KR101336023B1 - 신경세포 성장 조절용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포 성장 조절용 조성물에 관한 것이다. 이는 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에 따르면, 예컨대 알츠하이머 증후군 또는 파킨슨 증후군과 같은 퇴행성 신경질환의 치료제로서 비용이 저렴하면서도 부작용이 없는 새로운 치료제의 제공이 가능하다는 등의 현저한 효과가 있다.

Description

신경세포 성장 조절용 조성물 {A Composition For Controlling the Growth of Nerve Cells}

본 발명은 일반적으로 신경세포의 성장 조절에 관한 것으로, 더 상세하게는, 예컨대 애기뿔소똥구리와 같은 곤충으로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 하여 부작용없이 신경세포 성장과 증식을 촉진하거나 세포사멸 과정을 억제할 수 있도록 한 새로운 신경세포 성장 조절용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 알츠하이머 증후군과 파킨슨 증후군 등은 퇴행성 신경질환으로서 발병기작 규명은 물론 치료제 개발이 미비한 난치성 질환이다. 현대사회 발달과정에서 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경질환은 사회적 문제로까지 크게 대두되고 있다.

현재까지 알츠하이머 증후군은 senile plaque의 침착, neurofibrillary tangle의 형성과 신경세포사멸 등이 주요 원인과정으로 보고 있다. β-amyloid peptide(A)의 형성 및 침착과정 그리고 침착된 A에 의해 초래되는 신경세포 독성유발기전에 대한 연구가 많이 진행되어 왔다. 또한 산화적 스트레스가 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군과 같은 중추신경계의 퇴행성 뇌 질환의 중요한 요인으로도 고려되어 그 발생과정을 차단하는 치료제 개발을 시도하고 있다. 임상적으로는 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해서, 항산화물 처리, 세포이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 동시에 나타내고 있는 것이 현실이다.

뇌 조직의 경우 일단 손상이 되면 기능 회복이 어렵기 때문에 퇴행성 신경질환에 있어서 신경세포를 보호하거나 남아있는 신경세포의 생장을 촉진하여 감소한 신경세포의 수적 보상을 유도할 수 있는 새로운 기술 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 요구에 부응하기 위하여 현재 많은 선도적 연구기관에서 줄기세포를 이용하는 새로운 기술이 제안되고 있다. 예컨대 국내의 메디포스트에 의하여 제대혈에서 추출한 간엽줄기세포를 이용하여 신경세포의 재생과 증식을 유도하는 기술이 발표된 바 있고, 2011년 현재 미국을 비롯한 6개국 15개 기관에서 신경세로포 분화유도 가능한 줄기세로 72종이 확립되어 있으며, 국내의 미즈메디에서는 신경세포로 분화 유도후 치료로 사용할 수 있는 줄기세포 7종을 확립한 바 있다. 그런데 이와 같이 줄기세포를 이용하는 기술은 개발 비용이 크고 부작용이 심하다는 문제가 있었다.

그러므로 뇌 세포와 같은 중추신경계에 발생하는 퇴행성 신경질환의 치료를 위하여 개발 비용이 저렴하면서도 부작용 없이 신경세포의 생장과 증식을 촉진하고 세포사멸을 억제할 수 있는 새로운 기술에 대한 요구는 여전히 존재한다.

본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하고 여러 가지 다른 장점들을 추가하기 위하여 안출된 것으로서, 특히 발명자들은 종래의 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해서 임상적으로 시행되는 항산화물 처리나 세포이식 그리고 외과적 수술 등은 이미 치료효과가 낮고 다양한 부작용들을 유발한다는 점, 따라서 새로운 치료적 접근으로서, 신경세포에는 무독성을 나타내며, 신경 줄기세포들에 대해서 선별적으로 성장과정을 촉진할 수 있는 약물을 개발하여야 할 필요가 있다는 점, 동시에 세포자살 과정이 이미 진행되고 있는 신경세포들에 작용하여 자살과정을 억제해 줌으로서 남아있는 신경세포를 보호하는 물질을 분리해낸다면 해당 질환에 치료제로 적용이 가능할 것이라는 점 등에 착안하였다.

본 발명은 특히 예컨대 애기뿔소똥구리와 같은 곤충으로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 하여 개발비용이나 별다른 부작용없이 신경세포 성장과 증식을 촉진하거나 세포사멸 과정을 억제할 수 있도록 한 새로운 신경세포 성장 조절용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적은 본 발명에 따라 제공되는 신경세포 성장 조절용 조성물에 의하여 달성된다.

본 발명의 일 양상에 따라 제공되는 신경세포 성장 조절용 조성물은 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 함유한다.

일 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)는 신경세포의 성장을 촉진하는 조절자이다.

다른 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)는 신경세포의 세포사멸(programmed cell death)를 억제하는 조절자이다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 신경세포는 뇌세포이다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)는 D-type이다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)는 곤충으로부터 유래하며, 바람직하게는 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리한 것이다.

또 다른 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 또는 헌팅턴 증후군과 같은 중추신경계의 퇴행성 신경질환의 치료에 이용할 수 있다.

그리고 또 다른 실시예에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)는, 애기뿔쇠똥구리에서 분리한 항생 펩타이드 코프리신(Coprisin) (43 아미노산)의 알파-나선 부위에 위치하는 9개 아미노산을 선정하여 추가 합성하고, 다시 9개 아미노산 중에서 히스티딘을 루신으로 추가 치환하며, 마지막으로 9-mer coprisin analogue 서열 중간에 위치하는 시스테인의 티올 잔기를 이용하여 이량체로 합성하여 제조되는 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.

상술한 구성을 가지는 본 발명에 따르면, 애기뿔소똥구리와 같은 곤충으로부터 추출한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 하여 개발비용이나 별다른 부작용없이 신경세포 성장과 증식을 촉진하거나 세포사멸 과정을 억제할 수 있는 새로운 신경세포 성장 조절용 조성물이 제공될 수 있어, 퇴행성 신경질환의 치료를 위한 비용이 저렴하면서 부작용이 없는 새로운 치료제의 개발 가능성을 제공한다는 등의 현저한 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경세포 성장 조절 조성물의 주 성분인 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)의 펩타이드 서열을 예시하는 개략도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경세포 성장 조절 조성물의 주 성분인 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)의 자극 농도변화에 따른 SH-SY5Y 신경세포의 성장률 증가를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경세포 성장 조절 조성물의 주 성분인 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)의 SH-SY5Y 신경세포에 대한 세포 무독성을 보여주는 그래프.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경세포 성장 조절 조성물의 주 성분인 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)의 Okadaic acid-유발 신경세포 사멸과정에 대한 억제효과를 보여주는 그래프.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구범위에 의해 한정된다.

본 발명의 실시예를 설명함에 있어 이미 공지되어 있는 기능이나 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하 도면을 참고로 하여 본 발명의 구체적인 실시예에 따른 신경세포 성장 조절용 조성물을 설명한다.

본 발명에서는, SH-SY5Y 신경세포에 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3를 처리한 다음 생장 촉진 효과를 확인하였다.

이를 위해 SH-SY5Y 신경세포를 96-well plate에 1 X 10⁴ 개로 seeding한 후 48시간 동안 인큐베이터(incubator)에서 배양하고 (37 , 5% CO) CopA3를 10 μg/ml 농도로 24시간 동안 처치하고 BrdU assay Kit를 이용하여 proliferation 변화를 측정하였다 또한 증식하는 세포 수를 현미경으로 측정하는 증식변화 측정실험도 병행 하여 수행하였다.

또한 CopA3가 SH-SY5Y 신경세포에 직접적으로 세포독성을 초래하는지를 확인하기 위해서 10 μg/ml 농도의 CopA3를 처치하고 48시간동안 배양 유지한 다음 MTT assay를 수행하였다. 독성물질에 노출시에 나타나는 세포의 형태적 변형도 시간별로 측정하였다.

마지막으로 SH-SY5Y 신경세포에 대하여 apoptosis를 유발하는 것으로 알려진 okadaic acid (OA)를 처치하고 OA-유발 세포사멸 과정을 CopA3가 억제할 수 있는지 확인해 보았다. 이를 위해 신경세포에 CopA3를 1시간 전처치리 한 다음 OA를 1 μM의 농도로 처리 후 66시간 배양하였다. 그 후에 MTT assay를 수행하여 세포사멸 정도를 평가하였다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는 다는 것은 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 인간이나 포유동물의 신경세포에 대해 생장 촉진 작용이 있는 본 발명에 의한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 뇌 질환 관련 치료제의 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

실시예 1: 코프리신과 CopA3의 펩타이드 서열

발명자들은 애기뿔쇠똥구리에서 분리한 항생 펩타이드 코프리신(Coprisin) (43 아미노산)의 알파-나선 부위가 항생효과를 나타내는 부위임을 확인하였다. 이를 바탕으로 알파-나선부위에 위치하는 9개 아미노산을 선정하여 추가 합성하였으며 여전히 강한 항생효과를 보임을 확인하였다. 발명자들은 다시 9개 아미노산 중에서 히스티딘을 루신으로 추가 치환하였으며 항생효과가 증가함을 확인하였다. 마지막으로 9-mer coprisin analogue 서열 중간에 위치하는 시스테인의 티올 잔기를 이용하여 이량체로 합성하여 신경세포에 대한 효능을 평가하고자 하였다. 이량체로 최종 합성된 본 펩타이드는 CopA3로 명명하였으며, 본 발명과정에서 사용한 모든 펩타이드는 CopA3이다.

실시예 2: SH-SY5Y 신경세포에 대한 CopA3의 생장촉진 효과

SH-SY5Y 신경세포를 96-well plate에 seeding하고 CopA3을 10 μg/ml의 농도로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포 생장률 변화를 측정하기 위해 Exalpha Biological사의 BrdU Cell Proliferation Assay Kit를 구매하여 사용하였다. 도 1의 (A)에서처럼, CopA3을 처리한 SH-SY5Y 신경세포의 DNA 합성률 (cell proliferation, 세포생장률)이 30% 이상 증가하는 것으로 확인되었다. 도 2의 (B)는 세포증식률 변화를 평가하기 위해서 현미경으로 증가하는 세포 수를 측정하는 실험방법을 보여주고 있다. 이 실험은 단위 시간당 현미경 측정 면적 내에서 증가하는 세포 수를 나타내게 된다. 이를 위해 신경세포에 CopA3를 1, 5, 10, 20 μg/ml가 되도록 처리한 후 시간에 따른 신경세포 수 증가를 확인하였다. 도면2의 (B)에서처럼, CopA3 자극은 농도 의존적으로 신경세포의 세포 수를 증가시키는 것으로 확인되었다 (대조군에 비해 약 30% 이상의 세포 수 증가). 10 μg과 20 μg 농도의 CopA3에서는 생장률 증가 차이가 나타나지 않았으며 이는 신경세포 성장촉진을 유도하는 CopA3의 최대농도가 10 μg임을 보여준다.

실시예 4: SH-SY5Y 신경세포에 대한 CopA3의 독성 효과 평가

CopA3을 고농도 (200 μg/ml)로 처리하였을 때 다양한 혈액암 세포주들에서 세포사멸을 유도한다는 기존 보고가 있기 때문에, 신경세포에 대한 CopA3 (10 μg/ml)의 세포독성 여부를 평가하고자 하였다. 이를 위해 CopA3을 12, 24, 48시간 처리 후 MTT assay를 수행하였다. 대조군에 비해 CopA3 처치군에서 세포 건강도가 (cell viability)가 유의하게 증가함을 확인하였다. 이 상의 결과는 10 μg 농도의 CopA3가 SH-SY5Y 신경세포에 세포독성을 야기하지 않음을 의미한다.

세포독성에 따른 신경세포의 형태변형 유무를 확인하고자 CopA3를 처치한 다음 세포모양 변화를 시간별로 현미경으로 관찰하였다. 도 3의 (B)에서처럼, CopA3 자극은 신경세포의 축삭이나 수상돌기의 형태적 변형을 야기하지 않았다. 이 결과는 앞서 결과와 마찬가지로 CopA3가 SH-SY5Y 신경세포에 독성효과가 없으며 형태적 변형을 유발하지 않음을 보여준다.

실시예 6: Okadaic acid-유발 신경세포 사멸과정에 대한 CopA3의 억제효과 평가

SH-SY5Y 신경세포에 대해서 apoptosis를 유발하는 것으로 알려진 Okadaic acid를 처치하여 세포사멸과정을 유도한 다음 CopA3의 억제효과를 검증해보고자 하였다. 이를 위해, CopA3를 1시간 전 처치 한 다음 1 μM OA를 66시간 처리하고 MTT assay를 수행하여 세포사멸 정도를 평가하였다. 앞서 도 3의 (A)에 보여지는 결과에서처럼, CopA3 단독 처치는 신경세포의 세포건강도의 유의하게 증가시켰다. OA의 경우, 처치 48시간 경과 후에 세포건강도가 50% 이상 감소하였다. 그러나 CopA3를 전처치하고 OA를 처치한 그룹의 경우 세포건강도 감소가 전혀 관찰되지 않았다. 이 결과는 신경세포의 생장률을 증가시키는 CopA3의 효능이 OA 자극으로 초래되는 세포건강도 감소를 낮아지게 할 수 있음으로 보여주고 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명을 통해 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리한 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3(D-type 아미노산, a 9-mer disulfide dimer)가 SH-SY5Y 신경세포의 생장과 증식을 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 또한 CopA3가 신경세포에 대해서 세포독성을 전혀 보이지 않음도 확인하였다. Okadaic acid를 처치하여 유발시킨 신경세포 사멸과정 역시 CopA3 전 처치로 인해 유의하게 저해됨을 확인하였다. 본 발명에 따라, 신경세포의 생장을 촉진하고 세포자살 과정을 억제하는 CopA3의 독특한 효능을 이용한다면 알츠하이머 증후군 또는 파킨슨 증후군 등과 같은 퇴행성 신경질환의 치료제 개발이 가능하다는 등의 현저한 효과를 제공할 수 있다.

Claims (9)

1. 삭제
2. 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(9-mer disulfide dimer)를 유효 성분으로 함유하며,
   

   

   
   상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3는 신경세포의 성장을 촉진하는 조절자인 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
3. 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3를 유효 성분으로 함유하며,
   

   

   
   상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3는 신경세포의 세포사멸(programmed cell death)를 억제하는 조절자인 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서, 상기 신경세포는 뇌세포인 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
5. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3는 D-타입인 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
6. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3는 곤충으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3를 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리한 것을 특징으로 하는 신경세포 성장 조절용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제

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