KR101021226B1 - 급성위막성대장염 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 유효 성분으로 함유하는 급성위막성대장염(Pseudomembranous colitis) 치료용 조성물에 관한 것이다.
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본 발명에 따르면, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 Bifidobacterium과 Lactobacillus와 같은 대장 유용미생물들에게는 항생효과가 전혀 없으며 병원성 미생물인 Cd균에 대해서 특이적으로 항생효과를 나타낸다. CopA3(HL)에 의한 Cd균 성장억제 효과는 동물실험에서도 검증되었으며, Cd균 유발 장내염증과 융모괴사 과정들이 효과적으로 완화된다.
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본 발명에 따르면, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 Bifidobacterium과 Lactobacillus와 같은 대장 유용미생물들에게는 항생효과가 전혀 없으며 병원성 미생물인 Cd균에 대해서 특이적으로 항생효과를 나타낸다. CopA3(HL)에 의한 Cd균 성장억제 효과는 동물실험에서도 검증되었으며, Cd균 유발 장내염증과 융모괴사 과정들이 효과적으로 완화된다.
Description
본 발명은 현재 제한된 항생제들을 (metronidazole과 vancomycin) 이용해 치료를 수행하고 있는 Clostrdium difficile균 (Cd균)-유발성 급성위막성대장염의 새로운 치료제로서 코프리신 펩타이드 유도체 CopA3(HL)의 용도에 관한 것이다.
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본 발명은 애기뿔소똥구리로부터 분리된 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 급성위막성 대장염을 일으키는 Cd균에 대한 항생효과가 매우 강함을 제시하는 것이다. 1970년대 후반에 Cd균이 위막성대장염의 원인균으로 밝혀졌다 (Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 항생제 연관성 설사 중 Cd균이 원인균으로 증명된 경우는 15∼20% 정도이며, 증상의 발현은 무증상 보균상태에서부터 중증 위막성대장염까지 다양하다 (Pothoulakis C and LaMont JT. Gastroenterol Clin North Am 1993;22:623). 건강한 성인의 5%, 건강한 소아의 30%, 병원입원환자의 30%에서 대변배양 검사상 Cd균이 발견된다고 보고된 경우가 있다. 지금까지 Cd균에 의한 설사와 위막성대장염 발병 메커니즘은 항생제의 사용으로 인하여 장내 정상 세균총수가 감소하는 것이 주요한 첫 번째 원인으로 고려되어 왔다. 유산균과 같은 장내 유용미생물수의 감소는 Cd균의 이상 증식을 허용하게 되고 colonization한 Cd균은 톡신 단백질들(톡신 A와 톡신 B)을 분비하여 대장 상피세포의 세포사멸을 초래하거나 세포투과성을 증가시키게 되어 지속적인 염증을 유발하는 것으로 알려져 왔다(Lamont JT. Trans Am Clin Climatol Assoc 2002;113:167-80). 300 kDa 분자량의 톡신A는 동물과 인체대장에 (human genograft)에 주입되면 광범위한 장점막 손상을 야기하는 것으로 검증되어왔으며 급성염증반응과 액틴을 포함하는 세포골격계 이상을 초래하는 것으로 또한 밝혀졌다. 톡신B의 경우에는 배양세포에 대한 세포독성이 톡신A 에 비해 100배 이상 강한 것으로 확인되었지만, 톡신A와는 달리 쥐나 토끼의 대장 내 주입 시에 세포투과율 증가나 대장 상피세포 사멸과정 등을 야기하지 못하는 것으로 보고되어왔다 (Castagliuolo I and Kelly CP. Am J Physiol 1997;273:G333-41). 그러나 인간의 대장조직에서 톡신B 주입이 급성염증을 야기함이 최근 보고에서 확인되었다. 이는 사람의 대장 내에서 톡신A와 톡신B 모두가 위막성대장염의 주요 조절자로 작용함을 의미한다.
위막성대장염의 임상적인 증상으로는 고열과 점액성 혹은 수액성 설사를 동반한다는 점이다. 또한, 심한 복통과 장운동 감소 등이 나타날 수 있으며 혈액검사상 50,000/m2 이상의 백혈구 과다증과 단백소실성 장병증으로 초래된 저알부민혈증 등이 관찰될 수 있다고 알려져 있다. 심한 경우에는 쇼크, 흉막삼출, 복수, 거대결장, 대장천공 및 복막염, 2차적 패혈증 등이 발생하여 사망에까지 이르게 하기도 한다고 보고되었다 (Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 진단방법으로는 세포배양법을 이용하여 대변 내 톡신단백질을 검출하는 것이다. 위막성대장염 환자의 95%에서 톡신A나 톡신B가 검출되기 때문에 Cd균이 원인균임을 동정하기가 쉽다. 아울러 경제성이 높고 결과를 빠른 시간 내에 확인할 수 있는 EIA (Enzyme immunoassay) 방법을 수행할 수도 있다.
위막성대장염의 치료로는 원인이 되는 항생제를 중단하는 것과 수액 요법 전해질 교정 등의 보존적 치료를 병행해야 하며 환자의 상태가 위중할 때는 vancomycin을 투여하는데 균의 세포내 침투가 아니고 장관 내 세균에 의해 생성되는 톡신에 의해 기인된 경우에는 metronidazole이나 vancomycin을 경구 투여하는 것이 좋은 결과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 최근 문헌에서 살펴보면 vancomycin이 metronidazole에 비해 그 치료효과가 큰 것으로 보고되었다 (Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 경구 투여가 불가능한 경우에는 직장을 통해 주입하는 것이 추천될 수 있으며 대장균총을 정상화하기 위하여 Yogurt, Lactobacilli 장내 주입도 치료에 도움을 주는 것으로 보고되고 있다.
그러나 현재 임상적으로 선택 가능한 항생제인 metronidazole에 대한 내성세균이 이미 30% 이상 보고되고 있어 문제가 되고 있다. vancomycin 역시 치료를 위한 항생제로 고려되고는 있지만 모든 그람양성 세균성 감염질환에 대한 마지막 항생제라는 가치로 인해서 임상적 적용이 자유롭게 이뤄지지 않는 문제들을 감안하면, 새로운 항생제 개발이 시급한 실정이다.
위막성대장염의 임상적인 증상으로는 고열과 점액성 혹은 수액성 설사를 동반한다는 점이다. 또한, 심한 복통과 장운동 감소 등이 나타날 수 있으며 혈액검사상 50,000/m2 이상의 백혈구 과다증과 단백소실성 장병증으로 초래된 저알부민혈증 등이 관찰될 수 있다고 알려져 있다. 심한 경우에는 쇼크, 흉막삼출, 복수, 거대결장, 대장천공 및 복막염, 2차적 패혈증 등이 발생하여 사망에까지 이르게 하기도 한다고 보고되었다 (Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 진단방법으로는 세포배양법을 이용하여 대변 내 톡신단백질을 검출하는 것이다. 위막성대장염 환자의 95%에서 톡신A나 톡신B가 검출되기 때문에 Cd균이 원인균임을 동정하기가 쉽다. 아울러 경제성이 높고 결과를 빠른 시간 내에 확인할 수 있는 EIA (Enzyme immunoassay) 방법을 수행할 수도 있다.
위막성대장염의 치료로는 원인이 되는 항생제를 중단하는 것과 수액 요법 전해질 교정 등의 보존적 치료를 병행해야 하며 환자의 상태가 위중할 때는 vancomycin을 투여하는데 균의 세포내 침투가 아니고 장관 내 세균에 의해 생성되는 톡신에 의해 기인된 경우에는 metronidazole이나 vancomycin을 경구 투여하는 것이 좋은 결과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 최근 문헌에서 살펴보면 vancomycin이 metronidazole에 비해 그 치료효과가 큰 것으로 보고되었다 (Kelly CP and LaMont JT. N Engl J Med 2008;359:1932). 경구 투여가 불가능한 경우에는 직장을 통해 주입하는 것이 추천될 수 있으며 대장균총을 정상화하기 위하여 Yogurt, Lactobacilli 장내 주입도 치료에 도움을 주는 것으로 보고되고 있다.
그러나 현재 임상적으로 선택 가능한 항생제인 metronidazole에 대한 내성세균이 이미 30% 이상 보고되고 있어 문제가 되고 있다. vancomycin 역시 치료를 위한 항생제로 고려되고는 있지만 모든 그람양성 세균성 감염질환에 대한 마지막 항생제라는 가치로 인해서 임상적 적용이 자유롭게 이뤄지지 않는 문제들을 감안하면, 새로운 항생제 개발이 시급한 실정이다.
본 발명은 곤충으로부터 분리한 항균 펩티드인 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 Cd균에 대한 선별적 항생효과를 나타내는지를 검증하고 나아가 대장 상피세포를 포함하는 일반 포유류세포들에 대한 무독성 기능을 확인함으로써 Cd균 유발성 급성장염에 대한 새로운 항생제를 제공하고자 한다.
즉 본 발명의 목적은 현재 제한된 항생제들을 (metronidazole과 vancomycin) 이용해 치료를 수행하고 있는 Cd균 유발성 위막성대장염의 치료제로서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 사용하는 것에 관한 것이다.
즉 본 발명의 목적은 현재 제한된 항생제들을 (metronidazole과 vancomycin) 이용해 치료를 수행하고 있는 Cd균 유발성 위막성대장염의 치료제로서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 사용하는 것에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 유효 성분으로 함유하는 급성위막성대장염(Pseudomembranous colitis) 치료용 조성물을 제공한다.
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본 발명에서는, 위막성대장염을 일으키는 Cd균을 배양하고 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리한 다음 항균효과를 확인하였다. 이를 위해 Meat broth-배양액을 이용 Cd균을 접종 배양하고(37℃에서 5일간) L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 1㎍ 농도로 처리한 다음 600nm 흡광도에서 생장속도 변화를 측정하였다. 경구 투여한 펩티드가 소화효소에 의해 분해되기 쉽기 때문에 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 D-type구조 펩티드를 추가로 합성하여 실험하였다. Cd균에 대해 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 농도를 결정하기 위하여 상기의 조건을 유지한 상태에서 1 ug과 5 ug의 농도로 각각 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 처리하고 생장률 감소를 측정하였다. 다음으로, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 여러 항생제들(clindamycin, kanamycin, vancomycin)과 비교하였다.
장내 정상균총(유산균)에 대해서 강한 항생효과를 보이는 약물들은 병원성 미생물에 대한 항생효과가 강하더라도 치료제로서의 가치가 떨어지기 때문에 Cd균에 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)에 대해서 유산균들에 무독성임을 규명하고자 하였다. 이를 위해 생쥐의 대장 미생물을 분리하고 그들의 성장과정에 1㎍/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 (D-type)을 처리하여 장내 정상균총에 대한 독성이 없음을 검증하였다. 또한, Bifidobacterium, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis, Lactobacillus bulgaricus와 같은 유산균들을 개별 배양한 다음 코프리신 펩티드 유도체 CopA3를 처리하여 독성 실험을 반복하였으며, 이때 vancomycin과 clindamycin 그리고 kanamycin도 병행 처리하여 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과와 비교하였다. 다음으로, 복합항생제 전 처리와 Cd균 감염을 통해 급성위막성대장염을 유발하는 모델을 이용하여 동물실험을 수행하였다. 4주령 Cd균 처리는 쥐 (n=12)에게 혼합-항생제 (kanamycin (0.4 mg/ml), gentamicin (0.035 mg/ml), colistin (850 U/ml), metronidazole (0.215 mg/ml), vancomycin (0.045 mg/ml))를 물에 섞여 3일 동안 먹인 후 하루 동안 물만을 공급하고 나서 다시 clindamycin (10 mg/kg)을 복강 내 주사 주입하였다. 그 다음 Cd균 (1 x 105 cells)을 존대를 이용하여 위 (stomach) 내로 직접 주입하였다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) (1 ug/ml)은 음용수 내에 포함시켜 공급하였으며 생쥐의 체중감소와 치사량을 추적하였다. 죽은 쥐들의 장들이 채취되어 융모막 파괴 정도 염증성 사이토카인의 분비변화를 각각 비교하였다.
표 1은 생쥐에 항생제 복합체와 Cd균 감염을 연속적으로 노출하여 위막성대장염 모델을 확립하는 과정을 나타낸 것이다.
표 2는 면역 유도된 애기뿔소똥구리 (Copris tripartitus)에서 분리한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 (HL)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
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본 발명에서는, 위막성대장염을 일으키는 Cd균을 배양하고 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리한 다음 항균효과를 확인하였다. 이를 위해 Meat broth-배양액을 이용 Cd균을 접종 배양하고(37℃에서 5일간) L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 1㎍ 농도로 처리한 다음 600nm 흡광도에서 생장속도 변화를 측정하였다. 경구 투여한 펩티드가 소화효소에 의해 분해되기 쉽기 때문에 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 D-type구조 펩티드를 추가로 합성하여 실험하였다. Cd균에 대해 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 농도를 결정하기 위하여 상기의 조건을 유지한 상태에서 1 ug과 5 ug의 농도로 각각 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 처리하고 생장률 감소를 측정하였다. 다음으로, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 여러 항생제들(clindamycin, kanamycin, vancomycin)과 비교하였다.
장내 정상균총(유산균)에 대해서 강한 항생효과를 보이는 약물들은 병원성 미생물에 대한 항생효과가 강하더라도 치료제로서의 가치가 떨어지기 때문에 Cd균에 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)에 대해서 유산균들에 무독성임을 규명하고자 하였다. 이를 위해 생쥐의 대장 미생물을 분리하고 그들의 성장과정에 1㎍/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 (D-type)을 처리하여 장내 정상균총에 대한 독성이 없음을 검증하였다. 또한, Bifidobacterium, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis, Lactobacillus bulgaricus와 같은 유산균들을 개별 배양한 다음 코프리신 펩티드 유도체 CopA3를 처리하여 독성 실험을 반복하였으며, 이때 vancomycin과 clindamycin 그리고 kanamycin도 병행 처리하여 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과와 비교하였다. 다음으로, 복합항생제 전 처리와 Cd균 감염을 통해 급성위막성대장염을 유발하는 모델을 이용하여 동물실험을 수행하였다. 4주령 Cd균 처리는 쥐 (n=12)에게 혼합-항생제 (kanamycin (0.4 mg/ml), gentamicin (0.035 mg/ml), colistin (850 U/ml), metronidazole (0.215 mg/ml), vancomycin (0.045 mg/ml))를 물에 섞여 3일 동안 먹인 후 하루 동안 물만을 공급하고 나서 다시 clindamycin (10 mg/kg)을 복강 내 주사 주입하였다. 그 다음 Cd균 (1 x 105 cells)을 존대를 이용하여 위 (stomach) 내로 직접 주입하였다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) (1 ug/ml)은 음용수 내에 포함시켜 공급하였으며 생쥐의 체중감소와 치사량을 추적하였다. 죽은 쥐들의 장들이 채취되어 융모막 파괴 정도 염증성 사이토카인의 분비변화를 각각 비교하였다.
표 1은 생쥐에 항생제 복합체와 Cd균 감염을 연속적으로 노출하여 위막성대장염 모델을 확립하는 과정을 나타낸 것이다.
표 2는 면역 유도된 애기뿔소똥구리 (Copris tripartitus)에서 분리한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 (HL)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
| 펩티드 | 아미노산 서열 (9개) |
| CopA3(HL) | L-L-C-I-A-L-R-K-K |
본 발명에 따른 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)은 Cd균 감염으로 유발된 생쥐 대장 내 급성장염 과정을 현저히 감소시키며, Bifidobacterium과 Lactobacillus와 같은 장내 정상균총이 아닌 병원성 미생물인 Cd균에 대해서만 선별적 항균효과를 나타낸다.또한, C. difficile에 의해 야기된 대장 융모괴사와 장내출혈도 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 처리로 억제된다.
도 1은 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 강한 항생효과를 나타낸 것이다.
도 2는 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 농도별 항생효과를 나타내는 것이다.
도 3은 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)와 항생제들(vancomycin, clindamycin, kanamycin)의 항균효과 검증을 나타내는 것이다.
도 4는 생쥐의 대장 내에서 분리한 장내미생물에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 5는 유용세균 (Effective Microorganism)에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 6은 다양한 장내 유산균들 (Bifidobacterium, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis, Lactobacillus bulgaricus)에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 7은 Cd균 감염으로 증가한 생쥐의 치사율과 몸무게 감소가 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 처리로 회복됨을 나타내는 것이다.
도 8은 Cd균 감염을 통해 야기한 급성장염 생쥐의 소장/대장에서 융모막 파괴과정과 인터루킨-6(염증성 사이토카인)를 억제하는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 나타내는 것이다.
도 2는 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 농도별 항생효과를 나타내는 것이다.
도 3은 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)와 항생제들(vancomycin, clindamycin, kanamycin)의 항균효과 검증을 나타내는 것이다.
도 4는 생쥐의 대장 내에서 분리한 장내미생물에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 5는 유용세균 (Effective Microorganism)에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 6은 다양한 장내 유산균들 (Bifidobacterium, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis, Lactobacillus bulgaricus)에 대해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 독성이 없음을 나타내는 것이다.
도 7은 Cd균 감염으로 증가한 생쥐의 치사율과 몸무게 감소가 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 처리로 회복됨을 나타내는 것이다.
도 8은 Cd균 감염을 통해 야기한 급성장염 생쥐의 소장/대장에서 융모막 파괴과정과 인터루킨-6(염증성 사이토카인)를 억제하는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 나타내는 것이다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한, 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항균 작용이 있는 본 발명에 의한 항균 펩티드를 유효성분으로 함유하는 장염치료제 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.
실시예 1: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)은 급성-위막성대장염의 원인균인 Cd균에 대하여 강한 항생효과를 나타냄.
급성위막성 대장염을 일으키는 장내 병원성 세균인 C. difficile(Cd균)은 그람양성 세균이며 정상균총수가 항생제의 처리로 감소할 때 colonization 되며 최종적으로 톡신을 분비하여 급성 장내 염증을 유발하는 것으로 알려져 왔다. 면역반응 자극 후 애기뿔소똥구리 분리해낸 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 펩티드들을 이용하여 Cd균에 대한 특이적 항생효과들을 검증해보고자 하였다.
이를 위해 Meat broth 6.5g을 50ml의 증류수에 넣은 후 시약병을 완전히 밀봉하여 공기의 이동을 막은 후에 멸균하여 Cd균 배양 배지를 준비하였다. 혐기성 Cd균을 공기가 들어가지 않도록 적당량 배양액 내에 접종시킨 후 37℃에서 5일간 배양시켰다. 이때 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) D-type과 L-type을 각각 1 ug 농도로 처리한 다음 추가 배양을 유지하고 흡광도계를 이용하여 600 nm에서 세균의 생장속도 변화를 추적 비교하였다. 도 1에서처럼 혐기적 조건에서 배양한 Cd균의 성장률이 S자 곡선을 나타내며 기하급수적으로 증가함을 확인하였다. 그러나 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 동시에 처리되면 그 성장률이 유의하게 감소함을 확인하였다. 이 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 경구 투여하면 소화효소들에 의해 분해되어 치료제로서의 적용범위가 제한되기 때문에 D-type 구조의 펩티드를 추가로 합성하여 Cd균에 대한 L-type이 가지는 항생효과와 비교해 보았다. 도 1) 결과에서처럼, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) L-type과 D-type 모두 강하게 Cd균의 성장을 억제함을 확인할 수 있었다. Cd균의 급격한 성장곡선 증가가 3일과 4일부터 시작됨을 볼 수 있는데 반해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리된 군에서는 증가현상이 전혀 관찰되지 않았으며(도 1A 와 1B), 이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리 초기부터 Cd균에 대한 항생효과가 나타남을 보여주고 있다. 더욱이 L-type 보다 D-type 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 항생효과가 더 강한 것으로 확인되었다(도 1B). 이 결과는 D-type 코프리신 펩티드 유도체 CopA3가 L-type이 갖는 기본적인 화학적 성상을 그대로 유지함은 물론 증가한 항생효과를 가짐을 보여주는 결과이며 나아가 치료제로서의 적용가능성을 높여주는 결과이다. (C) 배양시험관 사진. 혼탁도가 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 처리군에서 유의하게 감소하였다.
실시예 2: Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 항생농도 결정.
Cd균에 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 농도를 결정하기 위하여 농도별 코프리신 펩티드 유도체 CopA3을 처리한 다음 Cd균의 생장률 변화를 측정하였다. 앞서 결과들에서 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 항생효과가 L-type보다 D-type에서 더 강한 것으로 확인됐으므로 이후에 모든 실험에서는 코프리신 펩티드 유도체 CopA D-type을 사용한 결과들로 구성하였다. 1ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도에서 관찰되는 Cd균에 대한 항생효과가 5 ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 처리로 야기되는 정도에 유사함을 확인할 수 있었다 (도 2). 그 이하 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도 실험에서도 Cd균에 대한 항생효과는 1 ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도가 Cd균에 대한 항생효과를 나타내는데 최소 농도임을 보여주고 있다(도 2A). control(con)은 Cd균 접종 시 측정된 최초 세균수를 나타낸다. 오른쪽 이미지는 배양시험관 사진이다 (도 2B).
실시예 3: C. difficile 세균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 항생효과.
세균 감염질환에 임상적으로 광범위하게 사용되는 clindamycin과 kanamycin 그리고 Cd 감염으로 초래되는 위막성대장염의 치료제로서 알려져 있는 vancomycin을 포함하여 CopA3(HL)의 항생효능과 비교하였다. Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 60% 생장률 감소 효과와 비교하였을 때 clindamycin은 62% 생장감소를 나타내어 그 정도가 유사함을 확인했지만, Cd에 대한 가장 효과적인 치료제로 알려진 vancomycin의 항생효능은 상대적으로 약한 것으로 확인되었다 (30%). kanamycin의 경우 Cd균에 대한 항생효능이 거의 없음도 확인하였다. 이는 기존의 항생제보다 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 Cd균에 대해서 매우 특이적이며 강력한 항생효과를 나타냄을 증명한 것이다. 특히 vancomycin의 효능보다 강한 것으로 확인된 것이 본 발명의 주요한 부분이다.
실시예 4: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)은 유산균을 포함한 유용미생물들에 대한 항생효과
병원성 미생물들의 증식을 막거나 톡신분비과정을 억제하는 것으로 알려져 온 장내 유산균들에 대해서 강한 항생효과를 보이는 약물들은 비록 그 물질들이 병원성 미생물에 대한 항생효과가 크다고 하더라도 치료적 응용으로 이어지기가 어렵다. 따라서 Cd균에 대해 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 경우 유산균을 포함한 장내 유용미생물들에 대한 선별적 무독성 효능이 있는지 확인해야 한다. 이를 위해 연구자 등은 먼저 생쥐의 대장 미생물들의 생장률에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 효과를 검증하고자 하였다. 이를 위해 4주령 수컷 쥐들 (CD1 mouse)의 복부를 절개하고 대장 내에서 서로 다른 위치의 대변들을 3개씩 무작위로 추출하여 혐기적 조건을 유지하며 LB broth 배지 속에서 균질화되도록 파쇄한 다음 동일한 양을 이용하여 혐기적 또는 호기적 조건에서 각각 배양하였다. 이때 1 ug/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) (D-type)을 동시에 처치하여 성장률 변화를 대조군과 비교하였다. 도 4에서처럼 쥐의 대변을 24시간 동안 배양했을 때 최초 세균수의 3배 이상 자라는 것을 확인하였다. 그러나 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리되어도 세균성장률 감소를 야기하지 않음을 확인하였다. 또한, D-type과 L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 모두 장내 미생물 생장에 전혀 영향이 없음을 증명하였다.
실시예 5: Effective Microorganism (EM균)에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 독성 검사.
다음으로, 유산균을 포함하는 유용미생물들만을 혼합하여 배양한 다음 CopA3(HL)의 효과를 재검증하였다. 이를 위해 전주대학교 EM 연구개발단에서 EM혼합균을 구매하여 LB broth 배지 속에서 배양한 다음 성장률에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 비교하였다. EM 혼합균에는 효모, 유산균, 누룩균, 광합성 세균 등이 들어있으며 인류가 식품발효 등에 이용해 왔던 80여 종의 미생물들이 포함되어 있다. 대조군은 EM혼합균 접종과 동시에 1 ug/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 처리하고 24시간 후에 흡광도를 이용하여 생장률 변화를 비교하였다. 또한, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 D-type과 L-type 을 구분하여 각각 1ug/ml 농도로 처치하고 동일한 방법으로 생장률을 측정하였다. 도 5A에서처럼, LB broth에 접종한 EM혼합균이 3일 이후에 최초 접종 세균수의 5배 이상으로 증가함을 확인하였다. 앞서 결과에 마찬가지로 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처치는 EM혼합균 성장에 전혀 영향을 미치지 않았다. D-type과 L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 모두 EM균에 대한 항생효과가 전혀 없음도 확인할 수 있었다 (도 5B). 이상의 결과들은 장내 유용미생물들에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 세포독성이 전혀 없음을 의미함과 동시에 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 항생효과 과정이 매우 특이적인 항균작용임을 시사한다.
실시예 6: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 Bifidobacterium와 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis 그리고 Lactobacillus bulgaricus의 생장률 감소를 야기하지 않는다.
생쥐의 대장 내 미생물을 이용한 액체배양 실험과 EM혼합세균을 이용한 배양실험 모두에서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 무독성이 검증되었기 때문에 연구자 등은 유산균들을 각각 개별 배양한 다음 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 자극에 의한 생장률 변화를 추적해 보고자 하였다. 이를 위해 농촌진흥청으로부터 (KACC) 장내 정상균총으로서 병원성 미생물의 생장률 증가를 억제한다고 알려져 있는 Bifidobacterium와 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis 그리고 Lactobacillus bulgaricus등을 각각 분양받아 적절한 배지들에 개별 접종하여 24시간 동안 배양하고 고농도(5ug/ml)의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리한 다음 시간별로 생장률 변화를 추적하였다. vancomycin (5 ug/ml)과 clindamycin (5 ug/ml) 그리고 kanamycin (5 ug/ml)도 역시 고농도로 처리하여 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과와 비교하였다. 도 6에서 보듯이, 최초배양 세균수를 기준으로 Bifidobacterium은 8배, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis는 3배 그리고 Lactobacillus bulgaricus는 2배 이상 세균수가 증가하는 것으로 확인되었다. 앞서 결과에서처럼 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리하여도 세균성장률에 전혀 영향을 미치지 않았다. 그러나 vancomycin의 경우 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis와 Lactobacillus bulgaricus에 대해서 성장률 감소효과를 나타내지 않았지만 Bifidobacterium에 대해서는 강한 항생효과를 보이는 것으로 확인되었다. Clindamycin의 경우 3가지의 세균 모두에서 강한 항생효과를 보이는 것으로 검증되었다. Kanamycin은 Bifidobacterium을 제외한 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis와 Lactobacillus bulgaricus에게 강한 항생효과를 나타내었다. 이상의 결과들은 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 장내 정상균총에 대한 항생효과가 거의 없고 병원성 세균인 C. difficile에 대해서만 특이적으로 항생효과를 나타냄을 재증명해보이고 있으며 나아가 해당 급성장염 치료제로서의 가능성을 보여주는 결과라고 할 수 있다. Vancomycin과 비교한 결과, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 치료적 가능성이 더 클 것으로 기대되는 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 7: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)는 C. difficile 감염으로 초래된 생쥐의 급성장염에 대한 영향
Cd균에 대해서 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 장내 유용미생물들에 대해서는 반대로 선별적인 무독성을 보여주고 있기 때문에, 본 발명자는 Cd를 직접 쥐에게 감염시켜 급성장염이 초래된 동물모델에서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처리가 항염증 효과로 이어지는지를 검증해보자 하였다. 4주령 CD1 쥐 (n=12)에게 혼합-항생제 (kanamycin (0.4 mg/ml), gentamicin (0.035 mg/ml), colistin (850 U/ml), metronidazole (0.215 mg/ml), vancomycin (0.045 mg/ml))를 물에 섞여 3일 동안 먹인 다음 24시간 동안 물만 제공하였다. 그 다음날 clindamycin (10 mg/kg)을 복강 내 주사 주입하여 24시간 동안 추가 항생제 자극을 유도한 후에 Cd균(1 x 105 cells)을 존대를 이용하여 위 (stomach) 내로 직접 주입하였다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처리는 Cd 균 주입 하루 전인 clindamycin이 복강 주입되는 날부터 1ug/ml 농도로 희석하여 음용수를 통해 공급하였다. 이때 장내 분해를 막기 위해 D-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 1ug/ml 농도로 음용수에 타서 공급해준 다음 몸무게 감소와 치사율을 Cd감염 후 물만 공급한 대조군과 비교하여 추적하였다. Cd균 주입 다음날부터 체중변화와 대변의 단단함 그리고 치사량을 조사하였다. 도 7A에서처럼, Cd균 주입은 급격한 체중감소를 초래한다. Cd균 주입 3일 후부터 급격한 체중감소가 초래되며 하루 평균 2g ~ 3g의 체중감소가 지속적으로 관찰되었다. 반면에 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 음용수에 섞여 공급된 실험 군에서는 쥐들의 체중감소가 현저하게 회복되었다. Cd균 주입 후 3일까지 대조군별 체중감소에는 큰 차이가 관찰되지 않지만 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 공급된 생쥐들은 4일 이후부터 체중들이 유의하게 회복되어 6일 이후에는 최초 체중을 회복함을 관찰하였다. Cd 감염 후 물만 공급한 쥐에서는 76%의 치사율이 관찰되었지만 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 공급된 대조군에서는 16%의 치사율이 확인되었다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 혼합한 음용수의 공급은 Cd 감염으로 초래되는 소장 내 융모괴사과정도 현저하게 억제하였다 (도 8A). 염증성 사이토카인인 인터루킨-6 (IL-6) 역시 Cd 감염 후 물만을 공급한 생쥐 군에서 높게 나타난 반면 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 이 음용수를 통해 공급된 대조군에서는 유의하게 감소하는 것으로 확인되었다 (도 8B). 이상의 결과들은 장내세균총에 무독성을 나타내는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 Cd균에 대해서 특이적으로 강한 항생효과를 나타내어 Cd균 유발성-급성위막성 대장염을 효과적으로 완화할 수 있음을 시사하고 있다.
실시예 1: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)은 급성-위막성대장염의 원인균인 Cd균에 대하여 강한 항생효과를 나타냄.
급성위막성 대장염을 일으키는 장내 병원성 세균인 C. difficile(Cd균)은 그람양성 세균이며 정상균총수가 항생제의 처리로 감소할 때 colonization 되며 최종적으로 톡신을 분비하여 급성 장내 염증을 유발하는 것으로 알려져 왔다. 면역반응 자극 후 애기뿔소똥구리 분리해낸 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 펩티드들을 이용하여 Cd균에 대한 특이적 항생효과들을 검증해보고자 하였다.
이를 위해 Meat broth 6.5g을 50ml의 증류수에 넣은 후 시약병을 완전히 밀봉하여 공기의 이동을 막은 후에 멸균하여 Cd균 배양 배지를 준비하였다. 혐기성 Cd균을 공기가 들어가지 않도록 적당량 배양액 내에 접종시킨 후 37℃에서 5일간 배양시켰다. 이때 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) D-type과 L-type을 각각 1 ug 농도로 처리한 다음 추가 배양을 유지하고 흡광도계를 이용하여 600 nm에서 세균의 생장속도 변화를 추적 비교하였다. 도 1에서처럼 혐기적 조건에서 배양한 Cd균의 성장률이 S자 곡선을 나타내며 기하급수적으로 증가함을 확인하였다. 그러나 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 동시에 처리되면 그 성장률이 유의하게 감소함을 확인하였다. 이 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 경구 투여하면 소화효소들에 의해 분해되어 치료제로서의 적용범위가 제한되기 때문에 D-type 구조의 펩티드를 추가로 합성하여 Cd균에 대한 L-type이 가지는 항생효과와 비교해 보았다. 도 1) 결과에서처럼, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) L-type과 D-type 모두 강하게 Cd균의 성장을 억제함을 확인할 수 있었다. Cd균의 급격한 성장곡선 증가가 3일과 4일부터 시작됨을 볼 수 있는데 반해서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리된 군에서는 증가현상이 전혀 관찰되지 않았으며(도 1A 와 1B), 이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리 초기부터 Cd균에 대한 항생효과가 나타남을 보여주고 있다. 더욱이 L-type 보다 D-type 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 항생효과가 더 강한 것으로 확인되었다(도 1B). 이 결과는 D-type 코프리신 펩티드 유도체 CopA3가 L-type이 갖는 기본적인 화학적 성상을 그대로 유지함은 물론 증가한 항생효과를 가짐을 보여주는 결과이며 나아가 치료제로서의 적용가능성을 높여주는 결과이다. (C) 배양시험관 사진. 혼탁도가 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 처리군에서 유의하게 감소하였다.
실시예 2: Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 항생농도 결정.
Cd균에 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 최저 농도를 결정하기 위하여 농도별 코프리신 펩티드 유도체 CopA3을 처리한 다음 Cd균의 생장률 변화를 측정하였다. 앞서 결과들에서 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 항생효과가 L-type보다 D-type에서 더 강한 것으로 확인됐으므로 이후에 모든 실험에서는 코프리신 펩티드 유도체 CopA D-type을 사용한 결과들로 구성하였다. 1ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도에서 관찰되는 Cd균에 대한 항생효과가 5 ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3의 처리로 야기되는 정도에 유사함을 확인할 수 있었다 (도 2). 그 이하 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도 실험에서도 Cd균에 대한 항생효과는 1 ug/ml의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 농도가 Cd균에 대한 항생효과를 나타내는데 최소 농도임을 보여주고 있다(도 2A). control(con)은 Cd균 접종 시 측정된 최초 세균수를 나타낸다. 오른쪽 이미지는 배양시험관 사진이다 (도 2B).
실시예 3: C. difficile 세균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 항생효과.
세균 감염질환에 임상적으로 광범위하게 사용되는 clindamycin과 kanamycin 그리고 Cd 감염으로 초래되는 위막성대장염의 치료제로서 알려져 있는 vancomycin을 포함하여 CopA3(HL)의 항생효능과 비교하였다. Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 60% 생장률 감소 효과와 비교하였을 때 clindamycin은 62% 생장감소를 나타내어 그 정도가 유사함을 확인했지만, Cd에 대한 가장 효과적인 치료제로 알려진 vancomycin의 항생효능은 상대적으로 약한 것으로 확인되었다 (30%). kanamycin의 경우 Cd균에 대한 항생효능이 거의 없음도 확인하였다. 이는 기존의 항생제보다 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 Cd균에 대해서 매우 특이적이며 강력한 항생효과를 나타냄을 증명한 것이다. 특히 vancomycin의 효능보다 강한 것으로 확인된 것이 본 발명의 주요한 부분이다.
실시예 4: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)은 유산균을 포함한 유용미생물들에 대한 항생효과
병원성 미생물들의 증식을 막거나 톡신분비과정을 억제하는 것으로 알려져 온 장내 유산균들에 대해서 강한 항생효과를 보이는 약물들은 비록 그 물질들이 병원성 미생물에 대한 항생효과가 크다고 하더라도 치료적 응용으로 이어지기가 어렵다. 따라서 Cd균에 대해 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 경우 유산균을 포함한 장내 유용미생물들에 대한 선별적 무독성 효능이 있는지 확인해야 한다. 이를 위해 연구자 등은 먼저 생쥐의 대장 미생물들의 생장률에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 효과를 검증하고자 하였다. 이를 위해 4주령 수컷 쥐들 (CD1 mouse)의 복부를 절개하고 대장 내에서 서로 다른 위치의 대변들을 3개씩 무작위로 추출하여 혐기적 조건을 유지하며 LB broth 배지 속에서 균질화되도록 파쇄한 다음 동일한 양을 이용하여 혐기적 또는 호기적 조건에서 각각 배양하였다. 이때 1 ug/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) (D-type)을 동시에 처치하여 성장률 변화를 대조군과 비교하였다. 도 4에서처럼 쥐의 대변을 24시간 동안 배양했을 때 최초 세균수의 3배 이상 자라는 것을 확인하였다. 그러나 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 처리되어도 세균성장률 감소를 야기하지 않음을 확인하였다. 또한, D-type과 L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 모두 장내 미생물 생장에 전혀 영향이 없음을 증명하였다.
실시예 5: Effective Microorganism (EM균)에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 독성 검사.
다음으로, 유산균을 포함하는 유용미생물들만을 혼합하여 배양한 다음 CopA3(HL)의 효과를 재검증하였다. 이를 위해 전주대학교 EM 연구개발단에서 EM혼합균을 구매하여 LB broth 배지 속에서 배양한 다음 성장률에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과를 비교하였다. EM 혼합균에는 효모, 유산균, 누룩균, 광합성 세균 등이 들어있으며 인류가 식품발효 등에 이용해 왔던 80여 종의 미생물들이 포함되어 있다. 대조군은 EM혼합균 접종과 동시에 1 ug/ml 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 처리하고 24시간 후에 흡광도를 이용하여 생장률 변화를 비교하였다. 또한, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3 D-type과 L-type 을 구분하여 각각 1ug/ml 농도로 처치하고 동일한 방법으로 생장률을 측정하였다. 도 5A에서처럼, LB broth에 접종한 EM혼합균이 3일 이후에 최초 접종 세균수의 5배 이상으로 증가함을 확인하였다. 앞서 결과에 마찬가지로 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처치는 EM혼합균 성장에 전혀 영향을 미치지 않았다. D-type과 L-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 모두 EM균에 대한 항생효과가 전혀 없음도 확인할 수 있었다 (도 5B). 이상의 결과들은 장내 유용미생물들에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 세포독성이 전혀 없음을 의미함과 동시에 Cd균에 대한 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 항생효과 과정이 매우 특이적인 항균작용임을 시사한다.
실시예 6: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 Bifidobacterium와 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis 그리고 Lactobacillus bulgaricus의 생장률 감소를 야기하지 않는다.
생쥐의 대장 내 미생물을 이용한 액체배양 실험과 EM혼합세균을 이용한 배양실험 모두에서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 무독성이 검증되었기 때문에 연구자 등은 유산균들을 각각 개별 배양한 다음 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 자극에 의한 생장률 변화를 추적해 보고자 하였다. 이를 위해 농촌진흥청으로부터 (KACC) 장내 정상균총으로서 병원성 미생물의 생장률 증가를 억제한다고 알려져 있는 Bifidobacterium와 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis 그리고 Lactobacillus bulgaricus등을 각각 분양받아 적절한 배지들에 개별 접종하여 24시간 동안 배양하고 고농도(5ug/ml)의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리한 다음 시간별로 생장률 변화를 추적하였다. vancomycin (5 ug/ml)과 clindamycin (5 ug/ml) 그리고 kanamycin (5 ug/ml)도 역시 고농도로 처리하여 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 효과와 비교하였다. 도 6에서 보듯이, 최초배양 세균수를 기준으로 Bifidobacterium은 8배, Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis는 3배 그리고 Lactobacillus bulgaricus는 2배 이상 세균수가 증가하는 것으로 확인되었다. 앞서 결과에서처럼 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 처리하여도 세균성장률에 전혀 영향을 미치지 않았다. 그러나 vancomycin의 경우 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis와 Lactobacillus bulgaricus에 대해서 성장률 감소효과를 나타내지 않았지만 Bifidobacterium에 대해서는 강한 항생효과를 보이는 것으로 확인되었다. Clindamycin의 경우 3가지의 세균 모두에서 강한 항생효과를 보이는 것으로 검증되었다. Kanamycin은 Bifidobacterium을 제외한 Lactobacillus delbrueckii subsp Lactis와 Lactobacillus bulgaricus에게 강한 항생효과를 나타내었다. 이상의 결과들은 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)가 장내 정상균총에 대한 항생효과가 거의 없고 병원성 세균인 C. difficile에 대해서만 특이적으로 항생효과를 나타냄을 재증명해보이고 있으며 나아가 해당 급성장염 치료제로서의 가능성을 보여주는 결과라고 할 수 있다. Vancomycin과 비교한 결과, 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)의 치료적 가능성이 더 클 것으로 기대되는 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 7: 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)는 C. difficile 감염으로 초래된 생쥐의 급성장염에 대한 영향
Cd균에 대해서 강한 항생효과를 보이는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 장내 유용미생물들에 대해서는 반대로 선별적인 무독성을 보여주고 있기 때문에, 본 발명자는 Cd를 직접 쥐에게 감염시켜 급성장염이 초래된 동물모델에서 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처리가 항염증 효과로 이어지는지를 검증해보자 하였다. 4주령 CD1 쥐 (n=12)에게 혼합-항생제 (kanamycin (0.4 mg/ml), gentamicin (0.035 mg/ml), colistin (850 U/ml), metronidazole (0.215 mg/ml), vancomycin (0.045 mg/ml))를 물에 섞여 3일 동안 먹인 다음 24시간 동안 물만 제공하였다. 그 다음날 clindamycin (10 mg/kg)을 복강 내 주사 주입하여 24시간 동안 추가 항생제 자극을 유도한 후에 Cd균(1 x 105 cells)을 존대를 이용하여 위 (stomach) 내로 직접 주입하였다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)처리는 Cd 균 주입 하루 전인 clindamycin이 복강 주입되는 날부터 1ug/ml 농도로 희석하여 음용수를 통해 공급하였다. 이때 장내 분해를 막기 위해 D-type의 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 1ug/ml 농도로 음용수에 타서 공급해준 다음 몸무게 감소와 치사율을 Cd감염 후 물만 공급한 대조군과 비교하여 추적하였다. Cd균 주입 다음날부터 체중변화와 대변의 단단함 그리고 치사량을 조사하였다. 도 7A에서처럼, Cd균 주입은 급격한 체중감소를 초래한다. Cd균 주입 3일 후부터 급격한 체중감소가 초래되며 하루 평균 2g ~ 3g의 체중감소가 지속적으로 관찰되었다. 반면에 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 음용수에 섞여 공급된 실험 군에서는 쥐들의 체중감소가 현저하게 회복되었다. Cd균 주입 후 3일까지 대조군별 체중감소에는 큰 차이가 관찰되지 않지만 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 공급된 생쥐들은 4일 이후부터 체중들이 유의하게 회복되어 6일 이후에는 최초 체중을 회복함을 관찰하였다. Cd 감염 후 물만 공급한 쥐에서는 76%의 치사율이 관찰되었지만 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 공급된 대조군에서는 16%의 치사율이 확인되었다. 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)을 혼합한 음용수의 공급은 Cd 감염으로 초래되는 소장 내 융모괴사과정도 현저하게 억제하였다 (도 8A). 염증성 사이토카인인 인터루킨-6 (IL-6) 역시 Cd 감염 후 물만을 공급한 생쥐 군에서 높게 나타난 반면 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL) 이 음용수를 통해 공급된 대조군에서는 유의하게 감소하는 것으로 확인되었다 (도 8B). 이상의 결과들은 장내세균총에 무독성을 나타내는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)이 Cd균에 대해서 특이적으로 강한 항생효과를 나타내어 Cd균 유발성-급성위막성 대장염을 효과적으로 완화할 수 있음을 시사하고 있다.
Claims (5)
- 하기 아미노산 배열을 가지는 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)를 유효 성분으로 함유하는 급성위막성대장염(Pseudomembranous colitis) 치료용 조성물.
L-L-C-I-A-L-R-K-K - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)는 소장과 대장내에서 병원성세균들을 억제하고 일반세균총들의 성장률을 선별적으로 높이는 조절자인 것을 특징으로 하는 급성위막성대장염(Pseudomembranous colitis) 치료용 조성물. - 삭제
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 코프리신 펩티드 유도체 CopA3(HL)는 D-type인 것을 특징으로 하는 급성위막성대장염(Pseudomembranous colitis) 치료용 조성물.
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