KR101283710B1 - 염증성 장 질환과 만성 췌장염의 진단을 위한, 췌장 자이모겐 과립으로부터 당단백질 2(ｇｐ2)와의 면역 반응을 통한 체액으로부터 항체의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 절편(tissue section)을 제외하고, 췌장 자이모겐 과립(pancreatic zymogenic granule)으로부터 GP2 분자, 면역반응성 서열(immunoreactive sequence) 또는 이들의 유사체와의 면역 반응(immune reaction)을 통하여 체액(body fluid)으로부터 항체를 검출하는 방법에 관계한다.

Description

염증성 장 질환과 만성 췌장염의 진단을 위한, 췌장 자이모겐 과립으로부터 당단백질 2(ＧＰ2)와의 면역 반응을 통한 체액으로부터 항체의 검출 방법{METHOD FOR THE DETECTION OF ANTIBODIES FROM BODY FLUIDS VIA IMMUNE REACTION WITH GLYCOPROTEIN 2 (GP2) FROM PANCREATIC ZYMOGENIC GRANULES FOR THE DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASES AND CHRONIC PANCREATITIS}

본 발명은 조직 절편(tissue section)을 제외하고, 췌장 자이모겐 과립(pancreatic zymogenic granule)으로부터 GP2 분자, 면역반응성 서열(immunoreactive sequence) 또는 이들의 유사체와의 면역 반응(immune reaction)을 통하여 체액(body fluid)으로부터 항체를 검출하는 방법에 관계한다.

상기 방법은 GP2 및 유사 물질에 대한 면역 반응과 연관된 질환의 진단 또는 치료 제어에 이용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 만성 염증 질환(chronic inflammatory disease) 또는 자가면역 질환(autoimmune disease), 특히, 크론병(Crohn's disease, CD)과 만성 췌장염(chronic pancreatitis, CP)의 진단 또는 치료 제어에서 GP2 분자, 면역반응성 서열 또는 이들의 유사체의 용도에 관계한다.

본 발명은 GP2가 염증성 장 질환(IBD), 바람직하게는 CD와 CP에서 면역 과정(immune process)의 자기항원(autoantigen)이고, 따라서 질병-연관된 항체의 에피토프(epitope)를 대표한다는 조사 결과에 기초한다.

GP2는 78 kDa의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 갖는, 췌장의 샘포 세포(acinar cell)의 막 당단백질(membrane glycoprotein)이다. 더 나아가, GP2는 장의 브러시-보더 세포(brush-border cell)에서 리소좀(lysosome)의 한 성분으로서 검출되거나, 또는 췌액(pancreatic juice)에서 유리, 비-막-결합된 펩티드로서 검출된다. 전체 막 단백질의 30 내지 45%를 구성하는 GP2는 자이모겐 과립 막(zymogen granule membrane)의 주요 성분을 대표한다. 자이모겐 과립의 다른 분비 췌장 단백질(secretory pancreatic protein), 예를 들면, 신콜린(syncollin), 렉틴(lectin) ZG16p, 시납토브레빈(synaptobrevin) 2와 다른 황산염 기반 프로테오글리칸(sulfate matrix proteoglycan)과 함께, GP2는 과립 막의 지질뗏목(lipid raft)의 한 성분이고, 신콜린은 GP2와 상호작용한다. ZG46p와 같은 단백질을 또한 포함하는 이들 복합체는 막하 기반(submembranous matrix)을 형성한다.

GP2는 포스파티딜 이노시톨 앵커(phosphatidyl inositol anchor)를 통하여 췌장 샘포 세포의 자이모겐 과립 막에 결합되고, 예로써 바실루스 세레우스(B. cereus)의 인지질가수분해효소 C에 의해 제거될 수 있다. 자이모겐 과립은 췌장의 샘포 세포에서 아밀라아제(amylase)와 같은 소화 효소(digestive enzyme)의 저장소이다. 샘포 세포의 뉴런 또는 호르몬 자극 이후에, 이들 소화 효소는 췌장관(pancreatic duct) 내로 분비된다. GP2는 자이모겐 과립 막으로 국지화될 뿐만 아니라 이의 기반, Golgi 기구와 샘포 내강(acini lumen) 내에 췌액에서 발견된다. 더 나아가, GP2는 리소좀의 한 성분이고, 따라서 엔도시토시스(endocytosis)에 관 여한다.

췌장 분비의 자극 동안, GP2는 샘포 세포의 꼭지면 세포막(apical membrane) 표면으로 운반되고, 쪼개지고, 샘포 내강 내로 방출된다. 췌액 내에서 상대적으로 많은 양의 GP2를 고려하면, GP2가 분비될 수 있는 다른 세포 풀(cellular pool)이 존재할 것으로 의심된다. 단백분해(proteolysis)를 통하여 장 내에서 활성화된 소화 효소에 대조적으로, GP2는 절단(cleavage)에 의해 샘포 세포 내에서 미리 변형된다. GP2의 세포내 순차적 단백분해는 이의 기능에 영향을 주는 것으로 추정된다.

급성과 만성 췌장염에서 GP2의 증가된 혈청 수준은 이들 존재의 혈청학적 진단(serological diagnostics)에서 마커(marker)로서 GP2의 적합성(suitability)에 관련된 논의를 이끌어냈다. 쥐 모형에서, GP2의 혈청 농도는 염증성 장 질환의 심각도(severity)와 상관하는 것으로 증명되었다.

인간 세포주(cell line)의 경우에, 이런 상관관계는 아직 명확하게 확립되지 않았다; 자기항체를 통하여 검출가능한 GP2의 수준은 상당한 개별 변이성(individual variability)을 보인다.

이러한 단점에도 불구하고, 진단 방법을 개발하기 위한 다수의 접근법은 항체 반응(antibody reaction)으로부터 염증성 장 질환의 심각도를 결정하기 위하여, GP2를 지향하는 항체의 생산과 검출에 의존한다.

CD와 궤양성 대장염(UC)은 염증성 장 질환 중에서 가장 중요한 2가지 질환이다. 이들은 소화기 계통(digestive system)에서 만성 재발성 조직-파괴 염증 과정(inflammatory process)으로 특징된다. 현재까지, CD와 UC의 원인(etiology)과 병인(pathogenesis)은 명확하지 않다.

UC에서 염증은 대장(colon)과 직장(rectum)의 점막(mucosa)과 점막밑(submucosa)에서 주로 나타나는 반면, CD는 전체 위장관(gastrointestinal tract)의 벽-침투성(wall-penetrating) 육아종성(granulomatous) 염증 과정으로 특징된다.

IBD의 발생에서 유전 인자와 환경 인자가 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. NOD2 유전자에서 돌연변이와 CD의 외형 사이에 관계는 여러 무리에서 널리 확립된 것으로 간주되고 있다. 유사하게, 말단 회장(terminal ileum) 내에서 CD의 출현에 관하여 명백한 연관이 존재한다. 현재까지, 유전자 마커(genetic marker)와 치료 과정 사이에 상관관계는 어떤 치료 방법(항-TNF 요법 포함)에서도 확립되지 못하였다.

유럽에서 CD의 발생률(incidence)은 연간 100,000명당 대략 5.6명이다. 독일에서 CD의 이환율(prevalence)은 1/500 내지 1/800인 것으로 알려지고 있다.

평균적으로, CD의 첫 번째 증상은 30세의 상대적으로 어린 연령에서 나타난다. 결과적으로, CD 환자는 그들의 노동 생활(working life)에서 영향을 받고, 상응하는 사회-경제적 효과(socio-economic effect)에 노출된다. UC에서와 유사한 방식으로, 암종(carcinoma)의 발생률이 크론 대장염(Crohn's colitis)을 앓는 CD 환자 환자에서 증가하고, 수년간 과정이 지속된다.

임상 양상(clinical picture)에는 복통(abdominal pain), 설사(diarrhea), 흡수불량(malabsorption), 종기(abscess), 누관(fistula), 담석 합병증(gallstone complication), 신장 결석(renal stone), 그리고 이들과 연관된 합병증이 포함된다.

CD 환자는 다수의 장외 증상(extraintestinal manifestation)을 나타내는데, 3.5%에 이르는 췌장염(pancreatitis)은 CD 환자에서도 상대적으로 드물다. 하지만, 침묵 췌장염(silent pancreatitis)의 증가된 비율을 암시하는, 급성 췌장염의 징후가 없는 고아밀라아제혈증(hyperamylasemia)과 고리파아제혈증(hyperlipasemia)이 8-17%의 환자에서 관찰될 수 있다. 췌장관에서 변화와 췌장 기능의 제한이 일부 사례에서 보고되었다. 고아밀라아제혈증과 고리파아제혈증의 수준은 CD의 활성과 상관한다. 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis)을 앓는 환자에서와 유사한 방식으로, 담관(biliary duct)과 췌장관에서 동시 변화가 4.6%의 CD 환자에서 관찰된다. 하지만, CD 환자에서 만성 췌장염은 통상적으로, 담관의 침범(involvement), 체중 감소(weight loss)와 췌장관 협착(stenosis)이 더욱 빈번하게 관찰되는 UC에서 만성 췌장염과 상이하다. CD와 연관된 특발성 만성 췌장염의 존재에 관한 논의가 있어왔다. UC-연관된 만성 췌장염에 대조적으로, CD 환자에서 이들 장 증상은 췌장 조사(pancreatic finding)에 앞서 빈번하게 나타난다. CD에서 빈번한 외인성 체장가능 부전(exocrine pancreatic insufficiency)은 연조직(parenchyma) 내에서 조밀한 염증 침윤물(inflammatory infiltrate)과 연관된 현저한 샘포 변성(acinar degeneration)에 확실히 기인할 수 있다.

5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid)의 투여는 여러 연구에서 상기 활성 물질이 극히 제한된 효과를 달성하거나 효과가 전혀 없음으로 인하여 상당한 단 점이 지적되긴 했지만, 요법으로서 권장되고 있다. 하지만, 가용한 데이터를 고려하면, 경등도 내지 중등도 공격을 받는 환자에서 이의 이용은 무효의 경우에 치료에서 변화를 적시에 개시할 때 매우 적합한 것으로 보인다. 합병증 없는 중증도 공격의 경우에, 프레드니솔론(prednisolone) 등가물의 투여가 고려된다. 공격이 빈번하면(≥ 2회/year), 아자티오프린(azathioprine) 또는 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine)이 부가적으로 투여될 수 있다.

독일에서, CD 환자에 관련된 전체 비용은 연간 사례별로 20,000 EUR인 것으로 추산된다. 간접적인 비용을 비롯한 CD 환자에 대한 비용은 독일에서 20억 EUR인 것으로 추산되고, 미국에서는 양쪽 IBD에 대한 사회-경제적 비용(socio-economic cost)으로 26억 US 달러가 보고되었다.

항-TNFα 조합제(preparation)는 CD의 재발(remission)을 비롯하여, 이러한 만성 질환에 효과적이다. 하지만, 이들 조합제는 부작용으로 인하여 불편한데, 이런 이유로 이들의 이용은 임상적 상황(clinical situation)에 따라, 예비 약제(reserve medication)로서만 가능하다. 장외 증상(extraintestinal complication)으로서 활성 척추관절증(spondyloarthropathy)을 나타내는 CD 환자만 양쪽 임상 양상에서 항-TNFα 치료로부터 이익을 얻는 것으로 보인다.

이들 환자의 적절한 치료와 사후 점검(follow-up)을 위하여 명확한 진단이 필요하다. 하지만, 이는 상당한 불이익을 수반하는데, 그 이유는 명백한 검사가 아직 가용하지 않고, 따라서 회결장 단편 생검(ileocoloscopic segmental biopsy)을 필수 성분으로서 필요로 하는 CD의 임상적 진단이 이용되어야 하고, 또한 이들 생 검이 선택적 장 수술에 앞서 필요하기 때문이다. 하지만, 이는 임의의 급성 증후군(symptomatic complex)에서 이의 과정 동안 또는 새로운 항-염증 요법에 앞서 반드시 필요한 것은 아니다. 상부위장관 내시경 진단(upper endoscopic diagnosing)은 일차 진단(primary diagnostics) 동안 각 환자에서 수행되어야 한다.

점막 생검(mucosa biopsy)의 매우 복잡하고 비교적 비용-집중적인 조직학적 조사(histological investigation)는 진단 영역 내에서 다른 중요한 요소를 구성한다. 이를 위하여, 생검은 특히, 거시적으로 눈에 띄는 부위와 눈에 띄지 않는 부위로부터 수집된다. 하지만, 조직병리학적 감별 진단(histopathological differential diagnostics)의 잠재력을 효과적으로 이용하기 위하여, 직장을 비롯한, 대장 전체의 최소한 5가지 상이한 해부학적 부분(anatomic segment)으로부터, 말단 회장(terminal ileum)으로부터, 그리고 상부위장관으로부터 생검을 수집하는 것이 필요하다.

영상(imaging) 방법으로서 경복부 초음파(transabdominal ultrasound)는 CD 환자에서 장 벽(intestinal wall)의 염증성 변화, 그리고 종기, 누관과 협착을 검출하는 민감한 방법으로서 이용된다. 장간막 정맥(mesenteric artery)과 장 벽 둘 모두에서 혈류(bloodflow)의 검출가능한 증가가 급성 염증의 존재와 연관된다. 소골반(minor pelvis)의 직장내 초음파(endorectal ultrasound)와 자기 공명 영상장치(magnetic resonance tomography, MRT)는 항문직장(anorectal) 누관과 종기의 진단과 구분에서 동등하게 민감한 방법으로서 인정되고 있다.

명확한 검사가 가용하지 않기 때문에, CD의 실험실 진단(laboratory diagnostics)을 위하여 다수의 파라미터가 수집된다. C-반응성 단백질(CRP), 혈소판(thrombocyte), 헤모글로빈(hemoglobin, Hb)/헤마토크릿(hematocrit)과 백혈구(leukocyte)의 결정은 기초 진단(basic diagnostics)을 대표한다. 감별 혈액 수(differential blood count)와 알부민(albumin)과 같은 다른 파라미터가 부가적으로 이용된다. 급성 단계의 CD에서, CRP, 백혈구 수와 급성-단계 단백질과 같은 상기한 파라미터가 많은 환자에서 증가되고, 또한 사후 점검(follow-up)에서 권장된다.

급성 단계 동안, 장 투과성(intestinal permeability), 알파1-안티트립신(alpha1-antitrypsin) 소거(clearance)와 분변에서 칼프로텍틴(calprotectin) 배출의 증가가 관찰된다.

하지만, 임상적 데이터와 조직학적 데이터의 수집으로 CD와 UC 사이에 명확한 구별이 가능하지 않다. 이러한 결점은 빈번하게, 불확정 대장염(indeterminate colitis, IC)의 정의를 결과하였다. 더 나아가, 장 감염과 기능적 질환(functional disease)에서 유사한 증상이 발생하기 때문에, 감별 진단(differential diagnosis)이 더욱 어려워진다. 10 내지 15%의 IBD 환자에서, UC 또는 CD로 구분은 전체 대장 영역 내에서 임상 증상의 다소간 중복으로 인하여 생검 데이터로부터 극히 어렵다. 외과적 개입(surgical intervention) 이후에, IC 환자는 UC 환자보다 더욱 빈번하게, 장기 합병증(long-term complication)과 문합 부전증(anastomotic insufficiency)을 나타내는 것으로 보인다. 하지만, 예측 관점에서 IC 환자가 CD 또는 UC의 방향으로 발전하는 지의 구별은 상기 질환의 예후와 과정, 그리고 약물- 기초된 치료와 외과적 개입 시점의 선택에 실질적인 영향을 준다. 상기 질환의 과정 동안 후기 시점에서, 지정은 빈번하게, 부가적인 임상 데이터의 기초에서만 가능하다. 가령, CD와 UC 사이에 구별은 환자에서 회장 낭 형성술(ileoanal pouch anastomosis)이 계획될 수 있는 지를 결정할 때 기초이다. 이런 외과적 개입은 대장이 현저하게 영향을 받는 CD 환자(크론 대장염)에서 드물게 필요한 반면, UC의 경우에는 상기 방법이 더욱 빈번하게 필요하다. CD 환자는 훨씬 높은 비율의 문합 부전증을 나타내고, 따라서 임의의 외과적 개입이 면밀한 숙려를 요한다.

내인성 항원(endogenic antigen)과 음식물 항원(food antigen)에 반응하는 다수의 항체가 IBD의 감별 진단의 배경에서 기술되었다. 이들 항체는 병리적 역할(pathogenetic role)을 수행하지 않는 것으로 보이고 상기 질환의 활성을 반영하지 못한다는 점에서, 불편하다. 그럼에도 불구하고, 혈청학적 항체 진단(serological antibody diagnostics)은 진단에서 결정적인 보조로서 활용되고, 치료 결정(therapeutic decision), 특히, 불확정 대장염에서 치료 결정의 기초를 대표한다.

세포골격 단백질(cytoskeletal protein)에 대한 자기항체는 생검에 의해 확증된 CD 환자에서 보고되었다(Mayet et al., 1990). 특히, 시토케라틴(cytokeratin) 18, 액틴(actin), 비멘틴(vimentin), 데스민(desmin)과 트로포미오신(tropomyosin)에 대한 자기항체가 발견되었다. 시토케라틴 18 자기항체가 상기 질환의 활성과 상관하는 것으로 밝혀졌긴 하지만, 이들 항체는 아마도, 낮은 특이성(specificity)으로 인하여 IBD 루틴 진단(routine diagnostics)에서 인정을 받지 못했다.

CD 환자의 경우에, 외분비(exocrine) 췌장의 조직에 대한 자기항체(PAK)와 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로부터 만난(mannan)에 대한 항체(ASCA)가 특징적인(pathognomonic)인 것으로 확인되었다(Stoker et al., 1987; Main et al., 1988). 인간 호중성 과립구(neutrophilic granulocyte)에 대한 자기항체(ANCA)와 배상 세포(goblet cell)에 대한 자기항체(BAK)는 주로, UC 환자에서 관찰된다.

PAK, ANCA와 ASCA의 결정은 진단 IC에서 유용한 것으로 간주된다.

하지만, 현재에도, 면역 반응을 주도하는 불명확한 자기항원(autoantigen)으로 인하여, 췌장 조직, 배상 세포와 인간 호중성 과립구에 대한 IBD-특이적 자기항체는 여전히, 면역형광 기술(immunofluorescence technology, IFT)을 이용하여 결정된다. 따라서 상기 기술을 이용하여, 췌장 항원에 대한 자기항체가 27 내지 39%의 CD 환자에서 발견되었다. 장외 증상을 나타내는 이들 CD 환자의 절반 이상(68%)이 PAK를 보유할 수 있다. 하지만, 실제로는, 이러한 기술은 자동화될 수 없고, 따라서 비용-집중적이고 시간-소모적이기 때문에, 불편한 것으로 밝혀졌다.

대조적으로, CD에 대하여 유사하게 특이적인 ASCA는 효소 면역분석(enzyme immunoassay, EIA)에서 증가된 수준으로 검출되는데, 그 이유는 상기 방법이 평가의 측면에서, 덜 주관적이고 자동화될 수 있기 때문이다.

현재, 단독 항체 결정은 CD의 혈청학적 진단에서 너무 무감각한 것으로 간주된다. 상이한 항체 특이성(antibody specificity)을 조합하면, IBD의 감별 진단에 서 진단 민감도 또는 특이성이 고도로 향상되고 IC에서 예후가 가능해질 수 있다.

EIA와 같은 공통의 기술적 플랫폼은 파라미터를 합동하는데 특히 유리하다. 하지만, 한 가지 전제조건은 상이한 종의 췌장 조직 절편 내에서 PAK에 의해 특이적으로 인식되는 PAK 자기항원을 알고 있어야 한다는 점이다.

과거에, CD에서 자기항원을 동정하기 위한 다양한 접근법이 시도되었는데, 췌장 항원이 PAK의 앞서 언급된 상대적으로 높은 민감도로 인하여 주목을 받고 있다. 다양한 종(인간, 쥐, 원숭이)의 조직 절편을 이용하여, PAK는 IFT에 의해 검출되었다. 계통발생(phylogeny)에 관하여, 이는 PAK에 의해 인식되는 보조된 에피토프(conserved epitope)를 암시한다. Fricke 등은 PAK에 반응하는 800 kDa 이상의 분자량(molecular weight, m.w.)을 갖는 복수의 아단위(subunit)로 구성되는 단백질 복합체를 기술하였다(Fricke et al., 1999). 하지만, 이들 저자는 면역블랏(immunoblot)에서 상응하는 단백질과 PAK에 반응하는 m.w. 16, 18, 19, 24, 27, 29, 31과 34 kDa를 갖는 아단위를 서열분석하고 확인할 수 없었다. PAK에 의해 인식되는 단백질은 다수의 하위집단(subgroup)을 포함하는 대형 단백질 복합체일 것으로 추정되었다. 다양한 당단백질을 이용한 저해 실험에 기초하여, PAK와 추정 자기항원의 탄수화물 사슬의 반응성은 배제되었다.

Seibold 등은 췌액으로부터 정제되고 10⁶ Da(1,000 kDa) 이상의 m.w를 갖는 거대 항원에 대한 PAK의 반응성을 기술하였는데, 상기 항원은 트립신(trypsin)으로 처리 이후에 PAK 반응성을 상실하였다. PAK에 반응성 없음은 다양한 췌장 단백질, 예를 들면, 아밀라아제, 리파아제(lipase), 인지질가수분해효소 A와 C, 엔테로키나아제(enterokinase), 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) A와 B, 키모트립신(chymotrypsin) A와 B, 키모트립시노겐(chymotrypsinogen), 엘라스타아제(elastase), 트립신, 트립신 저해물질, 락토페린(lactoferrin)과 칼레크레인(callecrein)을 이용한 ELISA에서 결정되었다.

다수의 저자에 따르면, GP2의 수준과 IBD의 심각도가 상관하긴 하지만, 생리학적 배경(physiological context)은 알려져 있지 않다. 적중(knock-out) 생쥐 모형에서 증명된 바와 같이, GP2의 부재는 외분비 췌장의 분비와 자이모겐 과립의 형성에 필수적이지 않다. 게다가, GP2의 2가지 공지된 동종형(isoform)의 생리학적 기능이 불명확하다(Fukuoca, 2000). 380개 아미노산의 길이를 갖는 짧은 동종형, β-GP2 이외에, 530개 아미노산 길이를 갖는 α-GP2가 존재한다. 상기 펩티드의 양쪽 동종형은 인간 췌장의 조직에서 검출될 수 있는데, 특히, 소형 β-GP2 동종형은 대형 α-GP2보다 훨씬 높은 역가(titer)로 발생한다. 또한, 췌장 조직 내에서 양쪽 형태의 전사체(transcript)의 검출은 α-GP2에 비하여 β-GP2의 더욱 강한 발현을 보여준다.

이들 상이한 동종형의 역할을 분명하지 않다. 대형 α-GP2 동종형에 매우 유사한 서열을 보유하는 펩티드는 췌장 종양 형성을 주도하는 것으로 알려져 있다. 분석물(analyte)과 마커(marker)로서 GP2에 대한 항체는 췌장암의 진단에서 이용이 의도되고, 상기 펩티드와 이의 핵산 서열은 췌장의 암 질환의 면역 치료에서 이용이 의도된다(WO 01/94409). 소형 β-GP2 동종형에 대한 항체는 췌장염의 마커로서 이용될 수 있다(WO 96/17873). β-GP2 농도에서 증가는 상기 질환을 지시하는 것으로 알려져 있다.

CD의 병인에서 자기면역 과정(autoimmune process)의 상태를 분명하게 하고 적절한 실험실 진단으로 불분명한 IBD 사례의 감별을 뒷받침하기 위하여, 췌장 자기항원의 필수적인 - 하지만 여전히 달성되지 않은 - 동정에 대한 명백한 관계가 이루어졌다.

선행 기술로부터 시도가 알려져 있는데, 여기서 펩티드는 무작위화된 파지 전시 라이브러리(randomized phage display library)를 이용하여 획득되고, 이들 펩티드는 CD-특이적 항체의 결정에 이용되었다. EIA에 이용될 때 CD 환자의 혈청 중에서 56.5%에서 양성 검출(positive detection)을 제공하는 4가지 상이한 9합체(nonamer)가 결정되었다. 대조군(control group)(UC, 십이지장 궤양, 건강한 개체)은 반응이 없거나, 또는 6%의 사례에서만 반응을 보였다. 하지만, 이들 9합체의 공지된 펩티드 서열로부터, 이들 고유 CD 자기항원에 대한 결론이 불가능하였다.

현재까지, 상응하는 췌장 항원을 동정하는데 성공한 사례는 없다(Bossuyt, 2006). 따라서 크론병과 만성 췌장염을 진한하고 후자를 궤양성 대장염과 구별하기 위한 비-침해성(non-invasive)이고, 특이적이고, 정량적이고, 신속하고, 용이하고, 저렴하고, 실현가능한 검출 분석법은 현재 가용하지 않다.

이러한 문제점은 본 발명에 의해 해결된다. CD 및 연관된 만성 췌장염에 대한 자기항원으로서 GP2의 놀라운 특성화에 기초하여, 특허청구범위에 따른 방법이 GP2를 이용한 IBD의 진단 또는 치료 제어를 위하여 개발되었다; 본 발명의 유익한 구체예는 하위청구범위(subclaim)로부터 추론될 수 있다.

따라서 본 발명은 자가면역 질환의 예방, 진단, 치료 또는 몸조리에서, GP2 분자, 면역반응성 서열 또는 이들의 유사체, 특히, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자와의 면역 반응을 통하여 분변 및/또는 체액, 특히, 혈액 및/또는 혈청으로부터 항체의 검출 방법에 관계한다:

본 발명에 따르면, 체액의 정의는 인간 혈액, 혈청, 소변, 순수 췌액 또는 십이지장 액 역시 포괄한다.

GP2에 대한 자기항체의 결정, 또는 CD 또는 만성 췌장염의 혈청학적 진단에서 고형상 항원으로서 ELISA에서 이의 용도는 선행 기술에서 고려되거나 언급된 바가 없다.

본 발명은 GP2 분자, 특히, SEQ ID NO 1 서열에 따른 GP2 분자, 또는 이를 인코딩하는 핵산이 자가면역 질환, 특히, 염증성 장 질환, 더욱 바람직하게는 크론병, 만성 췌장염과 궤양성 대장염의 검출과 치료에 이용될 수 있다는 놀라운 조사 결과에 관계한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 IgA, IgM 및/또는 IgG 항체 자가면역 질환이 검출되는 방법에 관계한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, GP2는 인간, 동물, 재조합 또는 합성 기원이다. GP2는 본 발명에 따른 서열에 기능적으로 유사하면 임의의 기원의 GP2가 검출에 유리하게 이용될 수 있도록 고도로 보존된 펩티드를 대표한다. 항원과 자기항체로서 GP2 사이에 높은 결합 친화성이 유지된다.

본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 자기항체는 면역분석에서, 바람직하게는 표지 물질(labelling substance)에 대한 반응물의 직접적인 또는 간접적인 결합으로 검출된다. 이는 상이한 실험실과 이들의 실험실 진단 설비의 잠재력과 필요조건에 상기 방법의 유연한 적합을 가능하게 한다.

유익한 구체예에서, IBD-특이적 항체가 면역분석에서 검출되는데, 여기서 이들 항체는 액상(liquid phase)에 용해된 상태, 바람직하게는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 완충액 또는 희석되지 않은 체액에서 희석된 상태로 존재한다. 본 발명에 따르면, 검출은 분변 샘플을 이용하여 달성될 수도 있다.

다른 유익한 구체예에서, 이러한 면역분석은 항체의 검출에 이용되는데, 이의 종결 시점에서 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 항원의 고형상에 결합이 계획된다. 샘플 용액의 부가 이후에, 여기에 포함된 환자의 항체는 GP2 항원에 결합한다. 예로써, 환자의 혈청 또는 분변으로부터 획득되고 GP2에 결합하는 항체는 표지된 반응물을 이용하여 차후에 검출되고 선택적으로 정량된다. 항원이 고형상에 결합되는 이러한 방법은 당업자에게 "직접적인 분석법"으로 알려져 있다.

따라서 본 발명에 따르면, 상기 방법에서 항체의 검출은 널리 공지된 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 기술에 따라 표지된 반응물을 이용하여 달성된다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 라벨(label)은 광학 수단(optical means), 특히, 발색성 기질(chromogenic substrate), 화학발광(chemiluminescent) 방법 또는 형광 염료(fluorescent dye)에 의해 결정될 수 있는 화학 반응을 촉매하는 효소를 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, 자기항체는 생성된 방사성(radioactivity)이 측정되는 방사성면역분석(radioimmunoassay, RIA)에서 약한 방사성 물질로 표지함으로써 검출된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 가용성 또는 고형상-결합된 GP2 분자가 이들 항체에 결합하는데 이용된다. 두 번째 반응 단계에서, 항-인간 면역글로불린, 바람직하게는 항-인간 IgA, 항-인간 IgM 및/또는 항-인간 IgG 항체로 구성된 군에서 선택되는 항-인간 면역글로불린이 이용되는데, 상기 항-인간 면역글로불린은 임의의 통상적인 표지 효소(labelling enzyme), 특히, 발색성 및/또는 화학발광성 기질, 바람직하게는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 공동될 수 있는 2가지 성분의 검출가능하게 표지된 배합체(conjugate)이다. 이러한 구체예의 이점은 본 발명에 따른 검출이 비용-효과적 방식으로 확립될 수 있도록 실험실 시설에서 통상적으로 이용가능한 ELISA 기술의 이용에 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, GP2에 결합하는 항체는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)에 검출가능하게 결합된 항-인간 면역글로불린, 바람직하게는 항-인간 IgA, 항-인간 IgM 및/또는 항-인간 IgG 항체로 구성된 군에서 선택되는 항-인간 면역글로불린과 반응한다. 앞서 언급된 ELISA와 유사하게, FITC 기술은 많은 장소에서 이용가능하고, 따라서 실험실 루틴(laboratory routine)에서 본 발명에 따른 검출의 매끄러운 저-비용 확립을 가능하게 하는 시스템을 대표한다.

본 발명은 또한, 염증성 장 질환의 치료 방법에 관계하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:

a) GP2가 결합된 칼럼을 제공하는 단계;

b) 환자의 혈장 내에서 항체에 GP2의 효과적인 결합을 가능하게 하는 조건 하에 환자의 혈장을 칼럼에 통과시켜 환자의 혈장으로부터 상당한 양의 항체를 제거하는 단계;

c) 이렇게 획득된 혈장을 환자로 환원하는 단계.

본 발명에 따른 상기한 방법의 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는 장 조직을 지향하는 자기항체를 인식한다. 이러한 구체예는 IBD의 진단이 환자에 스트레스를 빈번하게 수반하는 개입(intervention) 없이 체액 또는 분변으로부터 간단하게 달성될 수 있는 유익한 효과를 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는 고형상에 결합된다. 고형상에 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자의 결합은 스페이서(spacer)를 통하여 달성될 수 있다. 스페이서 기능을 위한 적절한 구조적, 기능적 전제조건을 충족하는 모든 화학적 화합물이 스페이서로서 이용될 수 있는데, 단서로써 이들은 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 자기항체의 결합이 부정적인 영향을 받는 방식으로 결합 행태(binding behavior)를 변화시키지 않아야 한다.

본 발명의 방법과 용도는 크론병의 진단 또는 치료 제어를 가능하게 하는데, 그 이유는 GP2 항원, 바람직하게는 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 항원이 놀랍게도, GP2 분자, 면역반응성 서열 또는 이들의 유사체와의 면역 반응을 통한 분변 및/또는 체액, 특히, 혈액 및/또는 혈청으로부터 자기항체의 검출을 가능하게 하고, 상기 면역 반응이 동물 또는 인간 조직의 조직 절편을 이용하지 않으면서 수행될 수 있기 때문이다.

앞서 기술된 검출 방법의 바람직한 이형에서, 자기항체는 바람직하게는 반응물의 표지 물질과의 직접적인 또는 간접적인 결합을 이용하여 검출된다.

본 발명에 따르면, 고형상에서 앞서 기술된 검출 방법을 수행하는 것이 바람직한데, 이러한 경우에 펩티드의 저장성(storability)이 고형상에 대한 GP2 항원의 놀랍도록 안정한 연쇄(linkage)의 결과로써 유익하게 증가된다.

본 발명은 또한, 자가면역 질환의 예방, 진단, 치료 및/또는 몸조리에 이용되는 약제의 생산에서 SEQ ID NO 1 서열에 따른 GP2 분자의 용도에 관계한다. 실제로, 본 발명에 따른 용도는 예로써, 생검, 실험실 진단과 임상적 개입(clinical intervention)에 기초한 더욱 복잡하고 신뢰성 없는 절차가 많은 경우에 중요하지 않거나, 또는 이들 조치 - 앞서 기술된 검출에 기인함 -가 이행될 때 유의하게 최적화될 수 있는 유익한 효과를 갖는다.

이러한 방법의 바람직한 구체예에서, 자가면역 질환은 염증성 장 질환(IBD) 및/또는 자가면역 간질환으로 구성된 군에서 선택되는데, 이의 검출은 유리하게는, GP2 자기항원을 이용한 특이적이고, 재현가능하며, 비용-효과적인 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 염증성 장 질환은 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염이다. 현재까지, 이들 질환의 검출 또는 구별은 많은 노력을 필요로 하거나, 또는 극히 제한적으로만 성공하였다. 상기한 바람직한 구체예는 크론병과 만성 췌장염의 용이한 검출, 그리고 감별 진단에 의한 궤양성 대장염으로부터 구별을 가능하게 한다.

크론병은 만성 염증성 장 질환의 집단에 속한다. 이는 전체 위장관, 다시 말하면, 구강(oral cavity) 내지 항문(anus)에서 발생하는 아마도, 자기공격성(autoaggressive) 만성 육아종(chronic-granulomatous) 염증이다. 주로 소장 하부(lower small intestine)(회장 말단부(terminal ileum), 대략 40%가 영향을 받음)와 대장이 영향을 받고, 식도(esophagus)와 입(mouth)은 드물게 영향을 받는다. 크론병은 장 점막의 불연속적이고 단편적인 영향(소위 "건너뛰기 병소(skip lesions)")으로 특징된다, 다시 말하면, 상기 질환은 건강한 절편에 의해 분리되는 복수의 장 절편 내에서 동시에 존재할 수 있다. 상기 질환의 다른 명칭은 국한성 창자염(regional enteritis), 말단 회장염(terminal ileitis), 국한성 소장결장염(regional enterocolitis)과 경화성 만성 장염(sclerosing chronic enteritis), 또는 속명(generic term)으로서 약어 CD(크론병)와 IBD(염증성 장 질환)이다. 따라서 본 발명에서 크론병은 거시적으로, 아래의 변화로 특징되는 질환이다:

- 정원용 분무기 현상(garden hose phenomenon): 섬유화(fibrosing)에 의해 유발된 단편 협착(segmental stenosis)

- 호박 돌 현상(cobble stone phenomenon): 심부 궤양(deep ulceration)이 교대로 나타나고, 따라서 호박 돌(cobble stone)-유사한 외형을 갖는 염증성 점막

- 염증성 집합 종양(inflammatory conglomerate tumor): 다양한 장 절편이 서로 부착된다.

조직학적으로, 이는 주로, 염증성 장 조직의 생검에서 인식되는 림프구(lymphocyte)(호산구성), 과립구(granulocyte)와 조직구(histiocyte)의 축적이다. 인접하는 림프절(lymphatic node)은 통상적으로, 크기가 증가한다. 빈번하게, 2가지 유형으로 구분될 수 있는 육아종: 유상피 세포성 육아종(epithelioid cell granuloma)과 소육아종(microgranuloma)(더욱 작고 중심 괴사(central necrosis)가 없음)이 형성된다.

하지만, 본 발명에서 크론병은 진단 방법으로 특징될 수도 있다. 이 경우에, 본 발명에서 크론병은 아래의 특징 중에서 최소한 하나가 검출될 수 있는 질환이다:

- 충수염(appendicitis): 통상적으로, 우측 하복부(lower abdomen)에서 통증이 급속하게 발생. 빈번하게, 직장 치수와 겨드랑이 치수 사이에 온도 차이 >1℃

- 게실염(diverticulitis): 촉진할 수 있는 저항(palpable resistance), 통상적으로 하복부 좌측면에서, 통증.

- 에르시이나증(yersiniosis): 분변 또는 생검 물질로부터 병원균의 검출, 항체 역가(antibody titer)의 증가.

- 장 결핵: 현재, 중부 유럽(Central Europe)에서는 매우 드물게 발생한다. 장 결핵은 폐의 침범을 빈번하게 동반한다. "건락성(cheesy)" 유상피 세포성 육아종이 생검 물질에서 관찰된다.

- 다른 침해성 감염성 대장염(살모넬라 장염(salmonella enteritis), 가막성 대장염(pseudomembranous colitis) 등)

본 발명에서 췌장염은 급성이나 만성인 췌장의 염증이다.

췌장염은 통상적으로, 췌장 내에서 췌장 효소의 활성화에 의해 유발된다. 이들 효소의 기능은 췌장의 단백질과 지방을 소화시켜 자기소화(autodigestion)를 유도하는 것이다. 자기소화는 췌장의 염증을 유발한다. 심각한 사례에서, 출혈(hemorrhage), 심각한 조직 손상, 감염과 낭포가 발생할 수 있다. 염증성 선(gland)은 효소가 혈류로 들어가고, 따라서 폐, 심장과 신장에 도달하도록 하여 추가적인 손상을 유발한다. 급성 췌장염은 췌장에 갑작스럽게 염증이 발생하지만 그 이후에 회복할 때 나타난다. 일부 환자는 급성 췌장염이 수회 발생하고, 매번 완전하게 회복한다. 급성 췌장염은 갑작스럽게 나타나고, 다수의 합병증을 유발하는 심각하고 치명적인 질환일 수 있지만, 환자들은 통상적으로, 급성 췌장염으로부터 회복한다. 발생률은 연간 100,000명의 거주민(inhabitant)당 대략 5 내지 10건이다.

2가지 유형의 과정이 존재한다:

1. 부종성 췌장염(edematous pancreatitis): 췌장의 팽창과 주변 지방 조직에서 경미한 괴사로 특징되는 온후한 과정

2. 출혈-괴사성 췌장염(hemorrhagic-necrotizing pancreatitis): 췌장 내에서와 인접 부위로 광범위한 괴사와 출혈; 종종, 극발성 증상(fulminant symptom)의 결과로써 췌장 출혈(pancreatic apoplexy)로 지칭됨.

췌장의 형태학적 평가(morphologic assessment), 특히, 부종성과 괴사성 췌장염의 구별은 조영 매체-증강된 컴퓨터 단층촬영(contrast medium-enhanced computer tomography)을 이용할 때 가장 성공적이다. Balthazar 스코어(0 내지 10 포인트)가 심각도 분류에 유용한 것으로 밝혀졌다.

급성 췌장염은 여러 원인에 기인할 수 있다. 가장 빈번한 원인은 췌장관의 분문(orifice)이 되는 십이지장으로 이어지는 담관의 분문 내에서 일시적으로 또는 장기간 동안 고정되는 담석(gallstone)이다(급성 췌장염의 대략 45%). 유사하게 빈번한 원인은 만성 알코올 중독(chronic alcohol abuse)이다(대략 35%). 병든 개체 중에서 대략 15%에서는 명확한 유발 인자(trigger factor)가 결정될 수 없는데, 이들 사례는 특발성 기원(idiopathic genesis)으로 지칭된다. 부가적으로, 드물긴 하지만 아래와 같은 원인이 존재한다:

- 약물(가령, 아스파라기나아제(asparaginase), 아자티오프린(azathioprin), 푸로세미드(furosemide), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 항생제(antibiotic)(테트라사이클린(tetracycline), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole), 트리메토프림(trimethoprim)), 항경련제(anticonvulsive agent)(발프로에이트(valproate), 카르바마제핀(carbamazepine)), 프로포폴(propofol) 등)의 부작용

- 감염, 예를 들면, 이하선염(mumps), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus), 간염(hepatitis), HIV, 시토메갈리 바이러스(cytomegaly virus)

- 예로써, 부갑상선 기능 항진증(hyperparathyroidism)에서 상승된 혈액 칼슘 수치

- 강하게 상승된 혈중지방(blood fat)(트리글리세리드)

- ERCP 이후에 의원병(iatrogenic disease)

- 유전적: 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)

초기에, 급성 췌장염은 흉강(thorax) 내로 발산하고 수일 이후에 소멸하는 (좌측 내지 전체) 상복부(upper abdomen)(epigastrium)에서 통증으로 분명해진다. 이러한 통증은 종종, 강력할 뿐만 아니라 때때로 연장된다. 상기 통증은 급작스럽고 격렬하거나, 또는 가벼운 통증의 형태로 시작되고 음식물의 섭취 이후에 악화된다(음식물을 소화시키기 위한 췌장 효소의 형성동안 췌장 자극의 결과로써). 복부는 팽창되고 고도로 민감해질 수 있다. 접촉만으로도 고통스런 복부, 그리고 고창(meteorism)과 (온후한) 경계(guarding)에 의해 유발되는 소위 고무 복부(rubber abdomen)가 신체검사에서 특징적이다. 유사하게, 흉추(thoracic spine)의 아래쪽 부위에도 통증이 발생할 수 있다. 초기에, 이런 통증은 경미한 요통(lumbago)에 유사하지만, 차후에 복부 상에서 췌장의 뒤에서부터 머리 영역으로 "관통되는" 느낌으로 더욱 발전한다.

급성 췌장염을 앓는 환자는 통상적으로, 매우 아파보이고, 실제로 아픔을 느낀다. 다른 증상에는 예로써, 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting), 변비(obstipation), 열병(fever), 가속화된 맥박(accelerated pulse) 등이 포함된다. 심각한 사례에서, 황달(jaundice)(icterus)(폐색된 담관의 경우에), 복수(abdominal dropsy)(ascites)(폐색된 문맥계(portal system)의 경우에), 흉막삼출(pleural effusion), 쇼크(shock)와 패혈증(sepsis) 증세가 부가적으로 나타난다.

실험실 진단에서, 증가된 백혈구 수(백혈구 증가증(leukocytosis))와 췌장 효소(가령, 트립신, 아밀라아제, 리파아제)의 농도에서 증가가 검출된다. 또한, 혈액 내에서 칼슘(calcium), 마그네슘(magnesium), 나트륨(sodium), 칼륨(potassium), 중탄산염(bicarbonate), 당(sugar) 또는 지방 수치가 증가될 수 있다.

급성 췌장염 사례 중에서 대략 20%가 심각하다. 환자는 탈수와 저혈압이 발생할 수 있다. 때때로, 심부전(cardiac failure), 폐부전(pulmonary failure) 또는 신부전(renal failure)이 발생한다. 최악의 사례에서 급성 췌장염은 출혈, 쇼크와 심지어 사망을 유발한다.

현재의 애틀랜타 분류(Atlanta classification)에 따라, 경등도와 중증도 급성 췌장염의 구별이 이루어진다.

기존의 분류는 부종 형태(edematous form)(초기 단계), 국소 또는 전신 출혈이 발생하는 출혈 형태(hemorrhagic form)와 급성 괴사 형태(acute necrotizing form)로 구분한다.

만성 췌장염은 많은 원인에 기인하지만, 70 내지 80%가 만성 알코올 중독에 기인할 수 있다. 만성 췌장염은 여성보다 남성에서 더욱 빈발하고, 종종 30세 내지 40세의 연령에서 발병한다. 만성 췌장염은 또한, 원인이 제거되지 않거나, 또는 원심관(efferent duct)이 손상되면, 급성 염증으로부터 발생할 수도 있다.

일부 만성 췌장염은 유전적 원인(hereditary cause)에 기인한다. 이들은 췌장에 의해 형성되고 조직 손상을 유발하는 효소의 비정상(abnormality)에 기초된다. 상기 질환의 다른 형태는 흡연(tobacco smoking)과 같은 외부 인자에 의해 유발된다.

췌장염의 초기 단계 동안, 의사는 종종, 급성 또는 만성 형태가 관련되는 지를 결정할 수 없다. 증상은 동일하다.

만성 췌장염은 빈번하게, 만성 통증을 유발한다. 만성 췌장염의 일부 사례에서, 병이 진전됨에 따라 통증이 약해진다. 이는 또한, 췌장 기능저하(pancreatic hypofunction)를 유발하여 체중 감소(weight loss)와 소화불량(disturbed digestion)을 초래한다. 불충분한 소화와 흡수는 분변을 통한 지방과 단백질의 배출로 이어진다. 췌장 내에서 내분비 세포(endocrine cell)(랑게르한스 섬(Langerhans islet))가 손상되면, 당뇨병(diabetes)이 발병할 수 있다.

만성 췌장염의 진단은 어렵다; 하지만, 일부 고도로 진전된 의학 기술이 가용하다. 췌장 기능 혈액 검사는 췌장이 충분한 소화 효소를 여전히 생산할 수 있는 지를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 하지만, 이들은 실질적으로, 거의 채택되지 못하고 있다.

췌장의 비정상은 음파홀로그래피(sonography), ERCP와 컴퓨터 단층촬영(computer tomography)을 이용하여 인식될 수도 있다.

당뇨병과 흡수불량(malabsorption)이 관찰되는 만성 췌장염의 더욱 진전된 단계 동안, 의사는 진단을 위한 혈액, 소변과 분변 검사를 수행할 수도 있다.

만성 췌장염의 치료는 진통제(analgesics)의 처방과 식이에서 변화를 필요로 한다. 환자는 췌장 효소를 함유하는 약물을 복용함으로써 지방과 단백질의 손실을 감소시킬 수 있다. 이의 결과는 향상된 영양과 체중 증가일 것이다. 인슐린 또는 다른 약제는 때때로, 혈당 수준을 통제하기 위하여 처방된다.

만성 췌장염의 일부 사례에서, 확장되고 울혈된 췌장관으로부터 긴장을 없앰으로써 통증을 완화시키는 수술이 수행된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, GP2는 간 질환, 원발성 경화성 담관염 및/또는 자가면역 장염(autoimmune enteritidis)을 검출하는데 이용된다. 놀랍게도, GP2 자기항원은 IBD의 특이적 검출뿐만 아니라 다양한 간질환의 검출에도 적합하다.

본 발명에서 담관염(cholangitis)은 간내 담관(intrahepatic biliary duct)의 염증을 지칭한다. 이는 특히, 담석, 협착, 종양 또는 기생충 감염에 의한 담관의 폐쇄를 비롯한 다양한 원인에 의해 유발될 수 있다. 이는 급성 화농성 담관염, 비-화농성 파괴성 담관염과 만성 경화성 담관염으로 구분된다.

급성 화농성 담관염: 급성 담관염은 통상적으로, 세균, 주로, 대장균(Escherichia coli), 장구균(Enterococcus) 또는 클레브시엘라(Klebsiella) 종으로 군집화(colonization) 동안 감염에 의해 발병한다. 상복부에서 편측 통증(unilateral pain), 열병과 오한 전율(shaking chill)이 증상으로서 나타난다. 게다가, 심각한 화농성 담관염은 쇼크 장애, 중추신경계 질환과 신장 기능장애를 유발한다. 치료는 담관 내에 내시경 개입(endoscopic intervention), 예를 들면, ERCP(endoscopic retrograde cholangiopancreatography) 또는 PTCD(percutaneous transhepatic cholangiodrainage)를 필요로 하는데, 이는 담즙 흐름(biliary flow)과 통상적으로, 항생 작용(antibiosis)을 복원한다.

비-화농성 파괴성 담관염: 이러한 형태의 담관염은 만성적인 과정을 거치고, 원발성 담도 경변증(primary biliary cirrhosis)으로 지칭된다. 병든 개체의 95%는 여성이고, 발병률 피크(incidence peak)는 40세 내지 60세이다. 진단 관점에서, 항미토콘드리아 항체(antimitochondrial antibody, AMA)가 대부분의 환자의 혈액에서 관찰되고, 따라서 자가면역성 기원(autoimmunological genesis)이 추정된다. 임상적으로, 이들 환자는 가려움증(itching), 황달(icterus)과 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia)으로 특징된다. 그 이상의 과정 동안, 환자에 대한 도움은 간 이식(liver transplantation)으로만 가능하다.

만성 경화성 담관염: 만성 경화성 담관염은 가장 드물게 발생하는 담관 염증이고, 원발성과 속발성 경화성 형태로 구분된다. 원발성 형태는 기존하는 유전적 소인(genetic disposition)(HLA-B8 항원과의 연관이 확인되었다)의 존재에서 감염을 통하여 발생하고, 여성에서보다 남성에서 2배 많이 발생한다. p-ANCA는 이들 사례의 최대 90%에서 관찰된다. 속발성 형태는 기존하는 면역결핍 증후군(immunodeficiency syndrome)의 기초에서 발병한다. 파괴성 담관염에서처럼, 간 이식(liver transplantation)이 최종 단계에서 필요하다.

본 발명에서 자가면역 장염은 임의의 장염 형태, 특히, 만성 염증성 장 질환에 의해 유발되는 장염을 포함한다. 또한, 본 발명에서 자가면역 장염은 살모넬라(salmonella), 대장균(E. coli), 콜레라(cholera) 또는 발진티푸스(typhus) 병원균에 의해, 또는 진균(fungi), 원생동물(protozoa), 독성 물질(toxic substance)에 의해 유발되는 장염뿐만 아니라 알레르기-기초된 장염(allergy-based enteritis) 또는 임의 형태의 일사성 장염(actinic enteritis), 예르시니아 장염(Yersinia enteritis) 또는 세균성 이질(bacterial dysentery) 역시 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, GP2 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO 1에 따른 서열에 최소한 60%, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 특히, 바람직하게는 90% 상동성을 갖는다. 다시 말하면, 본 발명은 SEQ ID NO 1에 따른 서열에, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 특히 바람직하게는 90% 상동성을 갖는 모든 펩티드에 관계한다. 이들 동족체(homolog)는 결실, 부가, 치환, 전위, 역위 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있다. 더욱 구체적으로, 이러한 변형은 기능적 상동성(functional analogy)을 갖는 상동한 펩티드에 관계한다. 본 발명에서 이들 펩티드는 상기한 질환과 연관된 자기항체와 특이적으로 상호작용하면 기능적으로 유사하다.

따라서 본 발명은 기능적으로 유사한 방식으로 이용될 수 있는 개시된 펩티드와 동족체에 관계한다. 동족체/기능적 유사체(functional analog)에 관하여, 당업자는 부가, 결실 또는 치환에 의한 변형이 펩티드를 실질적으로 변화시키지 않으면서 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 변형된 아미노산 서열이 SEQ ID NO 1에 따른 서열과 동일한 기능을 본질적으로 동일한 방식으로 달성하여 동일한 결과를 산출하면, 상기 서열은 실질적으로 변화가 없다. 가령, 기능적으로 유사한 펩티드는 SEQ ID NO 2:

MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASAVQRGYGNPIEASSYGLDLDCGAPGTPEAHVCF

DPCQNYTLLDEPFRSTENSAGSQGCDKNMSGWYRFVGEGGVRMSETCVQVHRCQTDAP

MWLNGTHPALGDGITNHTACAHWSGNCCFWKTEVLVKACPGGYHVYRLEGTPWCNLRYC

TVPRDPSTVEDKCEKACRPEEECLALNSTWGCFCRQDLNSSDVHSLQPQLDCGPREIKVK

VDKCLLGGLGLGEEVIAYLRDPNCSSILQTEERNWVSVTSPVQASACRNILERNQTHAIYKN

TLSLVNDFIIRDTILNINFQCAYPLDMKVSLQAALQPIVSSLNVSVDGNGEFIVRMALFQDQNY

TNPYEGDAVELSVESVLYVGAILEQGDTSRFNLVLRNCYATPTEDKADLVKYFIIRNSCSNQ

RDSTIHVEENGQSSESRFSVQMFMFAGHYDLVFLHCEIHLCDSLNEQCQPSCSRSQVRSE

VPAIDLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPSTAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF

또는, SEQ ID NO 3:

MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASAVQRGYGNPIEASSYGLDLDCGAPGTPEAHVCF

DPCQNYTLLDEPFRSTENSAGSQGCDKNMSGWYRFVGEGGVRMSETCVQVHRCQTDAP

MWLNGTHPALGDGITNHTACAHWSGNCCFWKTEVLVKACPGGYHVYRLEGTPWCNLRYC

TDPSTVEDKCEKACRPEEECLALNSTWGCFCRQDLNSSDVHSLQPQLDCGPREIKVKVDK

CLLGGLGLGEEVIAYLRDPNCSSILQTEERNWVSVTSPVQASACRNILERNQTHAIYKNTLSL

VNDFIIRDTILNINFQCAYPLDMKVSLQAALQPIVSSLNVSVDGNGEFIVRMALFQDQNYTNP

YEGDAVELSVESVLYVGAILEQGDTSRFNLVLRNCYATPTEDKADLVKYFIIRNSCSNQRDS

TIHVEENGQSSESRFSVQMFMFAGHYDLVFLHCEIHLCDSLNEQCQPSCSRSQVRSEVPAI

DLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPSTAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF

또는, SEQ ID NO 4:

MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASAVQRVPRDPSTVEDKCEKACRPEEECLALNSTW

GCFCRQDLNSSDVHSLQPQLDCGPREIKVKVDKCLLGGLGLGEEVIAYLRDPNCSSILQTEE

RNWVSVTSPVQASACRNILERNQTHAIYKNTLSLVNDFIIRDTILNINFQCAYPLDMKVSLQA

ALQPIVSSLNVSVDGNGEFIVRMALFQDQNYTNPYEGDAVELSVESVLYVGAILEQGDTSRF

NLVLRNCYATPTEDKADLVKYFIIRNSCSNQRDSTIHVEENGQSSESRFSVQMFMFAGHYD

LVFLHCEIHLCDSLNEQCQPSCSRSQVRSEVPAIDLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPS

TAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF

또는, SEQ ID NO 5일 수 있다:

MPHLMERMVGSGLLWLALVSCILTQASAVQRDPSTVEDKCEKACRPEEECLALNSTWGCF

CRQDLNSSDVHSLQPQLDCGPREIKVKVDKCLLGGLGLGEEVIAYLRDPNCSSILQTEERN

WVSVTSPVQASACRNILERNQTHAIYKNTLSLVNDFIIRDTILNINFQCAYPLDMKVSLQAALQ

PIVSSLNVSVDGNGEFIVRMALFQDQNYTNPYEGDAVELSVESVLYVGAILEQGDTSRFNLV

LRNCYATPTEDKADLVKYFIIRNSCSNQRDSTIHVEENGQSSESRFSVQMFMFAGHYDLVFL

HCEIHLCDSLNEQCQPSCSRSQVRSEVPAIDLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPSTAGF

LVAWPMVLLTVLLAWLF

더욱 구체적으로, 상기한 펩티드는 앞서 명시된 면역 질환의 진단에 요구된다. 상기한 서열은 SEQ ID NO 1 서열과 본질적으로 동일한 기능을 본질적으로 동일한 방식으로 달성하고, 본질적으로 동일한 결과를 산출한다. 이런 이유로, 이들은 본 발명에 따른 교시, 다시 말하면, 특히, 염증성 장 질환의 예방, 진단, 치료 및/또는 몸조리에서 약물로서 GP2 분자의 용도에 의해 포섭된다.

결과적으로, 본 발명에서 이들 아미노산 서열, 다시 말하면, 펩티드는 다수의 부가적인 아미노산, 스페이서, 또는 가급적, 자기항체에 대한 에피토프를 나타내도록 하는 방식으로 이들 펩티드를 자기항체와의 상호작용에 적합하도록 만드는 다른 구조를 포함한다. 따라서 본 발명에 따른 서열은 항체 에피토프에 관련된 펩티드에 국한되지 않고, 염증성 장 질환의 진단이 가능하도록 하는 방식으로 자기항체와 특이적으로 상호작용하는 분자와 이의 모든 단편을 지칭한다. 이런 이유로, 본 발명에서 에피토프, 펩티드와 아미노산 서열은 바람직한 구체예에서, 동의어로서 이용될 수 있다.

기능적으로 유사한 펩티드를 제조하는 다양한 방법은 선행 기술에서 개시된다. 이들 방법을 이용하여 본 발명의 펩티드를 출발 물질로 하여 설계된 펩티드는 본 발명에 따른 교시에 포함된다. 가령, 기능적으로 유사한 펩티드를 산출하는 방법은 PNAS USA 1998, Oct. 13, 9521, 12179-84; WO 99/6293 및/또는 WO 02/38592에서 기술된다; 이들 문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다. 다시 말하면, 상기한 방법을 이용하여 - 본 발명의 펩티드를 출발 물질로 하여 - 산출된 펩티드를 포함하는 모든 펩티드, 펩티드 단편 또는 구조는 이들이 본 발명의 목적을 달성하고, 특히, 병원성 자기항체와 상호작용한다면, 본 발명에 따른 펩티드이다. 가령, 이들 자기항체는 작동적(agonistic) 자기항체 활성화 수용체일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 분자는 α-아미노카르복실산과 이들의 동종- 또는 이종올리고머, α,ω-아미노카르복실산과 이들의 가지형 동종- 또는 이종올리고머, 다른 아미노산과 이들의 선형과 가지형 동종- 또는 이종올리고머; 아미노-올리고알콕시알킬아민; 말레인이미도카르복실산 유도체; 알킬아민의 올리고머; 4-알킬페닐 유도체; 4-올리고알콕시페닐 또는 4-올리고알콕시페녹시 유도체; 4-올리고알킬메르캅토페닐 또는 4-올리고알킬메르캅토페녹시 유도체; 4-올리고알킬아미노페닐 또는 4-올리고알킬아미노페녹시 유도체; (올리고알킬벤질)페닐 또는 4-(올리고알킬벤질)페녹시 유도체와 4-(올리고알콕시벤질)페닐 또는 4-(올리고알콕시벤질)페녹시 유도체; 트리틸 유도체; 벤질옥시아릴 또는 벤질옥시알킬 유도체; 크산텐-3-일옥시알킬 유도체; (4-알킬페닐)- 또는 ω-(4-알킬페녹시)알카노산 유도체; 올리고알킬페녹시알킬 또는 올리고알콕시페녹시알킬 유도체; 카르바메이트 유도체; 아민; 트리알킬실릴 또는 디알킬알콕시실릴 유도체; 알킬 또는 아릴 유도체 또는 이들의 조합에서 선택되는 링커 또는 스페이서를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, GP2 분자는 분변 및/또는 체액, 특히, 혈액 및/또는 혈청에서 직접적인 또는 간접적인 자기항체 검출을 위한 가용성 또는 고형상-결합된 자기항원으로서 이용되는데, 여기서 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자의 이러한 용도는 특히 유익한 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 서열, 또는 이로부터 산출될 수 있는 펩티드는 고정된다. 더욱 구체적으로, SEQ ID NO 1에 따른 고형상-결합된 GP2 분자는 유기, 무기, 합성 및/또는 혼합 고분자, 바람직하게는 아가로즈(agarose), 셀룰로오스(cellulose), 실리카 겔(silica gel), 폴리아마이드(polyamide) 및/또는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)에 결합된다. 본 발명에서, 고정화(immobilization)는 예로써, WO 99/56126 또는 WO 02/26292에 따른 특이적 담체(carrier) 상에 펩티드를 고정시키는 다양한 방법과 기술을 포함하는 것으로 간주된다. 가령, 고정화는 생물학적, 화학적 또는 물리적 노출에 의해, 특히, 보관 동안 또는 단일-배치(single-batch) 이용 동안 활성이 감소되거나 부정적인 영향을 받지 않도록 펩티드를 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 펩티드의 고정화는 기술적 또는 임상적 루틴 조건 하에 반복 이용을 가능하게 한다; 게다가, 샘플 - 바람직하게는, 혈액 성분 - 이 연속 방식(continuous fashion)으로 본 발명에 따른 최소한 하나의 펩티드와 반응할 수 있다. 특히, 이는 상응하는 분자, 특히, 상기 펩티드의 3차원 구조 - 특히, 자기항체와의 상호작용을 매개하는 활성 중심(active center)에서 - 가 변하지 않도록 하는 방식으로 진행되는, 이들 펩티드의 다른 펩티드 또는 분자에, 또는 담체에 결합으로, 다양한 고정화 기술에 의해 달성될 수 있다. 유리하게는, 이런 고정화의 결과로써 환자의 자기항체에 대한 특이성이 상실되지 않는다. 본 발명에서, 고정화를 위하여 3가지 기초적인 방법이 이용될 수 있다:

(i) 가교(crosslinking): 가교에서, 펩티드는 활성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 서로에게 고정된다. 유리하게는, 이들 펩티드는 이런 가교의 결과로써 더 이상 가용성이 아니다.

(ii) 담체에 결합: 담체에 결합은 예로써, 흡착(adsorption), 이온 결합(ionic binding) 또는 공유 결합(covalent binding)을 통하여 진행된다. 이런 결합은 또한, 미생물 세포(microbial cell) 또는 리포좀(liposome), 또는 다른 막형성 닫힌 또는 열린 구조 내에서 발생할 수도 있다. 유리하게는, 펩티드는 이런 고정에 의해 부정적인 영향을 받지 않는다. 가령, 임상적 진단 또는 치료에서 담체-결합된 펩티드의 유익한 복수 또는 연속 이용이 가능하다.

(iii) 함입(inclusion): 본 발명에서 함입은 특히, 겔(gel), 가는 섬유(fibril) 또는 섬유(fiber) 형태의 반투과성(semipermeable) 막 내에서 진행된다. 유리하게는, 캡슐화된 펩티드는 자기항체 또는 이의 단편과의 상호작용이 여전히 가능하도록 하는 방식으로, 반투과성 막에 의해 주변 샘플 용액으로부터 분리된다. 고정화를 위하여 다양한 방법, 예를 들면, 불활성 또는 전기 하전된 무기 또는 유기 담체 상에서 흡수가 가용하다. 가령, 이들 담체는 다공성 겔(porous gel), 산화알루미늄(aluminum oxide), 벤토나이트(bentonite), 아가로즈, 전분(starch), 나일론(nylon) 또는 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)일 수 있다. 고정화는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)과 이온 결합(ionic binding)을 빈번하게 포함하는 물리적 결합력(physical binding force)을 통하여 진행된다. 유리하게는, 이들 방법은 펩티드를 취급하기 용이하고 펩티드의 형태에 영향을 거의 주지 않는다. 유리하게는, 결합은 예로써, 이온 교환기(ion exchanger), 특히, 세파덱스(Sephadex)를 이용함으로써, 펩티드의 하전된 기(charged group)와 담체 사이에 정전기 결합력(electrostatic binding force)의 결과로써 향상될 수 있다.

다른 방법은 담체 물질에 공유 결합이다. 이에 더하여, 이들 담체는 아미노산 측쇄와 등극결합(homopolar bond)을 형성하는 반응기(reactive group)를 보유한다. 펩티드 내에서 적절한 기는 카르복시(carboxy), 하이드록시(hydroxy)와 설피드(sulfide) 기, 특히, 리신(lysine)의 말단 아미노 기이다. 방향족 기(aromatic group)는 디아조(diazo) 결합의 가능성을 제공한다. 현미경적 다공 유리 입자의 표면은 실란(silane) 처리에 의해 활성화되고, 차후에 펩티드와 반응할 수 있다. 가령, 자연 고분자의 하이드록시 기는 브로모시아노겐(bromocyanogen)으로 활성화되고, 차후에 펩티드와 결합할 수 있다. 유리하게는, 다수의 펩티드는 폴리아크릴아마이드 수지(polyacrylamide resin)와의 직접적인 공유 결합을 겪을 수 있다. 3차원 망 내에 함입은 이온투과성 겔(ionotropic gel) 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 구조 내에 펩티드의 함입을 수반한다. 더욱 구체적으로, 기반(matrix)의 구멍은 펩티드가 유지되고 표적 분자와의 상호작용이 가능하도록 실재한다. 가교에서, 펩티드는 이중기능성 작용제(bifunctional agent)와의 가교에 의해 고분자 집합체(polymer aggregate)로 전환된다. 이들 구조는 아교질이고, 쉽게 변형가능하고, 특히, 다양한 반응기에 이용하기 적합하다. 가교에서 젤라틴(gelatin)과 같은 다른 불활성 성분을 첨가함으로써, 기계적 특성과 결합 특성의 유익한 향상이 가능하다. 마이크로캡슐화(microencapsulation) 동안, 펩티드의 반응 부피(reaction volume)는 막에 의해 제한된다. 가령, 마이크로캡슐화는 계면 중합(interfacial polymerization)의 형태로 수행될 수 있다. 마이크로캡슐화 동안 고정화로 인하여, 펩티드는 불용화되고, 따라서 재사용될 수 있다. 본 발명에서, 고정된 펩티드는 재사용을 가능하게 하는 조건에 있는 모든 펩티드이다. 화학적, 생물학적 또는 물리적 수단에 의한 이들 펩티드의 이동성(mobility)과 용해성(solubility) 제한은 특히, 혈액 성분으로부터 자기항체를 제거할 때, 더욱 적은 공정 비용(process cost)을 유익하게 결과한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 단백질 A, 단백질 G, 항-인간 면역글로불린 또는 L-트립토판에서 선택되는 비-특이적인 흡착기 분자가 SEQ ID NO 1에 따른 가용성 또는 고형상-결합된 GP2 분자에 부가적으로 이용된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는

a) SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자에 충분한 상동성을 갖고 상기 분자에 기능적으로 유사한 아미노산 서열을 보유하는 분자; 또는

b) a)에 따른 분자에 기능적으로 유사하고 결실(deletion), 부가(addition), 치환(substitution), 전위(translocation), 역위(inversion) 및/또는 삽입(insertion)에 의해 변형된 a)에 따른 분자에서 선택된다.

놀랍게도, SEQ ID NO 1에 따른 상동성 GP2 분자와 변형된 GP2 분자의 이용은 다수의 이점과 연관된다. 실제로, b)에 따른 변화는 증가된 안정성을 갖고, 따라서 실험실 일일 루틴(laboratory daily routine)에서 이점을 결과하는 분자를 획득할 수 있도록 하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, b)에 명시된 분자는 a)에 명시된 분자에 최소한 40% 상동성을 갖는다. 실험실 일일 루틴에서, 상기 40% 동족체는 전반적으로 a)에 따른 분자보다 더욱 오랫동안 보관될 수 있을 뿐만 아니라 온도 변동(temperature fluctuation)에 증가된 내성을 갖는 놀라운 효과를 나타낸다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, b)에 명시된 분자는 a)에 명시된 분자에 최소한 60%, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 특히, 바람직하게는 90% 상동성을 갖는다. b)에 따른 모든 분자에 관하여, 이러한 변이체(variant)의 매우 놀라운 특성은 최장 저장 수명(storage life)의 유익한 이점을 갖는다는 점이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는 선형 또는 환형으로 존재하고, 펩티드 고리화(peptide cyclization)는 2개의 시스테인이 존재할 때 이황화 결합(disulfide bridge)에 의해, 또는 측쇄(side chain), 말단 C와 N을 통하여 선택적으로 진행되는 아미이드 고리화(amide cyclization)에 의해, 또는 이들 가능 경로의 조합에 의해 진행된다. 상기한 방법에서, GP2 분자의 변이체는 다양한 변성 완충제(denaturing buffer)의 존재에서 GP2 분자의 증가된 안정성을 결과할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염의 치료를 위한 연결된 GP2를 포함하는 칼럼의 생산에서 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자의 용도에 관계하는데, 상기 치료는 환자의 혈장 내에서 면역글로불린에 GP2의 효과적인 결합을 가능하게 하는 선택된 조건 하에 환자의 혈장을 칼럼에 통과시켜 환자의 혈장으로부터 상당한 양의 면역글로불린을 제거하는 단계와 이렇게 획득된 혈장을 환자로 환원하는 단계를 포함한다. 상기 용도는 급성 사례에서 IBD 환자의 혈액으로부터 면역글로불린이 매우 신속하게 제거될 수 있는 유익한 효과를 나타낸다.

다른 측면에서, 본 발명은 GP2 분자, 면역반응성 서열 또는 이들의 유사체에 대한 면역 반응과 연관된 질환의 진단 또는 치료 제어를 위한 약제의 생산에서 GP2 분자, 면역반응성 서열 또는 이들의 유사체를 이용한 면역제(immunogenic agent)에 관계한다. 놀랍게도, GP2의 상기한 서열은 의사의 지시에 따라 환자에 의해 복용되거나 이용될 수 있어 입원 치료가 필요하지 않은 취급 용이한 약제(easy-to-handle medication)의 생산을 가능하게 한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 만성 염증 질환 또는 자가면역 질환, 특히, 염증성 장 질환, 예를 들면, 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염의 진단 또는 치료 제어에서 상기한 면역제의 용도에 관계한다. 이러한 구체예의 이점은 능력 있는 진단과 치료 센터에 거의 출입하지 못하는 자가면역 염증성 장 질환을 앓는 환자도 취급 용이한 약제를 획득하고 주치의의 감독 하에 이를 사용할 수 있다는 것이다.

바람직한 방식에서, 본 발명에 따른 GP2 분자의 SEQ ID NO 1 서열, 또는 이의 면역반응성 서열, 유사체 또는 단편은 이들 물질에 대한 면역 반응과 연관된 질환의 경구 치료를 위한 약제의 생산에서 치료 활성 물질(therapeutic active substance)로서 이용된다. 본 발명에서 치료 활성 물질로서 이용은 전체 의학 분야에서 이로부터 형성될 수 있는 아미노산 서열 또는 펩티드의 이용을 포함한다. 유리하게는, GP2는 경구 경로에서도 약제로서 환자에 투여될 수 있을 만큼 충분히 안정하고 흡수되는 펩티드이다.

본 발명은 또한, 만성 염증 질환 또는 자가면역 질환, 특히, 염증성 장 질환, 예를 들면, 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염의 치료를 위한, 제약학적으로 허용되는 담체와 선택적으로 함께 SEQ ID NO 1에 따른 최소한 하나의 GP2 분자를 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다.

특히, 제약학적 조성물은 약물로서 이용될 수 있다. 이를 위하여, 예로써, 내인성 펩티드-변성 구조, 예를 들면, 혈청 프로테아제(serum protease)에 의한 파괴가 예방되도록 고리화(cyclization) 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 절차로 이들 펩티드 또는 전체 아미노산 서열을 변형하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 단백질(SEQ ID NO 1)을 이용함으로써, 자기항체의 생체내 또는 탈체 중화(neutralization)가 가능하다. 생체내 중화에서, 약물이 환자에 직접 투여된다; 탈체 중화에서, 혈액이 예로써, 루프(loop)를 통하여 튜브 순환(tube circulation)의 형태로 체외로 인도되고, 차후에 약물과 접촉되며, 자기항체의 중화 이후에 생물체, 다시 말하면, 환자로 환원된다. 본 발명에서는 치료와 예방용 조성물, 그리고 진단제(diagnostic agent)로서 사용가능한 제약학적 조성물이 약물로서 간주된다.

본 발명에 따르면, 약물 또는 제약학적 조성물 - 본 명세서에서 동의어로서 이용됨 - 은 인체 내외에 적용으로 질병, 질환, 신체 결함 또는 병리학적 장애(pathological affection)를 치료, 완화 또는 회피하도록 의도되는 물질과 물질의 제제(formulation)이다. 본 발명에 따르면, 의학적 어쥬번트(medical adjuvant)는 약물의 생산에서 활성 성분으로 이용되는 물질이다. 제약학적-기술적 어쥬번트는 약물 또는 제약학적 조성물을 적절히 조제하는 역할을 하고, 필요하면 생산 과정 동안에만 존재하고 이후에 제거되거나, 또는 제약학적으로 허용되는 담체로서 제약학적 조성물의 일부일 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체의 실례는 하기에 제시된다. 제약학적 조성물의 약물 제제 또는 제제는 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와의 조합으로 달성된다. 적절한 제약학적으로 허용되는 담체의 실례는 당업자에게 널리 공지되어 있는데, 여기에는 예로써, 인산염 완충액(phosphate-buffered saline), 물(water), 에멀젼(emulsion), 예를 들면, 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 세정제(detergent), 무균 용액(sterile solution) 등이 포함된다. 이런 담체를 함유하는 약물 또는 제약학적 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 조제될 수 있다. 이들 약물 또는 제약학적 조성물은 적절한 용량, 예를 들면, 일일 환자당 1 ㎍ 내지 10 g 범위의 펩티드 또는 단백질로 개체에 투여될 수 있다. 1 ㎎ 내지 1 g의 용량이 바람직하다. 가능한 적은 횟수와 적은 용량, 바람직하게는 단일 복용량(single dose)의 투여가 바람직하다. 투여는 다양한 경로, 예를 들면, 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 직장내(intrarectal), 위장내(intragastrointestinal), 림프절내(intranodal), 근육내(intramuscular), 국소(local), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal) 또는 피부 위, 또는 경점막(via mucosa)으로 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산의 투여는 유전자 요법(gene therapy)의 형태로, 예를 들면, 바이러스 벡터(viral vector)를 통하여 달성될 수도 있다. 투여량과 투여 경로의 종류는 임상 인자(clinical factor)에 따라서 담당 의사에 의해 결정될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 용량의 종류는 다양한 인자, 예를 들면, 환자의 크기, 신체 표면, 연령, 성별, 또는 전반적인 건강 상태, 투여되는 특정 작용제, 투여 기간과 유형, 동시 투여되는 다른 약제 등에 좌우될 것이다. 또한, 당업자는 약물의 필요 농도를 결정하기 위하여, 본 발명에 따른 펩티드를 이용하여 자기항체의 농도가 먼저 진단될 수 있음을 인지할 것이다.

더욱 구체적으로, 이들 제약학적 조성물 또는 약물은 적절한 용액 또는 투여 형태(administration form)에 담긴, 본 발명에 따른 한 가지 이상의 펩티드 또는 단백질 및/또는 이들을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 약리학적 물질을 함유한다. 이의 투여는 단독으로, 또는 약물 또는 제약학적 조성물과 관련하여 기술된 적절한 어쥬번트와 함께, 또는 한 가지 이상의 어쥬번트, 예를 들면, QS-21, GPI-0100 또는 다른 사포닌(saponine), 물-오일 에멀젼(water-oil emulsion), 예를 들면, 몬타니드(Montanide) 어쥬번트, 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine) 화합물, DNA 화합물, 예를 들면, CpG, Detox, 세균 백신(bacterial vaccine), 예를 들면, 장티푸스 백신(typhoid vaccine) 또는 BCG 백신, 염, 예를 들면, 인산칼슘(calcium phosphate) 및/또는 효과를 강화시키는 다른 적절한 물질, 바람직하게는 면역촉진 분자(immunostimulatory molecule), 예를 들면, 인터루킨(interleukin)(가령, IL-2, IL-12, IL-4) 및/또는 성장 인자(growth factor)(가령, GM-CSF)와의 조합으로 달성될 수 있다. 이들은 널리 공지된 방법에 따라, 본 발명의 펩티드 또는 인식 분자와 혼합되고, 적절한 제제와 용량으로 투여된다. 제제, 용량과 적절한 성분은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

명백하게, 이러한 제약학적 조성물 또는 약물은 시간적으로 동시에 또는 개별적으로 적절하게 투여되거나 적용되는, 2가지 이상의 본 발명의 제약학적 조성물 또는 약물의 조합(combination), 그리고 다른 약물, 예를 들면, 항체 요법제, 화학요법제 또는 방사선요법제와의 조합일 수도 있다. 이들 약물 또는 제약학적 조성물의 생산은 공지된 방법에 따라 진행된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서 계획된 바와 같이, 제약학적 작용제(pharmaceutical agent)에 대한 제약학적 담체는 충전제(filler), 붕해제(disintegrant), 접합제(binder), 습윤제(humectant), 희석제(diluent), 용해 지연제(dissolution retarder), 흡수 강화제(absorption enhancer), 침윤제(wetting agent), 흡착제(absorbent) 및/또는 윤활제(lubricant)로 구성되는 군에서 선택된다. 놀랍게도, 실제로, 다수의 제약학적 담체가 GP2에 적합하고, 따라서 약물의 투여 형태가 환자의 요구에 적합하게 상당 부분 개조될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 또한, 자가면역 질환의 결정을 위한 진단 키트에 관계하는데, 상기 키트는 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자를 포함한다. 이러한 진단 키트는 선택적으로, 상기 키트의 내용물을 합치고 및/또는 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염의 검출을 위한 제제(formulation)를 제공하는 것에 대한 사용설명서를 포함한다. 가령, 이러한 사용설명서는 사용자에게 상기한 물질이 이용되는 방법의 유형에 관한 정보를 제공하는 사용설명서 리플릿(instruction leaflet) 또는 다른 매체의 형태일 수 있다. 명백하게, 이러한 정보는 반드시 사용설명서 리플릿(instruction leaflet)의 형태로 존재할 필요가 없고, 예로써 인터넷을 통하여 제공될 수도 있다. 환자에게, 이런 키트의 유익한 효과는 예로써, 의사를 직접적으로 방문할 필요 없이, 환자가 여행 중에도 질병의 실제 상태를 결정하고, 이에 따라서 식이와 활동을 선택적으로 조정할 수 있다는 점이다.

본 발명은 또한, 크로마토그래피, 특히, 혈장 교환(apheresis)을 위한 기구(apparatus)에 관계하는데, 상기 기구는 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 만성 췌장염 및/또는 궤양성 대장염의 치료를 위한 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자를 포함한다. 일반적으로, 급성 염증의 전통적인 치료는 약물-기초된 치료를 이용하여 가능한 신속한 장 염증의 제어를 계획한다. 본 발명에 따른 크로마토그래피 기구의 이점은 약물을 환자에 투여할 필요가 없고, 대신에 항체로부터 환자 혈액의 정제 - 따라서 염증의 중심으로부터 확대 예방- 가 약물 상호작용과 장기 손상의 위험 없이, 혈장 교환 칼럼에서 달성된다는 것이다. 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는 크로마토그래피 시스템 내에서 고형상에 결합된다. 이들 GP2 분자는 자기항체에 대한 매우 높은 친화성을 나타내고 고형상에서 우수한 고정화를 보이고, 따라서 본 발명에 따른 기구는 환자의 유체로부터 자기항체를 제거하거나, 또는 이들 자기항체를 중화시키는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 면역흡착(immunoadsorption)과 혈장 교환 요법(apheresis therapy)으로 알려져 있다. 면역흡착의 도움으로, 면역글로불린은 환자의 혈액으로부터 제거된다.

유리하게는, 이러한 면역흡착 치료는 입원 치료와 외래 치료 둘 모두로 수행될 수 있다. 상기 기구, 특히, 흡착기(adsorber)는 몸밖의 혈액 순환의 일부로서 계획될 수 있다. 이를 위하여, 혈액은 환자의 주요 도관(vessel), 특히, 팔 정맥(arm vein)으로부터 연속적으로 또는 불연속적으로 채취되고, 여과 또는 원심분리를 이용하여 단일 성분, 예를 들면, 세포와 체액 성분으로 분리된다. 특히, 이러한 방식으로 획득되는 한 가지 필수 혈액 성분은 혈액 혈장이다. 유리하게는, 혈액 혈장은 본 발명의 기구를 통과하고, 자기항체의 흡착 이후에, 앞서 분리된 혈액 성분, 특히, 세포 성분과 함께, 팔 또는 다리의 다른 정맥을 통하여 환자로 환원될 수 있다. 또한, 이들 펩티드는 Sepharose 기반에 고정되도록 설계될 수 있다. 이러한 기반은 10 내지 400 ㎖의 부피를 갖는 용기 내에 배치될 수 있다. 이후, 환자의 혈액 혈장은 자기항체가 결합되는 기반을 통과하고, 따라서 혈액 혈장으로부터 자기항체가 제거될 수 있다.

당업자는 예로써, (i) 재생형 흡착 칼럼(regeneratable adsorption column), (ii) 이중 칼럼(double column)과 (iii) 일회용 칼럼(disposable columns)의 형태로 이런 고형상-고정된 펩티드를 제공하는 다양한 방법에 익숙할 것이다. 고효율의 처리를 가능하게 하는 다양한 세척과 용출 용액은 루틴 검사를 이용함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 교시, 특히, 본 발명의 펩티드를 제공함으로써, 한랭(cold-induced), 자기항체-매개된 질환의 예방, 진단, 치료와 몸조리에서 이들 펩티드를 생체내에서, 탈체에서 또는 시험관내에서 이용하는 다양한 방법이 당업자에게 개시된다.

본 발명에 따른 교시는 아래의 특징으로 인하여 현저하다:

- 전통적인 기술로부터 탈피

- 새로운 문제 분야

- 본 발명에 의해 해결된 문제점의 해법에 대한 오랫동안 충족되지 못한 시급한 필요성의 존재

- 당분야에서 지금까지 헛된 노력

- 해법의 단순함은 특히, 더욱 복잡한 교시를 대체한다는 점에서, 발명적 활동(inventive activity)을 지시한다

- 과학 기술에서 발전이 상이한 방향으로 진행되었다

- 발전을 합리화시키는 업적

- 논쟁이 되고 있는 문제점의 해법에 대한 당분야에서 착오적 인식(선입관)

- 기술적 진전, 예를 들면, 향상, 역량 강화(performance enhancement), 더욱 적은 비용; 시간, 재료, 작업 단계, 비용 또는 입수하기 힘든 원료의 절감, 강화된 신뢰성, 결점의 제거, 우수한 품질, 정비 없음, 더욱 높은 효율, 더욱 높은 수율, 기술 범위의 확장, 추가적인 수단의 제시, 이차적 접근법의 산출, 새로운 분야의 창출, 문제점의 최초 해법, 예비 수단(reserve means), 대안; 합리화, 자동화 또는 소형화를 위한 범위, 또는 가용한 약물 범위의 확대

- 다행스런 선택(다양한 가능성 중에서 하나가 선택되었고, 이의 결과는 예측될 수 없었는데, 다행스럽게도 특허가능한 선택이었다)

- 선행 기술 참고문헌에서 오류

- 신흥 기술 분야

- 조합 발명(combination invention), 다시 말하면, 놀라운 효과를 달성하기 위하여 여러 공지된 요소가 조합되었다.

- 허가의 발표

- 당분야에서 칭찬

- 경제적 성공

이들 특성은 본 발명의 바람직한 구체예에 특히 적용된다.

제한됨 없이, 본 발명은 실시예와 관하여 더욱 상세하게 기술될 것이다.

방법

쥐 췌장으로부터 GP2의 정제

자이모겐 과립(ZG) 획득과 ZG 막의 정제

아래의 모든 작업 단계는 얼음조(ice bath) 내에서, 또는 4℃로 냉각된 상태에서 수행되었다. 4마리의 성장된 Wistar 쥐의 췌장(대략 2.4 g의 조직)은 크기를 기계적으로 감소시키고 POTTER 균질화기(homogenizer)(1000 rpm에서 2회 스트로크(stroke)와 1300 rpm에서 2회 스트로크) 내에서 10배 부피의 차가운 0.3 M 사카로오스 용액(saccharose solution)에 담가서 부드럽게 하였다. 부드러워진 재료는 이후, 거즈 천(gauze cloth)으로 여과하였다. 세포 잔해와 핵은 500 g에서 10분 동안 원심분리로 제거하였다. 3000 g에서 10분 동안 원심분리를 이용하여, 자이모겐 과립(아래쪽, 백색 고체 펠릿)과 미토콘드리아(위에 깔려있음, 엉성하고 갈색을 띠는 펠릿)를 상층액(supernatant)으로부터 침전시켰다. 미토콘드리아는 완충액 A(10 mM 모르폴리노프로판설폰산(morpholinopropanesulfonic acid, MOPS), pH 6.8)로 조심스럽게 씻어내고, 자이모겐 과립은 교반기(vortexer)를 이용하여 2 ㎖의 0.1 M 탄산나트륨 용액, 1 mM 디이소프로필 플로오로포스페이트(diisopropyl fluorophosphate, DFP)에 재현탁시켰다. 이들 과립은 1시간 동안 얼음조에서 용해시켰다. 용해 배치(lysis batch)는 불연속 사카로오스 그라디언트(saccharose gradient)(0.3 M/1 M) 상에서 층상으로 쌓아올리고, 200,000 g에서 90분 동안 원심분리하였다. 막 분취물(membrane fraction)은 밀도 경계면(density interface)에서 띠로서 축적되었다. 상기 띠는 흡수하고, 생성 용액은 0.3 M 브롬화나트륨(sodium bromide)에 조정하였다. 이들 막은 200,000 g에서 60분 동안 원심분리로 침강시켰다.

GP2의 용해화

생성된 막 펠릿은 초음파를 이용하여 0.5 ㎖의 완충액 B(20 mM 모르폴리노에탄설폰산(morpholinoethanesulfonic acid, MES), pH 7.0; 80 mM KCl; 45 g/㎖ 사포닌)에 재현탁시키고, 포스파티딜이노시톨-특이적 인지질가수분해효소 C(바실러스 시리우스(B. cereus))의 첨가 이후에, GP2는 37℃에서 1시간 동안 항온 처리(incubation)로 막으로부터 제거하였다. 막은 원심분리(200,000 g, 60분)로 작은 알갱이로 만들고, 가용성 GP2를 포함하는 상층액은 한외여과(ultrafiltration)를 이용하여 대략 1:5 농축하였다.

GP2 항체의 결정을 위한 효소 결합 면역 흡수법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

마이크로역가 평판(Maxisorb, Nunc, Roskilde)은 코팅 완충액(coating buffer)(100 mM Na 탄산염, pH 9.6)에 녹인 10 ㎍/㎖ 쥐 GP2의 용액으로, 50 ㎕/웰로 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 세척 완충액(10 mM Na 인산염, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4)으로 마이크로역가 평판을 세척한 이후, 웰은 300 ㎕의 차단 완충액(blocking solution)(세척 완충액, 1% 소 혈청 알부민(BSA), pH 7.4)와 함께, 실온(RT)에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이후, 이들 웰은 세척 완충액으로 3회 세척하고, 희석 완충액(dilution buffer)(10 mM Na 인산염, 150 mM NaCl, 1% RSA)에서 1:100 희석된 웰당 50 ㎕의 인간 혈청 샘플은 RT에서 60분 동안 항온 처리하였다. 희석 완충액으로 3회 세척한 이후, 이들 웰은 50 ㎕의 짝 용액(conjugate solution)(항-인간 IgG 과산화효소, 양(sheep), 1 ㎍/㎖, 희석 완충 액)으로 채우고, RT에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이후, 이들 웰은 추가로 3회 세척하고, 웰당 50 ㎕의 기질 용액(테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine))을 분배하였다. RT에서 10분 동안 항온 처리한 이후, 기질 반응(substrate reaction)은 50 ㎕의 억제 용액(quenching solution)(0.3 M 황산(sulfuric acid))을 첨가함으로써 종결시켰다. 각 웰에서 용액의 광학 밀도(optical density)는 마이크로역가 평판 광도계(microtiter plate photometer)를 이용하여 450 nm와 620 nm에서 이색상(bichromatical)으로 측정하고, 이후 EIAstar 소프트웨어 프로그램을 이용한 컴퓨터-기초된 평가(computer-based assessment)를 수행하였다.

췌장 항원 항체의 결정을 위한 간접적인 면역형광(IIF)

IIF로 췌장 항원 항체를 결정하기 위하여, 상업적 원숭이 췌장 절편(Euroimmun, Lubeck)을 이용하였다. 혈청 샘플은 희석 완충액으로 1:40, 1:80과 1:160 희석하였다. 25 ㎕의 희석된 혈청은 반응물 서포트(reagent support)의 각 반응 패드(reaction pad)에 피펫으로 계량하고, 조직 절편을 포함하는 현미경 슬라이드는 RT에서 30분 동안 항온 처리하였다. 이후, 이들 슬라이드는 인산염 완충액(phosphate buffer)으로 1분 동안 세척하였다. 20 ㎕의 표지된 항혈청(항-인간 IgG FITC)은 청소된 반응물 서포트의 각 패드에 피펫으로 계량하고 슬라이드 상에서 조직 절편과 함께 RT에서 30분 동안 항온 처리하였다. 인산염 완충액으로 1분 동안 1회 추가로 세척한 이후, 마운팅 메디움(mounting medium)의 조력으로 이들 슬라이드에 커버슬립(coverslip)을 올려놓았다. 형광 평가는 형광 현미 경(fluorescence microscope)을 이용하여 수행하였다.

참고문헌

Bossuyt X. Serologic markers in inflammatory bowel disease. Clin Chem 2006, 52 (2): 171-181.

Fukuoka S-I. Molecular cloning and sequences of cDNAs encoding (large) and (small) isoforms of human pancreatic zymogen granule membrane-associated protein GP2. BBA 2000, 1491, 376-380.

Fricke H, Birkhofer A, Folwaczny C, Meister W, Scriba PC. Characterization of antigens from the human exocrine pancreatic tissue (Pag) relevant as target antigens for autoantibodies in Crohn's disease. Eur J Clin Invest, 1999, 29: 41-45.

WO 01/94409 (CORIXA CORP [US]; Hirst Shannon K [US]; Harlocker Susan L [US]; Dillon) December 13, 2001 (2001-12-13) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer.

Main J, McKenzie H, Yeaman GR, Kerr MA, Robson D, Pennington CR, Parratt D. Antibody to saccharomyces cerevisiae (bakers' yeast) in Crohn's disease. BMJ, 297: 1105-1106.

Mayet WJ, Press AG, Hermann E, Moll R, Manns M, Ewe K, Meyer zum Bㆌschenfelde KH. Antibodies to cytoskeletal proteins in patients with Crohn's disease. Eur J Clin Invest, 1990, 20: 516-524.

Seibold F, Weber P, Jenss H, Wiedmann K H. Antibodies to a trypsin sensitive pancreatic antigen in chronic inflammatory bowel disease: specific markers for a subgroup of patients with Crohn's disease. Gut 1991, 32: 1192-1197.

WO 96/17873 A (Alphagene INC [US]) June 13, 1996 (1996-06-13) Diagnosis of pancreatitits.

Stocker W, Otte M, Ulrich S, Normann D, Finkbeiner H, Stocker K, Jantschek G, Scriba PC. Autoimmunity to pancreatic juice in Crohn's disease. Results of an autoantibody screening in patients with chronic inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol, 1987, 22 (suppl 139), 41-52.

SEQUENCE LISTING <110> GA GENERIC ASSAYS GmbH <120> Verfahren zum Nachweis von Antik?pern aus K?perfl?sigkeiten durch eine Immunreaktion mit Glykoprotein 2 (GP2) aus zymogenen Granula des Pankreas zur Diagnose von entz?dlichen Darmerkrankungen und chronischer Pankraetitis <130> XII 1673-07 <140> PCT/DE2008/000183 <141> 2008-01-28 <150> EP 07090010.5 <151> 2007-01-26 <150> DE 10 2007 004 909.0 <151> 2007-01-26 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Glykoprotein 2 <400> 1 Met Val Gly Ser Gly Leu Leu Trp Leu Ala Leu Val Ser Cys Ile Leu 1 5 10 15 Thr Gln Ala Ser Ala Val Gln Arg Gly Tyr Gly Asn Pro Ile Glu Ala 20 25 30 Ser Ser Tyr Gly Leu Asp Leu Asp Cys Gly Ala Pro Gly Thr Pro Glu 35 40 45 Ala His Val Cys Phe Asp Pro Cys Gln Asn Tyr Thr Leu Leu Asp Glu 50 55 60 Pro Phe Arg Ser Thr Glu Asn Ser Ala Gly Ser Gln Gly Cys Asp Lys 65 70 75 80 Asn Met Ser Gly Trp Tyr Arg Phe Val Gly Glu Gly Gly Val Arg Met 85 90 95 Ser Glu Thr Cys Val Gln Val His Arg Cys Gln Thr Asp Ala Pro Met 100 105 110 Trp Leu Asn Gly Thr His Pro Ala Leu Gly Asp Gly Ile Thr Asn His 115 120 125 Thr Ala Cys Ala His Trp Ser Gly Asn Cys Cys Phe Trp Lys Thr Glu 130 135 140 Val Leu Val Lys Ala Cys Pro Gly Gly Tyr His Val Tyr Arg Leu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Pro Trp Cys Asn Leu Arg Tyr Cys Thr Asp Pro Ser Thr Val 165 170 175 Glu Asp Lys Cys Glu Lys Ala Cys Arg Pro Glu Glu Glu Cys Leu Ala 180 185 190 Leu Asn Ser Thr Trp Gly Cys Phe Cys Arg Gln Asp Leu Asn Ser Ser 195 200 205 Asp Val His Ser Leu Gln Pro Gln Leu Asp Cys Gly Pro Arg Glu Ile 210 215 220 Lys Val Lys Val Asp Lys Cys Leu Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Glu 225 230 235 240 Glu Val Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Pro Asn Cys Ser Ser Ile Leu Gln 245 250 255 Thr Glu Glu Arg Asn Trp Val Ser Val Thr Ser Pro Val Gln Ala Ser 260 265 270 Ala Cys Arg Asn Ile Leu Glu Arg Asn Gln Thr His Ala Ile Tyr Lys 275 280 285 Asn Thr Leu Ser Leu Val Asn Asp Phe Ile Ile Arg Asp Thr Ile Leu 290 295 300 Asn Ile Asn Phe Gln Cys Ala Tyr Pro Leu Asp Met Lys Val Ser Leu 305 310 315 320 Gln Ala Ala Leu Gln Pro Ile Val Ser Ser Leu Asn Val Ser Val Asp 325 330 335 Gly Asn Gly Glu Phe Ile Val Arg Met Ala Leu Phe Gln Asp Gln Asn 340 345 350 Tyr Thr Asn Pro Tyr Glu Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Val Glu Ser 355 360 365 Val Leu Tyr Val Gly Ala Ile Leu Glu Gln Gly Asp Thr Ser Arg Phe 370 375 380 Asn Leu Val Leu Arg Asn Cys Tyr Ala Thr Pro Thr Glu Asp Lys Ala 385 390 395 400 Asp Leu Val Lys Tyr Phe Ile Ile Arg Asn Ser Cys Ser Asn Gln Arg 405 410 415 Asp Ser Thr Ile His Val Glu Glu Asn Gly Gln Ser Ser Glu Ser Arg 420 425 430 Phe Ser Val Gln Met Phe Met Phe Ala Gly His Tyr Asp Leu Val Phe 435 440 445 Leu His Cys Glu Ile His Leu Cys Asp Ser Leu Asn Glu Gln Cys Gln 450 455 460 Pro Ser Cys Ser Arg Ser Gln Val Arg Ser Glu Val Pro Ala Ile Asp 465 470 475 480 Leu Ala Arg Val Leu Asp Leu Gly Pro Ile Thr Arg Arg Gly Ala Gln 485 490 495 Ser Pro Gly Val Met Asn Gly Thr Pro Ser Thr Ala Gly Phe Leu Val 500 505 510 Ala Trp Pro Met Val Leu Leu Thr Val Leu Leu Ala Trp Leu Phe 515 520 525 <210> 2 <211> 537 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Glykoprotein 2 <400> 2 Met Pro His Leu Met Glu Arg Met Val Gly Ser Gly Leu Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Cys Ile Leu Thr Gln Ala Ser Ala Val Gln Arg Gly 20 25 30 Tyr Gly Asn Pro Ile Glu Ala Ser Ser Tyr Gly Leu Asp Leu Asp Cys 35 40 45 Gly Ala Pro Gly Thr Pro Glu Ala His Val Cys Phe Asp Pro Cys Gln 50 55 60 Asn Tyr Thr Leu Leu Asp Glu Pro Phe Arg Ser Thr Glu Asn Ser Ala 65 70 75 80 Gly Ser Gln Gly Cys Asp Lys Asn Met Ser Gly Trp Tyr Arg Phe Val 85 90 95 Gly Glu Gly Gly Val Arg Met Ser Glu Thr Cys Val Gln Val His Arg 100 105 110 Cys Gln Thr Asp Ala Pro Met Trp Leu Asn Gly Thr His Pro Ala Leu 115 120 125 Gly Asp Gly Ile Thr Asn His Thr Ala Cys Ala His Trp Ser Gly Asn 130 135 140 Cys Cys Phe Trp Lys Thr Glu Val Leu Val Lys Ala Cys Pro Gly Gly 145 150 155 160 Tyr His Val Tyr Arg Leu Glu Gly Thr Pro Trp Cys Asn Leu Arg Tyr 165 170 175 Cys Thr Val Pro Arg Asp Pro Ser Thr Val Glu Asp Lys Cys Glu Lys 180 185 190 Ala Cys Arg Pro Glu Glu Glu Cys Leu Ala Leu Asn Ser Thr Trp Gly 195 200 205 Cys Phe Cys Arg Gln Asp Leu Asn Ser Ser Asp Val His Ser Leu Gln 210 215 220 Pro Gln Leu Asp Cys Gly Pro Arg Glu Ile Lys Val Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Cys Leu Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Glu Glu Val Ile Ala Tyr Leu 245 250 255 Arg Asp Pro Asn Cys Ser Ser Ile Leu Gln Thr Glu Glu Arg Asn Trp 260 265 270 Val Ser Val Thr Ser Pro Val Gln Ala Ser Ala Cys Arg Asn Ile Leu 275 280 285 Glu Arg Asn Gln Thr His Ala Ile Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Leu Val 290 295 300 Asn Asp Phe Ile Ile Arg Asp Thr Ile Leu Asn Ile Asn Phe Gln Cys 305 310 315 320 Ala Tyr Pro Leu Asp Met Lys Val Ser Leu Gln Ala Ala Leu Gln Pro 325 330 335 Ile Val Ser Ser Leu Asn Val Ser Val Asp Gly Asn Gly Glu Phe Ile 340 345 350 Val Arg Met Ala Leu Phe Gln Asp Gln Asn Tyr Thr Asn Pro Tyr Glu 355 360 365 Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Val Glu Ser Val Leu Tyr Val Gly Ala 370 375 380 Ile Leu Glu Gln Gly Asp Thr Ser Arg Phe Asn Leu Val Leu Arg Asn 385 390 395 400 Cys Tyr Ala Thr Pro Thr Glu Asp Lys Ala Asp Leu Val Lys Tyr Phe 405 410 415 Ile Ile Arg Asn Ser Cys Ser Asn Gln Arg Asp Ser Thr Ile His Val 420 425 430 Glu Glu Asn Gly Gln Ser Ser Glu Ser Arg Phe Ser Val Gln Met Phe 435 440 445 Met Phe Ala Gly His Tyr Asp Leu Val Phe Leu His Cys Glu Ile His 450 455 460 Leu Cys Asp Ser Leu Asn Glu Gln Cys Gln Pro Ser Cys Ser Arg Ser 465 470 475 480 Gln Val Arg Ser Glu Val Pro Ala Ile Asp Leu Ala Arg Val Leu Asp 485 490 495 Leu Gly Pro Ile Thr Arg Arg Gly Ala Gln Ser Pro Gly Val Met Asn 500 505 510 Gly Thr Pro Ser Thr Ala Gly Phe Leu Val Ala Trp Pro Met Val Leu 515 520 525 Leu Thr Val Leu Leu Ala Trp Leu Phe 530 535 <210> 3 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Glykoprotein 2 <400> 3 Met Pro His Leu Met Glu Arg Met Val Gly Ser Gly Leu Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Cys Ile Leu Thr Gln Ala Ser Ala Val Gln Arg Gly 20 25 30 Tyr Gly Asn Pro Ile Glu Ala Ser Ser Tyr Gly Leu Asp Leu Asp Cys 35 40 45 Gly Ala Pro Gly Thr Pro Glu Ala His Val Cys Phe Asp Pro Cys Gln 50 55 60 Asn Tyr Thr Leu Leu Asp Glu Pro Phe Arg Ser Thr Glu Asn Ser Ala 65 70 75 80 Gly Ser Gln Gly Cys Asp Lys Asn Met Ser Gly Trp Tyr Arg Phe Val 85 90 95 Gly Glu Gly Gly Val Arg Met Ser Glu Thr Cys Val Gln Val His Arg 100 105 110 Cys Gln Thr Asp Ala Pro Met Trp Leu Asn Gly Thr His Pro Ala Leu 115 120 125 Gly Asp Gly Ile Thr Asn His Thr Ala Cys Ala His Trp Ser Gly Asn 130 135 140 Cys Cys Phe Trp Lys Thr Glu Val Leu Val Lys Ala Cys Pro Gly Gly 145 150 155 160 Tyr His Val Tyr Arg Leu Glu Gly Thr Pro Trp Cys Asn Leu Arg Tyr 165 170 175 Cys Thr Asp Pro Ser Thr Val Glu Asp Lys Cys Glu Lys Ala Cys Arg 180 185 190 Pro Glu Glu Glu Cys Leu Ala Leu Asn Ser Thr Trp Gly Cys Phe Cys 195 200 205 Arg Gln Asp Leu Asn Ser Ser Asp Val His Ser Leu Gln Pro Gln Leu 210 215 220 Asp Cys Gly Pro Arg Glu Ile Lys Val Lys Val Asp Lys Cys Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Leu Gly Leu Gly Glu Glu Val Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Pro 245 250 255 Asn Cys Ser Ser Ile Leu Gln Thr Glu Glu Arg Asn Trp Val Ser Val 260 265 270 Thr Ser Pro Val Gln Ala Ser Ala Cys Arg Asn Ile Leu Glu Arg Asn 275 280 285 Gln Thr His Ala Ile Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Leu Val Asn Asp Phe 290 295 300 Ile Ile Arg Asp Thr Ile Leu Asn Ile Asn Phe Gln Cys Ala Tyr Pro 305 310 315 320 Leu Asp Met Lys Val Ser Leu Gln Ala Ala Leu Gln Pro Ile Val Ser 325 330 335 Ser Leu Asn Val Ser Val Asp Gly Asn Gly Glu Phe Ile Val Arg Met 340 345 350 Ala Leu Phe Gln Asp Gln Asn Tyr Thr Asn Pro Tyr Glu Gly Asp Ala 355 360 365 Val Glu Leu Ser Val Glu Ser Val Leu Tyr Val Gly Ala Ile Leu Glu 370 375 380 Gln Gly Asp Thr Ser Arg Phe Asn Leu Val Leu Arg Asn Cys Tyr Ala 385 390 395 400 Thr Pro Thr Glu Asp Lys Ala Asp Leu Val Lys Tyr Phe Ile Ile Arg 405 410 415 Asn Ser Cys Ser Asn Gln Arg Asp Ser Thr Ile His Val Glu Glu Asn 420 425 430 Gly Gln Ser Ser Glu Ser Arg Phe Ser Val Gln Met Phe Met Phe Ala 435 440 445 Gly His Tyr Asp Leu Val Phe Leu His Cys Glu Ile His Leu Cys Asp 450 455 460 Ser Leu Asn Glu Gln Cys Gln Pro Ser Cys Ser Arg Ser Gln Val Arg 465 470 475 480 Ser Glu Val Pro Ala Ile Asp Leu Ala Arg Val Leu Asp Leu Gly Pro 485 490 495 Ile Thr Arg Arg Gly Ala Gln Ser Pro Gly Val Met Asn Gly Thr Pro 500 505 510 Ser Thr Ala Gly Phe Leu Val Ala Trp Pro Met Val Leu Leu Thr Val 515 520 525 Leu Leu Ala Trp Leu Phe 530 <210> 4 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Glykoprotein 2 <400> 4 Met Pro His Leu Met Glu Arg Met Val Gly Ser Gly Leu Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Cys Ile Leu Thr Gln Ala Ser Ala Val Gln Arg Val 20 25 30 Pro Arg Asp Pro Ser Thr Val Glu Asp Lys Cys Glu Lys Ala Cys Arg 35 40 45 Pro Glu Glu Glu Cys Leu Ala Leu Asn Ser Thr Trp Gly Cys Phe Cys 50 55 60 Arg Gln Asp Leu Asn Ser Ser Asp Val His Ser Leu Gln Pro Gln Leu 65 70 75 80 Asp Cys Gly Pro Arg Glu Ile Lys Val Lys Val Asp Lys Cys Leu Leu 85 90 95 Gly Gly Leu Gly Leu Gly Glu Glu Val Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Pro 100 105 110 Asn Cys Ser Ser Ile Leu Gln Thr Glu Glu Arg Asn Trp Val Ser Val 115 120 125 Thr Ser Pro Val Gln Ala Ser Ala Cys Arg Asn Ile Leu Glu Arg Asn 130 135 140 Gln Thr His Ala Ile Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Leu Val Asn Asp Phe 145 150 155 160 Ile Ile Arg Asp Thr Ile Leu Asn Ile Asn Phe Gln Cys Ala Tyr Pro 165 170 175 Leu Asp Met Lys Val Ser Leu Gln Ala Ala Leu Gln Pro Ile Val Ser 180 185 190 Ser Leu Asn Val Ser Val Asp Gly Asn Gly Glu Phe Ile Val Arg Met 195 200 205 Ala Leu Phe Gln Asp Gln Asn Tyr Thr Asn Pro Tyr Glu Gly Asp Ala 210 215 220 Val Glu Leu Ser Val Glu Ser Val Leu Tyr Val Gly Ala Ile Leu Glu 225 230 235 240 Gln Gly Asp Thr Ser Arg Phe Asn Leu Val Leu Arg Asn Cys Tyr Ala 245 250 255 Thr Pro Thr Glu Asp Lys Ala Asp Leu Val Lys Tyr Phe Ile Ile Arg 260 265 270 Asn Ser Cys Ser Asn Gln Arg Asp Ser Thr Ile His Val Glu Glu Asn 275 280 285 Gly Gln Ser Ser Glu Ser Arg Phe Ser Val Gln Met Phe Met Phe Ala 290 295 300 Gly His Tyr Asp Leu Val Phe Leu His Cys Glu Ile His Leu Cys Asp 305 310 315 320 Ser Leu Asn Glu Gln Cys Gln Pro Ser Cys Ser Arg Ser Gln Val Arg 325 330 335 Ser Glu Val Pro Ala Ile Asp Leu Ala Arg Val Leu Asp Leu Gly Pro 340 345 350 Ile Thr Arg Arg Gly Ala Gln Ser Pro Gly Val Met Asn Gly Thr Pro 355 360 365 Ser Thr Ala Gly Phe Leu Val Ala Trp Pro Met Val Leu Leu Thr Val 370 375 380 Leu Leu Ala Trp Leu Phe 385 390 <210> 5 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Glykoprotein 2 <400> 5 Met Pro His Leu Met Glu Arg Met Val Gly Ser Gly Leu Leu Trp Leu 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Cys Ile Leu Thr Gln Ala Ser Ala Val Gln Arg Asp 20 25 30 Pro Ser Thr Val Glu Asp Lys Cys Glu Lys Ala Cys Arg Pro Glu Glu 35 40 45 Glu Cys Leu Ala Leu Asn Ser Thr Trp Gly Cys Phe Cys Arg Gln Asp 50 55 60 Leu Asn Ser Ser Asp Val His Ser Leu Gln Pro Gln Leu Asp Cys Gly 65 70 75 80 Pro Arg Glu Ile Lys Val Lys Val Asp Lys Cys Leu Leu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Leu Gly Glu Glu Val Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Pro Asn Cys Ser 100 105 110 Ser Ile Leu Gln Thr Glu Glu Arg Asn Trp Val Ser Val Thr Ser Pro 115 120 125 Val Gln Ala Ser Ala Cys Arg Asn Ile Leu Glu Arg Asn Gln Thr His 130 135 140 Ala Ile Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Leu Val Asn Asp Phe Ile Ile Arg 145 150 155 160 Asp Thr Ile Leu Asn Ile Asn Phe Gln Cys Ala Tyr Pro Leu Asp Met 165 170 175 Lys Val Ser Leu Gln Ala Ala Leu Gln Pro Ile Val Ser Ser Leu Asn 180 185 190 Val Ser Val Asp Gly Asn Gly Glu Phe Ile Val Arg Met Ala Leu Phe 195 200 205 Gln Asp Gln Asn Tyr Thr Asn Pro Tyr Glu Gly Asp Ala Val Glu Leu 210 215 220 Ser Val Glu Ser Val Leu Tyr Val Gly Ala Ile Leu Glu Gln Gly Asp 225 230 235 240 Thr Ser Arg Phe Asn Leu Val Leu Arg Asn Cys Tyr Ala Thr Pro Thr 245 250 255 Glu Asp Lys Ala Asp Leu Val Lys Tyr Phe Ile Ile Arg Asn Ser Cys 260 265 270 Ser Asn Gln Arg Asp Ser Thr Ile His Val Glu Glu Asn Gly Gln Ser 275 280 285 Ser Glu Ser Arg Phe Ser Val Gln Met Phe Met Phe Ala Gly His Tyr 290 295 300 Asp Leu Val Phe Leu His Cys Glu Ile His Leu Cys Asp Ser Leu Asn 305 310 315 320 Glu Gln Cys Gln Pro Ser Cys Ser Arg Ser Gln Val Arg Ser Glu Val 325 330 335 Pro Ala Ile Asp Leu Ala Arg Val Leu Asp Leu Gly Pro Ile Thr Arg 340 345 350 Arg Gly Ala Gln Ser Pro Gly Val Met Asn Gly Thr Pro Ser Thr Ala 355 360 365 Gly Phe Leu Val Ala Trp Pro Met Val Leu Leu Thr Val Leu Leu Ala 370 375 380 Trp Leu Phe 385

Claims (33)

1. SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자, 또는 SEQ ID NO 2, 3, 4 또는 5에 따른 서열에서 선택되는 이들의 기능적 유사체와의 면역 반응(immune reaction)을 통한 분변(stool) 또는 체액(body fluid)으로부터 항체의 검출 방법.
2. 삭제
3. 혈장으로부터 항체를 제거하는 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

   a) SEQ ID NO 1에 따른 GP2가 결합된 칼럼을 제공하는 단계;

   b) GP2가 혈장 내에 항체에 결합할 수 있는 칼럼에 혈장을 통과시켜 혈장으로부터 항체를 제거하는 단계.
4. 청구항 3에 있어서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자는 장 조직을 지향하는 자기항체(autoantibody)를 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 크론병(Crohn's disease)과 연관된 항체를 검출하는 방법에 있어서, 분변 또는 체액으로부터, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자에 대한 항체가 SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자, 또는 SEQ ID NO 2, 3, 4 또는 5에 따른 서열에서 선택되는 이들의 기능적 유사체와의 면역 반응을 통하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 검출은 조직 절편의 기초에서 면역형광 검사를 제외하고, 반응물의 표지 물질과의 직접적인 또는 간접적인 결합을 이용한 면역분석에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 자가면역 질환의 치료를 위한, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자를 포함하는 약제.
8. 청구항 7에 있어서, 자가면역 질환은 염증성 장 질환(IBD) 또는 자가면역 간질환(autoimmune hepatic disease)인 것을 특징으로 하는 약제.
9. 청구항 8에 있어서, 염증성 장 질환은 크론병, 만성 췌장염(chronic pancreatitis) 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)인 것을 특징으로 하는 약제.
10. 청구항 8에 있어서, 간질환은 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis) 또는 자가면역 장염(autoimmune enteritidis)인 것을 특징으로 하는 약제.
11. 청구항 7에 있어서, GP2 분자는 선형 또는 환형으로 존재하고, 펩티드 고리화(peptide cyclization)는 2개의 시스테인이 존재할 때 이황화 결합(disulfide bridge)에 의해, 또는 측쇄(side chain), 말단 C와 N을 통해 선택적으로 진행되는 아마이드 고리화(amide cyclization)에 의해, 또는 이들 가능 경로의 조합에 의해 진행되는 것을 특징으로 하는 약제.
12. 청구항 7에 있어서, GP2 분자는 염증성 장 질환, 크론병, 만성 췌장염 또는 궤양성 대장염의 치료를 위한 칼럼에 연결되고, 여기서 GP2가 혈장 내에 면역글로불린에 결합될 수 있는 칼럼에 혈장이 통과되고, 따라서 혈장으로부터 면역글로불린이 제거되는 것을 특징으로 하는 약제.
13. 청구항 7에 있어서, SEQ ID NO 1에 따른 GP2 분자, 또는 SEQ ID NO 2, 3, 4 또는 5에 따른 서열에서 선택되는 이들의 기능적 유사체에 대한 면역 반응과 연관된 질환의 진단 또는 치료 제어에 이용되는 것을 특징으로 하는 약제.
14. 청구항 7에 있어서, 만성 염증 질환 또는 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 만성 췌장염 또는 궤양성 대장염의 진단 또는 치료 제어에 이용되는 것을 특징으로 하는 약제.
15. 청구항 7에 있어서, GP2 분자에 대한 면역 반응과 연관된 질환의 경구 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 약제.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제