트 PCR 에 의해서 증폭하여, 부분 염기 배열을 결정한다. 또, 적당한 제한 효소로 소화 후, 환형화된 #375 주 gDNA 를 주형으로, 동 배열 상에 외향으로 설계한 프라이머를 사용한 인버스 PCR 에 의해서, 근방 영역의 염기 배열 정보를 취득한다. 이렇게 해서, 합계 약 900bp 의 lip32 영역 gDNA 의 염기 배열을 결정한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 DNA 가 함유되고, DNA 에는, 게놈 DNA, cDNA 및 화학 합성 DNA 가 포함된다. DNA 는, 1 본쇄 DNA 및 2 본쇄 DNA 일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예는, Tetrasphaera 속 유래의 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 그 재조합 벡터에 의해 형질 전환된, 형질 전환체 (예를 들어 형질 전환 대장균, 형질 전환 효모, 형질 전환 곤충 세포) 도 제공한다. 본 발명은 또, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 숙주 (예를 들어 대장균, 효모, 곤충 세포) 를 형질 전환하는 공정 (예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질 전환하는 공정) 을 포함하는, 형질 전환 방법도 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 벡터는, 숙주 내에서 삽입물을 발현시키는 것이 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 벡터는, 통상 프로모터 배열, 터미네이터 배열, 외적인 자극에 의해 유도적으로 삽입물을 발현시키기 위한 배열, 목적 유전자를 삽입하기 위한 제한 효소에 의해 인식되는 배열, 및 형질 전환체를 선택하기 위한 마커를 코드하는 배열을 갖는다. 재조합 벡터의 제조, 재조합 벡터에 의한 형질 전환 방법은, 당업자에 주지된 방법을 적용할 수 있다.
본 발명은 또, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는 분자량 약 32kDa 의 리파아제 또는 그 호모로그, 하기의 (e1), (f1) 또는 (g1) 을 함유하는 단백질을 제공한다 :
(e1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;
(f1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(g1) 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
본 발명의 분자량 약 32kDa 의 리파아제 또는 그 호모로그의 바람직한 예는, 하기 단백질이다 :
ㆍ하기의 (e1'), (f1') 또는 (g1') 인, 단백질 :
(e1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;
(f1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(g1') 서열 번호 : 11 에 기재된 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
ㆍ하기의 (e2), (f2) 또는 (g2) 를 함유하는, 단백질 :
(e2) 서열 번호 : 16 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 적어도 48∼306 번의 아미노산 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 단백질 ;
(f2) (e2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(g2) (e2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
ㆍ하기의 (e2'), (f2') 또는 (g2') 인, 단백질 :
(e2') 서열 번호 : 16 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 48∼306 번의 아미노산 배열로 이루어지는 일부인 단백질 ;
(f2') (e2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(g2') (e2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
이 분자량 약 32kDa 의 리파아제는, 중사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있고, 실시예 11 에 나타낸 조건에서는, 최적 온도가 약 40℃ 이고, 최적 pH 가 7.0 부근이다.
본 발명은 또한, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는 분자량 약 40kDa 의 리파아제 또는 그 호모로그, 즉 하기의 하기의 (l1), (m1) 또는 (n1) 을 함유하는 단백질을 제공한다.
(l1) 서열 번호 : 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 ;
(m1) 서열 번호 : 35 에 기재된 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(n1) 서열 번호 : 35 에 기재된 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
서열 번호 : 35 및 도 16 에는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주가 생산하는 분자량 약 40kDa 의 리파아제의, 성숙 단백질의 아미노산 배열이 나타나 있다.
본 발명의 분자량 약 40kDa 의 리파아제 또는 그 호모로그의 바람직한 예는, 하기 단백질이다 :
ㆍ상기 서술한 (l1), (m1) 또는 (n1) 인, 단백질.
ㆍ하기 (l2), (m2) 또는 (n2) 를 함유하는, 단백질 :
(l2) 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 적어도 29∼424 번의 아미노산 배열을 함유하는 일부로 이루어지는 단백질 ;
(m2) (l2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(n2) (l2) 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
ㆍ하기의 (l2'), (m2') 또는 (n2') 인, 단백질 :
(l2') 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 29∼424 번의 아미노산 배열로 이루어지는 일부인 단백질 ;
(m2') (l2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질 ;
(n2') (l2') 에 기재된 단백질의 아미노산 배열과 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 리파아제 활성을 갖는 단백질.
이 분자량 약 40kDa 의 리파아제는, 중사슬 지방산 및 장사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있고, 실시예 11 에 나타낸 조건에서는, 최적 온도가 약 45∼50℃ 이고, 최적 pH 가 7.0 부근이다.
상기한 단백질 또는 리파아제는, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균을, 시판되는 배지 (예를 들어, Marine broth 2216 (Difco 사 제조) 를 사용한다. Marine broth는 식염이 약 2% 함유되는 것을 특징으로 하는 액체 배지이다.) 에서 배양하여 얻어지는 배양 상청으로부터 단리·정제할 수 있다.
구체적으로는, 다음과 같이 한다. 우선, 배지에 대하여 0.1∼5% 가 되도록 균액을 식균 (植菌) 하고, 10∼40℃ 에서 2일∼10일 배양한다. 염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 트리스 염산 버퍼로 평형화한 소수성 겔 (예를 들어 φ-Sepharose) 0.01∼1부를 사용하여, 배양 상청을 칼럼 크로마토그래피에 넣는다. 상기 버퍼액으로 세정 후, 1% 의 비이온 계면 활성제 (예를 들어, TritonX-100) 를 함유하는 상기 버퍼액으로 용출시킴으로써, 리파아제 활성을 갖는 획분을 얻을 수 있다. 본 리파아제 획분을 10부의 상기 버퍼액으로 희석한 후, 0.001∼1부의 음이온 교환 겔 (예를 들어, Q-Sepharose) 에 흡착시키고, 0.1% 의 양성 계면 활성제 (예를 들어, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)) 를 함유한 상기 버퍼로 세정 후, 염화나트륨 수용액의 농도 구배로 용출하여, 리파아제 활성 획분을 얻는다. 본 리파아제 획분을 음이온 교환 칼럼 (예를 들어 HiTrapQ) 에서 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 넣고, 염화나트륨 수용액에 의한 농도 구배 그래디언트 용출을 실시하여, 리파아제 활성을 갖고, 또한 분자량 약 32kDa 또는 약40kDa 의 단백질의 존재가 확인되는 획분을 얻는다. 보다 구체적인 수법으로서, 본 명세서의 실시예 1 을 참조할 수 있다.
상기 단백질 또는 리파아제는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 삽입한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체 (예를 들어, 형질 전환 대장균) 에 의해 재조합 단백질로서 얻을 수 있다.
구체적으로는, 다음과 같이 한다. 우선, 대장균 발현계에 사용하는 유전자의 염기 배열은, 적절한 프라이머 세트를 사용한 PCR 에 의해서 증폭, 클로닝 후, 시퀀싱에 의해 염기 배열을 확인한다. 클로닝한 DNA 단편은, 적절한 제한 효소에 의해 소화하여 추출 후, 단백질의 대장균 발현용 벡터에 집어 넣고, 이것을 사용하여, 대장균으로 형질 전환하여, 단백질을 발현시킨다. 목적 유전자를 발현시킨 대장균을 파쇄하고, 상청을 칼럼으로 정제하여, 약 32kDa 또는 약 40kDa 의 목적 단백질을 얻는다. 보다 구체적인 수법으로서, 본 명세서의 실시예 3 또는 8 을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균이 생산하는, 중사슬 지방산 및 장사슬 지방산을 기질로서 인식할 수 있는, 분자량 약 40kDa 의 리파아제, 또는 하기 공정을 포함하는 제조 방법에 의해 단리할 수 있는 분자량 약 40kDa 의 리파아제를 제공한다.
Tetrasphaera 속에 속하는 균의 배양 상청액을 소수성 수지 칼럼에 적용시켜, 소수성 수지 흡착물을 1% 비이온 계면 활성제를 함유하는 완충액으로 용출하고 ;
용출물을 음이온 교환 수지에 적용시켜, 음이온 교환 수지 흡착물을 0.5M NaCl 용액으로 용출하고 ;
용출물을, 투석 후, 음이온 교환 칼럼에 적용시켜, NaCl 그래디언트 용매로 용출한다.
이 제조 방법은, 보다 상세하게는, 하기 1)∼3) 의 공정을 포함한다 :
1) Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균의 배양 상청액을 소수성 수지 칼럼에 적용시켜, 소수성 수지 흡착물을, 필요에 따라서 0.5% 비이온 계면 활성제 (예를 들어, TritonX-100) 를 함유하는 완충액 등으로 세정한 후, 1% TritonX-100 을 함유하는 완충액으로 용출하고,
2) 용출물을 음이온 교환 수지에 적용시켜, 음이온 교환 수지 흡착물을, 필요에 따라서 0.1% 양성 계면 활성제 (예를 들어, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)) 를 함유한 완충액 등으로 세정한 후, 0.5M NaCl 용액으로 용출하고,
3) 용출물을, 투석 후, 음이온 교환 칼럼에 적용시켜, NaCl 그래디언트 용매로 용출한다. 예를 들어, 용출물을, 투석 후, 1㎖ 용적의 음이온 교환 칼럼에 적용시켜, 0∼0.75M NaCl 그래디언트 용매로 용출하고, 용출물을 0.5㎖ 마다 분획한다.
상기한 40kDa 의 리파아제는, 32kDa 의 리파아제에 관해서 이미 서술한 것과 동일한 수법에 준하여, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균을, 시판되는 배지에서 배양하여 얻어지는 배양 상청으로부터 단리·정제할 수 있다 (실시예 1 참조).
상기한 40kDa 의 리파아제의 바람직한 예는, 그 아미노산 배열로서, 서열 번호 : 3 및/또는 서열 번호 : 14 에 기재된 아미노산 배열, 보다 특정하면 서열 번호 : 3 및 서열 번호 : 14 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 것이다.
본 발명 및 본 명세서에 의해 제공되는 정보를 이용함으로써, 예를 들어, 상기한 40kDa 의 리파아제의 전부 혹은 일부, 서열 번호 : 3 혹은 서열 번호 : 14 에 기재된 아미노산 배열에 기재된 아미노산 배열, 또는 Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균, 그 균으로부터 얻어지는 게놈 DNA 를 이용함으로써, 또한 적절하다면 그들에 추가하여 본 명세서에 개시한 32kDa 의 리파아제에 관한 각종 방법을 적용함으로써, 40kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 배열 정보 및 40kDa 의 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균으로부터 얻은 게놈 DNA 를 적당한 제한 효소로 완전 소화하고, 제한 효소에 대응하는 카세트를 연결하여, 주형 DNA 를 조제한다. 한편, 40kDa 의 리파아제의 일부에서 얻어진 아미노산 배열 정보 (예를 들어, N 말단 아미노산 배열인 서열 번호 : 3, 내부 아미노산 배열인 서열 번호 : 14) 를 이용하여, 적절한 프라이머를 설계한다. 이 프라이머와 카세트 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하고, 40kDa 리파아제 유전자의 주변 게놈 DNA 배열을 얻는다. 얻어진 염기 배열 등으로부터, 40kDa 의 리파아제를 코드하는 유전자의 ORF 를 추정할 수 있다. 추정 ORF 의 증폭, 클로닝, 염기 배열의 확인, 코드되는 단백질의 기능의 확인에는, 본 명세서에 기재한 32kDa 의 리파아제에 관해서 동일한 목적으로 사용한 수법을 적용할 수 있다.
즉, 본 발명은 또한, 서열 번호 : 3 혹은 서열 번호 : 14 에 기재된 아미노산 배열, 상기한 40kDa 의 리파아제의 전부 혹은 일부 (즉, 리파아제 자체 혹은 그 프래그먼트), 또는 Tetrasphaera 속에 속하는 (바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일 종에 속하고, 보다 바람직하게는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주인) 균을 사용하는 것을 특징으로 한다, 그 리파아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기 배열 정보의 생산 방법도 제공한다.
II
.
Tetrasphaera
속
NITE
P-154 균주
본 발명은 또한, 본 발명의 리파아제를 생산할 수 있는, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주를 제공한다.
Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주는, (주) 카이요 바이오 테크놀로지 연구소가 소유하는 신규 해양성 미생물의 라이브러리로부터 중사슬 지방산 유지(MCT) 를 함유한 한천 플레이트를 사용하여, 할로가 형성되는지 여부에 의해 선발되었다.
[Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주의 균학적 성질]
Tetrasphaera sp. NITE P-154주 (본 명세서에서는, 「#375」라고 표기하는 경우가 있다.) 는, 형태적으로는 구균 (0.86×0.86㎛) 이고 운동성은 없다. 생리학적으로는 그램 양성으로 생육 온도 범위는 15∼45℃, 탄소원으로서 D-프룩토오스, D-글루코오스, D-만니톨, 라피노스 및 수크로오스를 이용할 수 있고, L-아라비노오스, 이노시톨, L-람노스 및 D-자일로스는 이용할 수 없다. 화학 분류학적으로는 이소프레노이드·퀴논은 MK-8(H4) 이고, DNA 의 염기 조성은 70.5% 이다.
| a. 형태적 성질 1) 세포의 형 및 크기 : 구균, 0.86×0.86㎛ 2) 운동성 유무 : 없음 b. 배양적 성질 1) ISP 배지 N o.2 평판 배양 : 원형, 반구상, 전연 (全緣), 광택이 있는 백색 콜로니 형성 2) ISP 배지 N o.4 평판 배양 : 원형, 반구상, 전연, 광택이 있는 백색 콜로니 형성 3) ISP 배지 N o.5 평판 배양 : 생육은 좋지 않지만, 백색 콜로니 형성 4) ISP 배지 N o.6 평판 배양 : 원형, 반구상, 전연, 광택이 있는 황색기 도는 백색 콜로니 형성 5) ISP 배지 N o.7 평판 배양 : 생육은 좋지 않지만, 백색 콜로니 형성 6) Marine Agar 한천 평판 배양 : 원형, 반구상, 전연, 광택이 있는 백색 콜로니 형성 c. 생리학적 성질 1) 그램 염색 : 양성 2) 생육 온도 범위 : 15 - 45 도 3) 알칼리 포스파타아제 활성 : 음성 4) 에스테라아제 (C4) 활성 : 양성 5) 에스테라아제 리파아제 (C8) 활성 : 양성 6) 리파아제 (C4) 활성 : 양성 7) 류신 아릴아미다아제 활성 : 양성 8) 발린 아릴아미다아제 활성 : 양성 9) 시스틴 아릴아미다아제 활성 : 음성 10) 트립신 활성 : 음성 11) 키모트립신 활성 : 음성 12) 산성 포스파타아제 활성 : 양성 13) 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제 활성 : 양성 14) α-갈락토시다아제 활성 : 음성 15) β-갈락토시다아제 활성 : 양성 16) β-글루크로니다아제 활성 : 음성 17) α-글루코시다아제 활성 : 양성 18) β-글루코시다아제 활성 : 양성 19) N-아세틸-β-글루코사미니다아제 활성 : 음성 20) α-만노시다아제 활성 : 음성 21) α-푸코시다아제 활성 : 음성 22) 탄소원의 이용성 L-아라비노오스 : － D-프룩토오스 : ＋ D-글루코오스 : ＋ 이노시톨 : － D-만니톨 : ＋ L-람노스 : － 라피노스 : ＋ 수크로오스 : ＋ D-자일로스 : － BiOLOG SFP2 마이크로플레이트 사용 d. 화학 분류학적 성질 1) 이소프레노이드·퀴논 : MK-8(H4) 2) DNA 의 염기 조성 : 70.5% |
Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주를 marine broth 2216 (Difco 사 제조) 에서 배양시키면 본 발명의 리파아제를 균체 밖으로 분비한다.
본 발명은 또한, Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주와 동일한 균학적 성질을 갖는, 균주 또는 그 변이체, 및 Tetrasphaera 속 NITE P-154 균주의 16S rRNA 유전자 (서열 번호 : 1) 와 높은 동일성을 갖는 (예를 들어, 98% 보다 높은 동일성을 갖는, 바람직하게는 98.5% 동일하고, 더욱 바람직하게는 99% 동일하고, 특히 바람직하게는 99.5% 동일한) 염기 배열로 이루어지는 16S rRNA 유전자를 갖는, 균주 또는 그 변이체도 제공한다. 또, 본 발명자들의 검토에 의거하면, 공지된 균에서 가장 가까운 것으로 98% 였다.
본 발명의 균주 및 그 변이체의 균주는, 본 발명의 단백질 및 리파아제의 제조를 위해 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열 번호 : 1 의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
도 1 은, Tetrasphaera sp. NITE P-154 (#375) 의 16S rRNA 유전자의 염기 배열을 나타낸 도면이다.
도 2 는, HPLC 분획 후의 각 프랙션의 SDS-PAGE 사진이다. MW 는, 분자량 마커, 21∼35 는 프랙션 #21∼35 를 영동한 레인을 나타낸다.
도 3 은, Streptomyces 속 균 추정 분비 단백질과, Streptomyces rimosus 유래 GDSL-리파아제와의 얼라인먼트 결과를 나타낸 도면이다. #375 주가 생산하는 32kDa 단백질의 N-말단 15 아미노산 잔기는, 비교적 근연의 Streptomyces 속 균의 추정 분비 단백질과 높은 동일성을 나타내고, 이 Streptomyces 속 균 추정 분비 단백질은, Streptomyces rimosus 유래 GDSL-리파아제를 포함하는 몇몇 리파아제 등의 아미노산 배열과 동일성이 있었다.
도 4 는, 32kDa 단백질을 코드할 것으로 예상되는 유전자 (lip32 유전자) 의 염기 배열과 대응하는 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. lip32 유전자는 적어도 777bp 로 구성되고, 259 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질을 코드하는 것으로 생각된다.
도 5 는, LIP32 단백질 발현 벡터 (pET22b : :lip32Nc) 의 구성을 나타낸 도면이다.
도 6 은, 칼럼 정제 후의 LIP32 단백질의 SDS-PAGE 사진이다. M 은 마커, 2 는 프랙션 #2, 3 은 프랙션 #3 을 영동한 레인을 나타낸다.
도 7 은, 칼럼 정제 후의 LIP32 단백질의 Bradford 법에 의한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 은, LIP32 를 코드하는 유전자를 함유한 게놈 DNA 의 염기 배열과 LIP32 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 그늘진 부분은 정제 LIP32 의 N 말단 아미노산 배열과 일치한 배열을 나타낸다.
도 9 는, LIP32 의 추정 프리(pre-) 배열 및 프로(pro-) 배열과, pETLIP32-F, pETLIP32-M, pETLIP32-S 벡터를 나타낸 도면이다.
도 10 은, LIP40 을 코드하는 유전자를 포함한 게놈 DNA 의 염기 배열과 LIP40 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 하선부는 분비 시그널 배열, 그늘진 부분은 정제 LIP40 의 부분 아미노산 배열과 일치한 배열을 나타낸다. 2 중 하선부는 리파아제의 보존 영역이다.
도 11 은, LIP40 단백질 발현 벡터 (pETLIP40HP) 의 구성을 나타낸 도면이다.
도 12 는, LIP32PH 및 LIP40HP 의 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 13 은, LIP32PH 및 LIP40HP 의 최적 pH 를 나타낸 그래프이다.
도 14 는, 고정화한 LIP40HP 또는 대조 (pET22b) 를 사용하여 아스타산틴(astaxanthin)으로의 지방산 전이 반응을 실시하였을 때의, 반응액의 HPLC 분석 차트이다.
도 15 는, LIP40HP 또는 대조 (pET22b) 를 사용하여 카테킨으로의 지방산 전이 반응을 실시하였을 때의, 반응액의 HPLC 분석 차트이다.
도 16 은, LIP40 성숙 단백질의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 2 는, HPLC 분획 후의 각 프랙션의 SDS-PAGE 사진이다. MW 는, 분자량 마커, 21∼35 는 프랙션 #21∼35 를 영동한 레인을 나타낸다.
도 3 은, Streptomyces 속 균 추정 분비 단백질과, Streptomyces rimosus 유래 GDSL-리파아제와의 얼라인먼트 결과를 나타낸 도면이다. #375 주가 생산하는 32kDa 단백질의 N-말단 15 아미노산 잔기는, 비교적 근연의 Streptomyces 속 균의 추정 분비 단백질과 높은 동일성을 나타내고, 이 Streptomyces 속 균 추정 분비 단백질은, Streptomyces rimosus 유래 GDSL-리파아제를 포함하는 몇몇 리파아제 등의 아미노산 배열과 동일성이 있었다.
도 4 는, 32kDa 단백질을 코드할 것으로 예상되는 유전자 (lip32 유전자) 의 염기 배열과 대응하는 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. lip32 유전자는 적어도 777bp 로 구성되고, 259 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질을 코드하는 것으로 생각된다.
도 5 는, LIP32 단백질 발현 벡터 (pET22b : :lip32Nc) 의 구성을 나타낸 도면이다.
도 6 은, 칼럼 정제 후의 LIP32 단백질의 SDS-PAGE 사진이다. M 은 마커, 2 는 프랙션 #2, 3 은 프랙션 #3 을 영동한 레인을 나타낸다.
도 7 은, 칼럼 정제 후의 LIP32 단백질의 Bradford 법에 의한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 은, LIP32 를 코드하는 유전자를 함유한 게놈 DNA 의 염기 배열과 LIP32 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 그늘진 부분은 정제 LIP32 의 N 말단 아미노산 배열과 일치한 배열을 나타낸다.
도 9 는, LIP32 의 추정 프리(pre-) 배열 및 프로(pro-) 배열과, pETLIP32-F, pETLIP32-M, pETLIP32-S 벡터를 나타낸 도면이다.
도 10 은, LIP40 을 코드하는 유전자를 포함한 게놈 DNA 의 염기 배열과 LIP40 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다. 하선부는 분비 시그널 배열, 그늘진 부분은 정제 LIP40 의 부분 아미노산 배열과 일치한 배열을 나타낸다. 2 중 하선부는 리파아제의 보존 영역이다.
도 11 은, LIP40 단백질 발현 벡터 (pETLIP40HP) 의 구성을 나타낸 도면이다.
도 12 는, LIP32PH 및 LIP40HP 의 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 13 은, LIP32PH 및 LIP40HP 의 최적 pH 를 나타낸 그래프이다.
도 14 는, 고정화한 LIP40HP 또는 대조 (pET22b) 를 사용하여 아스타산틴(astaxanthin)으로의 지방산 전이 반응을 실시하였을 때의, 반응액의 HPLC 분석 차트이다.
도 15 는, LIP40HP 또는 대조 (pET22b) 를 사용하여 카테킨으로의 지방산 전이 반응을 실시하였을 때의, 반응액의 HPLC 분석 차트이다.
도 16 은, LIP40 성숙 단백질의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
본 발명의 32kDa 또는 40kDa 의 리파아제는, 적당한 담체에 고정화시켜, 고정화 효소로서 사용할 수 있다.
*담체에는, 동일한 목적으로 사용되는 종래의 수지, 예를 들어, 염기성 수지 (예를 들어, MARATHON WBA (Dow Chemcal 사 제조), 미츠비시 화학의 SA 시리즈, WA 시리즈 또는 FP 시리즈의 수지 및 오르가노사의 앰버라이트의 IRA 시리즈), 소수성 수지 (예를 들어, FPHA (다이아이온, 미츠비시 화학사 제조), 미츠비시 화학의 HP 시리즈, 오르가노사의 앰버라이트 XAD7) 등을 담체로서 사용할 수 있다.
담체에 대한 고정화 방법도, 동일한 목적으로 사용되는 종래 기술을 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기한 수지 담체 1부에 대하여 10부의 #375 의 배양 상청을 첨가하여, 그대로 감압 건조시켜도 되고, 또한 흡착시킨 후, 상청을 제거한 후 건조시켜도 된다.
고정화된 리파아제는, 공업적으로 유용하다. 즉, 고정화 효소를 칼럼에 충전하고, 그 칼럼에 원료를 도통시키는 연속적인 반응이 가능하다. 또한, 반응액으로부터 용이하게 고정화 효소를 제거할 수도 있으며, 또한 재사용하는 것도 가능하게 된다.
본 발명의 리파아제 또는 고정화 리파아제는, 중사슬 지방산 및/또는 장사슬 지방산의 전이 반응에 있어서, 및 중사슬 지방산 에스테르 및/또는 장사슬 지방산 에스테르의 제조에 있어서 사용할 수 있다. 에스테르에는, 아스타산틴 등의 카로티노이드 (카로틴류와 크산토필류로 이루어진다.) 와 지방산의 에스테르, 및 카테킨 등의 폴리페놀과 지방산의 에스테르가 포함된다.
본 명세서에서 「전이 반응」이라고 할 때는, 특별한 경우를 제외하고, 에스테르화 반응 또는 에스테르 교환 반응을 말한다.
전이 반응은, 각종 지방산 에스테르를 제조하는 데 유용하다. 예를 들어 트리글리세리드간의 에스테르 교환, 스테롤에스테르의 제조, 지방산 메틸에스테르의 제조 등의 공업적인 실시에 있어서 종래의 리파아제가 사용되고 있는 것같이, 본 발명의 리파아제도 또한, 이러한 케이스에서 사용할 수 있다. 본 발명의 리파아제에 의해 제조될 수 있는 에스테르 중, 특히 유용한 예로서, 스테롤에스테르 (예를 들어, β-시토스테롤카프릴산 에스테르), 아스타산틴카푸릴산 에스테르, 카테킨카프릴산 에스테르 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의해서 처음으로 제공되는 서열 번호 : 1, 서열 번호 : 3, 서열 번호 : 14,서열 번호 : 10, 서열 번호 : 11, 서열 번호 : 15, 서열 번호 : 16, 서열 번호 : 28 및, 서열 번호 : 29 에 관한 배열 정보 및 그 일부, 그리고 그들의 이용 방법도 제공한다.
[
실시예
]
다음으로, 실시예에 의해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕#375 주 배양 상청으로부터의 리파아제 단백질의 단리·정제와 N 말단 15 잔기의 배열의 결정 :
Marine broth 2216 (Difco 사 제조) 액체 배지에 #375 주를 1% 식균하고, 25℃ 에서 4일간 진탕 배양하였다. 배양 상청액 200㎖ 에 대해서, 버퍼 A ; 50mM 트리스 염산 버퍼 (pH 8.0)/2mM CaCl2/2mM MgCl2 로 평형화한 소수 수지 ; Phenyl Sepharose CL4B (Amersham Biosciences 사 제조) 2㎖ 에 흡착시키고, 칼럼 크로마토그래피에 넣었다. 버퍼 A 로 세정한 후, 10㎖ 의 0.5% TritonX-100 을 함유한 버퍼 A 로 리파아제 단백질 이외의 물질을 세정 제거하였다. 다음으로, 10㎖ 의 1% TritonX-100 을 함유한 버퍼 A 로 용출시킴으로써 리파아제 활성 획분을 얻었다.
본 리파아제 획분 (10㎖) 에 10배량의 버퍼 A 를 첨가 희석한 후, 음이온 교환 수지 ; Q-Sepharose (Amersham Biosciences 사 제조) 0.4㎖ 에 흡착시키고, 0.1% CHAPS 를 함유한 버퍼 A 로 충분히 세정하여 계면 활성제 TritonX-100 으로부터 CHAPS 로 치환한 후, 0.5M 또한 1M NaCl 에 의해 스텝와이즈 용출을 실시하였다. 리파아제 활성이 인정된 0.5M NaCl 용출 획분 (2㎖) 을 0.1% CHAPS 를 함유한 버퍼 A 로 충분히 투석을 실시한 후, 음이온 교환 칼럼 ; HiTrapQ (Amersham Biosciences 사 제조) 1㎖ 를 사용하여, HPLC 에 의한 0 → 0.75M NaCl 그래디언트 용출을 실시하였다. 프랙션 0.5㎖ 마다 분획하여, 각각의 리파아제 활성, 및 SDS-PAGE 에 의한 밴드의 검출을 실시하였다. 표 2 에 리파아제 활성 및 전이 활성을, 도 2 에 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
리파아제 활성은, 실시예 3 에 상세히 서술한 MU-C8 을 사용하는 방법에 준하여, 기질로서 MU-C8 또는 MU-C18 을 사용하여 측정하고, 단위는 Unit (1 Unit (1 MU) 은, 1L 의 샘플이 1min 동안에 1μ㏖ 의 MU 를 가수 분해에 의해 유리하는 활성) 으로 나타내었다.
또한, 전이 활성은, 다음과 같이 측정하였다. 3-페닐-1-프로판올 (10㎕) 또는 1-페닐-2-프로판올 (10㎕) 과 트리카프릴린 (150㎕) 의 혼합액에 효소 용액 (100㎕) 을 첨가하고, 45℃ 에서 3일간 격하게 교반하여 반응시켰다. 반응액을 원심 분리하여, 상층 50㎕ 를 회수하고 아세토니트릴 50㎕ 를 첨가하여, 10㎕ 를 HPLC 에 의해 분석하였다. 분석 조건은, 칼럼으로서 Develosil C30-UG-5 (4.6 x 150 mm) (Nomura chemical, Aichi, Japan) 를, 이동층으로서 90% 아세토니트릴 0.08% TFA, 유속 1㎖/분, 온도는 실온으로 하였다. 각각의 카프릴산 에스테르의 생성률로 나타내었다.
2 종의 리파아제 (32kDa, 40kDa) 에 관해서 프로테인 시퀀서에 의해 N 말단으로부터 15 잔기의 아미노산 배열을 결정하였다. 그 결과를 표 3 및 배열표 (서열 번호 : 2, 서열 번호 : 3) 에 나타낸다.
또한, 분자량 40kDa 의 리파아제에 관해서, SDS-PAGE 로부터 밴드를 잘라내어, 트립신에 의한 소화, 역상 HPLC 에 의한 단편 펩티드의 분리를 실시하였다. 임의의 피크의 펩티드의 N 말단으로부터 12 잔기의 아미노산 배열 LSTNVGPTHLGG (서열 번호 : 14) 을 결정하였다.
〔실시예 2〕32kDa 의 리파아제 유전자의 클로닝 :
[#375 로부터의 DNA 및 RNA의 조제]
본 균으로부터의 게놈 DNA (gDNA) 의 조제에는 DNeasy Tissue Kit (QIAGEN) 를, 전체 RNA 의 조제에는 RNeasy Plant isolation Kit (QIAGEN) 를 각각 사용하여, 각 키트의 프로토콜에 따라서 실시하였다. 전체 RNA 를 주형으로 한 역전사 반응 (1st strand cDNA 합성) 은, SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) 를 사용하고, 프로토콜에 따라서 실시하였다.
PCR 산물의 벡터에 대한 라이게이션에는, TOPO TA-cloning Kit (Invitrogen) 를 사용하여, 정법에 따라서 대장균으로 형질 전환하였다. 클로닝한 DNA 단편의 염기 배열은, 클로닝 벡터의 MCS 의 외측에 설계된 프라이머 (M13 primer M4, RV 등) 나 기지 배열 상에 설계한 프라이머를 사용한 프라이머 워킹에 의해서 결정하였다. 시퀀싱 시료는, ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) 를 사용하여, 프로토콜에 따라서 조제하였다. 시퀀서는, ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems) 를 사용하고, 데이터 해석 소프트에는 Vector-NTI 9.0 (InforMax) 를 사용하였다.
[lip32 유전자의 취득]
#375 주의 32kDa 단백질을 코드할 것으로 예상되는 유전자 (이하 lip32 유전자로 한다) 를 취득하기 위해서, 당해 단백질의 N-말단 15 아미노산 잔기의 배열 (GDAPAYERYVALGDS) 을, genebank 의 아미노산 배열 데이터 베이스에 대하여 blastp 검색을 실시한 결과, #375 주와 비교적 근연의 Streptomyces 속 균의 추정 분비 단백질 (액세션 (accession) No.CAC42140) 과 높은 동일성을 나타내고 있었다. 이 Streptomyces 속 균 추정 분비 단백질은, 몇몇 리파아제 등의 아미노산 배열과 동일성이 있었다. 그 중 Streptomyces rimosus 유래 GDSL-리파아제 (액세션 No.AAK84028) 와의 ClustalW 에 의한 얼라인먼트 결과를 도 3 에 나타낸다. 이들 단백질에서 보존된 배열 중, 하선부로 나타낸 2 개의 배열 VALGDSYS (서열 번호 : 4) 과 IGGNDS (서열 번호 : 5) 을 바탕으로, 센스 사슬의 축중 (縮重) 프라이머 375-dg-F3 (5'-TGGCCCTCGGCGACTCSTAC-'3) (서열 번호 : 6) 과 안티센스 사슬 축중 프라이머 375-dg-R3 (5'- CGTCGTTGCCNCCGATG-3') (서열 번호 : 7) 를 설계하였다. #375 주 cDNA 를 주형으로, 프라이머 375-dg-F3 과 프라이머 375-dg-R3 에 의해, ExTaq (타카라바이오) 를 사용하여, 98℃ 2 분, (98℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 1분) x 35 사이클, 72℃ 5분의 PCR 에 의해 DNA 를 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편의 염기 배열을 결정하여, 서열 번호 : 10 의 73 번째∼290 번째 부분 염기 배열을 얻었다. 다음으로, 얻어진 배열 상에 외향으로 프라이머 375-IPC32-F1 (5'-CGGCGCGGACACGACGGACATGACG-3') (서열 번호 : 8) 과 375-IPC32-R1 (5'-GGTAGCAGCCGCCCGCGATGTCGAG-3') (서열 번호 : 9) 를 설계하였다. #375 주 gDNA 를 제한 효소 PstI 또는 NotI 로 소화한 후, 셀프라이게이션함으로써 환형화된 것을 주형으로, 프라이머 375-IPC32-F1 과 프라이머 375-IPC32-R1 에 의해, LATaq (타카라바이오) 를 사용하여, 98℃ 20초, 68℃ 15분 (+10초/사이클) x 35 사이클의 PCR (인버스 PCR) 에 의해서, 근방 배열을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 클로닝하고, 그 일부의 염기 배열을 결정하였다. 먼저 얻어진 부분 염기 배열과 합하여, 합계 약 900bp 의 lip32 영역 gDNA 의 염기 배열을 결정하였다. 실시예 1 에서 결정한 N-말단 아미노산 배열 (서열 번호 2) 로부터, LIP32 단백질의 아미노산 배열을 추정하였다. 본 균의 lip32 유전자 영역의 DNA 배열 및 추정 아미노산 배열을, 도 4 및 배열표 (서열 번호 : 10, 서열 번호 : 11) 에 나타낸다. 실시예 1 에서 결정한 N-말단 아미노산 배열 (서열 번호 : 2) 은, 도 4 의 N-말단 아미노산 배열과 일치하였다. 이상의 결과로부터, LIP32 성숙 단백질은 259 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질인 것으로 생각되었다.
또한, 추정된 LIP32 단백질에 관해서, ClustalW 에 의해 기지의 리파아제 단백질 아미노산 배열과의 동일성 해석을 실시하였다. 각 단백질의 아미노산 배열의 동일성을 표 4 에 나타낸다.
〔실시예 3〕32kDa 리파아제 유전자의 대장균으로의 도입과 리파아제 활성 :
[대장균 발현계에 의한 LIP32 단백질 (LIP32PH) 의 조제]
대장균 발현계에 사용하는 #375 주의 lip32 유전자 ORF 의 cDNA 배열은, 프라이머 lip32-Nc-F (5'-CCATGGGCGACGCACCGGCATACGAACGC-3') (서열 번호 : 12), lip32-Xh-R1 (5'-CTCGAGGGTGAGCTCGTCGATGAGCAGGTG-3') (서열 번호 : 13) 을 사용한 RT-PCR 에 의해서 증폭, 클로닝 후, 시퀀싱에 의해서 염기 배열을 확인하였다. 클로닝한 cDNA 단편은, 제한 효소의 NcoI 과 XhoI 에 의해 소화하여 추출 후, 단백질의 대장균 발현용 벡터 pET22b(+) (Novagen) 의 동 제한 효소 인식 부위에 집어 넣고, 이것을 pET22b::lip32Nc 벡터로 하였다 (도 5). pET22b::lip32Nc 벡터에 의해 E. coli strain BL21 (DE3) 을 형질 전환하여, 단백질 발현에 사용하였다.
LIP32 단백질 발현 벡터 (pET22b::lip32Nc) 를 형질 전환한 E. coli 의 단(單)콜로니를 2㎖ 의 LB 배지 (100㎍/ml ampicillin 을 함유한다) 에 식균하고, 전(前)배양 (> 150rpm, 12hr, 37℃) 하였다. 전배양 균액을 50㎖ 의 Enriched medium (2% trypton, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.2% (v/v) glycerol, 50mM KH2PO4, pH 7.2 ; 100㎍/㎖ ampicillin 을 함유한다) 에 식균하여, 진탕 배양 (150rpm, 25℃) 하였다. 균액이 OD600 = 0.6 에 도달한 시점에서 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 를 최종 농도가 1.0mM 이 되도록 첨가하여, LIP32 단백질의 발현을 유도하였다. 다시 진탕 배양 (150rpm, ∼4hr, 25℃) 에 의해서 다량의 LIP32 단백질을 생성시켰다. 원심 분리 (6000rpm, 10 min, 4℃) 에 의해서 대장균을 회수하고, Storage buffer (20mM β-mercaptoethanol (β-ME), 50mM Tris-HCl, pH 8.0) 로 2 회 세정하였다. 그리고 40㎖ 의 빙랭 Lysis buffer (500mM NaCl, 5mM imidazole, 20mM β-ME, 10% (v/v) glycerol, 25mM Tris-HCl, pH 8.0) 에 재현탁 후, 세포를 초음파 파쇄하였다. 파쇄액은, 원심 분리 (10000rpm, 60 min, 4℃) 후, 공경 φ 0.22㎛ 의 필터를 통과시켜 세포편이나 불용물을 제거하고, 이것을 단백질 조(粗)추출액으로 하였다. 단백질 조추출액 (10㎖) 을, 미리 1.0㎖ 의 0.1M NiSO4 을 부하하여 10㎖ 의 Equilibration buffer (500mM NaCl, 20mM β-ME, 10% (v/v) glycerol, 25mM Tris-HCl, pH 8.0) 로 평형화한 HiTrap Chelating HP column (1.0㎖ bed volume) 에 통과시켰다. 칼럼에 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하기 위해, 10㎖ 의 Wash-1 buffer (500mM NaCl, 0.8mM imidazole, 20mM β-ME, 10% (v/v) glycerol, 25mM Tris-HCl, pH 8.0), 1.0㎖ 의 Wash-2 buffer (500mM NaCl, 40mM imidazole, 20mM β-ME, 10% (v/v) glycerol, 25mM Tris-HCl, pH 8.0) 를 순차적으로 흘림으로써 칼럼을 세정하였다. LIP32 단백질은, 5㎖ 의 Elution buffer (500mM NaCl, 250mM imidazole, 20mM β-ME, 10% (v/v) glycerol, 25mM Tris-HCl, pH 8.0) 에 의해서 칼럼으로부터 용출시키고, 용출액을 500㎕ 마다 분획하였다. 각 분획 중에 함유되는 단백질의 순도와 농도는, SDS-PAGE (도 6) 와 Bradford 법 (도 7) 에 의해서 확인하였다. SDS-PAGE 의 결과, 프랙션 #2∼3 중에, LIP32 단백질로 상정되는 약 30kDa 의 밴드가 명확하게 확인되었다. 그리고, 각 프랙션에 관해서 MU-C8 을 기질로 하여 리파아제 활성을 측정하였다 (하기의 리파아제 활성 측정과 동일). 그 결과, 프랙션 #3 에 강한 동 (同) 활성이 인정되었다. 따라서, 이후의 연구에는 프랙션 #3 을 LIP32 단백질의 효소 용액 (약 530ng/㎕) 으로서 사용하기로 하였다.
[LIP32 단백질 (LIP32PH) 의 리파아제 활성]
LIP32 단백질의 리파아제 활성은, 20㎕ 의 희석한 대장균 배양액 (현탁액) 과 180㎕ 의 기질 용액 (0.1mM MU-C8, 50mM 인산 칼륨 버퍼 (pH 7.0), 1% DMF) 을 혼화한 반응 용액 (200㎕) 을 조제하고, 37℃ 에서 20 min 동안의 형광 강도의 변화를 SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices) 에 의해 측정함으로써 구하였다. 1 Unit (1 MU) 은, 1L 의 샘플이 1min 동안 1μ㏖ 의 MU 를 가수 분해에 의해 유리하는 활성으로 하였다.
LIP32 단백질을 발현 유도한 대장균 현탁액을 사용하여, 리파아제 활성을 측정한 결과, LIP32 는 높은 리파아제 활성 (MU-C8 분해 활성) 을 나타내고 있다 (표 5).
〔실시예 4〕#375 주의 배양 상청의 음이온 교환 수지에 대한 고정화와 전이 활성 :
강(强)음이온 교환 수지 (MARATHON WBA, 다우·케미컬사 제조) 500㎎ 에 #375 배양액 5㎖ 를 첨가하고, 실온에서 감압 건조시켜, 고정화 효소를 얻었다. 3-페닐-1-프로판올 (25㎕) 과 트리카프릴린 (375㎕) 의 혼합액에 고정화 효소 50㎎ 을 첨가하고, 또 물 (20㎕) 을 첨가하여, 40℃ 에서 3일간 교반하였다. 반응액을 HPLC 에 의해 분석하여, 3-페닐-1-프로판올의 카프릴산 에스테르의 생성률이 75% 였다.
〔실시예 5〕#375 주의 배양 상청의 소수성 수지에 대한 고정화와 전이 활성 :
FPHA (다이아이온, 미츠비시 화학사 제조) 500㎎ 을 사용하여, 실시예 4 와 동일하게 고정화 효소를 얻었다. 이 고정화 효소 50㎎ 을 사용하여, 실시예 4 와 동일한 반응을 실시하였다. 이 경우는 에스테르의 생성률이 47% 였다.
〔실시예 6〕 lip32 유전자의 전장 배열의 결정 :
#375 주 gDNA 를 제한 효소 PstI 또는 NotI 로 소화시킨 후, 셀프라이게이션함으로써 환형화된 것을 주형으로, 프라이머 375-IPC32-F1 과 프라이머 375-IPC32-R1 에 의해, LATaq (타카라바이오) 를 사용하여, 98℃ 20초, 68℃ 15분 (+10초/사이클) x 35사이클의 PCR (인버스 PCR) 에 의해서, 근방 배열을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 클로닝하고, 그 일부의 염기 배열을 결정하여, 먼저 얻은 염기 배열 (서열 번호 : 10) 과 연결시켜, LIP32 를 코드하는 ORF 를 함유한 게놈 DNA 배열 (서열 번호 : 15, 도 8), 및 추정 아미노산 배열 (서열 번호 : 16, 도 8) 을 얻었다.
〔실시예 7〕 LIP32 단백질의 추정 프리 배열 및 프로 배열에 관한 검토 :
LIP32 단백질의, 전장 아미노산 배열을 코드하는 LIP32-F 의 증폭용으로 프라이머 LIP32-Full-Nde-F (5'-CATATGAGCTCGTCACGTCGTACCGTCCGCACC-3') (서열 번호 : 17) 와 LIP32stop-Xho-Rv (5'-CTCGAGTCAGGTGAGCTCGTCGATGAGCAGGTC-3') (서열 번호 : 18) 를, 프리 배열을 제외한 아미노산 배열을 코드하는 LIP32-M 의 증폭용으로 프라이머 LIP32-Mid-Nco-F (5'-CCATGGCGACCGAGCGGGCGTCGGCGCCCACG-3') (서열 번호 : 19) 와 LIP32stop-Xho-Rv 를, 프리-프로 배열을 제외한 아미노산 배열을 코드하는 LIP32-S 의 증폭용으로 프라이머 LIP32-sht-Nco-F (5'-CCATGGGCGACGCACCGGCATACGAACGCTAT-3') (서열 번호 : 20) 와 LIP32stop-Xho-Rv 를 각각 합성하였다. #375 주 gDNA 를 주형으로, 각각의 프라이머 세트를 사용한 PCR 에 의해서 증폭시킨 DNA 단편을, pCR4Blunt-TOPO 벡터 (인비트로겐사 제조) 에 클로닝하여, 염기 배열을 확인하였다. 제한 효소의 NdeI 와 XhoI (LIP32-F) 또는 NcoI 와 XhoI (LIP32-M, -S) 에 의해 잘라낸 각 lip32 유전자 단편을, 대장균 발현용 벡터 pET22b(+) (Novagen) 의 동 제한 효소 인식 부위에 집어 넣고, 각각을 pETLIP32-F, pETLIP32-M, pETLIP32-S 벡터로 하였다 (도 9).
각 대장균을 LB 배지에서 OD600 이 약 0.6 에 도달할 때까지 진탕 배양 후, IPTG 를 최종 농도가 1mM 이 되도록 첨가하였다. 그리고 3 시간의 진탕 배양에 의해서 LIP32 단백질을 발현 유도하였다. 이들 대장균 현탁액의 각 리파아제 활성은, 다음과 같이 하여 측정하였다.
즉, 20㎕ 의 희석한 대장균 현탁액과 180㎕ 의 기질 용액 (0.1mM MU-C8, 50mM 인산 칼륨 버퍼 (pH 7.0), 1% DMF) 을 혼화한 반응 용액 (200㎕) 을 조제하여, 37℃ 에서 20min 동안의 형광 강도의 변화를 SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices) 에 의해 측정함으로써 구하였다. 1 Unit (1 MU) 은, 1L 의 샘플이 1min 동안에 1μ㏖ 의 MU 를 가수 분해에 의해 유리하는 활성으로 하였다. 분석 결과를 하기 표에 나타내었다.
이 결과로부터, LIP32 단백질의 활성 발현을 위해서는, 추정 프리 배열 및 프로 배열의 절단이 필요하다는 것이 시사되었다.
〔실시예 8〕 lip40 유전자의 클로닝 :
분자량 40kDa 의 리파아제에 관해서, SDS-PAGE 로부터 밴드를 잘라내고, 트립신에 의한 소화 후, 역상 HPLC 에 의한 단편 펩티드의 분리를 실시하였다. 임의의 피크의 펩티드로부터, 먼저 얻은 아미노산 배열 (서열 번호 : 3, 서열 번호 : 14) 에 추가하여, 이하의 아미노산 부분 배열을 얻었다.
GPDSVPGTAGATTVT (N 말단) (서열 번호 : 3) … 실시예 1 참조
LSTNVGPTHLGG (서열 번호 : 14) … 실시예 1 참조
APWFGLGAR (서열 번호 : 21)
QLAESVTEYE (서열 번호 : 22)
GYAVAFTDYQ (서열 번호 : 23)
아미노산 부분 배열 중, 서열 번호 : 23 에 대한 센스 사슬과 서열 번호 : 14 의 3∼12 에 대한 안티센스 사슬의 축중 프라이머로서 프라이머 LIP40-9 (GGNTAYGCNGTNGCNTTYACNGAYTAYCA) (서열 번호 : 24) 와 프라이머 LIP40-5 (CCNCCNARRTGNGTNGGNCCNACRTTNGT) (서열 번호 : 25) 의 올리고 DNA 를 각각 합성하였다.
#375 의 게놈 DNA 100ng 을 주형으로 하고, LA Taq with GC buffer (타카라바이오) 에서 GC buffer II 를 사용하여, 프라이머 LIP40-9 와 프라이머 LIP40-5 를 각각 종농도 (終濃度) 10mM, LA Taq 0.2 unit 첨가하여 전체량 20㎕ 로 하고, 94℃ 1분, (94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 2분) 을 40 사이클, 72℃ 5 분의 PCR 을 실시하였다. PCR 산물을 아갈로스 겔 전기 영동에 의해 분석한 결과, 약 0.7kb 의 DNA 단편이 확인되었으므로, 겔로부터 잘라내어, GFX 키트 (아마샴) 에 의해 정제하고, TOPO-TA 클로닝 키트 (인비트로겐) 에 의해 클로닝하였다. 클론화된 DNA 의 염기 배열을 결정하여, 부분 염기 배열 (서열 번호 : 28 의 932∼1571) 이 얻어졌다. 다음으로, lip40 유전자의 전장을 클론화하기 위해서, 역 PCR (inverse PCR) 을 실시하였다. #375게놈 DNA 를 제한 효소 NotI 로 완전히 소화한 후, 셀프라이게이션시켰다. 그것을 주형으로 하고, 프라이머 LIP40-13 (gacgcggttcatgtaggtgtgcgtcc) (서열 번호 : 26) 과 LIP40-14 (gtgcgccaagggcgccaacgtccgcc) (서열 번호 : 27) 를 사용하여 LA Taq with GC buffer (타카라바이오) 로 PCR 을 실시하였다.
얻어진 7kb 의 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit (인비트로겐) 로 클론화하여, 양단으로부터 염기 배열을 결정하였다. 얻어진 염기 배열과 먼저 얻어진 염기 배열을 연결하여, 서열 번호 : 28 의 염기 배열을 얻었다. ORF 해석, LIP40 의 부분 아미노산 배열 등으로부터, LIP40 은, 414bp∼1688bp 의 ORF 로 코드되는 것으로 생각되었다. 당해 ORF 는 424 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질 (서열 번호 : 29, LIP40 아미노산 배열) 을 코드하고 있었다. 정제 단백질의 N 말단 아미노산 배열 (서열 번호 : 3) 과 서열 번호 : 29 (LIP40 아미노산 배열) 의 29 번째부터의 배열이 일치하는 점에서, 서열 번호 : 29 의 1∼28 번째까지의 펩티드는 분비 시그널인 것으로 생각되었다 (도 10).
LIP40 아미노산 배열은, Janibacter sp. HTCC 2649 유래의 hypothetical protein (gi#84498087) 과 72.9% 의 identity 를 나타내었다.
〔실시예 9〕40kDa 리파아제 유전자의 대장균으로의 도입과 리파아제 활성 :
[대장균 발현계에 의한 LIP40 단백질의 조제]
#375 의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 프라이머 L40EcoRI-F1 (GAATTCGGGACCGGACTCCGTGCCCGGCAC) (서열 번호 : 30) 또는 프라이머 L40NdeI-F3 (CATATGACGTCAGCACTGCTCCGACGAGCCCTCGC) (서열 번호 : 31) 와, 프라이머 L40HindIII-R1 (AAGCTTCTAGACGGCCCAGCAGTTGCTGAG) (서열 번호 : 32) 을 사용하여, LA Taq with GC buffer 로 PCR 반응을 실시하였다. 증폭된 약 1.2kbp 의 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit 를 사용하여 클론화해서, 염기 배열을 확인하고, 플라스미드 pCR-375LIP40P 와 플라스미드 pCR-375LIP40S 를 얻었다. 플라스미드 pCR-375LIP40P 를 EcoRI 와 HindIII, 플라스미드 pCR-375LIP40S 를 NdeI 와 HindIII 에 의해 소화시키고, 대장균 발현용 벡터 pET22b(+) (Novagen) 를 EcoRI 와 HindIII 또는 NdeI 와 HindIII 에 의해 소화시킨 것에, ligation high (토요보) 를 사용하여 연결해서, 플라스미드 pET375L40P 와 pET375LP40S 를 얻었다.
LIP40 단백질 발현 벡터 (플라스미드 pET375L40P 와 pET375L40S) 를 사용하여 형질 전환된 E. coli 의 단콜로니(single colony)를 100㎍/㎖ ampicillin 을 함유하는 LB 배지 2㎖ 에 식균하고, 전(前)배양 (> 150rpm, 12 hr, 37℃) 하였다. 전배양 균액을 100㎍/㎖ ampicillin 을 함유하는 Enriched medium (2% trypton, 1% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.2% (v/v) glycerol, 50mM KH2PO4, pH 7.2) 50㎖ 에 식균하여, 진탕 배양 (150rpm, 25℃) 하였다. 균액이 OD600 = 0.6 에 도달한 시점에서 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 를 최종 농도가 1.0mM 이 되도록 첨가하고, LIP40 단백질의 발현을 유도하여, 다시 진탕 배양 (150rpm, ∼4hr, 25℃) 하였다.
[LIP40 의 리파아제 활성]
리파아제 활성은, 20㎕ 의 희석시킨 대장균 배양액 (현탁액) 과 180㎕ 의 기질 용액 (0.1mM MU-C8 또는 MU-C18, 50mM 인산 칼륨 버퍼 (pH 7.0), 1% DMF) 을 혼화한 반응 용액 (200㎕) 을 조제하고, 37℃ 에서 20min 동안의 형광 강도의 변화를 SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices) 에 의해 측정함으로써 구하였다. 1 Unit (1 MU) 은, 1L 의 샘플이 1min 동안에 1μ㏖ 의 MU 를 가수 분해에 의해 유리하는 활성으로 하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
전이 활성은, 다음과 같이 측정하였다. 3-페닐-1-프로판올 (10㎕) 또는 1-페닐-2-프로판올 (10㎕) 과 트리카프릴린 (150㎕) 의 혼합액에 대장균 배양액 (100㎕) 을 첨가하고, 45℃ 에서 3 일간 격하게 교반하여 반응시켰다. 반응액을 원심 분리하여, 상층 50㎕ 를 회수하고 아세토니트릴 50㎕ 를 첨가하여, 10㎕ 를 HPLC 에 의해 분석하였다. 분석 조건은, 칼럼으로서 Develosil C 30-UG-5 (4.6 x 150 mm) (Nomura chemical, Aichi, Japan) 를, 이동층으로서 90% 아세토니트릴 0.8% TFA, 유속 1㎖/분, 온도 실온으로 하여, 각각의 카프릴산 에스테르의 생성률로 나타내었다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
〔실시예 10〕대장균 발현계에 의한 LIP40 단백질 (LIP40HP) 의 조제 :
#375 주의 LIP40 단백질에 6His-tag 를 부가하여 대장균에서 발현시키기 위해서 다음과 같이 벡터를 구축하였다. MBI375 주의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 프라이머 375L40EcoRI-His-F (5'-GAATTCGCACCACCACCACCACCACGGACCGGACTCCGTGCCCGGCAC-3') (서열 번호 : 33) 와 375L40HindIII-R1 (5'-AAGCTTCTAGACGGCCCAGCAGTTGCTGAG-3') (서열 번호 : 34) 을 사용한 PCR 에 의해서 증폭 후, pCR2.1 TOPO 벡터로 클로닝하였다. 염기 배열을 확인한 후, 제한 효소인 EcoRI 와 HindIII 에 의해 소화, 추출한 Lip40 유전자 단편은 대장균 발현용 벡터 pET22b(+) (Novagen) 의 동 제한 효소 인식 부위에 집어 넣어, 이것을 pETLIP40HP 벡터로 하였다 (도 11). pETLIP40HP 벡터에 의해 형질 전환된 E. coli strain BL21 (DE3) 을 단백질 발현에 사용하였다.
대장균에서의 LIP40HP 단백질의 발현은, IPTG 유도 후의 배양 시간을 12 시간으로 변경한 것 외에는, LIP32 단백질과 동일한 방법으로 실시하였다. LIP40HP 단백질의 정제는, N-말단에 융합된 6-His-tag 를 이용한 어피니티 정제로 실시하였다. 그 순서는, 실시예 3 에 약간의 변경을 가한 것 외에는 LIP32 단백질과 동일한 순서에 따랐다. 변경은, (1) Lysis buffer, Equilibration buffer, Wash-1 bufer 를 공통의 완충액 (500mM NaCl, 5mM imidazole, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 25mM Tris-HCl, pH 8.0) 로 변경한 점과, (2) Elution buffer 를 500mM NaCl, 250mM imidazole, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 25mM Tris-HCl, pH 8.0 으로 변경한 점의 2 가지이다.
〔실시예 11〕 LIP32PH 및 LIP40HP 의 캐릭터리제이션 (characterization) :
[LIP32PH, LIP40HP 의 최적 온도]
대장균으로부터 정제, 희석시킨 효소 용액 20㎕ 과, 미리 측정 온도 (10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60℃) 에서 보온한 180㎕ 의 기질 용액 (0.1mM MU-C8, 1% DMF, 50mM Tris-HCl, pH 7.0) 을 혼화함으로써 반응을 개시하였다. 활성은, 각각의 측정 온도에서의 반응에 있어서 MU 형광의 강도 변화를 경시적으로 측정함으로써 구하였다.
활성 측정의 결과, LIP32PH (실시예 3 에서 얻은 것) 의 최적 온도는 40℃, LIP40HP 의 최적 온도는 45℃-50℃ 이었다 (도 12).
[LIP32PH, LIP40HP 의 최적 pH]
대장균으로부터 정제, 희석시킨 효소 용액 20㎕ 과 미리 37℃ 에서 보온한 180㎕ 의 기질 용액 (0.1mM MU-C8, 1% DMF, 50mM 각종 pH 의 완충액) 을 혼화함으로써 반응을 개시하였다. 활성은, 37℃ 에서 20 분간의 반응에 있어서 MU 형광의 강도를 경시적으로 측정함으로써 구하였다. 각 pH 의 완충액으로서, 50mM Sodium acetate - acetic acid (pH 4.0-6.0), 50mM MES-NaOH (pH 5.5-7.0) 및 50mM Tris-HCl (pH 6.5-9.0) 을 사용하였다.
활성 측정의 결과, LIP32PH, LIP40HP 의 최적 pH 는 모두 pH 7.0 부근이었다 (도 13).
〔실시예 12〕 LIP40HP 고정화 효소에 의한 아스타산틴으로의 지방산 전이 반응 :
LIP40HP 에 의한, 트리카프릴린 (MCT) 으로부터 아스타산틴으로의 지방산 전이 반응에는, LIP40HP 의 고정화 효소를 사용하였다. LIP40HP 고정화 효소 (WBA-LIP40HP) 는, 강음이온 교환 수지 (MARATHON WBA, 다우ㆍ케미컬사 제조) 50㎎ 에 LIP40HP (약 3.65ng /㎕) 500㎕ 를 첨가하고, 2 시간 교반 (1000rpm, 10℃) 후, 실온에서 감압 건조시켜 조제하였다.
전이 반응은, 1.25㎎ 의 아스타산틴 (와코쥰야쿠) 과 MCT (125㎕) 의 혼합액에, WBA-LIP40HP (50㎎) 와 H2O (6.25㎕) 를 순차 첨가하고, 45℃ 에서 3 일간 정치 (靜置) 시킴으로써 실시하였다. 반응액에 100㎕ 의 아세톤을 첨가하여 교반, 원심 분리 후, 상층 100㎕ 를 회수하여 20㎕ 를 HPLC 에 의해 분석하였다. 분석 조건은, 칼럼 : Develosil C30-UG-5 (노무라 화학 주식회사 제조, 4.6 x 150 mm), 이동층 : 75-100% 아세톤, 1-15분 그래디언트 용출, 유속 1.0㎖/min, 분석 온도 : 실온, 검출 파장 : 480㎚ 로 하였다. 전이 활성은, 유지 시간 16.4분을 지표로 한 아스타산틴의 에스테르의 생성률로서 구하였다. 분석 결과, 아스타산틴의 카프릴산 에스테르의 생성률은 2.25% 이었다 (도 14). 또한, 대조로서 동일하게 조제한 WBA-pET22b 를 사용한 반응에서는, 아스타산틴의 카프릴산 에스테르의 생성은 보이지 않았다 (도 14).
〔실시예 13〕 LIP40HP 에 의한 카테킨으로의 지방산 전이 반응
LIP40 에 의한, 트리카프릴린 (MCT) 에서 카테킨으로의 지방산 전이 반응은, 100㎕ 의 카테킨 용액 (0.01㎎/㎕) 과 150㎕ 의 MCT 의 혼합액에, 50㎕ 의 LIP40HP 효소 용액 (1.0㎍/㎕) 을 첨가하고 45℃ 에서 2일간 교반함으로써 실시하였다. 반응액을 원심 분리하여 오일층을 회수하고, 등량의 아세토니트릴을 첨가하여, 10㎕ 를 HPLC 에 의해 분석하였다. 분석 조건은, 칼럼 : Develosil C30-UG-5 (노무라 화학 주식회사 제조, 4.6 x 150 mm), 이동층 :(A) 0.1% TFA, (B) 90% 아세토니트릴, 0.08% TFA, 그래디언트 조건 5% B 액 → 100% B 액/5분, 유속 1.0㎖/min, 분석 온도 : 실온, 검출 파장 : 280㎚ 로 하였다. 전이 활성은, 유지 시간 8.4분을 지표로 한 카테킨 에스테르의 생성률로서 구하였다. 분석 결과, 카테킨의 카프릴산 에스테르의 생성률은 38.70% 이었다 (도 15). 또한, 대조로서 동일하게 조제한 pET22b 를 사용한 반응에서는, 카테킨의 카프릴산 에스테르의 생성은 보이지 않았다 (도 15).
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Claims (13)
- 하기의 (H2) 또는 (L2) 인 폴리뉴클레오티드 :
(H2) 서열 번호 : 28 에 기재된 염기 배열의 전부 또는 414∼1688 번의 염기 배열 혹은 498∼1685 번의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 ;
(L2) 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 29∼424 번의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드. - 제 1 항에 있어서,
Tetrasphaera 속 유래인 폴리뉴클레오티드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
- 제 3 항에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
- 하기의 (l1) 인 단백질 :
(l1) 서열 번호 : 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질. - 하기의 (l2) 인 단백질 :
(l2) 서열 번호 : 29 에 기재된 아미노산 배열의 전부 또는 29∼424 번의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질. - 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
수지에 고정화되어 있는 단백질. - 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르화 반응 또는 에스테르 교환 반응 방법.
- 제 7 항에 기재된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르화 반응 또는 에스테르 교환 반응 방법.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 기재된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산 에스테르의 제조 방법.
- 제 7 항에 기재된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산 에스테르의 제조 방법.
- 제 10 항에 있어서,
폴리페놀과 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르, 또는 카로티노이드와 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르의 제조 방법인 제조 방법. - 제 11 항에 있어서,
폴리페놀과 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르, 또는 카로티노이드와 탄소수가 7∼15 인 중사슬 지방산의 에스테르의 제조 방법인 제조 방법.
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