KR101291737B1

KR101291737B1 - 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스를 검지할 수 있는 압타머 및 그를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101291737B1
Application number: KR1020110064537A
Authority: KR
Inventors: 정용주; 조성제; 우혜민
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-07-31
Also published as: KR20120139512A

Abstract

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)에 대한 센서에 이용할 수 있는 특정한 서열의 올리고뉴클레오타이드 압타머에 관한 발명으로서, 특히 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 압타머는 중증 급성 호흡기 증후군 사스-코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 와 특별한 친화력을 가지고 있으며 항체 이상의 효과를 나타낸다.
본 발명의 뉴클레오타이드 분자는 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 항체에 비해 크기가 월등히 작고 또한 표적분자와 높은 결합력으로 결합할 수 있다. 또한 온도 변화에 민감하지 않으며, 변성이 되었다 하더라도 빠른 시간 내 재생이 가능하다.

Description

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스를 검지할 수 있는 압타머 및 그를 포함하는 약학적 조성물{Aptamer specific to Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus nucleocapsid and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)를 검지하는 센서로 이용할 수 있는 특정한 서열의 올리고뉴클레오타이드 압타머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중증 급성 호흡기 증후군 사스-코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid와 특별한 친화력을 가지고 있으며 항체 이상의 효과를 보이는 특정 서열의 올리고뉴클레오타이드 압타머에 관한 것이다.

새로운 코로나바이러스에 의해 발병되는 중증 급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, 이하 'SARS'라 함)은 2002년 중국의 광동지방에서 발생한 이래 전 세계적으로 약 30여개 나라에서 발병함으로써 세계적으로 판데믹을 일으켰다[Qugai. et. al., Journal of Virological Methods (2005) 46-53]. 'SARS'는 8000여명의 감염자 중 약 10%에 해당되는 800여명을 사망에 이르게 했을 만큼 치사율이 높은 바이러스성 질환이다[World Health organization, Summary of probable SARS cases with onset of illness from 1^st November 2002 to 31^st july 2003, http://www.who.int/csr/sars/contry/(2003)].
이와 같이 감염자 중 10%의 치사율을 야기한 중증 급성 호흡기 증후군을 치료하기 위해서는 사스-코로나바이러스(SARS-CoV)를 검지할 수 있는 특이적인 센서의 개발이 필요하다.
SARS-CoV는 약 30kb의 단일 나선 RNA 양성 가닥을 유전 물질로 가진 바이러스이다[M.A. Marra, et. Al., Science 300(2002) 1399-1404;P.A. Rota, et. Al., Science 300 (2003) 1394-1399].
Nucleocapsid 단백질은 코로나바이러스의 바이러스성 포장, 바이러스성 핵 생성, 바이러스 RNA를 합성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그리고 Nucleocapsid 단백질의 C-말단 라이신이 풍부한 부분이 핵 안으로 들어가는데 중요한 역할을 하는 핵국재화 신호의 기능을 한다고 알려져 있다[Milan Surjit at all. Infection, Genetics and Evolution 8 (2008) 397~405].
그 결과로 SARS-CoV에 감염된 세포에서는 세포질과 핵 두 군데 모두에서 Nucleocapsid 단백질이 발견되었다. 이렇듯 SARS-CoV의 구조 단백질의 하나인 Nucleocapsid 단백질은 여러 가지 기능을 하면서 바이러스 생활 주기의 중요한 역할을 하는 단백질이기 때문에 SARS-CoV를 억제하거나 검출할 수 있는 좋은 타겟이된다.
In vitro 선택 전략으로 SELEX법(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)을 사용하여 단일 가닥의 DNA 리간드(압타머)를 동정할 수 있으며, 이러한 DNA 압타머는 높은 친화도를 가지고 타겟 단백질에 결합하는 복합체 구조로 채택될 수 있다[c. Tierl. L. Gold, Science 249 (1990) 505-510;A.D Ellington, 등, Nature 346 (1990) 818-822]. SELEX는 단백질, 유기 소분자들을 포함하는 타겟 분자들에 대한 높은 친화도의 DNA 및 RNA 리간드를 분리하는 효율적인 방법이다[S.D. Jayasena, Clin Chem. 45 (1999) 1628-1650].

*SARS Helicase의 경우 DNA 압타머가 SELEX법을 사용하여 분리되었고 인 비트로에서 효소 활성을 저해할 수 있었다[Ka To Shum and Julian A. Tanner, ChemBioChem (2008) 9, 3037~3045]. 그러나 SARS CoV Nucleocapsid와 친화력 있는 DNA 압타머를 분리한 시도는 현재까지 없었으며, SARS-CoV를 억제하거나 검출할 수 있는 타겟으로 DNA 압타머를 분리할 필요성이 제기되고 있다.

본 발명은 SARS 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 단백질을 검지할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 DNA 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 단백질과 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 압타머 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오타이드 압타머 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV)에 감염의 치료 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

이상과 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 SARS-CoV/Nucleocapsid 단백질을 검지할 수 있는 검출물질인 특정 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드들을 연구하였으며, 45 뉴클레오타이드의 랜덤 서열을 함유하는 DNA 라이브러리로부터 SELEX법을 이용하여 SARS-CoV/Nucleocapsid 단백질을 검지할 수 있는 DNA 압타머를 분리하였다. SELEX의 12연속 라운드 후에 얻어진 DNA 압타머 라이브러리에서 그 단백질에 친화도가 있는 15개의 DNA 압타머 후보물질을 분리하여 아래에 기재한 바와 같이 nucleocapsid에 대한 친화도 및 항체 대용으로서의 사용가능성을 확인하였다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 분자는 센서로 사용될 수 있으며, 예를 들면 압타머와 표적분자간의 결합 전후에 나타나는 전자 전달정도를 감응하여 반응하는 전기화학적 방식의 센서, 형광물질등의 형광측정을 통한 광학적 방식의 센서, 표적 물질과의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하여 측정하는 질량 분석 방식의 압타머 센서들로 이용될 수 있다. 압타머(Aptamer)는 저분자의 올리고뉴클레오타이드로 표적분자에 아주 밀접하고 특이하게 선택적으로 결합하므로 질병의 진단과 치료면에서 효과적이다.
또한 본 발명의 뉴클레오타이드 분자는 항체에 비해 크기가 월등히 작고, 표적분자와 높은 결합력으로 결합할 수 있기 때문에 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 또한 온도 변화에 민감하지 않으며, 변성이 되었다 하더라도 빠른시간 내 재생이 가능하다는 장점이 있다.
한편, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 및 그 상보적 서열을 유효성분으로 함유하는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)에 대한 특이적인 결합을 가지는 약학 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 이것을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합한 약학조성물의 일부로서 대상에 제공될 수 있다.
본원에 사용된 "약학 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 본원에 기술된 하나 이상의 활성성분의 제제를 의미한다. 본원에 사용된 "활성성분"은 생물학적 효과가 있는 제제를 의미한다. "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않으며 투여된 화합물의 성질 및 생물활성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 활탁제, 붕해제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료등을 사용할 수도 있으며 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조할 수도 있다. 예를 들어 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 세스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 이외의 본 발명 약학 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구적으로 또는 정맥내 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 또한, 마이크로캡슐 또는 양이온성 지질과 같은 미립자가 본 발명의 이러한 일면의 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다.
상기의 약학조성물은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid에 특이적으로 결합하므로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 단백질을 검지할 수 있는 센서로서 이용할 수 있다. 그리고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함하는 약학조성물은 바이러스에 노출되었거나 노출될 대상을 검지하는 센서로 이용할 수 있고 바이러스 감염의 치료 및 진단에 이를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 일시적 또는 안정적으로 변형된 대장균 세포에서 발현하도록 하기 위하여 발현벡터를 제조할 수 있다.
본 발명의 DNA는 폴리머라아제 효소의 중합효소연쇄반응 또는 합성에 의하여 생산될 수 있다.
본 발명의 DNA는 하나 이상의 중합된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 그것은 인산-당 골격 또는 뉴클레오타이드에 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 천연 DNA 포스포다이에스테르 결합이 적어도 하나의 아민 또는 바이오틴 분자를 포함하도록 변형될 수 있다.
DNA 압타머 후보물질의 분리, nucleocapsid에 대한 친화도 및 항체 대용으로서의 사용가능성은 다음과 같이 확인하였다.

1. 압타머 후보물질 분리
SARS-CoV/Nucleocapsid에 대한 높은 친화력을 갖는 DNA를 찾기 위해 정의된 지역을 가지는 프랭크된 45 뉴클레오타이드의 랜덤 코어 서열을 포함하는 DNA 라이브러리 풀(10²⁷분자들)을 제조하였다(도 1). SELEX 과정을 통해 DNA 라이브러리 풀에서 친화력있는 DNA를 분리하였다. 라운드 #7 후에 연속적으로 단백질 농도를 감소시켜 반응하여 Nucleocapsid에 대한 DNA 라이브러리 풀이 더욱 높은 특이성 및 결합 친화도를 가지도록 하였다(도 2A). 12 연속 라운드의 인 비트로 선택을 거친 후, 분리된 DNA 라이브러리는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하여 증폭되고, 그 결과 DNA들은 클로닝되었다. 15 서브클론의 단일가닥의 DNA 압타머 후보물질의 서열이 결정되었다. DNA 풀에서 동정된 여러 DNA 서열을 ClustalW2 프로그램에 의하여 비교 분석하였으며[M.A. Larkin, Bioinformatics (2007) 23 (21): 2947-2948.](도 2B), MFold 프로그램에 의하여 2차 구조를 예상하였다[M. Zuker, Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180 (1989) 262-288]. 모든 DNA 압타머의 예측된 2차 구조는 도 3B에서와 같이 몇 가지 스템-루프 구조를 가진다.

2. DNA 압타머 후보물질과 nucleocapsid와의 친화도 테스트
SELEX 라운드 #12에서 얻어진 풍부하고 선택된 15개의 DNA 압타머 후보물질들과 Nucleocapsid와의 친화도를 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)로 테스트하였다. 니켈이 덮혀진 96-well 플레이트에 6X His 태그된 Nucleocapsid를 고정한 뒤, 바이오틴이 붙은 압타머 후보물질의 종류와 농도에 따라 다양하게 반응을 시킨 뒤에 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘을 항체 대신 사용하여 반응시켰다. 올쏘-페닐렌디아민 용액을 첨가시 변색 정도를 흡광도 492 nm로 확인하여 가장 결합력이 높은 서열을 확인하였다. 이 결과로 y 축에 492 nm에서의 흡광도, x 축에 첨가된 압타머 후보물질의 농도를 설정하여 Nucleocapsid와의 상호작용에 대한 경향성을 확인하였고, 15개 압타머 후보물질들의 Kd 값을 구한 후 가장 낮은 Kd값을 가지는 두 개의 압타머(aptamer 1 과 aptamer 11)를 동정할 수 있었다 (도 3A). ELISA 실험을 통해 친화도를 확인해 본 결과, 15개의 압타머 후보물질 중 1번과 11번 후보물질은 Nucleocapsid 단백질과 수 nM의 Kd값을 갖는 압타머이며 항체 대용으로서의 사용가능성을 확인하였다.
1번 압타머 후보물질의 서열은;(서열번호 1)
GCAATGGTACGGTACTTCCGGATGCGGAAACTGGCTAATTGGTGAGGCTGGGGCGGTCGTGCAGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA이며,

*11번 압타머 후보물질의 서열은;(서열번호 2)
GCAATGGTACGGTACTTCCCCGTAGATCGAGGGAGCGCATTAAGGTATACGCCCTTCCCATCTTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA 이다.
특히 1번 압타머의 경우 약 4.93 nM의 Kd값을 확인하였고(도 3A의 실선), 15개의 압타머 후보물질 중 Nucleocapsid 와 가장 결합적 친화도가 높은 서열임을 확인하였다. 다음으로 Nucleocapsid와 결합적 친화도가 높은 압타머 11의 경우 9.02 nM 의 Kd값을 가지는 것을 알 수 있었다 (도 3A의 점선).

3.압타머의 항체 대용으로 사용가능성 확인
본 발명자들은 발견한 압타머가 항체 대용으로 사용될 수 있는지에 대한 해답을 얻기 위해서 웨스턴 블럿법을 응용하였다. 기존의 웨스턴 블럿법과 마찬가지로 Nucleocapsid의 양을 다양하게 하여 10% SDS-PAGE로 전기영동한 뒤, PVDF 막으로 이동하였다. 그리고 항체 대용으로 5'- 바이오틴이 붙은 1번 압타머를 반응시킨 후 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘을 반응시켰다.
도 4A에서와 같이 Nucleocapsid의 양을 점점 증가시킴에 따라, 1번 압타머의 붙는 정도가 단백질 양에 비례하여 증가함을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통하여 1번 압타머와 Nucleocapsid의 강한 결합 친화도를 확인하였다.
그리고 Nucleocapsid에 대한 항체 및 His 태그를 인식하는 HRP, 5'-바이오틴이 부착된 1번 압타머를 각각 반응시켜 비교하여 항체를 사용하였을 때와의 대략적인 굵기를 확인하였다. 각각의 표지 핵산들은 겨자무과산화효소(HRP)를 이용하여 확인되었다. 그 결과 도 4B에 나타낸 바와 같이 오히려 His 태그를 인식하는 HRP의 경우는 얇은 굵기로 나타났고, Nucleocapsid에 대한 항체를 사용했을 때와 1번 압타머를 이용했을 때는 비슷한 두께의 두꺼운 굵기로 확인되었다. 이 결과를 통해서 1번 압타머는 항-SARS CoV 화합물들로 유용하게 사용할 수 있으며 항체 이상의 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 압타머 분자는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)에 대한 센서로 사용될 수 있다. 예로써, 압타머와 표적 분자 간의 결합 전후에 나타나는 전자 전달 정도를 감응하여 반응하는 전기화학적 방식의 센서, 형광물질등의 형광측정을 통한 광학적 방식의 센서, 표적 물질과의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하여 측정하는 질량 분석 방식의 압타머 센서들로 이용될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 분자는 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 항체에 비해 크기가 월등히 작고 또한 표적분자와 높은 결합력으로 결합할 수 있다. 또한 온도 변화에 민감하지 않으며, 변성이 되었다 하더라도 빠른 시간 내 재생이 가능하다는 장점이 있다.
또한 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함하는 약학조성물은 바이러스에 노출되었거나 노출될 대상을 검지하는 센서로 이용할 수 있고, 바이러스 감염의 치료 및 진단에 이를 사용할 수 있다.

도 1은 SARS Nucleocapsid에 대한 선택된 DNA 압타머 및 인 비트로 선택을 위한 DNA 풀의 서열로서, 45 랜덤 뉴클레오타이드들을 포함하는 DNA 주형의 람다-핵산말단가수분해효소에 의해 형성된 단일가닥의 DNA 라이브러리 및 인 비트로 선택 과정.
도 2는 인 비트로 선택의 라운드 증가에 따라 얻어진 DNA 풀과 압타머 후보물질의 서열로서,
(A)는 인 비트로 선택의 라운드 증가에 따른 단일가닥의 DNA와 Nucleocapsid 단백질의 친화도를 나타낸 그림(1열: 0round, 2열: 6round, 3열: 8round, 4열: 11round, 5열: 12round)이며,
(B)는 선택의 12 라운드를 통해 얻은 DNA 풀에서 동정된 15 종류의 다른 단일가닥의 DNA서열들의 비교이다.(ClustalW2 프로그램을 사용하여 비교함)
도 3은 ELISA를 이용하여 측정된 Nucleocapsid에 대한 압타머 후보물질의 결합적 친화도를 나타낸 그림으로,
(A)는 그 단백질과 바이오틴이 부착된 단일가닥의 DNA 압타머 여러 후보물질들의 결합하는 친화도를 실시예에 기재된 것과 같이 ELISA를 수행하여 가려낸 후, 단백질에 결합하는 리간드들 중 가장 친화력이 높은 상위 2개의 압타머 후보물질들을 나타낸 그래프이고,
(B)는 동정된 15 종류의 압타머 중 가장 Nucleocapsid와 친화도가 높다고 생각되는 상위 2개 후보물질(#1(서열번호 1),#11(서열번호 2))의 2차 구조이다.(2차 구조는 MFOLD 프로그램을 사용하여 예측함)
도 4는 단일가닥의 DNA 압타머를 이용한 수정된 웨스턴블럿법으로 Nucleocapsid 분석 원리를 나타낸 그림으로,
(A)는 웨스턴블럿법 반응은 정제된 Nucleocapsid 의 양을 무(1열 0 μg) 또는 여러 농도(2-6열: 0.92 μg, 1.84 μg, 4.6 μg, 9.2 μg, 18.4 μg)로 존재하게 하여 전기영동하였으며 합성된 5'-바이오틴이 부착된 #1 압타머(서열번호 1)를 이용하여 수행한 사진이고, (Nucleocapsid 농도가 증가함에 따라 선의 두께가 넓어짐)
(B)는 항체와 단일가닥의 DNA 압타머를 비교하기 위해 웨스턴블럿법을 수행하여 압타머가 항체 대용으로 사용 가능함을 나타낸 사진이다.
(M열: 분자량 표시, 1열: His-태그를 인식하는 HRP, 2열: Nucleocapsid에 대한 항체 이용, 3열: 바이오틴이 붙은 단일가닥의 DNA #1 압타머(서열번호 1) 이용)

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: His-태그된 SARS Nucleocapsid protein의 정제 및 발현
단백질을 발현하기 위해 매개자 pTrcHisB에 SARS Nucleocapsid 도메인(연세대학의 Jong-Won Oh. 박사로부터 제공)을 가지게 하여 재조합하였다. 그 제조된 단백질 발현 플라스미드는 Escherichia coli BL21 반응능(competent) 세포로 형질전환시켰다. 세포의 광밀도₆₀₀가 0.7이 될 때까지 37℃에서 자라게 한 후 이소프로필 1-티오-D-갈락토시드(IPTG) 0.5 mM를 첨가한 후 28℃에서 하루 밤새 두어 단백질 합성을 유도하였다. 그 단백질이 유도된 세포를 음파처리로 파괴한 후 재조합 His-태그된 SARS Nucleocapsid를 정제하였다; Q-세파로오스 (GE Healthcare)를 거쳐 니켈-차지된 킬레이팅 세파로오스 (GE Healthcare) 크로마토그래피로 정제 후, 그 단백질들을 가진 분획들은 10% SDS-PAGE로 결정하고, Amicon stirred 쎌(YM-30)로 초여과하였다. 초여과(ultrafiltration) 동안에, sephadex G-75 레진(sigma)을 포함하는 다음 컬럼을 버퍼(50 mM Tris/-HCl; pH 8.0, 150mM NaCl)로 세척하였다. 앞서 여과된 단백질 샘플(5 ml)을 세척된 컬럼에 건 후, 0.7 ml/min의 속도로 동일한 버퍼로 용출하였다. 10% SDS-PAGE에 의하여 결정된 정제 분획을 모아 정제된 단백질들을 장기간 보존을 위하여 글리세롤을 30%가 되도록 첨가 후 - 80℃에서 냉동하였다. 박테리아를 2리터 배양하였을 때, 정제된 단백질의 전형적인 수율은 약 2.88 mg이다.

실시예 2: 랜덤 라이브러리의 제조
In vitro 선택에 사용된 DNA 라이브러리는 45랜덤 뉴클레오타이드들을 포함하는 88 bp DNA 주형 및 람다-핵산말단가수분해효소 (NEB, Germany) 를 사용한 단일가닥으로 제조되었다.(도 1) DNA 주형은 형광 FAM(밑줄 서열)을 포함하는 정 프라이머(5'-FAM-GCAATGTACGGTACTTCC-3') 및 인산(밑줄 서열)을 포함하는 역 프라이머(5'-Phosphate-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3') 를 가지고 단일 가닥 DNA의 25 사이클의 증폭에 의하여 제조되었다. PCR-증폭된 이중가닥 DNA 주형은 랜덤 지역을 포함하는 단일 가닥으로 전환의 목적을 위해 인산을 포함하는 한정된 서열로 프랭크(flank)되었다. 그 증폭된 DNA는 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제되고 람다-핵산말단가수분해효소로 가수분해되었다. 그 생성된 DNA는 10 % 요소-변성 젤로 젤-정제되었으며 단일가닥의 DNA만을 10% 변성이 없는 젤로 젤-정제 및 확인하였다. 그 생성된 DNA의 서열은 5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-N45-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'이고, 여기서 N45는 각 위치에 동일 몰의 A, G, C, 및 T가 삽입된 45 뉴클레오타이드의 랜덤 코어 서열을 나타낸다.

실시예 3: DNA 압타머의 인 비트로 선택
인 비트로 선택은 정제된 His-태그된 Nucleocapsid 및 생성된 단일가닥의 DNA 라이브러리를 가지고 수행되었다. 먼저, 5 μg의 단일가닥의 DNA 라이브러리를 95℃에서 10분간 변성 및 얼음에서 10분간 복원하였다. 그 DNA 라이브러리를 100 μl의 결합 버퍼(50 mM Tris-HCl; pH 8.0, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM dithiothreitol (DTT) 및 1% (w/v) BSA)에 100 μl의 Ni-NTA 세파로스 비드로 상온에서 흔들며 30분간 전배양하였다. 원심분리에 의해 DNA-비드 복합체는 침전하고 상등액을 취하여 세파로스 비드에 비특이적으로 결합 활성을 가지는 DNA들로부터 분리하였다. 사전(precleared) 상등액 100 μl 에 2 μg의 His-태그된 Nucleocapsid 단백질을 첨가하여 상온에서 30분간 배양하였다. 다시, 100 μl의 Ni-NTA 세파로스를 첨가하고 배양을 30분간 계속하였다. 그 반응 혼합물 안에 존재하는 단백질에 결합되지 않은 DNA 분자를 제거하기 위하여 원심분리하였고 펠렛을 500 μl의 결합 버퍼로 5회 세척하였다. DNA와 복합체된 Nucleocapsid를 용출 버퍼(결합 버퍼 구성요소 + 0.4 M imidazole)로 용출하여 Ni-NTA 비드들로부터 분리하였다. 그 단백질에 결합된 DNA들로부터 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의하여 DNA만을 회수하였다. 회수된 DNA들을 Taq DNA polymerase로 PCR하여 증폭하고, 람다-핵산말단가수분해효소를 사용하여 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 전환 후 선택의 다음 라운드에 사용하였다. 선택의 7 연속 라운드를 동일한 방법으로 수행하였다. 그러나 8 라운드부터 시작으로 한 라운드 증가할 때마다 반응하는 단백질 농도를 줄여 DNA와 결합하는 환경을 더욱 가혹하게 하였다: 1 μg (8 라운드), 0.5 μg (9 라운드), 0.25 μg (10 라운드), 0.125 μg (11-12 라운드).

실시예 4: ELISA를 이용한 Nucleocapsid와 인 비트로 선택을 통하여 얻어진 ssDNA의 라운드 별 상호작용 분석
ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 Nucleocapsid와 바이오틴이 부착된 인 비트로 선택된 DNA의 각 라운드 별 상호작용을 측정하기 위하여 사용하였다. 선택된 DNA의 각 라운드 라이브러리에 바이오틴을 부착하기 위하여 바이오틴(밑줄 서열)을 포함하는 정 프라이머(5'-Biotin-GCAATGTACGGTACTTCC-3)를 사용하여 PCR 증폭하였다. ELISA 절차는 먼저, 니켈이 덮혀진 96-well 플레이트에 정제된 His-태그된 Nucleocapsid를 농도 100 nM로 100 μl /well로 하여 상온에서 한 시간 동안 180 rpm으로 흔들며 반응하였다. 플레이트를 0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하였으며 비 특이적 결합 자리를 메우기 위한 반응은 5 % 소 혈청 알부민(BSA)이 든 PBST(0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수) 버퍼로 상온에서 한 시간 수행하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 5'-바이오틴이 부착된 인 비트로 선택 과정 중 얻어진 여러 라운드의 DNA 라이브러리 농도를 각각 100 nM로 하여 90℃에서 10분간 변성 및 즉시 얼음에 10분간 복원하는 과정을 거쳐 플레이트에 주입하였으며 상온에서 한 시간 반응하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 결합한 라운드 라이브러리를 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘으로 탐지하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 올쏘-페닐렌디아민 용액을 첨가 시 변색이 시작되고 2.5 N 황산 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 그 흡광도는 TRIAD 마이크로플레이트 리더기(Dynex Technologies, VA, USA)를 사용하여 492 nm에서 측정하였다. 12번째 라운드의 단일가닥의 DNA가 Nucleocapsid와 가장 친화도가 높음을 확인하여, DNA를 PCR에 의하여 증폭하고 선형화된 pGEM T easy 벡터 (promega)에 클로닝하여 15개의 DNA 압타머 후보물질을 얻었다. 대장균에 서브클로닝과 형질전환 후, 프라즈미드 DNA를 개별 클론으로부터 분리하여 그 클론들의 DNA 서열을 분석하였다. 선택된 15개의 DNA 압타머 후보물질은 ClustalW2 프로그램에 의하여 비교 분석하였으며[M.A. Larkin, Bioinformatics (2007) 23 (21): 2947-2948.], 2차 구조는 Zuker 알고리즘에 기초한 MFOLD 프로그램에 의하여 예측되었다[M. Zuker, Computer prediction of RNA strcture, Methods Enzymol. 180 (1989)262-288].

실시예 5: ELISA를 이용한 Nucleocapsid와 바이오틴이 부착된 ssDNA의 상호 작용 분석
ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)를 Nucleocapsid와 바이오틴이 부착된 선택된 DNA 압타머와의 상호작용을 측정하기 위하여 사용하였다. 선택된 DNA 압타머에 바이오틴을 부착하기 위하여 바이오틴(밑줄 서열)을 포함하는 정 프라이머(5'-Biotin-GCAATGTACGGTACTTCC-3)를 사용하여 PCR 증폭하였다. ELISA 절차는 먼저, 니켈이 덮혀진 96-well 플레이트에 정제된 His-태그된 Nucleocapsid를 농도 100 nM로 100 μl /well로 하여 상온에서 한 시간 동안 180 rpm으로 흔들며 반응하였다. 플레이트를 0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하였으며 비 특이적 결합 자리를 메우기 위한 반응은 5 % 소 혈청 알부민(BSA)이 든 PBST(0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수) 버퍼로 상온에서 한 시간 수행하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 5'-바이오틴이 부착된 압타머의 농도를 다양하게 하여 90℃에서 10분간 변성 및 즉시 얼음에 10분간 복원하는 과정을 거쳐 플레이트에 주입하였으며 상온에서 한 시간 반응하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 결합한 압타머를 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘으로 탐지하였다. 다시 플레이트를 세척한 후, 올쏘-페닐렌디아민 용액을 첨가시 변색이 시작되었고 2.5 N 황산을 첨가에 의해 반응을 종결하였다. 그 흡광도는 TRIAD 마이크로플레이트 리더기(Dynex Technologies, VA, USA)를 사용하여 492 nm에서 측정하였다.

실시예 6: 항체 대용으로 압타머를 이용한 웨스턴블럿법
정제된 Nucleocapsid의 양을 0 μg, 0.92 μg, 1.84 μg, 4.6 μg, 9.2 μg, 18.4 μg 으로 다양하게 하여 10 % SDS-PAGE로 전기영동하였고 젤로부터 PVDF 막으로 단백질을 이동하였다. 그 막을 5 % 소 혈청 알부민(BSA)이 든 PBST(0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수) 버퍼로 상온에서 한 시간 동안 60 rpm으로 흔들며 반응하여 비 특이적 결합 자리를 메웠다. 그 막을 0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수(PBS)로 15분씩 4회 세척하였으며 그 후 5'-바이오틴이 부착된 #1 압타머(서열번호 1) 13.88 μg이 든 PBST 5 ml에 한 시간 동안 60 rpm으로 흔들며 반응하였다. 다시 막을 세척한 후, 막에 결합한 압타머를 탐지하도록 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘으로 15분 동안 60 rpm으로 흔들며 반응하였다. 다시 막을 세척한 후, 강화한 화학발광 용액[Enhanced chemiluminescence]을 첨가하여 LAS 4000에 노출시킴으로써 가시화하였다. 도 4의 A에서 보여지는 바와 같이 Nucleocapsid 농도가 증가함에 따라 선의 두께가 넓어짐을 알 수 있다.

실시예 7: 압타머와 항체를 비교한 웨스턴블럿법

*정제된 Nucleocapsid의 양을 9.2 μg 으로 고정하여 10 % SDS-PAGE 총 4개의 홈에 전기영동하였고 젤로부터 PVDF 막으로 단백질을 이동하였다. 항체 또는 압타머와 반응하기 위해 막의 각각의 홈 사이를 절단하였다. 그 막을 5 % 소 혈청 알부민(BSA)이 든 PBST(0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수) 버퍼로 상온에서 한 시간동안 60 rpm으로 흔들며 반응하여 비 특이적 결합 자리를 메웠다. 그 막을 0.1 % Tween-20이 포함된 인산완충식염수(PBS)로 15분씩 4회 세척하였으며, 하나의 홈은 His태그를 인식하는 HRP를 500 pg/μl가 되도록하여 1시간 반응하였다. 다른 하나의 홈은 Nucleocapsid 항체를 500 pg/μl가 되도록하여 반응시킨 후 PBST로 15분씩 4회 씻어준 뒤 500 pg/μl의 Goat anti mouse IgG-HRP를 반응하였다. 마지막 남은 하나의 홈은 바이오틴이 붙은 단일가닥의 압타머 1을 500 pg/μl가 되도록하여 반응시킨 후 PBST로 15분씩 4회 씻어준 뒤 500 pg/μl의 겨자무과산화효소(HRP)가 복합된 스트렙타아비딘을 반응하였다. 세 홈의 막을 모두 PBST로 다시 씻어준 뒤, 강화한 화학발광 용액[Enhanced chemiluminescence]을 첨가한 후 LAS 4000에서 확인하였으며 압타머가 항체 대용으로 사용 가능함을 알 수 있었다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 단백질과 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 압타머.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 압타머는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) Nucleocapsid 단백질에 대한 센서인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 압타머.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 압타머는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)에 대한 항체 대용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 압타머.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)의 Nucleocapsid 단백질과 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드 압타머 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 약학 조성물은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV)에 감염의 치료 및 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.