KR101271765B1 - 사과술 가미 막걸리 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사과쥬스에 건조효모와 무기칼슘 및 장내서식이 가능한 유용기능성 젖산균(프로바이오틱스)을 접종하여 발효시켜 사과술을 제조한 후 일반 막걸리의 제성시 후수에 약 20%수준으로 첨가한 사과술 가미 막걸리를 제조함으로서 일반 입국으로 제조한 막걸리의 젖산균수(10⁶/mL)에 비하여 기능성이 높은 장내서식 가능한 젖산균(프로바이오틱스)의 수를 100배 이상의 수준(10^8~9/mL)으로 높이고 숙취가 완화되며, 만성적인 막걸리 음주로 인한 간조직 손상을 경감시키는 특징을 지닌 막걸리 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

Description

사과술 가미 막걸리 및 그 제조방법{Preparation method of Makgirlli with the reducing effect of hepatic damage and hangover produced by chronic drinking}

본 발명은 사과술 가미 막걸리 및 그 제조방법에 관한 것이다.

사회가 복잡 다양화되면서 음주량이 지속적으로 증가하고 있으며, 발효주로서는 수입산의 포도주가 전통주 시장을 위축시키고 있으며 증류주로서는 소주 및 위스키를 비롯한 양주가 소비량의 주축을 이루고 있다.

그러나 최근에 이르러 우리나라의 전통주인 막걸리시장이 활기를 띠고 있으며 남아도는 쌀 소비문제와 더불어 많은 연구가 이루어지고 있다.

전통적인 막걸리는 지애밥(고두밥)에 누룩을 첨가시켜 발효시킨 후 후수를 가하면서 막 걸러낸 술로 색깔은 백색을 띄고 탁하며 알코올 농도가 6% 내외로 비교적 낮고 텁텁한 후미를 띄는 특성이 있다.

그리고, 막걸리를 장시간 방치하면 백색의 침전물이 가라앉는데 이 침전물은 누룩에서 유래하는 젖산균과 효소 그리고 효모에 의하여도 분해되지 않고 남은 일종의 식이섬유로 배변을 좋게 하고 비만을 해소하는 역할을 한다.

또 누룩으로 빚은 전통막걸리 함유된 젖산균은 락토바실러스속의 파라카제이(paraasei), 아리조넨시스(arizonensis), 브레비스(brevis), 프란타룸(plantarum), 힐가디(hilgardii), 하비넨시스(harbinensis) 등으로 10⁸/mL 수준이라 보고된바 있으나(한국식품과학회지 37권 61-66, 2005), 장내 정착이 가능한 젖산균의 수는 매우 적다.

막걸리는 옛날부터 농주로서의 역할을 해왔고 오늘에 이르러는 건강음료 또는 건강을 증진시키는 술로 점차 세계적인 술로 인정되어 가고 있다.

그러나 최근 누룩 이외의 다양한 효소제들이 개발되면서 누룩대신에 단일 미생물을 번식시킨 입국(코지)을 사용하게 됨으로서 옛날의 전통막걸리에 비하여 젖산균의 수가 크게 적은 상태에 있다.

막걸리에 자연발생적으로 존재하는 젖산균은 장내서식이 어려운 종으로 막걸리 제조시에 장내 서식이 가능하고 인체에서 유용한 기능성을 지닌 젖산균을 증식시킨 제품의 개발 필요성이 강조되고 있으며 막걸리가 기존에 지니고 있는 기능성이외의 새로운 기능성을 부여하는 일도 크게 요구되고 있다.

우리나라 막걸리는 1980년에만 해도 연간 142만 kL씩 소비되는 '국민주'였다. 그러나 서울올림픽과 함께 시작된 세계화 바람과 카바이드 파동으로 맥주, 위스키 등 외래 주종에 자리를 내주며 서민들이나 마시는 질 낮은 술로 폄하되었다. 소비량도 1990년에는 70만 kL, 2002년에는 12만 9000 kL로까지 떨어졌었다. 그러나 2000년대 후반 들어 웰빙과 복고 바람을 타고 주목을 받기 시작했다. 2008년엔 17만5000 kL가 소비되었고, 2009년에는 20만 kL가 소비될 전망이다(조선일보, 2009년 9월29일자, Life섹션).

우리나라는 예로부터 벼농사를 주로 했기 때문에 쌀과 곡자(누룩)를 원료로 하는 곡주가 일찍부터 발달하였는데, 곡주를 제조할 때 원래 찹쌀이나 쌀을 주원료로 하고 누룩을 주발효제로 하여 제조하는데, 누룩 미생물 중 곰팡이의 아밀라제(amylase)에 의하여 쌀 녹말을 당으로 분해하는 당화 공정과 알코올 발효능을 가진 효모에 의하여 당을 에탄올로 전환되는 두 공정이 병행된다(유대식. 1995. 전통 누룩의 특징과 개선 방향. 한국식품과학회 심포지움 발표 논문집, p245-256).

전통 탁, 약주는 멥쌀이나 찹쌀을 원료로 하고 누룩을 발효제로 양조하여 왔으나(이서래. 1986. 한국의 발효식품. 이화여대 출판부, 서울, p205, 김찬도, 김교창, 김도영, 오만진, 이석건, 이수오, 정순택, 정지흔. 1990. 발효공학. 선진문화사, 서울, p79, 김재욱. 1985. 식품가공학. 문운당, 서울, p79) 1963년 정부의 식량정책으로 원료인 멥쌀을 전량 소맥분으로 대체하여 제조하였고, 그 후 옥수수 및 보리쌀도 원료로 하여 제조하기에 이르렀으며 그 이후 대체원료로 보리쌀(최경환. 김덕치. 서보언. 1975. 탁, 약주 원료대체에 관한 연구. 시험양조 국세청 기술연구소보, 3: 1), 고구마(정기택, 유대식. 1969. 고구마 전분질 원료를 이용한 주류제조에 관한 연구. 국세청 기술연구소보, 2: 19, 김찬조, 최우영, 오만진. 1972. 탁주 양조원료로서 고구마의 이용에 관한 연구. 한국농화학회지, 15: 213)를 이용하기도 했다. 그러나 누룩, 용수, 담금방법 등의 제조조건이 각각 상이하므로 원료에 따른 품질특성을 비교하기는 비교적 어렵다. 그리고 지방이나 양조자에 따라 제조법이 다양하며 탁주제조에 사용하는 누룩, 제조원료 및 담금방법에 따라 맛, 향, 색 등의 품질에도 많이 차이를 보인다.

막걸리에는 일반 주류와는 달리 상당량의 단백질과 당질이 들어 있어 영양적, 기능적 가치가 높을 뿐만 아니라(Lee J. 1982. Studies on the qualities of Takju with various koji strains. MS Thesis Seoul Woman's Univ. Seoul, p10-30) 생 효모가 함유되어 있기 때문에 다른 주류와 비교할 수 없는 특이한 맛을 가지고 있다. 이와 같이 막걸리는 우수한 발효식품임에도 불구하고 소비자들에게 외면을 받아오고 있는 실정으로 그 이유는 소비자들의 고급화 성향, 저장 시 발생되는 이취, 마시기 불편함, 소량의 퓨젤유(fusel oil)의 생성 등 해결되지 않은 주질 상의 문제점과 발효에 관여한 미생물과 효소가 살아있는 상태로 유통되기 때문에 유통 중에도 발효가 지속적으로 이루어져 단맛의 소실과 함께 신맛과 쓴맛이 상대적으로 증가하며, 초산균, 곰팡이 등 다양한 미생물들이 번식하여 변질되는 특성이 있어 품질의 균일화가 어려운 점 등(Lee C.H., Kim J.Y., Kim K.M. 1989. Sensory quality attributes of Takju and their changes during pasteuization. Kor . J. Diet Cult. 4: 405-410.)을 들 수 있으며 또한 알코올 농도가 6%인 술로서 저장성이 매우 낮은 단점이 있고 원료에 함유된 미분해성 당질이나 단백질 등이 가라앉게 되어 기호성이 떨어지는 문제점을 들 수 있다.

막걸리를 비롯한 술은 에탄올을 함유하고 있는 식품으로 적당하게 섭취할 경우에는 혈액순환을 촉진하고 기분을 좋게 하는 특성을 가지나 과량이나 만성적인 섭취를 할 경우에는 높은 섭취 칼로리에 대한 상대적인 주요 영양소의 결핍과 영양소 흡수를 저해시켜 다양한 영양결핍현상을 일으킨다.

다행하게도 막걸리에는 쌀에 함유된 다양한 영양소가 함유되어 있어 일반적인 여타 술과는 달리 영양결핍현상이 일어나지 않는다. 그러나 섭취한 알코올로 인하여 여러 가지 대사장애를 초래할 수 있으며(Liber CS: Alcohol and the liver: 1994 update. Gastro Enterology 106: 1085-1180, 1994), 간에서 산화되면서 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)가 과잉의 환원형의 NADH를 생성함으로서 지방산의 생성을 촉진하며 간에 지방을 축적하여 알코올성 지방간, 간염 및 간암을 유발시킬 수 있다(Lieber CS: Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 15: 573-592, 1991). ). 또한 간에서의 지방축적은 여러 가지 활성산소종의 생성을 유발하여 지질과산화물을 만들뿐만 아니라 이로 인한 장기조직의 손상을 유발한다.

알코올은 체내에서 알코올 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase)에 의하여 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 전환되며 아세트알데하이드 디하이드로게나제(acetalde hyde dehydrogenase)에 의하여 초산을 거쳐 에너지 사이클로 진입하여 다량을 칼로리를 생성하며 이때 체내 아세트알데하이드 디하이드로게나제의 활성이 낮게 되면 숙취의 원인이 된다.

사과는 효모에 의하여 직접 발효가 가능한 유리당이 약 12% 함유하는 과일로 사과주, 샴페인, 사과브랜디 등의 제조 원료로 많이 사용하고 있으며 사과를 이용한 막걸리 제조에 관한 연구는 특허등록 1009037340000(생과일 막걸리 제조방법), 특허등록 1005636510000(과즙과 야채즙액을 수곡으로한 양조술의 제조방법), 특허등록 1005194830000(유산균이 생산하는 박테리오신을 이용한 탁주 및 약주의 제조방법), 특허등록 1003821690000(과즙을 이용한 주류의 제조방법), 특허등록 1005143790000(사과를 이용한 주류제조방법)등이 있으나, 단순히 막걸리에 혼합함으로서 향, 맛 및 색상을 아름답게 하고자 하는 등을 목적으로 한 연구가 있을 뿐이며 사과에 함유된 유리아미노산인 아스파트산(aspartic acid) 사과산(malic acid) 및 사과가 나타내는 항산화활성을 활용한 숙취해소 및 음주로 인한 간기능 장애 현상을 향상시키고자한 연구는 보이지 않는다.

본 발명은 사과쥬스에 건조효모와 무기칼슘 및 장내서식이 가능한 유용기능성 젖산균(프로바이오틱스)을 접종하여 발효시켜 사과술을 제조한 후 일반 막걸리의 제성시 후수에 약 20%수준으로 첨가한 사과술 가미 막걸리를 제조함으로서 일반 입국으로 제조한 막걸리의 젖산균수(10⁶/mL)에 비하여 기능성이 높은 장내서식 가능한 젖산균(프로바이오틱스)의 수를 100배 이상의 수준(10^8~9/mL)으로 높이고 숙취로 인한 부작용 및 간조직 손상을 경감시키는 특징을 지닌 막걸리 및 그 제조 방법을 제공하는 데 목적이 있다.

본 발명의 특징은, 사과 쥬스량에 대하여 건조효모 0.01~1%(w/v)와 젖산균 10⁹cells/mL를 함유하는 종배양액 0.01~1%(v/v) 및 무기칼슘 50~300 mg%(w/v)를 첨가하여 혼합한 후 10~30℃에서 1~5일간 발효시켜 알코올도 5.5~6.0%, 총젖산균수 10⁹/mL, 체내에서 흡수되기 쉬운 젖산칼슘(칼슘량으로 환산) 50~90 mg/100 mL의 사과술을 제조하는 과정; 막걸리 원주( 알코올도 10~16%)를 제조하는 과정; 상기 제조된 막걸리 원주에, 막걸리 원주 부피 100 기준 80~150 비율의 후수와 상기 후수의 부피 100기준 10~30의 비율로 사과술을 혼합하여 사과술 가미 막걸리를 제조하는 과정; 을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리 및 그 제조방법에 있다.

상기에서 젖산균은 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus ) 중에서 하나 이상 선택하여 사용하며, 바람직하게는 상기 5종의 젖산균을 1:1:1:1:1의 중량 비율로 혼합하여 사용한다.

이상과 같은 본 발명의 사과술 가미 막걸리는 만성적인 음주 하에서도 일반쌀막걸리 보다 활성산소종의 생성계 효소인 잔틴옥시다아제 O 타입의 활성을 현저하게 억제하고 소거계 효소인 슈퍼옥시드 디스뮤타아제, 카탈라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성은 현저히 증가시킨다. 또한 간 조직내의 독성물질인 과산화지질의 함량을 현저하게 감소시키고 ALT의 활성을 감소시킴으로서 음주로 인한 간 조직의 손상율이 낮은 효과가 있다.

그리고, 알코올 대사에 관여하는 ADH의 활성을 높이고 CYP2E1 효소의 활성을 정상수준으로 유지함으로서 혈중알코올농도를 단시간에 감소시키는 효과가 있으며, ALDH의 활성이 현저하게 높임으로서 잔존하는 아세트알데하이드로 인한 숙취와 간 손상을 완화시키는 효과가 있다.

사과술 가미 막걸리는 일반 쌀막걸리에서는 나타나지 않는 DPPH 라디칼소거능 및 환원력과 같은 항산화활성이 높고 알코올대사에 필요한 보효소를 생성하는 사과산과 아스파트산의 함량이 높아 알코올대사가 원활하게 되므로 숙취로 인한 부작용이 감소되고, 장내젖산균(probiotics)수가 10^8~9/mL으로 높아 정장효과 높으며, 흡수되기 쉬운 수용성 칼슘의 함량이 50~90 mg/100 mL 수준으로 높다.

도 1은 본 발명에 따른 사과 막걸리 제조공정도이다.
도 2a 내지 도 2c는 막걸리를 만성적으로 4주간의 급여한 후의 간 조직 활성산소종 생성계 및 제거계 효소류의 활성변화를 나타내는 것으로, 잔틴옥시다아제(xanthin oxidase: uric acid nmole/단백질 mg), 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase: 헤마톡실린의 자동산화를 50% 억제하는 단백질 함량), 카탈라아제(catalase: hydrogen peroxide nmole/단백질 mg), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase: NADPH nmole/단백질 mg), 글루타치온 S-트렌스프라제(glutathione S-transferase: thioether nmole/단백질 mg) 데이터를 6마리 측정치의 평균값±표준편차로 나타내며, 도내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내고, NS는 유의성이 없음을 나타내는 도면이다.
도 3은 사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리를 격일로 4주간 급여하여 사육한 흰쥐의 간 조직 글루타치온 및 과산화지질 함량을 나타내고, 데이터는 6마리 측정치의 평균값±표준편차이고, 도 내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 4는 사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리를 격일로 4주간 급여하여 사육한 흰쥐의 혈청의 알라닌 아미노전이효소(alanine amino transferase: ALT, unit: Karmen unit)활성을 나타내고, 데이터는 6마리 측정치의 평균값±표준편차이며, 도 내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 5a 내지 도 5b는 사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리를 격일로 4주간 급여하여 사육한 흰쥐의 간 조직 지질함량(단위: mg/dL)을 나타내며, 데이터는 6마리 측정치의 평균값±표준편차이고, 도 내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 6a 내지 도 6b는 사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리를 격일로 4주간 급여하여 사육한 흰쥐의 간 조직의 알코올대사효소 및 CYP2E1의 활성을 나타내며, 효소활성단위로서 알코올탈수소효소는 NADH nmole/단백질 mg, 알데히드탈수소효소는 NADH nmole/mg이고, 데이터는 6마리 측정치의 평균값 ±표준편차, 도내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 7은 사과술가미막걸리를 경구투여(체중 kg당 5mL) 하였을 때의 경시적 혈중알코올농도 변화를 나타내고, 데이터는 6마리 측정치의 평균값±표준편차이며, 도내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 8은 사과술 가미율(농도 %)에 따른 항산화능 변화를 나타내고, 데이터는 3반복 측정치의 평균값 ±표준편차임이며, 도 내 서로 다른 문자는 5% 수준에서 유의성이 있음을 나타내는 도면이다.
도 9는. 사과술가미막걸리의 숙취 완화 메카니즘을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명의 실시예를 구체적으로 설명한다.

I. 재료 및 방법

1. 재 료

막걸리 양조용 원료미 및 코지제조용 쌀은 국내산 일품미를 사용하였으며 사과는 청송군 현동면 소재하고 있는 성일영농조합법인에서 구매를 하여 실험에 사용하였다. 누룩(곡자)은 청송 대전양조장에서 분양받은 것으로 한국곡자 진주공장에서 생산된 것을 사용하였다. 입국(koji)시 사용한 균주는 백국균 Aspergillus kawachii를, 배양효모는 경기도 파주시 소재의 공장에서 생산되는 고체효모(Saccharomyces cerevisiase)를 사용하였다.

2. 사과술가미 막걸리의 제조방법

사과술가미 막걸리 제조방법은 도 1과 같이 3단계로 제조하였다.

1단계 : 사과술 제조

사과를 착즙하여 쥬스(12 brix)를 만들고 쥬스량에 대하여 건조효모 0.2%(w/v)와 장내혼합젖산균(락토바실러스 GG(Lactobacillus GG), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus) 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 혼합균(1:1:1:1:1)) 10⁹cells/mL를 함유하는 종배양액 0.1%(v/v) 및 탄산칼슘 150 mg%(w/v)를 첨가하여 혼합한 후 20℃에서 4일간 발효시켜 알코올도 5.5~6.0%, 총젖산균수 10⁹/mL, 체내에서 흡수되기 쉬운 젖산칼슘(칼슘량으로 환산) 50~90 mg/100 mL의 사과술을 제조하였다.

2단계로 : 쌀막걸리 제조

표 1의 재료비율에 따라 일반적인 쌀 막걸리를 제조하였다. 술밑의 발효는 25℃에서 24시간 발효시켰으며 1단사입한 술덧은 25℃에서 30시간 발효시킨 후 2단사입을 행하여 동일 온도에서 4일간 발효시켜 알코올 농도 12%의 쌀 막걸리를 제조하였다.

3단계 : 사과술가미막걸리의 제조

2단계에서 제조한 쌀막걸리 원주(알코올농도 12%)에 동일량의 후수와 1단계에서 제조한 사과술을 혼합하여 사과술가미막걸리를 제조하였다. 이때 사과술의 혼합비는 후수 100에 대하여 20의 비로 혼합함이 기호성과 품질면에서 우수하였다.

동물실험용의 대조구는 상기의 사과술가미막걸리 제조법에서 사과술을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 제조한 술을 사용하였다.

표 1에서 ¹⁾원료미량으로 계산한다.

또한, 도 1에서 ^1,6)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisia), ²⁾탄산칼슘, ³⁾락토바실러스 GG(Lactobacillus GG), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus) 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 혼합균(1:1:1:1:1), ⁴⁾첨가량은 후수량의 20%(v/v), ⁵⁾종균은 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus kwachi), ⁷⁾누룩의 당화력은 300 SP이다.

3. 동물실험

1) 실험동물, 기본식이 및 실험군

기본식이는 고형사료(5L79 diet of PMI Nutrition : LLC, PO Box 19798, Brentwood MO 63144, USA, 성분조성: 조단백 18%, 조지방 5%, 조섬유 5%, 회분 8%)를 사용하였으며, 일반쌀막걸리리 및 사과술가미막걸리의 급여는 하루는 물로, 하루는 물 대신에 막걸리를 자유섭취케 하였다.

실험동물은 6주령의 평균체중이 150±10g인 흰쥐(Sprague-Dawly SPF/VAF outbred rats, 오리엔트, 성남시, 한국)를 1주일간 환경에 적응시킨 후 정상군, 일반쌀막걸리 급여군, 사과술가미막걸리군으로 나누어(총 3군) 각각 6마리씩으로 하여 4주간 사육하였다. 4주간 급여 후 12시간의 공복기간을 거친 후 처치하였다. 사육장은 스테인레스 스틸 케이지를 사용하고, 온도 및 습도는 23±2℃, 60±5%로 조정하고, 명암주기는 12시간 간격으로 설정하고, 사료의 섭취는 자유 섭취시켰다. 동물실험 승인은 대구가톨릭대학교 동물실험윤리위원회를 통해 승인 받았으며(승인번호: 제IACUC-2009-009호), 3R원칙을 준수하였다.

2) 체중, 식이섭취량 및 음용수 섭취량

체중, 식이 및 음용수 섭취량은 전 실험기간을 통하여 매일 일정한 시간에 측정하였다. 식이효율은 일일 증체량을 일일 식이 섭취량으로 나눈 값으로 하였다.

3) 경시적 혈중 알코올 농도 측정

격일로 4주간 막걸리를 제공한 각 군의 실험동물을 12시간 절식시킨 후 쌀 및 사과술가미막걸리를 체중 kg당 5 g씩을 경구투여하고 에테르 마취 하에서 경시별 (30분, 1시간, 2시간 및 4시간)로 꼬리동맥으로부터 채혈하여 혈청을 분리하여 Beutler의 방법(Beutler HO: Ethanol. In methods of enzymatic analysis 3rd ed. VXH Publishers UK Lts Cambridge UK., Vol Ⅳ pp. 598-606, 1998)에 따라 니코틴산아마이드(nicotinic acid amide, NAD)존재 하에서 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase: ADH)가 알코올을 산화시키는 동안 생성시킨 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)의 량을 측정하여 혈중 에탄올 함량을 구하였다. 혈중 에탄올 함향을 혈청 100 mL 당 μg 으로 나타내었다.

4) 분석시료의 채취

물 대신에 격일로 막걸리를 4주간 급여하고 12시간동안 절식시킨 후는 에테르 마취 하에서 복부 대동맥으로부터 채혈한 다음, 빙냉의 생리식염수로 간을 관류하고 장기를 적출한 후 습기를 제거하여 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 실온에서 응고시킨 다음 4℃, 2,500 rpm으로 20분간 원심분리 하여 혈청을 분리한 후 -70℃에 두면서 분석용 시료로 사용하였다.

5) 혈청 알라닌 아미노전이효소의 활성 측정

혈청 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT) 활성도는 키트시약(아산제약, 한국)을 사용하여 측정하였으며 활성도는 혈청 1 mL당 칼멘유니트(Karmen unit)로 나타내었다(Karmen A: A note on the spectrophotometric assay of glutamic oxaloacetic transaminase in human blood serum. J Clin Invest 34: 131-133, 1955).

6) 간 조직의 효소류의 활성 측정

알코올 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase: ADH), 아세트알데히드 디하이드로게나제(acetaldehyde dehydrogenase: ALDH), 잔틴산화환원효소(xanthine oxidoreductase: XOD), 슈퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase: SOD), 카탈라아제(catalase: CAT), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase: GPX) 및 글루타치온 에스-트렌스퍼라제(glutathione S-transferase: GST) 싸이토크롬 P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)활성 측청용 효소원은 적출한 동물의 간 조직 일정량에 4배량의 빙냉의 0.25 M 설탕 용액을 가하여 균질화한 다음 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 나온 상징액(postmitochondrial fraction, PMF) 및 미토콘드리아 분획을 사용하였다.

알코올탈수소효소의 활성은 Bernet & Bergermeyer의 방법(Bernet E: Methods of enzymatic analysis. Vch Pub; 3rd edition pp. 1506-1509, 1983)에 따라 기질인 에탄올과 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)를 첨가하여 반응시키는 동안 생성된 NADH(reduce NAD)의 함량을 340 nm에서 측정하였으며 활성도는 분당 단백 1 mg이 생성시킨 NADH의 량을 nmole로 나타내었다.

아세트알데히드탈수소효소의 활성은 Lundquist의 방법(Bernet E: Methods of enzymatic analysis. Vch Pub; 3rd edition pp. 1, 1983)에 따라 기질인 아세트알데하이드와 NAD를 첨가하여 반응시키는 동안 생성된 NADH의 함량을 파장 340nm에서 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 mg이 생성시킨 NADH의 량을 nmole로 나타내었다.

잔틴산화환원효소의 활성은 Stirpe F & Della Corte의 방법(Stirpe F, Della Corte E: The regulation of rat liver xanthine oxidase. J Biol Chem 244: 3855-3860, 1969)에 따라 토탈 타입(total type) 활성은 NAD의 존재 하에서, O 타입(O type) 활성은 NAD를 첨가하지 않은 상태에서 생성되는 요산의 함량을 292 nm에서 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 mg이 기질인 잔틴으로부터 생성되는 요산의 량을 nmole로 나타내었다.

슈퍼옥시드 디스뮤타아제 활성은 헤마토자일렌(hematoxylin) 자동산화의 억제 정도를 측정하는 Martin등의 방법(Martin JP, Dailey JM, Sugarmanand E: Negative and positive assays of superoxide dismutase based on hematoxylin autoxidation. Arch Biochem Biophys 255: 329-336, 1987)에 따라 560 nm에서 측정하였으며, 활성도는 효소 부재 하에서 헤마토자일렌의 자동산화를 50% 억제하는 단백의 함량(unit)으로 나타내었다.

카탈라아제의 활성은 Claibome의 방법(Claibome A: Catalase activity in "CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research; ed. RA Greenwald. CRC Press, Florida. pp. 283-284, 1986)에 따라 반응시키는 동안 분해되는 과산화수소의 함량을 240 nm에서 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 mg이 분해시킨 과산화수소의 량을 nmole로 나타내었다.

글루타치온 퍼옥시다아제의 활성은 Pagila & Valentine의 방법(Pagila ED and Valentine WN: Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 70(1): 158-169)에 준해 반응시키는 동안 기질인 과산화수소를 환원시키는데 소모되는 환원성 글루타치온(reduced glutathione)을 글루타치온 환원효소(glutathione reductase)가 글루타치온로 재환원시키는데 이용하는 NADH 인산(NADPH)의 함량을 340 nm에서 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 mg이 소모한 NADH 인산의 량을 nmole로 나타내었다.

글루타치온 S-트렌스퍼라제의 활성은 Habig등의 방법(Habig WH, Pabst MJ, Fleischner G, Gatmaitan F, Aris IM, Jacoby WB: The identity of glutathione S-transferase B with ligandin, a major binding protein of liver. Proc Natl Acad Sci USA 71(10): 3879-3882 (1974)에 따라 기질인 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4- dinitroezene, CDNB)과 환원성 글루타치온이 포합하여 생성되는 티오에테르(thioether)를 340 nm에서 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 mg이 생성시킨 티오에테르 량을 nmole로 나타내었다.

7) 간 조직의 글루타치온 및 과산화지질 함량

간 조직 글루타치온(glutathione: GSH)의 함량은 Ellman의 방법(Ellman GL: Tissue sulfhydryl group. Arch Biochem Biophys 82(1): 70-77 1959)에 따라 적출한 동물의 간 조직 균질액에 2-니트로벤조닉산(2-nitrobenzoic acid)를 가해 생성되는 티오페놀(thiophenol)의 측정하였으며 간 조직 g당 환원형 글루타티온 μmole로 나타내었다.

과산화지질(Lipid peroxide, LPO)의 함량은 Satho의 방법(Satho K: Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method. Clin Chim Acta 90(1): 37-43 1978)에 따라 간 조직 균질액에 티오바비투릭산(thiobarbituric acid, TBA) 용액을 가하여 반응시킨 후 부탄올(n-butanol)을 가해 이행되는 티오바비투릭산 반응물질(TBA-reactive substance)의 흡광도를 532 nm에서 측정, 분자흡광계수, ε=1.5×105 M^-1 cm^{- 1}를 이용하여 함량을 산출하였으며 간 조직 g당 nmole로 나타내었다.

8) 단백질 함량 측정

간 조직의 단백질 함량은 소의 혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 표준용액으로 하여 Lowry 법(Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RL: Protein measurement folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275, 1951)으로 측정하였다.

4. 사과술가미막걸리의 품질평가

1) 항산화능

항산화능으로 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 Blois의 방법(Blois MS. Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature , 181: 1199-1120, 1958)에 따라 일정하게 희석한 막걸리 시액 0.2 mL에 0.4 mM DPPH(1,1diphenyl -2-picryl-hydrazyl) 용액 0.8 mL를 가하여 25℃에서 10분간 방치 한 다음 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. EDA 활성도는 전자공여능(%) = [1 - (시료흡광도/대조구흡광도)] x 100에 의하여 산출하였다.

환원력은 Saeedeh & Asna의 방법(Saeedeh AD, Asna U: Antioxidant properties of various solvent extracts of mulberry(Morus indica L.) leaves. Food Chem, 102: 1233-1240, 2007)에 따라 막걸리 시액 1 mL에 0.2M 포스페이트완충용액(phosphate buffer: pH 6.6) 2.5 mL과 1% 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide) 용액 2.5 mL를 가한 후 50℃에서 30분간 반응시킨 다음, 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액 2.5 mL 가한 후 1,650×g에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리하여 얻은 상징액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL과 0.1% FeCl₃ 용액 0.5 mL을 가한 후 700 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

2) 색상 및 관능검사

색상은 색차계를 이용하여 밝기(L*), 적색도(a*) 및 황색도(b*)를 측정하였으며 관능검사는 훈련된 관능요원 10명에 의하여 종합적 기호도를 아주 좋다(5점), 좋다(4점), 보통이다(3점), 나쁘다(2점), 아주 나쁘다(1점)로 평가하였다.

3) 퓨젤유(fusel oil) 함량분석

술덧을 증류하여 얻은 회수액을 시료로 가스크로마토그라피로 분석하였다. 분석조건은 표 2와 같다.

4) 유리아미노산

여과한 시액 15mL에 증류수 100mL를 가하여 혼합한 후 20% TCA(trichloroacetic acid) 용액 15 mL을 가한 다음 4℃에서 12시간 방치하여 침전된 단백질을 원심분리하여 제거하였다. 상층액에 에틸에테르(ethylether) 40 mL를 가하여 분액깔대기에서 TCA와 지용성 물질을 제거하고 수층을 40℃에서 감압농축하였다. 다음에 0.2 M 소디움시트레이트 완충용액(sodiumcitrate buffer: pH 2.2)으로 25 mL이 되도록 정용한 후 0.22 ㎛ 멤브레인 여과기(membrane filter)로 여과하여 아미노산 자동분석기로 분석하였으며, 분석조건은 표 3과 같다.

5) 유기산

유기산은 이 등(Lee CY, Kim TW, Song CK: Studies on the souring of Hansan Sogokju(Korean Traditional Rice Wine). J. Food Sci. Technol., 28: 117-121, 1996)의 방법에 따라 시료 여과액 5 mL을 취하여 4℃, 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액 2 mL 취하여 0.008M 황산용액 10 mL에 넣고 혼합한 후 Sep-Pak C18cartridge(Waters Corp., USA)로 처리한 다음 0.45㎛ 멤브레인 여과기로 여과하여 표 4와 같은 조건에서 HPLC로 분석하고, 유기산의 검량선으로부터 정량하였다.

5. 통계처리

동물실험은 실험동물 6마리에 대한 평균치와 표준편차로 나타내었으며 성분분석은 3회 반복으로 측정한 평균와 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 던컨다중검정(Duncan's multiple range test) 및 t-테스트를 행하였다.

II . 결과 및 고찰

1. 간 기능증진 및 숙취해소효과

1) 체중증가량 및 막걸리 섭취량

음용수 대신에 격일로 막걸리를 4주간 만성적인 급여를 하였을 때 흰쥐의 체중증가량, 식이섭취량, 막걸리섭취량, 음용수섭취량 및 식이효율을 조사한 결과는 표 5와 같다.

체중증가량은 사과술가미막걸리군과 일반쌀막걸리군이 정상군보다 유의적으로 낮았으며 사과술가미막걸리와 일반쌀막걸리를 비교하였을 때는 사과술가미막걸리군이 높았다.

식이섭취량은 일반쌀막걸리 및 사과술가미막걸리 급여군이 정상군보다 낮았으며 사과술가미막걸리와 일반쌀막걸리 사이에는 차이가 없었다.

알코올은 탄수화물이나 단백질에 비하여 칼로리 밀도가 높아 체내 신진대사가 활성화되어 높은 칼로리를 내게 되며, 체내 산소 소비량이 증가하며 호기성대사에 장애가 따르고 이로 인한 식욕부진과 영양소 부족현상을 초래하게 되며 체중이 감소하는 현상이 나타난다(Pikaar NA, Wedel M, Vander BEJ, Van DW and Hermus RJ: Effects of moderate alcohol consumption on platelet aggregation fibrinolysis and blood lipids. Metabolism 36: 538-548, 1897; Gruchow HW, Sobocinski KA Barboriac JJ, Scheller JG: Alcohol consumption, nutrient intake and relative body weight among US adults . Am Clin Nutr 42: 289-595, 1985; Luciana GDO, Francisca MB, Cybelle RDL: Effects of different concentrations of sugarcane alcohol on food intake and nutritional status of male and female periadolescent rats Alcohol 43: 137-146, 2009).

만성적인 알코올 섭취는 이러한 현상이 더욱 심하게 나타나며 알코올대사의 부진으로 알코올 분해물인 아세트알데하이드(acetaldehyde)가 잔류하여 숙취나 소화관 점막의 손상을 유발하며(Cederbaum AI: Microsomal generation of reactive oxygen species and their possible role in alcohol hepatotoxicity. Alcohol and Alcoholism Suppl 1:291?296 1991; Lieber CS: Medical and Nutritional Complications of Alcoholism: Mechanisms and Management. New York, Plenum Press, 1992; Lieber CS: Ethanol metabolism, cirrhosis and alcoholism. Clinica Chimica Acta 257:59-84, 1997), 식이섭취량이 감소하는 동시에 체중감소량이 더욱 높아진다.

본 발명의 초기 1-3일간은 막걸리를 매일 급여하였으나 막걸리 급여군에서 체중의 지나친 감소로 실험의 종결에 영향을 끼칠 수 있다고 판단하여 격일로 급여하게 되었다.

표 5는 정상군은 음용수(증류수)를 제공하고 막걸리급여군은 하루는 증류수를, 하루는 막걸리를 급여한 결과로 막걸리 섭취량은 사과술가미막걸리군과 일반쌀막걸리군이 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 그럼에도 음용수 섭취량은 사과술가미막걸리에 비하여 일반쌀막걸리에서 높게 나타나 사과술가미막걸리의 경우가 음주로 인한 갈증이 적은 것으로 나타났다.

표 5에서 ¹⁾실험방법의 실험동물, 기본식이 및 실험군 참조. ²⁾식이효율: 하루 체중증가량/하루 식이섭취량, ³⁾6마리 측정치의 평균값±표준편차임, 종으로 서로 다름 문자는 5%수준에서 유의성이 있음을 나타냄, ⁴⁾NS: 5%범위에서 유의성이 없음.

2) 장기중량

격일로 4주간 막걸리를 제공한 흰쥐를 처치하여 장기중량(체중 100 g당 장기무게 율, %)을 조사한 결과는 표 6과 같다.

일반적으로 고지방식이나 고콜레스테롤 식이 또는 만성적으로 음주를 지속하면 체내 영양소대사의 불균형을 초래하게 되며 면역기능이 저하되거나 알코올에 의한 독성 및 이로 인하여 생성된 활성산소종에 의하여 특히 간조직의 손상과 함께 지질함량의 누적으로 간이 비대해 진다(Cederbaum AI: Microsomal generation of reactive oxygen species and their possible role in alcohol hepatotoxicity. Alcohol and Alcoholism Suppl 1:291?296 1991; Lieber CS: Medical and Nutritional Complications of Alcoholism: Mechanisms and Management. New York, Plenum Press, 1992; Lieber CS: Ethanol metabolism, cirrhosis and alcoholism. Clinica Chimica Acta 257:59-84, 1997; Lands WEM, Pawlosky RJ, Salem N: Alcoholism, antioxidant status and essential fatty acids. In: Papas AM, ed. Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 299-344, 1999; Mantle D, Preedy VR: Free radicals as mediators of alcohol toxicity. Adverse Drug Reactions and Toxicological Reviews 18:235?252, 1999; Das SK, Nayak P, Vasudevan DM: Consequences of ethanol consumption. J Indian Soc Toxicol 1: 1-10, 2005).

본 발명에서는 모든 실험군에서 신장, 심장 및 고환의 중량은 차이를 보이지 않았으나 간의 경우는 일반쌀막걸리급여군에서 현저한 비대현상을 나타내었다. 그러나 사과술가미막걸리 급여군은 정상군과 유의적인 차이를 보이지 않을 정도로 간의 비대현상의 경감되었다.

따라서 사과술가미막걸리군은 만성적인 음주에서도 알코올에 의한 간 조직의 손상이 크지 않음을 시사한다.

표 6에서 ¹⁾실험방법의 실험동물, 기본식이 및 실험군 참조, ²⁾6마리 측정치의 평균값±표준편차임, 종으로 서로 다름 문자는 5%수준에서 유의성이 있음을 나타냄, ³⁾NS: 5%범위에서 유의성이 없음.

3) 간 조직의 활성산소종 생성계 및 소거계 효소류의 활성

격일로 4주간 막걸리를 제공한 흰쥐를 처치하여 간 조직 활성산소종 생성계 및 소거계 효소류 활성 조사한 결과는 도 2a 내지 도 2c와 같다.

잔틴산화효소는 정상적인 생리상태 하에서는 NAD를 전자수용체로 이용하여 잔틴탈수소효소(xanthine dehydrogenase: XOR type D)로 작용하지만, 만성적 알코올섭취 등으로 인한 간 조직손상과 같은 병태생리적인 상태에서는 NAD 대신에 분자상의 산소를 전자수용체로 이용하는 잔틴옥시다제(xanthine oxidase: XOR type O)로 전환되어 과산화물(superoxide) 및 과산화수소(hydrogen peroxide) 등과 같은 활성산소종(ROS)를 생성한다(Oei HH, Kentroo WE, Burton KP, Schaffer SW: A possible role of xanthine oxidase in pproducing oxidative stress in the heart of chronically ethanol treated rats. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 38: 453-461, 1982).

또한 슈퍼옥시드 디스무타아제는 초과산화물(O_{2 -})을 독성이 한 단계 낮은 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키고 최종적으로 카탈라아제 및 글루타치온 퍼옥시다아제는 과산화수소를 물로 전환하여 무독화 시킨다.

또한 글루타치온 S-트렌스퍼라제는 미처 제거하지 못한 활성산소종이 과산화지질을 만들었을 경우 글루타치온을 이용하여 이를 독성이 낮은 알코올성 지방으로 전환하여 무독화 시킨다(Im MJ, Manson PN, Bulkley GB, Hoopes JE: Effects pf superoxide dismutase and allopurinol in survival of acute island skin flaps. Ann Surgery 201: 357-359, 1985; Jacoby JB: The glutathione S-transferase: a group of multifunctional detoxification proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 46: 383-414, 1978). 하지만 만성적인 음주는 CYP2E1(Salmela KS, Kessova IG, Tsyrolv IB, Lieber CS: Respective roles of cytochrome P450 2E1, 1A2, and 3A4 in the hepatic microsomal ethanol oxidizing system. Alcoholism , Clinical and Experimental Research 22: 2125?2132, 1998; Albano E: Free-radicals and alcohol-induced liver injury. In: Sherman, CDIN, Preedy VR, Walson RR Eds., Ethanol and Liver. Taylor and Francis, London, pp. 153?190 2002, Lieber CS : Alcoholic fatty liver : its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol 34:9-19 2004; Lu Y, Ce derbaum AI: CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol. Free Radic Biol Med 44:723-738, 2008)과 미토콘도리아(mitochondria)의 전자전달계(Bailey SM, Pietsch EC, Cunningham CC. Ethanol stimulates the production of reactive oxygen species at mitochondiral complexes I and III. Free Radic Biol Med 27: 891-900, 1999)에서 생성되는 수퍼옥사이드(superoxide)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species: ROS) 및 중간대사산물인 아세트알데히드의 과잉생성으로 활성산소종 생성계와 제거계 사이의 불균형을 초래하고(Sies H: Oxidative stress. Academic Press, London, pp. 1-8, 1985; Das SK, Vasudevan DM: Alcohol-induced oxidative stress. Life Sci 81: 177-187, 2007; Devipriya N, Srinivasan M, Sudheer A R, Menon V P: Effect of ellagic acid, a natural polyphenol, on alcohol-induced prooxidant and antioxidant imbalance: a drug dose dependent study. Singapore MedJ 48:311-318 2007)이로 인하여 간 조직의 손상을 유발한다(Niemala O, Klajner F, Orrego H, Vidins E, Blendis L, Israel Y: Antibodies against acetaldehyde-modified protein epitopes in human alcoholics. Hepatology 7: 1210-1214, 1987; Lin RC, Smith RS, Lumeng L: Detection of a protein-acetaldehyde adduct in the liver of rats fed alcohol chronically. J Clin Invest 81: 615-619; 1988; Fang JL, Vaca CE: Detection of DNA adducts of acetaldehyde in peripheral white blood cells of alcohol abusers. Carcinogenesis 18: 627-632, 1997).

본 발명에서 사과술가미막걸리군이 일반쌀막걸리군 보다 활성산소종 생성계 효소인 잔틴옥시다아제 O 타입의 활성을 현저히 줄어들고 활성산소 소거계인 슈퍼옥시드 디스뮤타아제, 카탈라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성은 현저히 증가하였다.

즉, 사과술가미막걸리군은 만성적인 음주에도 간 조직의 활성산소종 생성계 및 소거계 효소류의 활성이 균형을 유지함으로서 간 손상이 적은 것으로 사료된다.

4) 간 조직의 글루타치온 및 과산화지질 함량과 ALT 활성

격일로 4주간 사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리를 제공한 흰쥐를 처치하여 간 조직의 글루타치온 및 과산화지질 함량을 측정한 결과는 도 3과 같다. 만성적인 알코올 섭취는 간 조직손상에 영향을 미치는 활성산소종의 생성을 촉진하며 음주로 인하여 축적되는 지질을 산화시킴으로서 지질과산화물을 생성하며 이로 인하여 지방간, 알코올성 간염 및 간경화를 동반하게 된다. 또 알코올의 미분해로 생성되는 아세트알데히드와 같은 독성물질을 축적시킴으로서 숙취의 원인이 된다(Lieber CS: Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 15: 573-592, 1991).

간 조직 내에 지질과산화에 관여하는 활성산소종은 생성계와 소거계가 균형을 이룸으로서 건강한 삶을 영위할 수 있으나 급성적인 음주나 만성적인 음주가 지속되면 활성산소의 소거계가 손상됨으로서 음주로 인한 간조직의 손상은 더욱 촉진된다.

글루타치온(glutathione)은 활성산소 소거계에 속하는 주요 물질로 간 조직내 지질과산화물의 함량과 반비례하며 간 조직 손상정도를 파악하는 중요한 지표로 알려져 있다(Vladislav E, Dana K, Monika B: The effect of curcumin on cadmium-induced oxidative damage and trace elements level in the liver of rats and mice. Toxicol Lett 151: 79-85, 2004).

본 실시예에서는 사과술가미막걸리 급여군과 일반쌀막걸리군의 글루타치온 함량은 유의한 변동이 없었으나 지질과산화물의 함량은 사과술가미막걸리군이 일반쌀막걸리군에 비하여 현저하게 낮은 함량을 나타내어 만성적인 음주에서도 사과술가미막걸리의 경우는 간 조직 손상에 뚜렷한 영향이 없는 것으로 나타나고 있다.

간조직손상의 주요 지표성분인 글루타치온의 함량에서 유의적인 차이를 보이지 않은 대한 확실한 검토를 위하여 임상에서 간 조직 손상의 지표로 널리 이용되고 있는 ALT 활성(Reitman S and Frankel S: A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxaloacetic pyruvic transaminase. AM J Clin Pathol 28: 58-63, 1957)을 측정한 결과 도 4에서 보는 바와 같이 사과술가미막걸리 급여군은 일반쌀막걸리급여군 보다 현저히 낮은 수치를 볼 수 있고 정상군과의 유의적인 차이를 보이지 않았다.

따라서 이러한 결과는 만성적인 음주에서도 간 조직의 손상이 일어나지 않음을 시사하며 이는 사과술가미막걸리에 함유된 장내젖산균과 수용성 칼슘, 알코올대사의 활성화, 항산화작용의 활성화 등에 기인된 효과라 사료된다. 사과에 함유하는 폴리페놀 및 플라보노이드가 항산화 적용이 높은 것과 관련이 있을 것으로 생각된다(Wang H, Cao G and Prior RL: Total antioxidant capacity of fruits. J Agric Food Chem 44: 701-705, 1996; Van der Sluiss AA, Dekker M and Jongen WMF. Flavonoids as bioactive components in apple products. Cancer Letters 114: 107-108 1997; J Lee HA, Lee SS and Shin HK: Effect of Apple Dietary Fiber on the in vitro Growth of Intestinal Bacteria. Korean J Food SCI Technol 29: 107-114, 1997).

5) 간 조직의 지질함량

격일로 4주간 막걸리를 제공한 흰쥐를 처치하여 간 조직 의 지질함량을 측정한 결과는 도 5a 내지 도 5b와 같다. 알코올의 만성적 섭취는 알코올분해효소인 ADH와 ALDH에 의해 NAD가 NADH로 환원되면서 NADH가 과잉으로 축적된다. 축적된 NADH는 지방산의 합성을 촉진시켜 간 조직내에 지방을 축적하게 되고 초저밀도지단백(VLDL)의 아포지단백(apolipoprotein)의 결핍을 초래하여 지방간이 되게 한다(Cederbaum AI: Microsomal generation of reactive oxygen species and their possible role in alcohol hepatotoxicity. Alcohol and Alcoholism Suppl 1:291?296 1991; Lieber CS: Medical and Nutritional Complications of Alcoholism: Mechanisms and Management. New York, Plenum Press, 1992; Lieber CS: Ethanol metabolism, cirrhosis and alcoholism. Clinica Chimica Acta 257:59-84, 1997; Lands WEM, Pawlosky RJ, Salem N: Alcoholism, antioxidant status and essential fatty acids. In: Papas AM, ed. Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 299-344, 1999; Mantle D, Preedy VR: Free radicals as mediators of alcohol toxicity. Adverse Drug Reactions and Toxicological Reviews 18:235?252, 1999; Das SK, Nayak P, Vasudevan DM: Consequences of ethanol consumption. J Indian Soc Toxicol 1: 1-10, 2005 Lieber CS: Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 15: 573-592, 1991).

사과술가미막걸리 급여군과 일반쌀막걸리 급여군에서는 간 조직의 총지질함량에는 유의한 변동이 없었으나 총 중성지방 및 총 콜레스테롤의 함량은 사과술가미막걸리군이 일반쌀막걸리군에 비하여 현저하게 낮은 함량을 나타내었다. 따라서 사과술가미막걸리는 만성적인 음주로도 일반쌀막걸리에 비하여 지음주로 인한 간 기능저하와 지방간으로의 전환율이 낮음을 시사한다.

6) 간 조직의 알코올 대사효소 및 싸이토크롬 P450 2E1 효소의 활성

격일로 4주간 사과술가미막걸리와 일반쌀막걸리를 제공한 흰쥐를 처치하여 간 조직 의 알코올 대사효소 및 CYP2E1 효소의 활성은 도 6a 내지 도 6b와 같다. 일반적으로 섭취된 에탄올은 ADH에 의해 아세트알데히드(acetaldehyde)로 산화되며, 아세트알데히드는 ALDH에 의해 아세트산(acetic acid)으로 산화되어 최종적으로 아세틸 조효소(acetyl CoA)로 전환되어 에너지를 생산한다(Lieber CS: Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 15: 573-592, 1991).

에탄올 대사의 중간생성물인 아세트알데히드는 간 조직 손상 및 숙취를 유발함과 동시에 조직내에서 각종 활성산소종을 생성시킨다(Lieber CS: Hepatic, metabolic and toxic effects of ethanol. Alcohol Clin Exp Res 15: 573-592, 1991).

CYP2E1 효소는 알코올을 아세트알데히드로 전환시키는 보조적인 역할을 담당하며 알코올의 만성적 섭취에 의해 간 조직이 손상되면 이 효소의 활성이 점점 커지는 것으로 알려져 있다(Salmela KS, Kessova IG, Tsyrolv IB, Lieber CS: Respective roles of cytochrome P450 2E1, 1A2, and 3A4 in the hepatic microsomal ethanol oxidizing system. Alcoholism , Clinical and Experimental Research 22: 2125?2132, 1998; Albano E: Free-radicals and alcohol-induced liver injury. In: Sherman, CDIN, Preedy VR, Walson RR Eds., Ethanol and Liver. Taylor and Francis, London, pp. 153?190 2002, Lieber CS : Alcoholic fatty liver : its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol 34:9-19 2004; Lu Y, Ce derbaum AI: CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol. Free Radic Biol Med 44:723-738, 2008). 그러나 CYP2E1 효소는 광범위한 기질특이성으로 체내의 유입되는 방향족 탄화수소 및 저분자 유기물질들과 반응하여 각종 발암물질을 생성하는 것으로 알려져 있다(Nelson SD, Mitchell JR, Timbrell JA, Snodgrass WR and Corcoran GB: Isoniazid and iproniazid activation of metabolites to toxic intermediates in man and rat. Science 193: 901-903, 1976; Lewis JG, Stewart W and Adams DO: Role of oxygen radicals in induction of DNA damage by metabolites of benzen. Cancer Res 48: 4762-4765, 1988; Seeff LB, Cuccherini BA, Zimmerman HJ, Alder E and Benjamin SB: Acetaminophen hepatotoxicity in alcoholics Ann Intl Med 104: 399-404, 1986).

이상의 자료와 본 발명 결과를 종합해 볼 때 사과술가미막걸리는 일반쌀막걸리에 비해 ADH 및 ALDH의 활성을 높이고 CYP2E1 효소도 정상적인 수치를 유지함으로서 만성적인 음주에서 나타날 수 있는 아세트알데하이드로 인한 숙취와 간조직 손상을 완화시키는 것으로 사료된다.

7) 사과술가미막걸리의 급여시 경시적 혈중알코올농도 변화

격일로 4주간 막걸리를 제공한 흰쥐에 체중 Kg당 5 mL의 일반쌀막걸리 및 사과술가미막걸리를 경구투여 하였을 때의 경시적 혈중알코올농도 변화는 도 7과 같다.

일반적으로 섭취된 에탄올은 호흡기를 통해 일부 배설되나 대부분은 간의 ADH에 의해 산화되며, 마이크로좀(microsome)의 싸이토크롬 효소(CYP2E1) 및 카탈라아제에 의해서도 아세트알데히드로 산화된다.

또 이는 아세트알데히드는 ALDH에 의해 산화되어 아세트산으로 산화되어 최종적으로 아세틸 조효소(acetyl CoA)로 전환되어 에너지를 생산하는 에너지 사이클로 진입하여 칼로리를 생성한다(Lieber CS: Alcohol and the liver; 1994 update. Gastro Enterology 106: 1085-1180, 1994).

본 실험에서는 사과술가미막걸리급여군에서 투여 60분 이후부터 일반쌀막걸리 급여군보다 혈중 에탄올 농도가 유의적으로 낮아지는 현상이 관찰되었다. 이러한 현상은 상기에서도 언급한 바와 같이 에탄올을 아세트알데히드로 전환하는 ADH활성이 사과술가미막걸리급여군에서 높고 알코올대사에 보조적으로 관여하는 카탈라아제와 아세트알데히드를 아세트산으로 전환시키는 알데히드탈수소효소의 활성 이 높게 나타난 상기의 실험결과와 일치한다.

2. 사과술가미막걸리의 품질특성

1) 항산화능

사과술가미막걸리의 항산화능을 일반쌀막걸리의 경우와 비교한 결과는 도 8과 같다.

일반쌀막걸리의 DPPH 라디칼 소거능은 거의 나타나지 않는 반면 사과술가미막걸리의 경우는 가미율의 증가에 따라 비례적으로 증가하였다.

환원력의 경우에도 사과술가미막걸리에서는 농도 증가함에 따라 비례적적으로 증가하였으나 일반쌀막거리에서는 현저하게 낮은 활성을 보였다.

2) 유리아미노산 함량

사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리의 유리아미노산 함량은 표 7과 같다.

사과술가미막걸리에서 아스파테이트(aspartate)의 함량이 일반쌀막걸리 보다 현저하게 높았다. 이는 사과에 아스파테이트의 함량이 높은것과 관련이 있는 것으로 생각된다(Choi OJ, Park HR and Chough SH: Variation of free sugar and free amino acid contents of apples during the ripening period).

표 7에서 단위는 mg%, ¹⁾데이터는 2반복 측정한 평균값이다.

3) 유기산 함량

사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리의 유기산 함량은 표 8과 같다.

모두 주산은 젖산이며 일반쌀막걸리에서 많았다. 사과술가미막걸리에서 젖산함량이 낮은 현상은 탄산칼슘의 첨가로 젖산이 젖산칼슘으로 전환되었기 때문으로 사료된다. 특히 사과술가미막걸리에서는 사과산의 함량이 현저하게 높았는데 이는 사과에서 유래한 것으로 사료된다(Do YS, Whang HJ, Ku JE and Yoon KR: Organic acids content of the selected korean apple cultivars. Korean J Food SCI Technol 37: 922-927, 2005).

표 8에서 ¹⁾데이터는 2반복 측정한 평균값.

4) 막걸리의 퓨젤유 함량

사과술가미막걸리 및 일반쌀막걸리의 퓨젤유 함량은 표 9와 같다.

아세트알데히드(Acetaldehyde)를 비롯하여 메탄올(methanol), 에틸아세테이트(ethylacetate), n-프로판올(n-propanol), 이소부탄올(isopbutanol), n-부탄올(n-butanol) 및 이소아밀알코올(isoamylalcohol) 등 6종이 분리되었으며 이들 중 이소아밀알코올(iso-amylalcohol)의 함량이 가장 높으며 일반쌀막걸리에서 다소 높았으나 그 외의 성분들은 사과술가미막걸리와 일반쌀막걸리간의 뚜렷한 차이가 없었다.

표 9에서 ¹⁾3회 반복 측정한 평균값임.

3. 만성적인 사과술가미막걸리 음주 하에서의 간 조직 손상 및 숙취 완화 메카니즘

상기의 결과를 종합한 결과 사과술가미막걸리가 일반쌀막걸리에 비하여 만성적인 음주에서도 간 조직손상이 일어나지 않으면서 숙취 완화능이 높게 나타나는 메카니즘을 요약하면 다음과 같다.

① 사과술가미막걸리에 풍부하게 한유되어 있는 사과산과 아스파트산이 NAD의 공급에 관여하는 말레이트셔틀을 활성화 시킴으로서 간 조직의 미토콘드리아에서는 알코올의 분해에 관여하는 ADH의 활성을 증대시킨다(도 9).

② 아세트알데하이드의 산화에 관여하는 ALDH의 활성을 증대시킴으로서 숙취해소에 관여한다.

③ 사과술가미막걸리가 나타내는 강한 항산화능에 의하여 만성적인 음주하에서 나타나는 활성산소생성계 효소를 억제하고 소거계효소류의 활성을 촉진함으로서 간의 기능을 정상적으로 유지시킨다.

④ 사과술가미막걸리의 섭취는 에너지 사이클이 활성화 되면서도 간 조직내에 지방축적현상이 관찰되지 않는 현상으로 보아 단위시간내의 에너지 소모율을 증대시킨다.

도 9에서 ADH는 alcohol dehydrogenase, ALDH는 acetaldehyde dehydrogenase, NAD는 nicotinamide adenine dinucleotide, NADH는 reduced NAD.의 약어이다.

Claims (6)

1. 사과 쥬스량에 대하여 건조효모 0.01~1%(w/v)와 젖산균 10⁹cells/mL를 함유하는 종배양액 0.01~1%(v/v)을 첨가하여 혼합한 후 10~30℃에서 1~5일간 발효시켜 알코올도 5.5~6.0%,의 사과술을 제조하는 과정;
   막걸리 원주( 알코올도 10~16%)를 제조하는 과정;
   상기 제조된 막걸리 원주에, 막걸리 원주 부피 100 기준 80~150 비율의 후수와 상기 후수의 부피 100기준 10~30의 비율로 사과술을 혼합하여 사과술 가미 막걸리를 제조하는 과정;
   을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 젖산균은 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 하나 이상 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 사과술 제조 과정에 사과 쥬스량에 대하여 무기칼슘 50~300 mg%(w/v)를 더 첨가하여 혼합한 후 10~30℃에서 1~5일간 발효시켜 알코올도 5.5~6.0%, 총젖산균수 10⁹/mL, 체내에서 흡수되기 쉬운 젖산칼슘(칼슘량으로 환산) 50~90 mg/100 mL의 사과술을 제조하는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리 제조 방법.
4. 알코올도 10~16%의 막걸리 원주,
   상기 막걸리 원주 부피 100기준 10~30의 비율로 첨가되고, 알코올도 5.5~6.0%, 총젖산균수 10⁹/mL인 사과술,
   상기 막걸리 원주 부피 100 기준 80~150 비율로 첨가되는 후수를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리.
5. 제 4항에 있어서, 상기 사과술은 체내에서 흡수되기 쉬운 젖산칼슘(칼슘량으로 환산) 50~90 mg/100 mL이 더 포함된 것을 특징으로하는 사과술 가미 막걸리.
6. 제 4항에 있어서, 상기한 젖산균은 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 서머필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus)중에서 하나 이상 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 사과술 가미 막걸리.

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