KR101334161B1 - 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법 - Google Patents

분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 혼합물의 제조방법 및 이로부터 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물은 분무건조법을 이용하기 때문에 기존의 가온건조법, 동결건조법 또는 질소건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물에 비해 제조시간이 단축되고 제조비용이 절감될 뿐만 아니라, 중합효소연쇄반응 혼합물 내의 효소활성 보존성이 우수하기 때문에 고품질의 PCR 결과물의 제조가 가능하다.

Description

분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법 {Manufacturing method of premix for polymerase chain reaction using spray drying}
본 발명은 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법 및 이로부터 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)은 유전자를 확보 또는 분석하기 위한 대표적인 방법이다. 그런데, 이들 기법을 사용하기 위해서는 열안정성 DNA 중합효소, 반응용 완충용액(reaction buffer), dNTPs(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 주형 DNA와 프라이머(primer), 젤로딩 염료(gel loading dye) 등이 필수적으로 요구되는 등, 많은 반응요소가 필요하다. 또한, 이를 위한 반응혼합물을 매번 필요할 때마다 제조하기 위해서는 많은 시간이 필요하고, 혼합물 제조 시 오염 및 혼합용량의 오차 등이 발생할 여지가 있어, PCR 이후의 분석에 있어 큰 오류로 나타날 수 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 반응용 완충용액, 염화마그네슘, dNTPs 및 DNA 중합효소를 포함하는 혼합물에 안정화 물질을 첨가하고 동결건조하여 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하는 방법에 관한 기술(한국등록특허 제162270호)이 개시된 바 있으나, 이와 같은 동결건조방법은 별도의 원심분리 절차가 요구되고, 이로 인해 생산시간과 생산비용이 증대되는 문제점과 동결 건조 시에 효소가 얼음결정에 노출되어 활성이 상실될 수 있는 문제점이 존재하였다.
또한, 한국등록특허 제730364호에는 DNA 중합효소, 반응용 완충용액, dNTPs 및 젤로딩 염료를 첨가하여 실온 또는 가온에서 건조시킴으로써 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하는 방법에 관한 기술이 개시된 바 있으나, 이는 실온조건에서 4시간 정도, 가온 조건에서 1시간 정도 진행하여야 하는 것으로 장시간의 제조시간이 요구되며, 장시간 공기에 노출 시 반응 혼합물이 오염되거나 효소가 활성을 상실할 수 있는 문제점이 존재하였다.
이 외에도, 염화마그네슘을 포함하는 반응용 완충용액, dNTPs 및 열안정성 DNA 중합효소를 포함하는 반응혼합물을 건조시켜 제조한 탈수된 PCR 프리믹스(premix)에 관한 기술(한국공개특허 제2006-0081575호)도 개시된 바 있으나, 이는 실온에서 20일 이상 건조과정을 거쳐 탈수시키는 것을 방법으로 하고 있어, 제조시간이 지나치게 많이 소요되는 문제가 있고, 장기간 공기에 노출됨으로 인해 반응혼합물이 오염되거나 효소의 활성이 상실될 수 있는 동일한 문제점이 존재하였다.
분무건조법(spray drying)은 분무기(atomizer)에 의해 미립화된 액체 방울이 가열공기와 접촉하여 순간적으로 건조, 분말화 되는 방법을 이용하는 건조방법인데, 건조할 때에 액체 방울 주위가 수증기 막으로 둘러싸여 습구온도로 건조되므로 열에 민감한 식품의 건조에 알맞고 연속 대량 생산에 적합하다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 분무건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물이 신속한 건조 과정을 통해 PCR 반응의 안정성, 분석기능 및 보관성이 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한편, 본 발명자들은 한국공개특허 제2010-0053011호에서 질소가스를 이용하여 건조한 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조한 바 있으나, 본 발명의 중합효소연쇄반응 혼합물은 질소가스를 이용하여 제조했을 때보다 건조시간이 빠르기 때문에, PCR 반응의 안정성이 더 우수한 것으로 확인된다.
한국등록특허 제162270호 (DNA 중합효소 반응혼합물의 제조방법, 1998.08.29. 등록) 한국등록특허 제730364호 (실온 또는 가온건조법에 의한 PCR 반응혼합물 제조방법, 2007.06.13. 등록) 한국공개특허 제2006-0081575호 (탈수된 PCR 프리믹스, 2006.07.13. 공개) 한국공개특허 제2010-0053011호 (질소가스를 이용하여 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하는 방법 및 그러한 방법에 의하여 제조된 중합효소 연쇄반응 혼합물, 2010.05.20. 공개)
본 발명의 목적은 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법 및 이로부터 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은, (1공정) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)에 사용되는 반응혼합물을 제조하는 단계; 및, (2공정) 분무건조법을 이용하여 상기 반응혼합물을 PCR 튜브(PCR tube)에 분주하는 단계;를 포함하는 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법을 제공한다.
상기 1공정의 반응혼합물은 열안정성 DNA 중합효소(thermostable DNA polymerase), 효소안정화제, dNTPs, 반응용 완충용액(reaction buffer), 증류수 및 젤로딩 염료(gel loading dye)를 포함할 수 있다.
상기 2공정에서 반응혼합물은 PCR 튜브 안에서 30초~1분 동안 건조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물 및 이를 포함하는 염기서열 분석용 키트나 질병진단용 키트를 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 자세하게 설명한다.
상기 열안정성 DNA 중합효소로는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase) 또는 pfu DNA 중합효소(pfu DNA Polymerase)를 사용할 수 있다.
상기 효소 안정화제로는 트레할로즈(trehalose), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 피콜(ficoll), 젤라틴, 소혈청 알부민, 황산암모늄, Thesit(hydroxypolyethoxydodecane), 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 글루코스, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨 및 솔비톨로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜로는 PEG-8000을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 1공정의 반응혼합물에 침강제로서 트레할로즈, 글리세롤, 글루코스, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨 및 솔비톨 중에 선택되는 1종 이상이 추가될 수 있는데, 효소 안정화제로서 상기 성분들이 사용된다면 생략가능하다.
dNTPs는 DNA를 합성하기 위한 단량체(monomer) 상태의 4종의 디옥시뉴클레오티드 삼인산(deoxynucleotide triphosphate)으로서, dGTP(deoxyguanosine triphosphate), dATP(deoxyadenosine triphosphate), dCTP(deoxycytidine triphosphate) 및 dTTP(deoxythymidine triphosphate)가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액으로는 Tris-HCl, 황산암모늄, 염화칼륨, 염화마그네슘 중에 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있고, 3~10배 농축된 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 증류수는 멸균된 3차 증류수를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 젤로딩 염료는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 크실렌시아놀(xylene cyanol), 브로모크레졸 레드(bromocrphenol red), 크레졸 레드(cresol red)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있고, 2~10배로 농축된 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 분무건조법을 이용하여 건조하기 때문에 단시간에 용이하게 건조가 가능하다. 분무건조시의 건조온도는 20~40℃가 바람직하다.
상기 방법으로 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물은 주형 DNA(생물체의 게놈 DNA), 타겟 유전자의 프라이머(primer)와 혼합된 후, PCR을 수행할 수 있다. 이에, 상기 방법으로 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물은 염기서열 분석용 키트나 질병진단용 키트의 제조에 사용할 수 있는데, 생물체의 게놈 DNA로부터 특정 DNA 단편만을 선택적으로 복제하고 증폭할 수 있는 모든 반응에 적용가능하다.
본 발명은 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 혼합물의 제조방법 및 이로부터 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물은 분무건조법을 이용하기 때문에 기존의 가온건조법, 동결건조법 또는 질소건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물에 비해 제조시간이 단축되고 제조비용이 절감될 뿐만 아니라, 중합효소연쇄반응 혼합물 내의 효소활성 보존성이 우수하기 때문에 고품질의 PCR 결과물의 제조가 가능하다.
도 1은 실시예 3 및 4와 비교예 2에서 PCR을 수행할 때 사용한 Enterobacteria phage의 DNA 염기서열 및 프라이머(primer)를 나타낸다.
도 2는 실시예 3 및 비교예 2의 PCR 결과물의 전기영동 분석사진이다.
도 3은 실시예 4 및 비교예 2-1의 PCR 결과물의 전기영동 분석사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 반응혼합물의 제조>
DNA 중합효소연쇄반응에 사용되는 반응 혼합물을 제조하기 위하여 표 1의 조건으로 열안정성 DNA 중합효소, 10x 반응용 완충용액(10배 농축된 상태의 반응용 완충용액), dNTPs, 6x 젤로딩 염료(6배 농축된 상태의 젤로딩 염료), 3차 증류수를 표 1에 표시된 양으로 혼합한 후, PCR용 튜브에 분주하여 DNA 중합효소연쇄반응에 사용되는 반응 혼합물을 제조하였다.
반응 혼합물의 제조를 위해서는, 열안정선 DNA 중합효소는 Prime Taq DNA Polymerase(G-1000)(제넷바이오), 반응용 완충용액은 Tris-HCl(pH 8.0, 시그마알드리치, T1503), 황산암모늄(시그마알드리치, A4418), 염화칼륨(시그마알드리치, P9541), 염화마그네슘(MgCl2, Fluka, 63068)을 혼합하여 제조하였다. 젤로딩 염료는 크실렌시아놀(시그마알드리치, X4126)을 사용하였고, 효소안정화제로는 트레할로즈(시그마알드리치, T9531)를 이용하였다.
조성 첨가량
멸균된 3차 증류수 350㎕
10x 반응용 완충용액
(10mM Tris-HCl[pH8.3], 2mM MgCl2, 50mM KCl, 10mM 황산암모늄) 		200㎕
10mM dNTPs 200㎕
10mM 트레할로즈 - 효소안정화제 200㎕
열안정성 DNA 중합효소 20㎕ (100units)
0.02%[w/v] 크실렌시아놀 - 젤로딩 염료 (6x) 30㎕
총 부피 1㎖
< 실시예 2. 분무건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물 제조>
PCR 튜브에 상기 실시예 1의 반응혼합물을 분주하되, 상기 반응혼합물을 분무건조기(제넷바이오 자체 제작)를 이용하여 각 10㎕씩 분무함으로써, PCR 튜브(PCR tube, 0.2㎖ 용량, 이후의 실험에서는 모두 동일한 용량의 제품 사용) 안에 분무건조된 반응혼합물이 포함되도록 하였다.
<실시예 3. 분무건조법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물을 이용한 PCR 수행>
실시예 2의 중합효소연쇄반응 혼합물(반응혼합물이 담긴 PCR 튜브)에 Enterobacteriophage DNA(GeneBank No. JO182735.1) 2㎕(1fg[femtogram]~10pg[picogram]), 전방향 프라이머(forward primer) 5'-cgcgaatatgccggttatca-3' 1㎕(10pmole/㎕), 역방향 프라이머(reverse primer) 5'-acggataacggctactccgtg-3' 1㎕(10pmole/㎕), 3차 증류수 16㎕를 첨가하여 총 20㎕의 조성물을 제조하고, 하기 표 2의 온도조건으로 1005bp(base paris)의 크기를 갖는 DNA 밴드(DNA band)를 합성하는 PCR을 수행하였다.
PCR 반응 온도 조건
Predenaturation 95℃ 5분 1 cycle
Denaturation 95℃ 30초
30 cycle
Annealing 57℃ 30초
Extension 72℃ 1분
Final Extension 72℃ 5분 1 cycle
< 실시예 4. 분무건조법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물의 안정성 확인>
상기 실시예 3과 동일한 조건에서 PCR을 수행하되, 하기 표 3처럼 실시예 2의 중합효소연쇄반응 혼합물을 40℃에서 1~4주간 보관한 것을 사용하였다.
PCR 조건 분무건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물
실시예 4-1 40℃에서 1주간 보관 후 사용
실시예 4-2 40℃에서 2주간 보관 후 사용
실시예 4-3 40℃에서 3주간 보관 후 사용
실시예 4-4 40℃에서 4주간 보관 후 사용
< 비교예 1. 비교대상 건조방법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조>
비교예 1-1. 건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조
PCR 튜브에 상기 실시예 1의 반응혼합물(표 1 참조)을 각 10㎕씩 주입하여 대조군 중합효소연쇄반응 혼합물로 이용하였다.
비교예 1-2. 질소건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조
PCR 튜브에 상기 실시예 1의 반응혼합물(표 1 참조)을 각 10㎕씩 분주하고, 상기 반응혼합물을 질소건조기(제넷바이오 자체 제작, 대한민국)를 이용하여 건조함으로써, PCR 튜브 안에 건조된 반응혼합물이 포함되도록 하였다.
비교예 1-3. 동결건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조
PCR 튜브에 상기 실시예 1의 반응혼합물(표 1 참조)을 각 10㎕씩 분주하고, 상기 반응혼합물을 동결건조기(라보진, 대한민국)를 이용하여 건조함으로써, PCR 튜브 안에 동결건조된 반응혼합물이 포함되도록 하였다.
비교예 1-4. 고온건조법을 이용한 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조
PCR 튜브에 상기 실시예 1의 반응혼합물(표 1 참조)을 각 10㎕씩 분주하고, 상기 반응혼합물을 항온기(제넷바이오 자체제작)를 이용하여 50℃에서 건조함으로써, PCR 튜브 안에 고온건조된 반응혼합물이 포함되도록 하였다.
< 비교예 2. 비교대상 중합효소연쇄반응 혼합물을 이용한 PCR 수행>
실시예 3과 동일한 조건으로 PCR을 수행하되, 실시예 2의 중합효소연쇄반응 혼합물을 이용하는 대신, 하기 표 4와 같이, 비교예 1-1 내지 1-4의 중합효소연쇄반응 혼합물을 이용하였다(단, 비교예 1-1의 중합효소연쇄반응 혼합물은 건조하지 않았기 때문에, 3차 증류수를 6㎕만 넣음).
중합효소연쇄반응 혼합물 사용 조건
비교예 2-1 비교예 1-1의 건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물 사용
비교예 2-2 비교예 1-2의 질소건조법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물 사용
비교예 2-3 비교예 1-3의 동결건조법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물 사용
비교예 2-4 비교예 1-4의 고온건조법을 이용하여 제조된 중합효소연쇄반응 혼합물 사용
< 실험예 1. 반응혼합물의 건조 시간 확인>
실시예 2, 비교예 1-2 내지 1-4의 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조할 때, 실시예 1의 반응혼합물이 PCR 튜브 안에서 수분 10% 이하로 건조되는 시간을 비교확인하여 하기 표 5에 나타내었다. 이 때 각 건조방법별로 반응혼합물이 포함된 PCR 튜브 8개를 측정하여 평균시간으로 나타내었다.
중합효소연쇄반응 혼합물 평균 건조시간
실시예 2 (분무건조법 이용) 41초
비교예 1-2 (질소건조법 이용) 16분 10초
비교예 1-3 (동결건조법 이용) 35분 22초
비교예 1-4 (고온건조법 이용) 64분 32초
표 5를 확인하면, 실시예 2의 중합효소연쇄반응 혼합물 제조시(분무건조법 이용), 반응혼합물의 건조시간이 불과 평균 41초였으나, 비교예 1-2의 중합효소연쇄반응 혼합물 제조시(질소건조법 이용)의 반응혼합물의 건조시간은 평균 16분 10초, 비교예 1-3의 중합효소연쇄반응 혼합물 제조시(동결건조법 이용)의 반응혼합물의 건조시간은 평균 35분 22초, 비교예 1-4의 중합효소연쇄반응 혼합물 제조시(고온건조법 이용)의 반응혼합물의 건조시간은 평균 64분 32초가 걸려, 본 발명에서처럼 분무건조법을 이용하는 것이 반응혼합물을 가장 짧은 시간에 건조할 수 있는 방법임을 알 수 있었다.
< 실험예 2. 건조 방법에 따른 PCR 결과물의 상태 확인>
실시예 3 및 비교예 2의 PCR 결과물의 상태는 각 PCR 결과물 5㎕를 1.5%[w/v] 아가로오스겔(agarose gel)에서 전기영동하고 EtBr(Ethidium Bromide)에 염색하여 UV 분석기(대한과학, WGD-20)를 이용하여 확인하였으며, 이에 대한 DNA 밴드 분석사진은 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, 분무건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용한 실시예 3의 PCR 결과물(Panel 나)의 DNA 전기영동 결과는 건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용한 비교예 2-1의 PCR 결과물(Panel 가)과 거의 비슷한 DNA 전기영동 결과를 나타내는 것으로 확인되었는데, 각 Enterobacteria phage의 DNA 농도별로 DNA 밴드가 선명하고 깨끗하게 나타났다.
따라서, 분무건조법을 이용하여 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하는 방법이 건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용할 때와 마찬가지로 열안정성 DNA 중합효소의 활성이 안정적인 상태 그대로 유지됨을 알 수 있었으며, 이러한 안정성은 반응혼합물을 분무건조하여 나타나는 것으로 예상되었다.
동결건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용한 비교예 2-3의 PCR 결과물(Panel 다)은 비교예 2-1의 PCR 결과물(건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물 사용, Panel 가)이나 실시예 3의 PCR 결과물(분무건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물 사용, Panel 나)에 비해, 고농도의 Enterobacteria phage를 이용하였을 경우(10pg 사용)에는 DNA 밴드의 전기영동 상태가 깨끗하지 못하고, 저농도의 Enterobacteria phage를 이용하였을 경우(10fg 사용)에는 DNA 밴드가 약하게 확인되어 열안정성 DNA 중합효소의 활성 안정도가 낮음을 알 수 있었다.
또한, 고온건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용한 비교예 2-4의 PCR 결과물(Panel 라)은 DNA 밴드가 다른 조건에 비해 매우 약하게 확인될 뿐만 아니라, Enterobacteria phage 10fg을 사용한 곳에서는 DNA 밴드가 거의 보이지 않아, 고온건조법을 이용하여 중합효소연쇄반응 혼합물을 제조하는 방법은 열안정성 DNA 중합효소의 활성을 유지시키기에는 바람직하지 않은 방법임을 알 수 있었다.
한편, 상기 도 2에는 비교예 2-2의 PCR 결과물(질소건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물 사용)의 전기영동 결과는 포함되어 있지 않지만, 상기 PCR 결과물의 전기영동 결과는 비교예 2-3의 PCR 결과(동결건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물 사용, Panel 다)와 유사한 것으로 나타났다.
< 실험예 3. 분무건조법을 이용하여 제조한 중합효소연쇄반응 혼합물의 보관 온도에 따른 안정성 확인>
실시예 4의 PCR 결과물을 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 전기영동하여 확인하였고, 이에 대한 DNA 밴드 분석사진을 도 3에 나타내었다. 한편, 상기 실시예 4의 PCR을 수행할 때, 비교예 2-1의 방법과 동일한 방법의 PCR을 동시에 수행하여(건조하지 않은 중합효소연쇄반응 혼합물 사용) 대조군으로 이용하였다.
도 3을 참고하면, 40℃의 고온에 총 4주간 보관한 본 발명의 중합효소연쇄반응 혼합물을 이용한 실시예 4-1 내지 4-4의 PCR 결과(Panel 나~마)가 건조하지 않는 중합효소연쇄반응 혼합물을 사용한 비교예 2-1의 PCR 결과(Panel 가)와 거의 유사함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 중합효소연쇄반응 혼합물의 DNA 중합효소의 활성은 고온에서도 장시간 유지됨을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. (1공정) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)에 사용되는 반응혼합물을 제조하는 단계; 및,
    (2공정) 분무건조법을 이용하여 상기 반응혼합물을 PCR 튜브(PCR tube)에 분주하여 상기 반응혼합물이 PCR 튜브 안에서 30초~1분 동안에 건조되는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 1공정의 반응혼합물은 열안정성 DNA 중합효소, 효소안정화제, dNTPs, 반응용 완충용액, 증류수 및 젤로딩 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응 혼합물의 제조방법.
















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