KR101302154B1

KR101302154B1 - 항비만 효능이 향상된 큐빅상 나노입자 및 항비만 천연추출물 혼합 현탁액 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101302154B1
Application number: KR1020130021061A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 서승리; 이주협
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-08-30

Abstract

본 발명은 황련 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 사과 추출물 및 쑥 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연추출물 현탁액 및 큐빅상 나노입자 현탁액을 함유하는 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액 및 그 제조방법을 개시한다.

Description

항비만 효능이 향상된 큐빅상 나노입자 및 항비만 천연추출물 혼합 현탁액 및 그 제조방법{Cubic phase nanoparticle and herbal extracts mixture suspension exhibiting enhanced anti-obesity efficacy and method for preparing the same}

본 발명은 항비만 효능이 향상된 큐빅상 나노입자와 천연추출물의 혼합 현탁액에 관한 것으로, 구체적으로는 항비만 효능이 미비한 천연 추출물의 항비만 효능을 더욱 촉진시키는 큐빅상 나노입자 및 천연추출물의 혼합 현탁액에 관한 것이다.

영국, 미국, 오스트리아 국민의 2/3가 과체중이고, 1/4이 비만으로 보고될 정도로 세계의 비만이 위험 수준에 이르고 있다. 우리나라도 2009년 보건복지가족 통계연보에서 분석한 결과를 보면 1998년에 비해 약 10년 후인 2007년에 성인 비만율이 10% 이상 증가했음을 알 수 있고, 소아 비만율도 빠르게 증가하는 것으로 나타났다.

비만의 원인으로는 필요 이상의 과량의 음식 섭취와 운동량의 부족 그리고 유전적인 민감성 등을 꼽을 수 있다. 그 중에서도 가장 큰 요인은 고열량의 서구식 음식 섭취라 할 수 있다. 비만이 우리의 건강과 삶의 질에 있어서 많은 부정적인 결과를 초래하고 있는데 그 예로, 제2형 당뇨, 고혈압, 고 콜레스테롤 혈증, 심혈관 질환 등이 있다. 비만으로 인한 이러한 대사성 질환들이 점차 증가하고 있고 그에 따른 사회적 비용이 점차 증가하는 추세이다.

현재까지 사용된 비만 치료제는 작용 기작에 따라 크게 포만감 항진제, 지방 흡수 억제제, 향정신성 식욕 억제제로 나뉜다. 포만감 항진제는 뇌에서 식욕을 조절하는 신경 호르몬 세로토닌(serotonin)과 노르아드레날린(noradrenalin)의 재흡수를 억제해 식욕을 저해하며, 기초대사량을 증가시켜 에너지 소모도 늘린다. 리덕틸(Reductil)이 대표적이며 이 제품의 성분인 시부트라민(Sibutramine)은 심혈관계 부작용으로 현재 퇴출된 상태이다. 지방 흡수 억제제는 지방을 체내로 흡수하는 소화효소인 리파아제(lipase)의 기능을 억제해 섭취한 지방을 몸 밖으로 배출하는 기능을 한다. 이러한 지방 흡수억제제로는 올리스타트(Orlistat) 성분으로 제니칼(Xenical)이 대표적이다. 향정신성 식욕 억제제는 뇌에서 식욕을 조절하는 신경 호르몬 노르에피네프린(norepinephrine)과 도파민(dopamine)의 생성을 촉진해 식욕 자체를 감소시킴으로써 비만을 치료하고 그 성분으로는 펜디메트라진(phendimetrazine), 펜터민(phentermine)이 있다. 이러한 비만 치료제들은 많은 부작용을 수반하는데 대표적인 치료제인 시부트라민(Sibutramin)은 식약청에서 심근경색과 뇌졸중 등의 이유로 최종 판매 중지 및 자발적 회수 권고 조치를 결정해 시장에서 빠르게 자취를 감췄다. 부작용이 가장 적은 것으로 알려진 제니칼 또한 지방변, 장내가스발생, 복부팽만감 등의 부작용을 나타내고 있고 최근에는 신장장애를 호소하는 환자들도 생겨나는 추세이다.

위와 같이 합성 항비만 치료제들이 여러 부작용을 나타내며 한계를 보임에 따라 상대적으로 안정성이 확보되는 천연 비만 치료제의 개발이 활기를 띄고 있다.

그런데, 천연물에서 추출한 생리활성 물질은 일반적으로 화학적으로 불안정하고, 생체의 흡수성이 낮다는 단점이 있어 바로 사용하게 될 경우 그 효과가 물질 본래의 효능에 비해 현저히 낮아진다는 문제점이 있다.

수용성 화합물은 수상에서 열역학적 활동도가 낮기 때문에 수용성 화합물의 피부를 통한 투과성은 매우 낮다[B. Bendas, U. Schmalfub, R. Neubert, Influence of propylene glycol as cosolvent on mechanisms of drug transport from hydrogels, Int . J. Pharm . 116 (1995) 19-30]. 이에 수용성 추출물의 생체이용률 (bio-availability)과 효능(efficacy) 향상을 위하여 수용성 추출물의 피부침투성 (skin permeability)이 촉진되어야 한다.

이에 기존 항비만제의 부작용은 줄이고 천연물의 항비만 효능을 극대화할 수 있도록 생체에 안전하고 생체 적합한 전달체에 대한 연구가 매우 절실한 실정이다.

한편, 모노올레인(1-monooleoyl glycerol, MO) 큐빅상은 약물 전달체로서 많은 장점을 지니고 있기 때문에 관련 학계와 산업계에 많은 관심을 받아오고 있다. 모노올레인은 적량 또는 과량의 물과 평형상태를 이룰 때 큐빅상을 형성한다고 알려져 있다[L. Sagalowicz, M. E. Leser, H. J. Watzke and M. Michel, Trends Food Sci. Technol. 17, 204-214 (2006)]. 큐빅상은 광학적으로 투명하고, 상호 가로지르는 수상 채널들을 가지고 있다. 그 수상채널들은 MO 이중층들에 의해서 분리되어 있고 직경은 5 ~ 7 nm이다. 큐빅상은 지질매트릭스에 수상채널을 가지고 있기 때문에 수상채널에 수용성 화합물(water-soluble compounds)을 탑재할 수 있고 매트릭스에 지용성 화합물(oil-soluble compounds)을 탑재할 수 있다. 게다가, 큐빅상은 인체에 독성이 없고 면역반응을 유발하지 않는다 [J. C. Shah, Y. Sadhale, D. M. Chilukuri, Adv. Drug Deliv. Rev. 47, 229-50 (2001), S. Fraser, F. Separovic, A. Polyzos, Eur. Biophys. J. 39, 83-90 (2009)].

대한민국 등록특허 제0156916호(발명의 명칭: 치근막 질환 치료용 서방성 조성물)에는 모노올레인 1 내지 99%와 소염제, 항미생물제, 항생제, 퍼옥사이드, 마취제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며 구강 질환 치료에 적합한 활성 약제 1 내지 90%로 이루어진 구강 질환을 앓는 사람 또는 하등동물의 치근막낭 속에 또는 이의 주위에 주입하기에 적합한 조성물에 대해 개시되어 있다. 그러나, 여기에는 항비만 효능이 향상된 큐빅상 나노입자 및 천연추출물 혼합 현탁액에 대해서는 개시된 바 없다. 대한민국 공개특허 제2003-0083348호(발명의 명칭: 지방세포 분화 저해 활성을 가지는 프로토베르베린알칼로이드 화합물인 베르베린을 유효성분으로 함유하는 비만예방 및 치료)에는 현호색(Corydalis ternata), 애기똥풀(Chelidonium major), 황련(Coptis japonica), 황백(Phellodendron amurense)으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 생약으로부터 유래된 프로토베르베린알칼로이드 화합물인 베르베린을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 대해 개시되었다. 그러나, 여기에는 항비만 효능이 향상된 큐빅상 나노입자 및 천연추출물 혼합 현탁액에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 항비만 효능이 미비한 천연추출물의 항비만 효능을 더욱 향상시킬 수 있는 항비만용 혼합 현탁액 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자 현탁액을 혼합함으로써, 경피 흡수성이 촉진되고 항비만 효능이 향상된 항비만용 혼합 현탁액 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 천연추출물을 이용하여 인체안전성이 확보된 항비만용 혼합 현탁액 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황련 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 사과 추출물 및 쑥 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연추출물 현탁액 및 큐빅상 나노입자 현탁액을 함유하는 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액을 제공한다.

본 발명은 큐빅상 나노입자는 수용성 성분과 지용성 성분을 동시에 탑재할 수 있고 경피흡수 촉진효과가 있기 때문에, 항비만 천연 추출물의 항비만 효능을 더욱 증진 시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 (A) 모노올레인 용융액에 수상을 첨가하여 모노올레인 큐빅상을 제조하는 단계; (B) 상기 모노올레인 큐빅상을 분산제가 용해된 수상에 첨가한 후, 균질화시켜 큐빅상 나노입자 현탁액을 제조하는 단계; (C) 황련 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 사과 추출물 및 쑥 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연추출물을 분산제가 용해된 수용액과 혼합한 후, 균질화하여 천연추출물 현탁액을 제조하는 단계; 및 (D) 상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연추출물 현탁액을 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 큐빅상 나노입자 현탁액은 모노올레인으로 큐빅상을 제조하고, 분산제가 용해되어 있는 수상에 상기 큐빅상을 첨가하여 균질화함으로써 제조되며, 천연추출물 현탁액은 천연추출물을 분산제가 용해된 수용액과 혼합한 후 균질화함으로써 제조되고, 상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연추출물 현탁액을 혼합하여 항비만용 혼합 현탁액이 제조된다.

이하에서는 본 발명의 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법에 대하여 자세히 설명하겠다.

(A) 모노올레인 용융액에 수상을 첨가하여 모노올레인 큐빅상을 제조하는 단계

본 단계는 모노올레인으로 큐빅상을 제조하는 단계로, 모노올레인을 융융시킨 후 수상을 첨가하여 모노올레인 큐빅상을 제조하는 단계이다.

구체적으로 모노올레인을 물중탕으로 가온하여 용융시키고 여기에 수상을 첨가하고, 상온(20 ~ 25℃)에서 수상이 완전히 흡수되어 투명한 반고체가 형성될 때까지 방치한다.

이때, 모노올레인을 물중탕으로 가온하여 용융시킬 때의 온도는 모노올레인의 용융점(약 32℃)보다 높은 온도에서 용융시키는데 그 온도가 100℃ 이상이 되지 않게 한다. 융점 이하의 온도에서는 모노올레인이 용융되지 않고 100℃ 이상의 온도에는 모노올레인의 이중결합이 파괴되어서 큐빅상이 형성되지 않는다. 바람직하게는 모노올레인 용융액의 온도는 45 ~ 70℃이다.

또한, 모노올레인 용융액에 수상을 첨가할 때 수상의 온도는 모노올레인 용융액의 온도와 동일하게 하는 것이 바람직하다. 수상의 온도가 모노올레인 용융액의 온도보다 낮을 때는 모노올레인이 고화(solidification)될 수 있고, 수상의 온도가 모노올레인의 온도보다 높을 때는 모노올레인의 이중결합이 파괴될 수 있다.

또한, 모노올레인 : 수상의 무게비는 바람직하게는 1 : 0.1 ~ 1 : 1, 더욱 바람직하게는 1 : 0.2 ~ 1 : 0.7, 가장 바람직하게는 1 : 0.4 ~ 1 : 0.5이다. 이 범위보다 낮은 무게 비에서는 헥사고날상(hexagonal phase)이 형성되고 큐빅상은 형성되지 않는다. 이 범위보다 높은 무게 비에서는 수상이 모두 흡수되지 않는다.

(B) 상기 모노올레인 큐빅상을 분산제가 용해된 수상에 첨가한 후, 균질화시켜 큐빅상 나노입자 현탁액을 제조하는 단계

본 단계는 상기 (A)단계에서 제조된 모노올레인 큐빅상을 분산제가 용해된 수상에 첨가한 후, 균질화시켜 큐빅상 나노입자 현탁액을 제조하는 단계이다.

본 발명의 모노올레인 큐빅상은 분산제가 용해되어 있는 수상에 첨가하여 균질화하는 것이 바람직한데, 이때, 수상에서 분산제의 농도는 바람직하게는 0.05중량% ~ 2중량%, 더욱 바람직하게는 0.1중량% ~ 1중량%, 가장 바람직하게는 0.15중량% ~ 0.5중량%이다. 이 범위보다 낮은 농도에서는 분산제의 농도가 너무 낮아서 큐빅상이 균질화 되지않고, 이 범위보다 높은 농도에서는 분산제의 농도가 너무 높아서 큐빅상이 가용화(solubilization) 된다.

또한, 균질화할 때에 분산제로서는 친수성 친유성 평형(HLB, hydrophilic lipophilic balance HLB) 넘버가 18 ~ 23인 것이 바람직하다. 이보다 낮은 친수성 친유성 넘버를 가지는 분산제는 그 자체가 물에 분산이 잘 되지 않아서 분산제 역할을 할 수 없고 이보다 높은 친수성 친유성 넘버를 가지는 분산제는 표면 활성력 (surface activity)이 너무 높아서 큐빅상을 가용화시킨다. 대표적인 분산제로서는 Pluronic 407, Pluronic F127, Pluronic F128, Pluronic F87, PEG-80 Sorbitan Laurate 등이 사용될 수 있다.

또한, 큐빅상을 분산제가 용해되어 있는 수상에 첨가하여 균질화할 때, 회전 임펠러 균질기, 초음파 균질기, 초고압 균질기 등이 사용될 수 있다.

한편, 분산제가 용해되어 있는 수상에 대하여 첨가되는 모노올레인 큐빅상의 농도(모노올레인 큐빅상/분산제가 용해되어있는 수상, w/v)는 바람직하게는 0.5 ~ 1.5%(w/v), 더욱 바람직하게는 1%(w/v)이다. 이보다 낮은 농도에서는 모노올레인 큐빅상의 농도가 너무 작아서 항비만 효능이 저하되고 이보다 높은 온도에서는 모노올레인 큐빅상이 일부 분산되지 않고 덩어리지게 된다.

(C) 황련 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 사과 추출물 및 쑥 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연추출물을 분산제가 용해된 수용액과 혼합한 후, 균질화하여 천연추출물 현탁액을 제조하는 단계

본 단계는 천연추출물을 분산제가 용해된 수용액과 혼합한 후, 균질화하여 천연추출물 현탁액을 제조하는 단계이다.

본 발명에서 사용되는 천연추출물의 추출방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 용매추출, 열수추출, 초임계추출, 초음파추출 등이 사용될 수 있다.

이때, 분산제가 용해된 수용액에 첨가되는 천연추출물의 농도는 바람직하게는 1 ~ 3%(w/v), 더욱 바람직하게는 2%(w/v)이다. 이보다 낮은 농도에서는 천연추출물의 농도가 너무 낮아 항비만 효능이 저하되고, 이보다 높은 농도에서는 함유량의 증가분에 비해 효과의 상승폭이 적어 경제적이지 못하다.

(D) 상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연추출물 현탁액을 혼합하는 단계

본 단계는 상기 (B)단계에서 제조된 큐빅상 나노입자 현탁액과, 상기 (C)단계에서 제조된 천연추출물 현탁액을 혼합하여 큐빅상 나노입자 및 항비만 천연추출물 혼합 현탁액을 제조하는 단계이다.

본 발명은 이와 같이 큐빅상 나노입자 현탁액과 천연추출물 현탁액을 혼합함에 따라 친수성 천연추출물 뿐만 아니라 소수성 천연추출물도 나노입자에 잘 포접될 수 있다.

이때, 상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연추출물 현탁액의 혼합비는 바람직하게는 0.5 ~ 1.5 : 0.5 ~ 1.5, 더욱 바람직하게는 1 : 1이다. 이 경우 항비만 효능이 매우 우수한 혼합 현탁액을 제조할 수 있다.

본 발명의 항비만용 혼합 현탁액은 혼합 현탁액에 포함되어 있는 큐빅상 나노입자가 천연 추출물의 생체이용률을 촉진시킴으로써 항비만 천연추출물의 항비만 효능을 향상시킬 수 있다. 즉, 큐빅상 나노입자는 수용성 성분과 지용성 성분을 동시에 포접할 수 있고, 피부지질과 상호작용할 수 있으며, 각질층을 투과하는 특징을 가지고 있기 때문에, 항비만 효능이 미미한 천연 추출물의 항비만 효능을 극대화시키는 효과를 발휘한다.

도 1a 내지 1f는 큐빅상 나노입자 현탁액과 각각의 큐빅상 나노입자/천연 추출물 혼합 현탁액의 투과전자현미경사진이다. 도 1a는 큐빅상 나노입자 현탁액의 TEM사진, 도 1b는 큐빅상 나노입자/황련 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1c는 큐빅상 나노입자/녹차 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1d는 큐빅상 나노입자/포도 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1e는 큐빅상 나노입자/사과 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1f는 큐빅상 나노입자/쑥 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진이다.
도 2는 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액에 포함되어 있는 입자의 평균 크기를 관찰한 결과이다(검은색은 큐빅상 나노입자 현탁액, 보라색은 천연추출물 현탁액, 빨간색은 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액).
도 3은 큐빅상 나노입자가 함유되지 않은 천연 추출물 현탁액의 농도에 따른 세포 생존율(세포 독성)을 관찰한 결과이다(검은색은 포도, 빨간색은 사과, 연두색은 녹차, 노란색은 황련, 파란색은 쑥).
도 4는 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 천연물 농도에 따른 세포생존율(세포 독성)을 관찰한 결과이다(검은색은 포도, 빨간색은 사과, 연두색은 녹차, 노란색은 황련, 파란색은 쑥).
도 5는 큐빅상 나노입자 현탁액, 천연추출물 현탁액, 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액으로 처리한 지방세포의 분화율을 나타낸 도이다(초록색은 큐빅산 나노입자 현탁액, 파란색은 천연추출물 현탁액, 빨간색은 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액, 검은색은 시료를 처리하지 않은 경우).
도 6은 시료의 처리에 따른 실험쥐의 평균 체중 증가량을 측정한 결과이다(검은색은 정규식을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐 그룹, 노란색은 고열량식을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐 그룹, 보라색은 고열량식을 섭취시키고 천연추출물 현탁액을 도포한 실험쥐 그룹, 빨간색은 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 도포한 실험쥐 그룹, 초록색은 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자를 도포한 실험쥐 그룹)
도 7은 시료 처리에 따른 실험쥐의 평균 간 무게를 측정한 결과이다(초록색은 정규식을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐, 검은색은 고열량식을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐의 그룹, 보라색은 고열량식을 섭취시키고 천연추출물 현탁액을 도포한 실험쥐, 빨간색은 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 도포한 실험쥐의 그룹, 노란색은 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자를 도포한 실험쥐 그룹).

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 큐빅상 나노입자 및 천연추출물의 혼합 현탁액 제조

모노올레인(MO) 0.5 g을 20 ml 유리병에 담고, 65℃로 맞춰진 물에서 중탕하여 용융시켰다. 그리고 동일한 온도로 가열된 증류수 0.215 g을 모노올레인 용융액 위에 첨가하였다. 뚜껑을 닫아 유리병을 밀봉하고 수용액이 모노올레인(MO)층에 완전히 흡수되어서 투명한 겔이 될 때까지 상온(22℃)에서 방치하여 모노올레인 큐빅상을 제조하였다.

100 ml의 비이커에 담겨져 있는 25 ml의 Pluronic 128 수용액(0.2%)에 상기 모노올레인 큐빅상을 담그고 균질기를 이용하여 큐빅상을 분쇄함으로써 큐빅상 나노입자 현탁액을 제조하였다.

황련, 녹차, 포도, 사과 및 쑥을 각각 열수추출하여 수득된 각각의 천연추출물(2%) 1 g을 Pluronic F-127 수용액(0.2%) 25 ml로 희석하고, 희석된 천연 추출물을 초음파분산기(bath-type sonicator)(VC 505, Sonic & Materials, USA , 30% energy intensity,30 sec pulse on, 30sec pulse off)를 이용하여 20 ~ 30분간 균질화함으로써 천연추출물 현탁액을 제조하였다.

상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연 추출물 현탁액을 혼합하고 상온에서 48시간 동안 교반시킴으로써, 큐빅상 나노입자 및 항비만 천연추출물 혼합 현탁액을 제조하였다. 이때, 모노올레인, 천연추출물 그리고 Puronic 128의 최종농도는 각각 1 중량%, 2 중량% 및 0.2 중량% 였다.

실시예 2: 큐빅상 나노입자 및 천연추출물의 혼합 현탁액의 관찰

<전자 현미경 사진 관찰>

큐빅상 나노입자 및 천연추출물의 혼합 현탁액의 TEM사진을 네거티브 스테이닝 기법(negative staining technique)으로 전처리한 후에 촬영하였다[JO, S.M., Lee, H. Y., Kim, J. C. (2009). Int . J. Biol . Macromol., 45, 421.].

큐빅상 나노입자 현탁액과 각각의 큐빅상 나노입자 및 천연추출물의 혼합 현탁액을 각각 phosphotungstic acid(PTA) 수용액(2%)과 동일 부피 비로 혼합하고 상온에서 2 ~ 3시간 동안 방치하여 염색된 각각의 현탁액 소량을 formvar-coated carbon grid (Electron Microscopy Science, 200 mesh)에 침적(deposition)시키고 상온에서 24시간 동안 자연 건조하였다. 그 다음, 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope (LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Germany))에 그리드(grid)를 장착시키고 각각의 현탁액의 영상이미지를 얻었다.

도 1a 내지 1f는 큐빅상 나노입자 현탁액과 각각의 큐빅상 나노입자/천연 추출물 혼합 현탁액의 투과전자현미경사진이다. 도 1a는 큐빅상 나노입자 현탁액의 TEM사진, 도 1b는 큐빅상 나노입자/황련 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1c는 큐빅상 나노입자/녹차 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1d는 큐빅상 나노입자/포도 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1e는 큐빅상 나노입자/사과 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진, 도 1f는 큐빅상 나노입자/쑥 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진이다.

도 1a에서 나타나는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 큐빅상 나노입자 현탁액의 TEM사진에서 스트라이프 줄무늬가 관찰되었다. 큐빅상 나노입자는 그 내부에 수로들(water channels)을 가지고 있기 때문에 스테이닝 수용액(PTA수용액)으로 염색하면 그 수용액이 미세수로를 채우게 된다. 따라서 투과전자 현미경의 전자빔이 미세수로부분은 통과하지 못하고 미세수로를 둘러싸고 있는 지질 메트릭스 부분만 통과한다. 결과적으로, 미세수로의 스트라이프 줄무늬가 관찰된다.

도 1b 내지 1f에 나타나는 바와 같이, 큐빅상 나노입자/천연 추출물 혼합 현탁액의 TEM사진에서도 스트라이프 줄무늬가 관찰되었다. 이로부터 큐빅상 나노입자 현탁액이 천연추출물 현탁액과 함께 존재하여도 큐빅상 나노입자의 구조가 유지되고 천연추출물은 큐빅상 나노입자의 구조에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다.

<입자의 크기 관찰>

광산란(dynamic light scattering)장치를 이용하여 큐빅상 나노입자 현탁액, 천연추출물 현탁액, 및 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 입자 크기를 관찰하였다.

도 2는 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합현탁액에 포함되어 있는 입자의 평균 크기를 관찰한 결과이다. 검은색은 큐빅상 나노입자 현탁액의 평균 크기, 보라색은 천연추출물 현탁액의 입자 평균 크기, 빨간색은 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 입자 평균 크기를 나타낸다.

녹차, 포도, 사과, 황련, 쑥 추출물의 입자의 평균 크기는 각각 274.3 nm, 518.5 nm, 1205.2 nm, 1333.5 nm, 1633.1 nm 이었고, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합현탁액의 입자의 평균 크기는 각각 205.6 nm, 223.2 nm, 294.1 nm, 251.1 nm, 835.2 nm이었다. 이와 같이, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합현탁액의 입자의 평균크기는 큐빅상 나노입자 현탁액이 함유되지 않은 천연 추출물 현탁액의 입자의 평균 크기보다 훨씬 작았는데, 이는 큐빅상 나노입자가 유용성분(oil-soluble ingredient)의 입자를 용해시키는 효과 때문이라고 판단되었다.

실시예 3: 천연 추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연 추출물 혼합 현탁액의 독성평가( in vitro )

본 실시예에서는 천연 추출물의 농도에 따른 세포독성을 관찰하기 위하여 3T3-L1을 천연 추출물이 함유된 배지에서 배양하였다. 3T3-L1을 96 웰 플레이트(well plate)에 1 x 10⁵ cells/well이 되도록 넣은 후, CO₂ 분위기(5%)에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 천연추출물 현탁액, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 첨가하고(2 μg/ml), 동일한 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 상등액을 제거하고, 세포를 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS, pH7.4)으로 세척하였다. 그 후, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액 (5 mg/ml, PBS) 100 ㎕를 첨가하고 동일 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상등액을 제거한 다음 PBS(pH 7.4)로 세포를 2회 세척하고, DMSO 100 ㎕를 첨가하여 30분간 상온에 방치한 후에 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3은 천연추출물 현탁액의 농도에 따른 세포 생존율(세포 독성)을 관찰한 결과이다. 검은색은 포도, 빨간색은 사과, 연두색은 녹차, 노란색은 황련, 파란색은 쑥의 결과를 나타낸다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 천연추출물의 농도가 증가할수록 세포독성(천연추출물 현탁액, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 처리하지 않은 실험군을 100% 생존율로 하여 계산, M.C.E. McFadyen, H.L. McLeod, F.C. Jackson, W.T. Melvin, J. Doehmer and G.I. Murray, Biochem. Pharmacol. Vol.62 pp.207-212 (2001))이 증가하였다. 또한, 포도, 사과, 녹차, 황련 추출물의 세포독성에는 큰 차이가 없었고, 10 ㎍/mL의 농도에서도 세포 생존율이 80%이상으로 나타났다. 다만, 천연추출물 중에서 쑥 추출물이 0.25 ㎍/mL에서 82%의 생존율을 나타내었고, 10 ㎍/mL에서는 58%의 생존율을 나타내어 비교적 높은 독성을 나타내었다.

도 4는 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 천연물 농도에 따른 세포생존율(세포 독성)을 관찰한 결과이다. 검은색은 포도, 빨간색은 사과, 연두색은 녹차, 노란색은 황련, 파란색은 쑥의 결과를 나타낸다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 포도, 사과, 녹차. 황련 추출물의 현탁액은 시험한 모든 농도 범위(0.25 ㎍/mL ~ 10 ㎍/mL)에서 세포생존율이 80%이상 유지되었으나, 쑥 추출물의 현탁액은 0.25 ㎍/mL에서 세포 생존율이 65%, 그리고 10 ㎍/mL에서 세포생존율이 57%에 불과하였다.

상기 세포독성 결과에 따라서 비만세포의 성장을 저해하지 않는 농도에서 하기 항비만 효능 평가를 실시하였다. 포도, 사과, 녹차. 황련 추출물은 10 ㎍/mL에서 그리고 쑥 추출물은 그리고 쑥 추출물은 0.1 ㎍/mL에서 항비만 효능을 평가하였다.

실시예 4: 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 비만세포 분화율 저해 효능 평가

본 실시예에서는 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 비만세포 분화율 저해 효능을 평가하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키고 지방세포에 대한 항비만 효능을 평가하였다[(S.G. Lee, Korean J. Oriental Physiology & Pathology Vol. 24(2) pp.266∼271 (2010)].

3T3-L1 지방전구세포를 12 웰(well)에 1 x 10⁵ cell/well이 되도록 넣은 뒤, FBS 10%가 함유된 DMEM에 0.05M IBMX(isobutylmethylxanthine) = 100 : 1, 167 μM 인슐린 = 1000 : 1, 1 mM Dexamethasone = 1000 : 1로 혼합하고 4일 동안 배양하였다. 그 다음 1 μg/mL의 인슐린만 포함된 배지에서 2일 동안 배양하였다. 3T3-L1의 지방세포 분화유도 완료 후, 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 함유한 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

지방세포의 분화를 억제하는 활성(항비만 효능)은 하기와 같이 평가하였다. 우선 각 웰(well)의 상층액을 제거하고 2 ml의 PBS를 각각 넣어 세척한 후, 세포를 고정시키기 위하여 10% 포르말린(formalin)을 각 웰(well)에 1 ml씩 넣고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 포르말린(Formalin)을 제거하고 증류수 2 ml로 두 번씩 세척하고 이소프로판올(60%) 1 ml를 각 웰(well)에 넣고 상온에서 5분간 배양하였다. 배양 후, 이소프로판올을 제거하고, 세포를 완전히 건조하였다. 건조한 후, Oil red O working solution을 각 웰(well)에 넣고 상온에서 10분간 배양하고, Oil red O working solution을 제거한 후, 즉시 증류수로 4번 헹구고 건조시켰다. 그 다음 이소프로판올(100%) 1.5 ml를 넣고 10분간 상온에서 조심스레 흔들었다. 10분 후, 96 웰(well)에 옮겨 닮고 540 nm에서 흡광도에서 측정하였다. 지방세포의 분화율(%)은 하기 수학식으로 계산하였다.

[수학식 1]

분화율 (%) = 시료를 처리한 실험군 지방 세포 흡광도/시료를 처리하지 않은 대조군 지방 세포 흡광도 x 100

도 5는 큐빅상 나노입자 현탁액, 천연추출물 현탁액, 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액으로 처리한 지방세포의 분화율을 나타낸 도이다. 초록색은 큐빅산 나노입자 현탁액, 파란색은 천연추출물 현탁액, 빨간색은 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액, 검은색은 시료를 처리하지 않은 지방세포의 분화율을 나타낸다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 큐빅상 나노입자 현탁액이 함유되지 않은 사과 추출물, 녹차 추출물, 포도추출물, 황련 추출물, 쑥 추출물 현탁액으로 처리한 지방세포의 분화율은 각각 72.4%, 88.1%, 66.5%, 80.3%, 75.7%으로 나타났다. 이는 지방세포 분화율 억제 효능이 포도 추출물 > 사과추출물 > 쑥 추출물 > 황련 추출물 > 녹차 추출물 순서임을 의미한다.

또한, 큐빅상 나노입자 현탁액이 혼합된 사과 추출물, 녹차 추출물, 포도 추출물, 황련 추출물, 쑥 추출물 현탁액으로 처리한 지방세포의 분화율은 각각 63.3%, 77.1%, 84.9%, 69.0%, 76.8%으로 나타나 큐빅상 나노입자 현탁액이 혼합되지 않은 천연 추출물 현탁액의 분화억제 효과보다 매우 높음을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과는 큐빅상 나노입자 현탁액이 지방세포 표면으로 용이하게 흡착(adsorption) 또는 내재화(internalization)되기 때문이거나, 큐빅상 나노입자를 구성하는 모노올레인이 지방세포벽의 지질과 상호작용하여 지방세포벽의 투과성을 향상시켜서 지방세포로의 천연물 추출물의 전달이 용이해졌기 때문이라고 판단되었다.

실시예 5: 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 항비만 효능 평가( In vivo )

본 실시예에서는 실험쥐(C57BL6)를 희생시켜서 천연추출물 현탁액과 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액의 항비만 효능을 평가하였다.

<생화학적 평가>

클리퍼(clipper)를 이용하여 실험쥐의 등을 제모하고 1주일 동안 적응시켰다. 실험쥐 4마리를 한 그룹으로 그룹핑 하고, 고 열량식(fat food) 또는 정규식(normal food) 그리고 물을 자유롭게 공급하였다. 고 열량식을 섭취시킨 그룹에는 천연추출물 현탁액 또는 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액 0.4 ml를 매일 쥐의 등에 한달 동안 도포하였고, 정규식을 섭취시킨 그룹에는 증류수를 도포하였다. 시료의 도포가 끝난 30일 후에 실험쥐를 에테르를 이용한 마취상태에서 개복하여 후대정맥에서 채혈한 다음 30분 이내에 3000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 분리된 혈청을 deep frezzer(-72℃)에 보관후 자동혈액분석기(ADVIA2120, SIEMENS, USA)로 측정하였다.

항비만 생화학 평가로서, 아스파르테이트 아미노전이요소(aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 총 콜레스테롤(total cholesterol), 트리글리세라이드(Triglyceride, TG), 알부민(abumin), 블러드 우레아 나이트로젠(Blood Urea Nitrogen, BUN), 저밀도 리포프로테인(low density lipoprotein, LDL), 고밀도 리포 프로테인(high density lipoprotein, HDL), 렙틴(leptin)의 함량 분석을 실시하였다. 하기 표 1은 항비만 관련 생화학적 평가 결과이다.

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 천연추출물 현탁액보다 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액이 AST 함량, ALT 함량, 총콜레스테롤 함량, 트리글리세라이드 함량, BUN 함량, LDL 함량을 더욱 효과적으로 낮추고 알부민 함량과 HDL 함량을 더욱 효과적으로 높였다. 이로부터 큐빅상 나노입자 현탁액은 항비만 효능이 있는 천연추출물의 항비만 효능을 더욱 향상시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<체중 증가량 측정>

상기와 같은 조건으로 실험쥐에 시료를 도포하고, 30일 후에 실험쥐를 에테르로 마취시켜서 희생시킨 후 체중을 측정하였다.

도 6은 시료의 처리에 따른 실험쥐의 평균 체중 증가량을 측정한 결과이다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 고열량식을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐는 평균 체중이 66.6% 증가하였다. 고열량식을 섭취시키고 천연추출물 현탁액을 도포한 실험쥐는 평균체중이 증류수를 도포한 체중보다 적었다. 구체적으로, 쑥, 사과, 녹차, 황련, 포도 추출물 현탁액으로 도포한 실험쥐의 평균체중은 각각 61.3%, 56.8%, 63.5%, 62.9%, 60.4%로 증가하였다. 또한, 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액을 도포한 실험쥐의 평균체중 증가량은 천연 추출물 현탁액을 도포한 실험쥐의 평균 체중 증가량보다 적었다. 구체적으로, 큐빅상 나노입자가 혼합된 쑥, 사과, 녹차, 황련, 포도 추출물 현탁액으로 도포한 실험쥐의 평균 체중 증가량은 각각 55.7%, 50.6%, 52.7%, 59.9%, 56% 증가하였다.

상기와 같이, 천연추출물 현탁액은 체중감량 효과를 나타내었고, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액은 단순 천연추출물 현탁액에 대비하여 체중 감량효과 면에서 더욱 효과적이었다.

<간 무게 측정>

상기와 같은 조건으로 실험쥐에 시료를 도포하고, 30일 후에 실험쥐를 에테르로 마취시켜서 희생시킨 후 간을 적출하여 간의 중량을 측정하였다.

도 7은 시료 처리에 따른 실험쥐의 평균 간 무게를 측정한 결과이다. 도 7에 의하면, 고열량을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐는 평균 간 무게가 14.75 g이었다. 고열량식을 섭취시키고 천연추출물 현탁액인 쑥, 사과, 녹차, 황련, 포도 추출물 현탁액으로 도포한 실험 쥐의 평균 간 무게는 각각 13.0 g, 14.3 g, 14.1 g, 13.4 g, 14.4 g으로, 상기 고열량을 섭취시키고 증류수를 도포한 실험쥐의 평균 간 무게보다 조금 적거나 거의 차이가 없었다.

또한, 고열량식을 섭취시키고 큐빅상 나노입자/천연추출물의 혼합 현탁액으로 도포한 실험쥐의 평균 간 무게는, 쑥, 사과, 녹차, 황련, 포도 추출물의 순서로 12.3 g, 13.0 g, 13.1 g, 12.9 g, 12.8 g이었다. 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액을 도포한 실험쥐의 평균 간 무게는 천연추출물 현탁액을 도포한 실험쥐의 평균 간 무게보다 뚜렷하게 적었다.

상기와 같이, 큐빅상 나노입자/천연추출물 혼합 현탁액은 단순 천연추출물 현탁액보다 우수한 간 무게 감량효과를 나타내었다.

Claims

삭제
(A) 모노올레인 용융액에 수상을 첨가하여 모노올레인 큐빅상을 제조하는 단계;
(B) 상기 모노올레인 큐빅상을 분산제가 용해된 수상에 첨가한 후, 균질화시켜 큐빅상 나노입자 현탁액을 제조하는 단계;
(C) 황련 추출물, 사과 추출물 및 쑥 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연추출물을 분산제가 용해된 수용액과 혼합한 후, 균질화하여 천연추출물 현탁액을 제조하는 단계; 및
(D) 상기 큐빅상 나노입자 현탁액과 상기 천연추출물 현탁액을 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 모노올레인 용융액은,
모노올레인을 45 ~ 70 ℃의 온도에서 물중탕으로 용융시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (A)단계에서,
상기 수상의 온도는 상기 모노올레인 용융액의 온도와 동일한 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (A)단계에서,
상기 모노올레인 용융액 : 수상의 무게비는 1 : 0.1 ~ 1 : 1인 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (B)단계에서,
상기 분산제의 농도는 수상 전체에 대하여 0.05 ~ 2중량%인 것을 특징으로 하는 항비만용 혼합 현탁액의 제조방법.