KR101335458B1 - 백혈병 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 4- 퀴놀린온 유도체를 포함하는 Myc 단백질 활성 저해제 및 상기 4- 퀴놀린온 유도체를 유효성분으로 하는 암 치료용 약학조성물로, 상기 본 발명에 따른 백혈병 치료용 약학조성물은 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 억제시켜 세포주기정지(cell cycle arrest)를 유도함으로써 다양한 인체 백혈병 세포주의 증식을 억제할 수 있어, 백혈병을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

Description

백혈병 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for leukemia therapy}

본 발명은 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 4- 퀴놀린온 유도체를 포함하는 Myc 단백질 활성 저해제 및 상기 4- 퀴놀린온 유도체를 유효성분으로 하는 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

발암유전자로 알려진 myc는 인간 8번 염색체에 존재하는 myc 유전자가 14번 염색체로 전좌돼 과잉발현 후 혈액암의 일종인 버킷림프종이 발생한다고 알려진 바 있으며, 이후 대장암, 유방암, 폐암 등에서 myc 유전자의 대량증폭이 발견됨이 이미 보고 된 바 있다.

이러한 Myc 유전자에 의해 코딩되는 Myc 단백질은 Max 단백질과 결합된 이형이량체의 형태로 기능을 하며, 이러한 Myc/Max 이형이량체의 결합을 저해하거나 불안정하게 할 수 있는 저분자 화합물이 우수한 항암 치료수단이 될 수 있음이 알려진 바 있으나, 현재 다양한 부작용이 발생하고 있어 이러한 부작용을 개선 또는 방지하기 위한 새로운 저분자 화합물이 요구되고 있다.

한편, 일본공개특허공보 평1-246263, 동공보 평5-202032, 동공보 평5-271222, 동공보 평7-285938 등에는, 퀴놀린 골격의 4 위에 아릴옥시기, 아릴티오기, 아미노기, 피리미딜옥시기, 피리미딜티오기, 벤조일기 등의 치환기를 갖는 퀴놀린 유도체가 식물병원균에 대하여 유효하고, 농원예용 살균제로서 유용한 점이 보고 된 바 있다.

또한 일본공개특허공보 평3-128355 호에는, 4-아실옥시퀴놀린 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 살충, 살진드기제에 대하여 보고 된 바 있으며, 한국등록특허 제10-0613690호에는, 4-퀴놀린온 유도체가 식물병원균에 대하여 항균활성을 갖는 것이 보고 된 바 있다. 뿐만 아니라 한국등록특허 제10-0916160에서는 동맥경화증 및 재발협착증에 대하여 치료효능이 있음이 역시 보고 된 바 있으나, 이들 화합물의 백혈병의 치료효능에 대해서는 지금까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 Myc/Max/DNA 콤플렉스(complex)의 결합을 저해하거나 불안정하게 할 수 있는 저분자 화합물을 스크리닝 하던 중, 농원예용 살균제 또는 살충제로서의 활성, 그리고 동맥경화증 및 재발협착증에 대하여 치료효능이 보고된 바 있는 4- 퀴놀린온 유도체가 생체 내에서 우수한 백혈병 세포주에 대한 성장 억제효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 4- 퀴놀린온 유도체를 포함하는, Myc 단백질의 활성 저해제 및 상기 4- 퀴놀린온 유도체를 유효성분으로 하는 백혈병 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 Myc/Max의 컴플렉스 형성을 억제시켜 세포주기정지(cell cycle arrest)를 유도함으로써 백혈병 세포주의 증식을 억제할 수 있는 4- 퀴놀린온 유도체를 포함하는 Myc 단백질의 활성 저해제, 및 상기 4- 퀴놀린온 유도체를 유효성분으로 하는 백혈병 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 Myc 단백질의 활성 저해제는 화학식 1의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 Myc 단백질의 활성 저해제는 하기 화합물 1 내지 28의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이들은 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 저해함으로서 Myc 단백질의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 백혈병 치료용 약학조성물은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 본 발명은 백혈병 치료용 약학조성물로서, 하기 화합물 1 내지 28의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이들은 세포사멸 유도의 기작을 통해 백혈병 세포의 증식을 억제시켜 백혈병 치료효과를 가짐을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 4- 퀴놀린온 유도체를 포함하는, Myc 단백질의 활성 저해제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₄는 수소, 할로겐, (C_1-10)알킬기, 할로(C_1-6)알킬기, 니트로기이고(단, R₁ 내지 R₄가 모두 수소인 경우는 제외됨);

R₅는 (C_{1 -6})알킬기이고;

Z는 화학결합, (C_{1 -6})알킬기, 페닐기로 치환되거나 치환되지 않은 (C_{1 -3})알킬렌, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 페닐기이며;

Ar은 할로겐, (C_{1 -6})알킬기, 할로(C_1-6)알킬로 치환되거나 치환되지 않은 페닐기, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 페닐기, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 벤질기이다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 4- 퀴놀린온 유도체는 하기 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 상기 화학식 1의 4- 퀴놀린온 유도체는 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 백혈병 세포주의 세포자기사멸(Apoptosis)과 세포증식억제(Cell cycle arrest) 유발 효과를 통해 백혈병 세포 억제 능력이 우수한 저분자 화합물을 선택하기 위하여, 총 6480개의 저분자 화합물을 대상으로 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 저해하는 저분자 화합물 및 백혈병 세포주인 HL-60 세포의 증식을 50% 이상 억제시키는 화합물을 선별하였으며, 그 결과 28개의 화합물 최종 선별할 수 있었다.

상기 선별된 화합물을 대상으로 사람 세포 내에서 Myc의 활성을 조절하여 궁극적으로 백혈병 치료용도로 가능함을 리포트 어세이(report assay)를 이용하여 확인하였다. 그 결과 사람 신장 상피세포 HEK293 내에서 화합물의 농도에 따른 Myc의 전사활성 억제효과를 확인한 결과, 선별된 화합물 1 내지 28의 화합물이 Myc의 활성을 조절하여 궁극적으로 백혈병 치료 용도로 사용가능함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 결과를 바탕으로, 선별된 화합물을 대상으로 HL-60 세포에 있어 세포증식억제(Cell cycle arrest) 효과를 조사한 결과, 선별된 화합물 1 내지 28의 화합물이 Myc/Max/DNA 콤플렉스 형성의 전사활성을 감소시켜 세포증식억제(Cell cycle arrest) 효과를 가짐으로써 다양한 인체 백혈병 세포주의 증식을 억제함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 화학식 1 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 약학조성물에 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1의 4- 퀴놀린온 유도체를 유효성분으로 하는, 백혈병 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₄는 수소, 할로겐, (C_1-10)알킬기, 할로(C_1-6)알킬기, 니트로기이고(단, R₁ 내지 R₄가 모두 수소인 경우는 제외됨);

R₅는 (C_{1 -6})알킬기이고;

Z는 화학결합, (C_{1 -6})알킬기, 페닐기로 치환되거나 치환되지 않은 (C_{1 -3})알킬렌, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 페닐기이며;

Ar은 할로겐, (C_{1 -6})알킬기, 할로(C_1-6)알킬로 치환되거나 치환되지 않은 페닐기, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 페닐기, 할로겐으로 치환되거나 치환되지 않는 벤질기인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1은 하기 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

하기 화합물은 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 상기의 조성물은 담체와 함께 제제화 될 수 있다. 경구투여용 제형의 경우, 예를 들면 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르(elixirs)로 제제화될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제조하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제와 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제 및 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는, 4-퀴놀린온 유도체를 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제등 스프레이용으로 제제화 할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 4-퀴놀린온 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제한다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 기제를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화 할 수 있다. 에어로졸제 등 스프레이용으로 제형화 하는 경우, 수분산 된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 백혈병 치료용 약학조성물은 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성을 억제시켜 세포주기정지(cell cycle arrest)를 유도함으로써 다양한 백혈병 세포주의 증식을 억제할 수 있어, 백혈병을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 Myc/Max/DNA의 콤플렉스(complex) 형성 억제 실험을 위해 제작한 재조합 단백질의 구조를 도식한 것이며,
도 2는 사람의 세포주(HEK 293)에 대한 화합물 1, 2, 3의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이고,
도 3은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 4, 5, 6의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이며,
도 4는 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 7, 8, 9의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이고,
도 5는 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 10, 12, 13의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이며,
도 6은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 14, 15, 16의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이고,
도 7은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 17, 18, 19의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이며,
도 8은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 20, 21, 22의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이고,
도 9는 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 23, 24, 25의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이며,
도 10은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 25, 26, 27의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이고,
도 11은 사람의 세포주(HEK 293) 화합물 28의 농도 별 Myc 활성저해 효과를 확인한 결과이며,
도 12는 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 1, 2, 3의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이고,
도 13은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 4, 5, 6의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 14는 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 7, 8, 9의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이고,
도 15는 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 10, 11, 12의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 16은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 13, 14, 15의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이고,
도 17은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 16, 17, 18의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 18은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 19, 20, 21의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이고,
도 19는 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 22, 23, 24의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이며,
도 20은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 25, 26, 27의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이고,
도 21은 백혈병 세포주(HL-60 세포)에 대한 화합물 28의 농도 별 세포증식 억제 효과를 확인한 결과이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] Myc/Max/DNA 콤플렉스(complex) 형성 억제 저분자 화합물의 스크리닝

백혈병 치료용 저분자 화합물을 선별하기 위해 각기 다른 골격구조를 갖는 6480개의 저분자 화합물로 구성된 라이브러리(chemical library)를 한국화합물은행으로부터 제공받아, 백혈병의 주된 원인인 발암유전자 Myc의 전사활성을 억제하는 화합물을 검색하였다. 상기 Myc의 전사활성을 억제하는 화합물의 검색을 위해 재조합 단백질 Myc87과 Max85를 제작하였으며 그 구조는 도 1과 같다.

상기 재조합 Myc87, Max85 단백질은 DNA-결합 베이직 도메인(DNA-binding Basic domain), 헬릭스-루프-헬릭스 도메인(Helix-Loop-Helix domain) 및 루신 지퍼 도메인(Leucine Zipper domain)을 포함한다.

본 발명에 사용된 백혈병 세포주인 HL-60 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였다.

총 6480개의 저분자 화합물을 대상으로, Myc87/Max85/DNA 콤플렉스(complex)를 저해하는 저분자 화합물을 선별하기 위하여 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)를 이용하여 스크리닝 하였다. 반응 완충액에 Myc87/Max85 단백질을 넣은 후 각각의 화합물을 10 μM로 처리한 후 DNA를 넣고 전기영동을 실시하여 Myc87/Max85/DNA 콤플렉스(complex)를 50% 이상 저해하는 화합물을 선별하였다. 선별된 화합물에 대하여 백혈병 세포주인 HL-60에 대하여 세포 성장 억제효과를 확인하였다. HL-60 백혈병 세포주를 20% FBS와 25 mM HEPES를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양한 후 96 웰 플레이트에 각 웰 당 3.0×10⁴ 개의 세포를 주입하고 선별된 화합물을 20 μM 농도로 24시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 50% 이상 저해하는 화합물을 검색하였다.

상기 실험에서 HL-60 세포주의 분화를 유도하기 위하여 배지에 1% DMSO를 포함하였다. 최종 선별된 화합물에 대하여 유도체 648종을 확보하고 보다 정확한 효과를 확인하기 위해 HL-60 백혈병 세포주에 10 μM 농도로 48시간 동안 처리하였을 때 세포 성장을 50% 이상 저해하는 물질을 94종 선별하였다.

94종의 화합물이 백혈병 세포에 대하여 선택적으로 작용하는지 여부를 판단하기 위해 상기 표기한 EMSA 기법을 이용하여 50 μM 농도에서 Myc87/Max85/DNA 콤플렉스(complex)를 50% 이상 저해하는 화합물을 재선별 하였다. 최종적으로 28종의 화합물을 선별하였으며, EMSA로 확인한 50 μM 농도에서 Myc87/Max85/DNA 콤플렉스(complex) 저해 효과는 하기 표 1과 같았고, 그 화학구조는 하기와 같았다.

[ 실시예 2]

상기 선별된 28개의 화합물을 대상으로, 28개의 화합물이 실제 세포 내에서 Myc의 활성을 조절하여 궁극적으로 백혈병 치료 용도로 사용가능함을 리포터 어세이(reporter assay)를 이용하여 확인하였다.

상기 리포터 어세이는, Myc의 전사 활성을 측정할 수 있도록 고안된 루시페라아제 벡터(luciferase vector)를 사람 신장 상피세포인 HEK 293 세포에 형질주입(transfection)한 후, 6시간 뒤 0 내지 10 μM 농도의 화합물 1 내지 29를 처리하고 24 시간이 지나 루시페라아제(luciferase)의 활성을 측정함으로써 진행하였다. 화합물 1 내지 28의 화합물이 사람 세포 내에서 나타내는 Myc 저해 정도는 하기 표 2와 같았다.

상기 결과는 본 발명의 선별된 화합물 1 내지 28의 화합물이 Myc의 활성을 조절하여 궁극적으로 백혈병 치료 용도로 사용가능함을 확인한 결과이기도 하다.

[ 실시예 3]

상기 실시예 2의 결과를 토대로 선별된 28종의 화합물이 백혈병 세포의 성장을 억제하는 정도를 확인하기 위해, 백혈병 세포주인 HL-60을 배양하여 96 웰 플레이트에 각 웰 당 3.0×10⁴ 개의 세포를 주입하고 선별된 28종의 화합물을 각각 0 내지 10 μM 농도로 48시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하였으며 그 결과는 하기 표 3과 같다. 상기 실험에서 HL-60 세포주의 분화를 유도하기 위하여 배지에 1% DMSO를 포함하였다.

또한 표 3의 결과를 바탕으로, 선별된 화합물 1 내지 28의 화합물이 c-Myc/Max/DNA 콤플렉스의 전사활성을 감소시켜, HL-60 세포의 세포주기 억제(Cell cycle arrest)를 유도함을 확인할 수 있었다.

상기의 결과는 본 발명의 상기 선별된 화합물 1 내지 28의 화합물이 c-Myc/Max/DNA 콤플렉스 형성의 전사활성을 감소시켜 세포증식억제(Cell cycle arrest) 효과를 가짐으로써 다양한 인체 백혈병 세포주의 증식을 억제함을 확인한 결과이기도 하다.

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