KR101337564B1

KR101337564B1 - 항알러지 효과를 갖는 루비아딘과 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101337564B1
Application number: KR1020100095362A
Authority: KR
Inventors: 박성하; 김진준; 박병준; 고은아; 심미희; 이은정; 신용국; 노재균; 김명기; 박경희; 정철승; 이운장
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2013-12-06
Also published as: KR20120033699A

Abstract

본 발명은 루비아딘(Rubiadin)을 유효성분으로 함유하는 항알러지 효과를 가지는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 루비아딘을 포함하는 화장료 조성물은 β-hexosaminidase 분비 및 caspase-1 발현을 억제하여 항알러지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 나아가 세라마이드를 함유하여 보습효과를 통한 아토피 개선 효과를 나타낼 수 있는 화장료 조성물에 대한 것이다.

Description

항알러지 효과를 갖는 루비아딘과 이를 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic components comprised of the rubiadin having anti-allergy activity}

본 발명은 알러지에 대한 활성을 갖는 루비아딘과 이를 포함하는 알러지 예방 및 완화에 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 쥐 비만세포의 탈과립화시 β-hexosaminidase 및 히스타민 발현을 억제시키고 알러지 반응시 발생되는 caspase-1 발현을 억제하여 알러지 증상 완화에 유용한 루비아딘추출방법과 루비아딘을 이용한 항알러지 화장료 조성물에 관한 것이다.

알러지(allergy)란, 이물질에 대한 특이하고 변형된 반응을 나타내는 생화학적 현상이다. 이는 면역 불균형에 의한 민반응의 일종으로 알러젠(allergen)이라는 특정한 항원에 대하여 나타나는 반응으로, 그 항원에 대해 특이적인 IgE급 항체가 비만세포(mast cell)나 호염구(basophile)에 결합되어 유도되는 반응이다. 알러젠에 특이적인 IgE 항체가 많이 만들어지면 이들 항체는 비만세포나 호염구 표면에 있는 Fc수용체와 결합하게 되며, 여기에 알러젠이 결합하게 되면 이들 세포가 활성화되어 여러 가지의 생리활성 물질(사이토카인, 프로스타글란딘, 루코트리엔, 히스타민, 브래디키닌, 트립테이즈 등)이 분비되어, 혈관확장, 혈관의 침투성의 증가, 평활근 수축, 염증반응 등과 같은 변화가 유도된다. 이러한 반응은 이들 세포가 만들어내는 매개물질의 종류와 양에 따라 국소적으로 또는 전신적으로 나타날 수 있다. 질환으로는 알러지성 아토피, 전신 알러지, 알러지성 비염, 천식, 음식 알러지, 피부 알러지 등이 있다.

알러지 반응에 대해 자세히 알아보면, 히스타민은 히스티딘이 L-히스티딘 디카복시레이즈에 의해 디카복실레이션되어 형성되며, 비만세포나 호염구에 과립형태로 저장되어진다. 알러젠이 비만세포나 호염구에 결합하여 알러지 반응이 시작되면 세포가 탈과립되어 히스타민이 분비되어지며, 이때 β-hexosaminidase도 함께 분비되어진다. 이런 효소적 활성은 비만세포 탈과립의 척도로 사용될 수 있어 실험에 사용할 수 있었다.

또한, 자극물질에 대한 알러지 반응시 활성화되는 caspase-1에 대한 발현 억제 정도를 측정하였다.

한편, 아토피는 유아기에 주로 발생하여 태열이라고도 하며 주로 각질층내의 세라마이드(ceramides)의 함량이 감소됨에 따라 발생한다. 아토피는 각질층의 수분유지기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조되어 각질이 다량 일어나며, 피부장벽(skin barrier) 기능이 저하됨에 따라 정상피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질등 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 피부 알러지 등이 용이하게 발생하여 심한 소양증을 나타낸다. 그러므로 아토피 환자의 90% 이상이 포도상구균에 감염되어 있는데 이 균은 환자가 가려움을 참지 못해 긁어서 생기기도 하지만 최근의 보고에 의하면 이 세균의 외독소가 우리 몸의 면역체계를 자극하여 알러지를 일으키는 화학물질을 나오게 하여 아토피를 악화시킨다고 한다.

알러지 질환은 1979년 10만명 당 0.9명 였으나 1998년 1.4명으로 약 55.6% 정도 크게 증가하였으며, 그에 따라 질환 완화 및 예방에 대한 중요성이 부각되게 되었다. 기존에 사용되는 치료제로는 크게 스테로이드성 소염제 또는 비스테로이드성 소염제와 항히스타민제 또는 항류코트리엔제로 나눌 수 있으며, 전자는 대부분 강력한 면역럭제 작용을 가지므로 단기간 내에 일시적인 진정 효과를 나타낼 수 있지만 메스꺼움 등의 가벼운 부작용부터 성장 억제나 골다공증 등과 같은 심각한 부작용까지 있어 장기 복용에는 많은 문제가 따른다. 후자는 일시적인 완화 효과를 보일 수는 있으나, 졸림이나 어지러움 등의 부작용이 있어 사용에 제한이 따른다. 따라서, 체내 부작용이 적으며 항알러지 활성이 높은 천연 추출물에서 유래한 물질의 필요성이 대두되고 있다.

노니(Morinda citrifolia)는 화산 토양에 뿌리를 깊이 내리고 자라는 나무로, 작은 덤불 모양에서 부터 9m 정도 높이의 나무까지 다양한 모습을 하고 있다. 화산성 토질의 폴리네시아, 남태평양군도, 타이티(Tahiti), 하와이, 말레이시아, 중국 등지에서 알로베라, 켈프, 파파야 파크노제놀과 함께 민간요법의 전통 약제로널리 사용되며, 동의보감에는 해파극(海巴戟) 또는 파극천(巴戟天)으로 알려져 있다.

노니를 이를 이용한 선행발명의 예를 보면, 노니 초임계 추출물을 함유하는 화장료 조성물(대한민국 특허 10-09555720000), 노니 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지용화장료 조성물 (대한민국 특허 10-08442750000), 조직 배양한 노니 배양세포 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직 배양한 노니 배양세포 추출물의 제조방법(국내공개공보 10-2010-0102437), 피부 기능 재생 화장료(JO 2005-145945), 피부 또는 모발용 화장료(JP 2004-035454) 등의 선행연구가 이루어졌다. 그러나 항알러지 목적으로 사용된 것이 아니며, 단순히 노니 추출물을 함유시킨 조성물이라는 한계가 있었다.

이에, 본 발명자들은 노니에 함유된 루비아딘(Rubiadin)이 항알러지 효과가 있음을 확인하고, 루비아딘을 함유하는 것을 특징으로 하는 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 알러지 반응시 생성되는 히스타민, β-hexosaminidase 발현억제와 알러지 반응 시 발생되는 caspase-1 발현을 억제하여 알러지 증상 완화에 유용한 루비아딘과 이를 이용한 항알러지 화장료 조성물을 제조하는데 있다. 나아가 항알러지 화장료 조성물로서 아토피의 악화를 방지하게 하고, 이에 더하여 세라마이드를 구성요소로 더하여 아토피를 개선 효과를 부여함을 목적으로 한다.

본 발명은 루비아딘(Rubiadin)을 유효성분으로 함유하는 알러지 예방 및 완화에 효과가 있는 화장료 조성물을 제공한다.

노니는 루비아딘 이외에 제로닌, 프로제로닌, 세로토닌, 담나칸탈, 노르담나칸탈, 안트로키노즈, 카레노이드, 모르딘, 테르펜, 식물성 스테롤,시토스테롤, 알자린, 어솔릭산, 카프로의 산, 클루코피라노즈, 세로토닌 선구, 이소류신, 발린 등 60여 가지의 천연성분을 포함하는데, 본 발명은 그 중 루비아딘(Rubiadin)을 분리하여 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 루비아딘은 합성되거나 노니(Morinda citrifolia) 부정근에서 분리하여 이용하는데, 노니 추출물에서 분리하는 방법으로 Prep-LC(LC 8A, 시마즈)를 이용하여 노니 부정근의 용매 추출물 중 methylene chloride 층과 hexane층을 분리하고, 이 각층을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리하였다. 그리고, 분취된 성분을 UPLC로 분석하여 루비아딘임을 확인하였다. 구체적인 분취 및 분석조건의 내용은 실시예 1에서 나타내는 바와 같다.

본 발명에 있어서, 노니추출물은 당업계 공지의 다양한 추출용매 및 추출방법을 이용하여 얻을 수 있다. 이러한 추출용매의 바람직한 예로는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 부틸 아세테이트 등으로 이루어진 군에서 선택되는 단일 용매 또는 이들중 2종 이상의 혼합용매가 있다.

본 발명은 상기 루비아딘을 함유하는 화장료로서 알러지 예방 및 완화용 화장료 조성물에서, 루비아딘이 0.00001 내지 30 중량%, 특히 바람직하게는 0.0025 내지 0.01 중량% 함유된 것임을 특징으로 하는 것으로 처방예 1 내지 7에서는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 바디크림, 베이비 로션, 베이비 크림을 제조하였다.

본 발명의 알러지 예방 및 완화는 히스타민방출 억제, β-hexosaminidase 발현억제와 알러지 반응 시 발생되는 caspase-1 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 따라서 루비아딘의 항알러지 효능을 증명하기 위하여 실시예 4에서 루비아딘의 β-hexosaminidase 발현억제 효과와 실시예 5에서는 루비아딘의 caspase-1 발현을 억제 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 상기 분리한 루비아딘을 RBL-2H3 (rat basophilic leukemia)와 HMC-1(hunman mast cell) 세포에 대한 항알러지 효능평가를 측정하여, 이를 포함한 화장료 조성물을 제공한다.

실시예 2에서 루비아딘의 세포에 대한 독성 실험을 통하여 화장료에 대한 원료로서의 기본적인 적합성을 실험하였는바, 사람 섬유아세포를 배양하여 루비아딘이 2.5㎍/㎖ 이하의 농도에서는 세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인하여 기본적인 안전성을 확보하였다.

루비아딘은 항산화 작용을 가지는 데, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; Superoxide dismutase)는 초과산화이온이 가지고 있는 자유 라디칼 음이온은 세포에 해로운 영향을 미치기 때문에 SOD는 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔 줌으로써 독성으로부터 세포를 방어하는 역할을 한다. 산소에 노출되는 거의 모든 세포에서 이러한 SOD에 의한 항산화방어기작이 중요하며, 일부 유산균들의 경우 다른 방어기작을 사용하는 것으로 알려져 있다. 실시예 3에서는 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정을 통하여 루비아딘이 50㎍/㎖에서 SOD와 유사활성을 나타내는 것으로 항산화 효과를 확인하였으며, 나아가 과산화물로서 하이드록젠퍼옥사이드 제거 활성에 대하여 확인하였다.

구체적인 루비아딘의 항알러지에 대한 효과로서 실시예 4에서 RBL-2H3(Rat basophilic leukemia) 세포에 1mg/㎖ IgE 항체를 첨가하여 배양한 뒤 원심분리 한 상층액을 50㎕ 취하여 배양판에 옮겨 기질을 50㎕씩 넣고 반응시켜 마이크로플에이트 계수기 405nm에서 결과 값을 측정하였는바, 히스타민의 방출지표로 사용되는 β-hexosaminidase의 방출을 측정하였고, 루비아딘은 β-hexosaminidase을 억제 효과를 나타내어 그 항알러지 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다. 구체적인 실험조건 및 결과는 실시예 4와 같다.

또한, 루비아딘이 caspase-1의 발현을 억제함을 증명하기 위하여 Caspase-1 colormetric assay kit(R&D system)을 이용하여 caspase-1의 발현정도를 측정한 결과 루비아딘은 10㎍/㎖에서 caspase-1 발현을 억제함을 확인하였고, Western blotting 결과 pro-caspase-1의 발현 억제에 매우 높은 효과를 가짐을 확인하였고, 또한 active caspase-1의 발현 억제를 나타냄을 확인하였다. 구체적인 실험조건 및 결과는 실시예 5와 같다.

따라서, 본 발명의 항알러지 효과를 가지는 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클린저의 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품의 예로서 처방예 1 내지 7에서, 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 바디크림, 베이비로션, 베이비 크림에 대한 구체적인 조성을 나타내었다.

본 발명의 화장료에는 상기 루비아딘을 유효성분으로 하는 외에 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다.

한편, 본 발명에서 처방예 6 및 7은 루비아딘에 더하여 세라마이드를 구성요소로 포함하는데, 상기 확인한 루비아딘의 항알러지 효과에 따른 알러지에 의한 아토피 악화 방지 뿐만 아니라 세라마이드는 피부장벽 유사체로서 피부장벽 복원에 사용되며, 조성물 총중량에 대하여 1.0 내지 3.0 중량 %에서 피부의 각질형성 촉진 효과에 의한 우수한 피부보습효과제공으로 아토피 증상의 개선에 보다 효과적이다.

본 발명에서 1,3 부틸렌글리콜을 더 포함하는 유연화제수, 에센스, 영야크림, 바디크림에 있어서, 1,3 부틸렌글리콜은 다가알코올의 고분자 보습제의 일종으로서 비교적 자극이 덜하며, 끈적임이 적은데, 이는 항미생물 효과를 가지고 있다. 글리세롤, 솔리톨, 프포릴렌 글리콜과 비교했을때 1,3 부틸렌글리콜이 가장 효과적인 항미생물 물질이다.

루비아딘은 히스타민 생성 관련 효소인 β-hexosaminidase와 히스타민 유리 억제 및 caspase-1의 발현을 억제하여 항알러지 효과를 가지며, 나아가 항산화 및 과산화물로서 하이드록젠퍼옥사이드 제거에 효과가 있다. 따라서 이를 포함한 화장료 조성물은 알러지의 예방 및 완화 등에 효과를 가질 수 있다. 나아가 이에 세라마이드를 더한 경우 보습효과를 통한 아토피 증상 개선에 효과가 있다.

도 1은 루비아딘의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 5에서 caspase-1 발현측정의 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 5에서 Western blotting에 있어서 X-ray film으로 현상한 결과를 나타낸 것이다.

실시예 1. 노니로부터 루비아딘의 분리

노니 부정근의 용매 추출물 중 항알러지 효과를 보이는 methylene chloride 층과 hexane 층을 Prep-LC(LC 8A, Shimadzu)로 분리하였다. 용매 분획물 10mg을 10ml의 methanol에 용해 후 0.2um syringe filter로 여과하여 5ml를 주입하였다. Prep-LC 분취 조건은 column은 ODS C18(300 x 250mm, Shimadzu), 이동상은 농축을 고려하여 100% methanol로 하였다. 유속은 15ml/min으로 하였다. 그리고, hexane 층과 methylene chlorine 층의 HPLC로 분리하였으며, 분리 조건은 아래의 표 1과 같다.

Parameter	Condition
HPLC	Prominance 20A( Shimadzu , Japan )
Mobile phase	MeOH : water = 70 : 30
Column	ODS C18(4.6 x 250 mm )
Wavelength	280 nm
Injection vol .	20 ul
Oven temp .	30℃
Flow rate	1 ml / min

HPLC condition for analysis of fraction .

HPLC로 분취된 성분은 UPLC(20A, Shimadzu)로 분석하였다. 분석조건은 70% methanol, column은 VP-ODS(3 x 75mm, Shimadzu), 유속은 0.1ml/min, 분석파장은 280nm로 하였다. 분취된 FRH2, FRM3를 GC/MS/MS(320MS, Varian)로 분자량 및 fragment를 확인하였다. GC/MS/MS 분석조건은 DB5(30m x 0.25mm id x 0.25um) 컬럼을 사용했다. 주입구 온도는 230℃, 유속은 1ml/min, column oven 온도는 80℃에서 2min간 유지 후, 10℃/min 씩 250℃까지 승온 후, 10 분간 유지하였다. EI-MS는 transfer line 온도는 210℃, source 온도는 180℃, 70eV에서 분석하였다.

피크가 가장 큰 FRH2, FRM3를 HPLC, GC/MS/MS, IT-TOF, UV/VIS의 분석결과 rubiadin임을 확인하였다. Rubiadin의 구조는 도 1과 같다.

실험에 필요한 루비아딘은 Chromadex (미국) 제품을 사용하였다.

실시예 2. 세포독성실험

2-1. 실험 방법

본 발명에 따른 루비아딘에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 사람 섬유아세포 (Human fibroblast cell)을 5x10⁴ cells/ml 농도로 하여 96well plate에 200㎕ 씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 1일 동안 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 IMDM(lscove's Modified Eagle Medium, Gibco)를 이용하였다. 배양 한 후 소혈청과 항생제가 배제된 IMDM 배지로 교체한 후, 시료를 농도 별로 첨가한 후, 같은 배양조건에서 45시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 5㎎/㎖ MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 시약을 첨가하여 동일 조건에서 3시간 배양한다. 그 후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimetyl sulfoxide)을 150㎕씩 넣은 후 10분 동안 쉐이킹 한 다음 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 570nm 에서 결과값을 측정하였으며, 그 값은 아래의 표 2와 같다.

2-2. 실험 결과

Rubiadin
시료 (㎍/㎖)	대조군	0.1	0.5	1	2.5	5
세포 증식율 (%)	100	118	99.6	108.4	89.5	78.7

상기 표 1에서와 같이 루비아딘 0.1㎍/㎖과 1㎍/㎖에서는 오히려 세포 증실율이 증가하였으며, 루비아딘은 2.5㎍/㎖ 이하의 농도에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 3. 루비아딘의 항산화 효과

3-1. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; Superoxide dismutase) 유사활성 측정

3-1-1. 실험 방법

SOD 유사활성은 측정은 각 추출물 당 100ppm의 농도별 시료용액 20㎕에 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 분석 키트(SOD assay kit-WST) 내 더블류에스티 작업용액(WST working solution) 200㎕을 넣어 교반 한 후, 다시 효소작업용액(Enzyme working solution) 20㎕를 넣어 혼합한 후, 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시키고, 마이크로플레이트 계수기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.실험 대조구로는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase, 1,000units)을 사용하였으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유사활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

3-1-2. 실험 결과

시료(㎍/㎖)	50	25	10
Rubiadin	29.1%	5.4%	0.8%

상기 표 3에서와 같이 루비아딘은 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 슈퍼옥사이드 디스큐타제 유사 활성을 나타냄을 확인하였다.

3-2. 하이드로젠 퍼록사이드 제거 효과

3-2-1. 실험 방법

하이드로젠 퍼록사이드 제거 효과 실험은 96well 플레이트에 각 농도별 루비아딘 20㎕, 10mM 하이드로젠 퍼록사이드 20㎕, 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 5) 100㎕ 넣고 37℃에서 5분 반응시킨 후 1.25mM ABTS와 1U/㎖ 퍼록시데이즈 30㎕를 넣고 37℃에서 10분 반응시킨 후 405nm 에서 흡광도를 측정하였다.

3-2-2. 실험 결과

시료(㎍/㎖)	50	25	10
Rubiadin	50.3%	31.4%	14.5%

상기 표 4에서와 같이 루비아딘은 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 하이드로젠 퍼록사이드 제거 활성을 나타냄을 확인하였다.

3-3. 하이드록실 라디칼 제거 효과

3-3-1. 실험 방법

하이드록실 라디칼 제거 효과 실험은 96well 플레이트에 각 농도별 루비아딘 200㎕, 10mM 황산제일철 200㎕, 10mM 이디티에이 200㎕, 10mM 데옥시리보즈 200㎕, 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.4) 1200㎕, 10mM 과산화수소 200㎕를 넣고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 2.8% TCA, 1% TBA을 각각 1ml 넣고 10분간 끓여준다. 원심분리하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.

3-3-2. 실험 결과

시료(㎍/㎖)	50	25	10
Rubiadin	41.5%	20.0%	6.8%

상기 표 5에서와 같이 루비아딘은 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 하이드록실 라디칼 제거 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4. 루비아딘의 β- hexosaminidase 억제 효과

4-1. 실험방법

RBL-2H3 (Rat basophilic leukemia) 세포를 10% 소혈청과 1% 항생제가 포함된 MEM(Modified eagle medium, Sigma) 배지를 사용하여 세포수가 5x10⁵ cells/ml 이 되게 계수한 후, 1㎎/㎖ IgE 항체를 첨가하여 24웰 배양판에 분주한 후 37℃, CO₂인큐베이터에서 24시간 배양한다. 배양 후 배양액을 제거하고 피비에스 용액 1ml으로 2회 세척한 후, 릴리징 버퍼 260㎕와 시료를 농도 별로 넣은 후 동일 조건에서 10분 배양한다. 여기에 비에스에이를 넣고 동일조건에서 1시간 배양한다. 배양이 끝나면 200㎕씩 취하여 300알피엠, 5분간 원심 한 후, 상층액을 50㎕씩 취하여 96웰 배양판으로 옮긴 다음 기질을 50㎕씩 넣고 동일 조건에서 30분 반응시킨 다음 100mM 카보네이트 버퍼 150㎕ 넣고 5분간 쉐이킹하여 마이크로 플레이트 계수기 405㎚에서 결과 값을 측정하였다.

4-2. 실험결과

농도 (㎍/㎖)	루비아딘 (%)
대조군	66.9
12.5	64.1
25	84.0
50	76.8

표 6과 같이 루비아딘의 β-hexosaminidase 방출 억제효과가 매우 뛰어남을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 유효성분인 루비아딘이 비만세포의 탈과립 현상을 억제하여 알러지 유발을 저해할 수 있음을 나타내는 것으로 항알러지 효과가 매우 뛰어난 것으로 확인된다.

(대조군은 케토티펜 푸마레이트(ketotifen fumarate)를 사용하였다. 케토티펜 푸마레이트는 항히스타민제로 사용된다.)

실시예 5. 루비아딘의 caspase -1 억제 효과

5-1-1. Caspase-1 colormetric assay

HMC-1(Human mast cell) 세포를 10% 소혈청과 1% 항생제가 포함된 IMDM(lscove's Modified Eagle Medium, Gibco) 배지를 사용하여 세포수가 6x10⁶ cells/ml 이 되게 계수한 후, 배양판에 분주한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 10분 안정화하였다. 배양 후 루비아딘을 처리하고 동일 조건에서 1시간 배양한다. 자극제를 처리하고 2시간 동일 조건에서 배양한 후 라이시스 버퍼를 사용하여 세포에서 단백질을 분리한다. Caspase-1 colormetric assay kit (R&D system)을 사용하여 caspase-1 발현 정도를 측정한다.

5-1-2. 실험 결과

도 2에서 보는 봐야 같이 루비아딘은 10 ㎍/㎖ 농도에서 caspase-1 발현을 억제함을 확인하였다.

5-2-1. Western blotting

5-1-1에서 분리한 단백질을 가지고 실험하였다. 12% SDS-PAGE 를 이용해 전기영동하고, PVDF membrane으로 이전시켰다. 5% skim milk가 함유된 tris 완충용액에서 1시간 bloking 과정을 거친 후, caspase-1과 β-actin 항체를 각각 반응시켰다. Horseraldehyde peroxidase (HRP)가 결합된 항체를 가하고, enhanced chemiliminescent (ECL, amersham, UK) kit를 사용하여 1~3분 동안 반응시킨 후 X-ray film으로 현상하였다.

5-2-2. 결과

도 3에서 보는 봐야 같이 루비아딘은 10 ㎍/㎖ 농도에서 pro-caspase-1과 active caspase-1의 발현을 억제함을 확인하였고, 특히 pro-caspase-1의 발현 억제에 높은 효과를 나타내었다.

6. 처방예

본 발명의 루비아딘을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 제제의 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

처방예 6-1

루비아딘을 함유한 화장료 중 유연화장수의 처방 예 표 7과 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.5
글리신	3.0
디포타슘글리시리제이트	0.1
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
에탄올	5.0
항산화제	0.1
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

처방예 6-2

루비아딘을 함유한 화장료 중 영양화장수의 처방예는 표 8과 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
글리세린	7.0
소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트	2.0
미네랄 오일	4.0
트리옥타노인	1.0
스테아릭에씨드	1.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
소르비탄모노스테아레이트	1.0
디메치콘	0.5
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
카보머	0.2
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

처방예 6-3

루비아딘을 함유한 화장료 중 에센스의 처방 예는 표 9와 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
글리세린	5.0
1,3-부틸렌 글리콜	2.0
폴리에칠렌 글리콜	2.0
카보머	1.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	3.0
폴리아크릴아마이드	2.0
히드록시에칠셀룰로이즈	0.2
에탄올	3.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
폴리옥시에칠렌경화피마자유	1.0
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

처방예 6-4

루비아딘을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방 예는 표 10과 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
하이드로제네이티드 레시친	1.0
옥틸도데카놀	3.0
트리옥타노인	2.0
스테아릭에씨드	1.5
세토스테아릴알콜	2.0
폴리솔베이트60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	2.0
디메치콘	3.0
항산화제	0.3
산탄검	0.2
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

처방예 6-5

루비아딘을 함유한 화장료 중 바디크림의 처방 예는 표 11과 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
글리세린	7.0
1,3-부틸렌 글리콜	3.0
스쿠알렌	3.0
디메치콘	3.0
소듐히아루로네이트	0.1
글리신	2.0
폴리아크릴아마이드	5.0
항산화제	0.3
트리에탄올아민	0.1
EDTA	0.1
방부제	적량
정제수	잔량

처방예 6-6

루비아딘을 함유한 화장료 중 베이비 로션의 처방 예는 표 12와 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
글리세린	5.0
판테놀	4.0
세라마이드	0.1
피토스팅고신	0.1
세테아릴알코올	0.5
인지질	1.0
스테아릭산	0.5
동백유	7.0
쉐어버터	1.0
소듐콜리아크릴레이트(5% 분산액)	10.0
복합 방부제	0.5
정제수	잔량

처방예 6-7

루비아딘을 함유한 화장료 중 베이비 크림의 처방 예는 표 13과 같다.

성분	함량(중량%)
루비아딘	0.001
글리세린	5.0
판테놀	4.0
세라마이드	0.5
피토스팅고신	0.5
세테아릴알코올	1.0
인지질	3.0
스테아릭산	1.5
동백유	16.0
쉐어버터	2.0
소듐콜리아크릴레이트(5% 분산액)	15.0
복합 방부제	0.5
정제수	잔량

Claims

항알러지 효과를 갖는 루비아딘(Rubiadin)이 유효성분으로 조성물 총중량에 대하여 0.00001 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 루비아딘은 노니 부정근으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 루비아딘(Rubiadin)은 조성물 총 중량에 대해 0.0025 내지 0.01 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
디포타슘글리시리제이트 0.01 내지 1.0 중량%;
1,3-부틸렌 글리콜 0.3 내지 10.0 중량%;
소듐히아루로네이트 0.01 내지 1.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
소르비탄스테아레이트 슈크로오즈코코에이트 0.2 내지 8.0 중량%;
트리옥타노인 0.01 내지 5.0 중량%;
스테아릭에씨드 0.01 내지 5.0 중량%;
소르비탄모노스테아레이트 0.1 내지 5.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
1,3-부틸렌 글리콜 0.2 내지 10.0 중량%;
폴리에틸렌글리콜 0.2 내지 10.0 중량%;
카보머 0.1 내지 5.0 중량%;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
1,3-부틸렌 글리콜 0.3 내지 15.0 중량%;
하이드로제네이티드 레시친 0.1 내지 4.0 중량%;
트리옥타노인 0.2 내지 8.0 중량%;
스테아릭에씨드 0.1 내지 7.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
1,3-부틸렌 글리콜 0.3 내지 15.0 중량%;
소듐히아루로네이트 0.01 내지 1.0 중량%;
폴리아크릴아마이드 0.05 내지 20.0 중량%;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항알러지 효과를 갖는 루비아딘 이외에 주요성분으로서,
세라마이드 0.01 내지 5.0 중량%;
피토스팅고신 0.01 내지 5.0 중량%;
인지질 0.1 내지 4.0 중량%;
스테아릭산 0.05 내지 2.5 중량%;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(a) 건조된 노니 부정근에 대하여 물 또는 알코올, 아세톤, 클로로포름 및 1,3-부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 하여 노니 추출물을 제조하는 단계;
(b) 노니 부정근 용매 추출물 중 methylene chloride 층과 hexane 층을 Prep-LC로 분리하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에 의해 분리된 hexane 층과 methylene chlorine 층을 HPLC로 각각 분리하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 HPLC로 분취된 성분을 UPLC로 분석하여 루비아딘을 확인하는 단계;를
포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 노니 부정근 용매 추출물로부터 루비아딘을 분리하는 방법.