KR101258833B1

KR101258833B1 - 유효성분으로 치커리 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101258833B1
Application number: KR1020100109108A
Authority: KR
Inventors: 조영수; 차재영; 정영기
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2013-05-02
Also published as: KR20120047510A

Abstract

본 발명은 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 및 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

Description

유효성분으로 치커리 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating fatty liver containing chicory root extract as effective components}

본 발명은 유효성분으로 치커리 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 및 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

피리미딘 뉴클레오티드(pyrimidine nucleotide) 생합성의 중간체인 오로트산(orotic acid, OA)은 쥐에 과도한 양을 급여하면 간에 트리글리세리드(triglyceride, TG)의 축적을 야기하는 것으로 알려져 있다(Su et al, J. Pham. Exp. Ther. 291: 953-959 (1999)). OA-유도 지방간은 VLDL (very-low-density lipo단백질) 분비의 억제, 지방세포 내로 자유 지방산의 흡수 증가, 그리고 지방산 산화의 감소에 의해 야기될 수 있다 (Hebbachi et al, Biochem. J. 325: 711-719 (1997)). 간에서의 OA-유도 지질 축적의 원인 중 하나는 간 PAP (phosphatidate phosphohydrolase) 활성의 변화에 의해 매개된 트리글리세리드 합성의 증가이다 (Su et al, J. Pham. Exp. Ther. 291: 953-959 (1999)). 상기 PAP 효소의 활성이 쥐의 간에서 트리글리세리드 합성에 대해 속도-제한적(rate-limiting)이라는 사실은 일반적으로 알려져 있다 (Fremont and Gozzelino, Lipids 31: 871-878 (1996)). 본 발명자들은 또한, 트리글리세리드 합성의 증가가 OA의 투여에 의해 야기되는 간 트리글리세리드 축적과 관련이 있는 PAP 및/또는 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)의 간 활성 변화에 의해 매개된다고 보고하였다 (Cha et al, Plant Foods Human Nutr. 56: 349-58 (2001)). 또 다른 이전의 연구는 알코올- 및 사염화탄소(carbon tetrachloride)-유도 지방간이 PAP 활성의 증가와 관련이 있다는 것을 나타내었다 (Pan et al, J. Biol. Chem. 282: 17078-17089 (2007)).

트리글리세리드 분비는 간에 의한 리포단백(lipoprotein)의 조립 및 분비를 필요로 하는데, 이는 아포리포단백-B(apolipoprotein-B) 및 MTP(microsomal triglyceride transfer protein)에 대해 매우 의존적이다 (Pan et al, J. Biol. Chem. 282: 17078-17089 (2007)). MTP는 간 및 장으로부터 분리된 마이크로좀(microsome)의 루멘(lumen) 내에 위치하고, 리포단백을 포함하는 아포리포단백-B의 분비 및 조립을 속도-제한(rate-limiting) 한다 (Gordon et al, Proc. Natl. Acad. USA 91: 7628-7632 (1994)). 이전의 연구는 간 VLDL 분비의 억제가 에탄올 및 사염화탄소에 의해 야기된 지방간의 주요 원인 중 하나이며, 이는 동물에서 MTP 활성 및 mRNA 발현의 억제와 관련이 있다는 것을 나타내었다 (Sugimoto et al, J. Hepatol. 36: 157-162 (2002)). 상기 결과는 MTP 활성 및/또는 mRNA 발현의 감소가 에탄올 및 사염화탄소에 의해 화학적으로 야기된 지방간의 발달에 결정적이라는 것을 제안한다. 그러나, OA 투여 후 간 트리글리세리드의 축적 동안 VLDL 분비 과정에서 MTP의 역할은 아직도 완전히 밝혀지지 않았다.

비소화성 올리고당(non-digestible oligosaccharide)을 포함하는 식이섬유는 음식의 중요한 구성 성분이며, 저중성지방혈증(hypotriglyceridemia) 및 간 보호 효과와 같은 많은 생리적 기능을 하는 것으로 잘 알려져 있다 (Kok et al, J. Appl. Toxicol. 18: 47-53 (1998)). 비소화성 올리고당을 함유하는 치코리움 인티부스(Chicorium intybus)의 뿌리는 치커리로 널리 알려져 있으며, 대부분의 유럽 국가, 일본 및 한국에서 천연 음식 재료로서 인식된다 (Loo et al, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 35: 525-552 (1995)). 치커리는 건강 증진 효과를 가지는 이눌린(inulin) 및 프룩토올리고당(fructooligosaccharide)과 같은 가용성 식이섬유의 공급원으로서 인식된다 (Bais and Ravishankar, J. Sci. Food. Agric. 81: 467-484 (2001)). 치커리 뿌리 추출물(CRE)은 사염화탄소 및 파라세타몰-유도(paracetamol-induced) 독성에 대해 잠재적인 간 보호 기능을 가진다고 알려져 있다 (Gadgoli and Mishra, J. Ethnopharmacol. 58: 131-134 (1997)). 게다가, 이전의 연구에서 본 발명자들은 CRE의 저중성지방혈증 효과가 쥐의 간에서 MTP의 활성 억제와 관련이 있다고 보고하였다 (Park et al, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 29: 518-527 (2000)). 최근에, OA-유도 간 트리글리세리드 축적은 지방산(Cha et al, Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 508-513 (1998)), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) (Bunang et al, Nutr. 21: 867-873 (2005)), 헤스페레틴(hesperetin) (Cha et al, Plant Foods Human Nutr. 56: 349-58 (2001)) 및 캡사이신(capsaicin) (Cha et al, Food Sci. Biotechnol. 13: 597-602 (2004))과 같은 임의의 식이 성분에 의해 현저하게 억제되었다. 게다가, 식이성 옥수수 겨 헤미셀룰로오스(hemicellulose)는 OA-유도 지방간의 발달을 예방하는 것으로 나타났다 (Miyasaka et al, Biosci. Biotechol. Biochem. 56: 157-158 (1992)). 올리고프룩토스(Oligofructose)의 투여는 프룩토스에 의해 야기된 간 트리글리세리드 축적을 억제한다 (Kok et al, Metabolism 45: 1547-1550 (1996)). 따라서, 본 발명자들은 OA-결핍 및 OA-강화 다이어트(diet)를 한 쥐에서 간 및 혈청에서의 트리글리세리드의 축적, 트리글리세리드 합성 효소의 간 활성, 그리고 VLDL 분비 과정 및 간세포 형태와 관련 있는 MTP 대사 산물의 분자 메커니즘에 대한 올리고당을 함유하는 CRE의 효과를 조사하였다.

한국공개특허 제2009-0106957호에는 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼 다당체 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0539457호에는 괴각 추출물을 포함하는 고지혈증, 동맥경화증 및 지방간의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 지방간을 개선시킬 수 있는 기능성 소재의 개발이 요망되고 있으나, 부작용 등 안전성의 문제 때문에 많은 제약을 받고 있는 요즘, 천연물이면서 비교적 안전성이 높은 치커리 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 지방간 예방 또는 치료용 조성물은 지방간의 개선에 효과적이며, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않으며, 안전성을 확보할 수 있어, 지방간의 개선을 위한 기능성 식품산업상 매우 유용한 발명이 될 것이다.

도 1은 오로트산 투여 쥐에서 간 MTP mRNA 발현에 대한 CRE의 효과를 나타낸다. Normal: 정상 쥐의 간, OA: 오로트산을 투여한 쥐의 간, OA+CRE: 오로트산 및 치커리 뿌리 추출물을 투여한 쥐의 간.
도 2는 오로트산 투여 쥐에서 간의 조직병리학적 변화를 나타낸다. 간세포 염색은 H&E (hematoxylin and eosin) 염색법으로 수행되었다(배율×200). Normal: 정상 쥐의 간, OA: 오로트산을 투여한 쥐의 간, OA+CRE: 오로트산 및 치커리 뿌리 추출물을 투여한 쥐의 간.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 추출물은 에탄올 추출과정, 메탄올 추출과정 또는 열수 추출과정에 의해 제조될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 에탄올 추출과정, 메탄올 추출과정 또는 열수 추출과정은 당업계에 주지되어 있다. 바람직하게는 상기 추출물은 열수 추출물이다. 바람직하게는 상기 조성물은 간 PAP (phosphatidate phosphohydrolase) 또는 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)의 활성을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 조성물은 간 트리글리세리드(triglyceride)의 농도를 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 지방간의 예방 또는 개선용 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 지방간의 예방 또는 개선용 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 기능성 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 지방간의 예방 또는 개선용 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 지방간의 예방 또는 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

재료

오로트산 일수화물(Orotic acid monohydrate), 포스파티드산(phosphatidic acid), 포스파티딜콜린, 트리올레산(trioleic acid) 및 카디오리핀(cardiolipin)은 Wako Pure Chemical Ind. (Osaka, Japan)에서 구입하였다. 다른 모든 화학약품 및 시약은 가장 높은 품질의 제품을 사용하였다.

치커리 뿌리 추출물의 제조

치커리(Chicorium intybus)의 뿌리는 지역의 약초 시장(진주, 한국)에서 구입하였다. 상기 치커리는 지리산(경남, 한국)에서 생장한 것으로 확인되었다. 건조된 치커리 뿌리는 미세한 분말로 제조되었고 사용 전까지 실온에서 보관되었다. 분말제조된 치커리 뿌리의 물 추출물은 2시간 동안 물을 끊여서 제조되었다. 물 추출물은 Whatman No. 1 filter paper를 이용하여 여과되었다. 상기 추출물은 회전 진공농축기(vacuum rotary evaporator)를 이용하여 농축되었고 동결건조되었다.

다이어트 및 동물 실험

4주령 수컷 SD (Sprague-Dawley) 쥐는 Hyochang Science Animals Co. (Daegu, Korea)에서 구입하였고, 12시간 광/암 주기(07:00 내지 19:00)의 온도조절된 동물실(21 내지 24℃)에 있는 스테인리스 철망 케이지에서 한 마리씩 사육하였다. 실험 전에, 상기 쥐는 실험실용 차우 다이어트(chow diet)를 7일 동안 자유 급여하였다. 그 후, 상기 쥐는 3가지의 식이 실험군으로 나뉘었다; 반합성(semisynthetic) 다이어트를 급여한 정상군, 1% (w/w) OA와 함께 반합성 다이어트를 급여한 OA 처리군, 그리고 1% OA 및 5% CRE (w/w)와 함께 반합성 다이어트를 급여한 OA + CRE 처리군. 각 다이어트 군은 6마리의 쥐로 구성되었고, 한 케이지에 한 마리씩 사육되었다. 상기 시험 다이어트는 표 1에 나타내었다. 대조군, OA 및 OA + CRE 처리군의 에너지 수준은 430, 426 및 425 kcal/100g 이었다. 상기 쥐에 투여한 CRE의 양은 이전의 보고에서 치커리 추출물이 쥐에서 부작용없이 간 트리글리세리드 대사에 대해 현저한 효과를 가지는 농도로 추산되었다 (Kim and Shin, J. Nutr. 128: 1731-1736 (1998)). 이전의 연구는 4% 옥수수 겨 헤미셀룰로오스 또는 5% 치커리 추출물을 OA 또는 콜레스테롤 다이어트에 수크로스를 대신하여 각각 첨가하였다고 보고하였다 (Kim and Shin, J. Nutr. 128: 1731-1736 (1998)). 따라서, OA, CRE 및 OA + CRE는 대조군 다이어트에서 수크로스로 대체되었다. 사료와 물은 10일 동안 자유 급여되었고, 체중은 2일 마다, 사료 섭취량은 매일 기록되었다.

실험용 다이어트의 조성(%)

	정상	OA	OA+CRE
카제인	20.0	20.0	20.0
α-옥수수 전분	15.0	15.0	15.0
옥수수유	10.0	10.0	10.0
셀룰로오스	5.0	5.0	5.0
AIN-93 mineral mixture	3.5	3.5	3.5
AIN-93 vitamin mixture	1.0	1.0	1.0
L-메티오닌	0.3	0.3	0.3
주석산수소콜린	0.2	0.2	0.2
치커리 뿌리 추출물	-	-	5.0
오로트산	-	1.0	1.0
수크로스	45	44	39

지질 및 효소 분석

상기 처리가 끝난 후, 쥐는 12시간 절식 후 가벼운 디에틸에테르 마취하에 복부 대동맥으로부터 혈액이 채취되었다. 간은 분리되어 무게를 측정하였고, 분석 전까지 -70℃에서 보관되었다. 혈청은 3,000 rpm에서 15분 동안 혈액을 원심분리하여 획득되었다. 혈청에서 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도는 키트(clinical laboratory of the Neodin Medical Institute, Seoul, Korea)를 이용하여 효소적으로 측정되었다. 간 지질은 Folch 등(J. Biol. Chem. 226: 497-509 (1957))의 방법에 따라 추출 및 정제되었다. 상기 지질 추출물에서 트리글리세리드 및 콜레스테롤의 농도는 키트(Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japan)를 이용하여 효소적으로 측정되었다.

간 세포하 분획( subcellular fraction )의 제조

각 쥐로부터 분리한 신선한 간의 일부는 10 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4), 1 mM EDTA (ethylenediamine tetraacetate) 및 0.2 mM DTT (dithiothreitol)를 포함하는 얼음으로 냉각시킨 0.25 M 수크로스 용액에서 균질화되었다. 마이크로좀 분획은 이전에 기재된 방법에 따라 제조되었고(Catwright et al, J. Biol. Chem. 268: 20937-20949 (1993)), 효소 활성 분석에 사용하기 전까지 -70℃에 보관되었다. 상기 마이크로좀 단백질은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 측정되었다.

PAP , DGAT 및 MTP 활성의 분석

PAP (phosphatidate phosphohydrolase, EC 3.1.3.4) 활성은 Walton 및 Possmayer(Biochim. Biophys. Acta 796: 346-372 (1984))에 의해 기재된 방법을 약간 변형하여 분석되었다. 요약하면, 상기 반응 혼합물은 0.05 M Tri-HCl (pH 7.0), 1 mM 포스파티드산, 1 mM 포스파티딜콜린 (Branson 250 Sonifier (Branson, Danbury, CT, USA)를 이용하여 0.9% NaCl에서 10분 동안 초음파처리하여 제조), 1.25 mM Na2-EDTA 및 100 ㎍의 간 효소 단백질을 최종 분석 부피 0.2 ㎖에 포함하였다. 활성 분석은 3.25 mM MgCl₂의 존재하에 수행되었다. 상기 분석 방법은 활성 및 배양시간 또는 단백질 농도 사이에 큰 상관성을 부여하였다. DGAT (Diacylglycerol acyltransferase, EC 2.3.1.20)는 이전에 개시된 방법에 따라 분석되었다 (Coleman and Bell RM, J. Biol. Chem. 251: 4537-4543 (1976)). 간 MTP의 활성은 Wetterau 등(Sci. 258: 999-1001 (1992))의 방법에 따라 단막 소포(unilamellar vesicle)의 두 집단 사이에 방사능표지된 트리올레이트(trioleate)의 이동을 측정함으로써 결정되었다. 상기 MTP 활성은 하기와 같이 계산되었다

이동 활성(%) = {dpm (블랭크(blank) 공여 소포 분획 - 샘플 공여 소포 분획)/dpm (블랭크 공여 소포 분획)} × 100.

MTP 웨스턴 블롯 분석

쥐의 간 유래 간 MTP 단백질은 이전에 개시된 방법에 따라 8% SDS-PAGE (레인 당 20 ㎍의 단백질)로 분리되었다 (Oliveira et al, Biochem. Pharmacol. 74: 290-297 (2007)). 그 후, 상기 분리된 단백질은 300/240 mA/cm²의 일정한 전류로 16시간 동안 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동되었고, 비특이적 부위는 블록킹 완충액 (5% 무지방유, 10 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl 및 0.1% Tween 20)에서 실온에서 2시간 동안 차단되었다. 상기 웨스턴 블롯은 4℃에서 밤새 마우스 단클론 항-MTP (1:1,000 희석, DB USA)로 프로빙되었고, 그 후 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체 (1:2,000 희석, DB USA)로 인큐베이션 되었다. 니트로셀룰로오스 막에서 단백질은 ECL 방법을 이용하여 검출되었고, 밀도를 분석하여 정량되었다. 각 반응에서 97kDa MTP 단백질 밴드의 상대 밀도는 Lumi-Imager F1 densitometer (Roche Molecular Biochemicals, Roche, Switzerland) 및 LumiAnalyst™ 3.1 software를 이용하여 정량되었다.

간 조직병리학적 검사

간은 조심스럽게 분리되었고 조직학적 검사를 위한 작은 단편의 고정은 0.1 M PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)에 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 4% 수준으로 용해시킨 용액으로 수행되었다. 상기 화학적으로 고정된 샘플은 파라핀에 포매되었고, 그 후 이전에 기재된 방법에 따라 표준 H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색을 위해 약 6 ㎛의 두께로 잘려 졌다 (Cha et al, Food Sci. Biotechnol. 15: 122-127 (2006)). 관찰된 임의의 병소의 형태는 분류되어 의과대학 해부학 실험실에 등록되었다 (Dong-A University, Busan, Korea).

통계 분석

동물 실험 데이타는 평균±표준오차로 나타내었고, 일원배치 분산분석 (ANOVA)을 이용하여 분석되었으며, 던컨 다중범위 검정(Duncan's new multiple-range test)으로 집단 간의 차이를 분석하였다 (Duncan, Biometrics 1: 1-42 (1959)). p값 <0.05 은 통계적으로 유의성이 있는 차이로 인정되었다.

실시예 1:

많은 양의 OA 처리가 체중 증가 지연 및 간의 종대를 야기하는 지방간을 유발한다는 것은 이미 보고되었으며(Su et al, J. Pham. Exp. Ther. 291: 953-959 (1999)), 본 발명에서도 관찰되었다. 본 발명자들은 또한, 통계적으로 유의적인 차이가 없는 OA 다이어트에 비해 OA 및 CRE를 동시 첨가한 군에서는 약간의 체중 증가를 확인하였다(표 2). 사료 섭취량은 OA-급여 쥐에서 현저하게 더 낮았지만(표 2), OA 및 CRE를 동시 첨가한 군의 사료 섭취량은 OA-급여 쥐에 비해 증가하였다. OA 투여는 정상 다이어트에 비해 간 트리글리세리드 농도를 현저하게 증가시켰다(표 3). 비록 OA-급여 쥐에서 간 트리글리세리드 농도가 정상 쥐의 6배에 달하지만, 상기 증가는 CRE 및 OA를 동시에 투여했을 때 1/3로 감소하였다. 또한, OA 투여는 간에서 콜레스테롤 축적을 야기하지만, 콜레스테롤 농도는 CRE 투여에 영향을 받지 않았다(표 3).

오로트산을 포함하는 다이어트를 급여한 쥐에서 체중, 사료 섭취량 및 상대적 간 무게에 대한 치커리의 효과

	정상	OA	OA+CRE
초기 체중(g)	101±2.3^NS	102±2.1	101±1.4
최종 체중(g)	189±4.4^a	157±6.1^b	178±6.4^ab
사료 섭취량(g/일)	16.39±0.29^a	13.43±0.40^b	15.63±0.51^ab
에너지 이용량(kcal/일)	70.48±1.25^a	57.21±1.70^b	66.43±2.17^ab
간 무게(g)	10.9±0.16^b	13.30±0.44^a	10.80±0.66^b
간 무게(g/100g 체중)	5.76±0.10^b	8.47±0.16^a	6.07±0.12^b

쥐는 10일 동안 시험 다이어트를 급여하였다.

오로트산(1.0%) 및/또는 CRE(5.0%)가 정상 다이어트에 첨가되었다.

각 값은 각 실험군 당 6마리 쥐의 평균 ± 표준오차로 나타내었다.

다른 문자로 표시한 값은 p<0.05에서 유의적으로 차이가 있다.

NS: 유의적인 차이가 없음.

오로트산을 포함하는 다이어트를 급여한 쥐에서 간 및 혈청 지질의 농도에 대한 치커리의 효과

	정상	OA	OA+CRE
간 지질(mg/g)
트리아실글리세롤	17.9±1.3^c	156.1±7.1^a	53.5±4.l^b
콜레스테롤	2.58±0.12^b	5.28±0.27^a	5.46±0.28^a
혈청 지질(mg/100 ㎖)
트리아실글리세롤	194±11^a	108±18^b	37.8±2.3^c
콜레스테롤	97.7±4.9^a	67.9±5.9^b	23.3±1.9^c

쥐는 10일 동안 시험 다이어트를 급여하였다.

오로트산(1.0%) 및/또는 치커리(5.0%)가 대조군 다이어트에 첨가되었다.

실시예 2:

간 지질의 과도한 축적의 주요 원인은 VLDL 분비의 억제, 드 노보(de novo) 지질 합성의 증가, 그리고 지질 분해의 장애에 의한 것으로 생각된다 (Hebbachi et al, Biochem. J. 325: 711-719 (1997)). CRE의 투여가 간에서 OA-유도 트리글리세리드 축적을 감소시키는 기본 메커니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은 트리글리세리드 합성에 관여하는 효소 활성을 측정하였다. 간에서 트리글리세리드 생합성은 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate) 경로를 통해 발생하고 3가지 효소 (글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(acyltransferase), PAP 및 DGAT)에 의해 촉매된다 (Fremont and Gozzelino, Lipids 31: 871-878 (1996)). 최근의 보고는 PAP가 트리글리세리드 합성에 대한 속도-제한적 효소라고 제안하였다 (Hebbachi et al, Biochem. J. 325: 711-719 (1997)). 본 발명자들은 트리글리세리드 합성 경로에 대한 간 효소 PAP의 활성을 측정하였다 (표 4). Mg² ⁺-의존성 PAP의 가용성 및 막-결합 형태의 활성은 OA-급여 쥐에서 현저하게 증가한 반면, 마이크로좀 막-결합 PAP 활성은 CRE의 동시 첨가 군에서 더 낮았다(표 4). 시토졸 PAP 활성은 OA 및 OA+CRE 처리군 사이에 유사하였다. 비록 상기 마이크로좀 PAP 활성이 CRE 투여에 의해 더 낮아졌지만, 상기 활성은 두 OA-처리 군에서 현저한 차이는 없었다 (표 4).

오로트산을 포함하는 다이어트를 급여한 쥐에서 PAP, DGAT 및 MTP의 간 활성에 대한 치커리의 효과

	정상	OA	OA+CRE
PAP 활성(nmol/분/mg 단백질)
마이크로좀	10.1±1.3^b	14.2±0.5^a	11.9±1.2^ab
시토졸	15.7±1.6^b	19.9±0.5^a	18.5±0.7^a
MTP 활성	8.79±0.87^a	4.91±0.66^b	4.59±0.31^b
DGAT 활성	3.01±0.04^b	6.74±0.09^a	2.78±0.03^b

쥐는 10일 동안 시험 다이어트를 급여하였다.

본 발명자들은 손상된 DGAT 활성이 OA-유도 지방간의 발생에 중요하게 관여한다고 가정하였다. 비록 DGAT이 트리글리세리드 드 노보(de novo) 합성의 조절에서 중요한 최종 효소라고 생각되지만, OA-유도 지방간의 발생에서 DGAT 활성의 관여는 완전히 밝혀지지 않았다(Casaschi et al, Metabolism 54: 403-409 (2005)). 본 발명에서 CRE의 투여는 OA-유도 지방간에서 DGAT의 활성을 현저하게 감소시켰다(표 4). 상기 결과는 간 트리글리세리드 및 DGAT 활성 사이에 유의성 있는 양성 상관관계를 나타내었다. 따라서, 상기 결과는 OA-유도 지방간에서 CRE의 가능성 있는 트리글리세리드-감소 메커니즘이 트리글리세리드 합성의 억제에 기인한 것일 수 있다는 것을 제안하며, 이는 DGAT 활성의 변화에 의해 제안된 바와 같다.

혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤 농도는 이전에 보고된 바와 같이 OA 다이어트를 급여한 쥐에서 현저하게 감소되었다 (Cha et al, Plant Foods Human Nutr. 56: 349-58 (2001)). 혈청 트리글리세리드 농도의 추가적인 감소는 OA 단독 투여에 비해 OA 및 CRE 동시 투여에서 관찰되었는데(표 3), 이는 간으로부터 트리글리세리드 분비의 감소가 OA 단독 투여에 대한 단독 작용은 아닐 수도 있다는 가능성을 제안한다.

본 발명자들은 MTP의 활성 및 mRNA 발현 손상이 OA-유도 지방간의 발달에 중요하게 관여할 수 있다고 가정하였다. 상기 MTP의 활성 및 mRNA 발현은 CRE 투여에 의한 혈청 트리글리세리드-감소 효과의 메커니즘을 설명하기 위해 측정되었다. 간 MTP 활성은 OA 투여군, 그리고 CRE 및 OA의 동시 투여군에서 현저하게 감소하였다(표 4). 본 발명에서 OA를 급여한 쥐의 간에서 MTP mRNA 발현을 측정하였을 때, OA 처리는 간 MTP mRNA 발현에 영향을 주지 않았다(도 1). 상기 결과는 지질생합성(lipogenesis)이 OA 투여에 의해 증가한 조건하에, MTP 활성의 감소가 OA-유도 지방간의 발달의 원인일 수 있다는 것을 나타낸다.

형태학적 실험에서 전형적인 간의 색이 정상 쥐에서 관찰되었지만, OA-유도 지방간의 색은 도 2에 나타낸 조직학적 검사 결과에서 황색 및/또는 더 옅은 흰색을 나타내었다. 상기 OA 투여 쥐에서 간세포의 지질 방울은 지방간이 진행됨에 따라 그 수와 크기가 증가하였고, 이는 간 무게의 증가를 동반하는 간종대(hepatomegaly)를 야기하였다(표 2). 그에 비해, CRE 및 OA의 동시 투여는 간세포에서 작은 지질 방울의 축적을 감소시켰다(도 2).

결론적으로, 본 발명은 CRE가 쥐에서 OA-유도 지방간의 발달을 억제하며, 상기 현상은 부분적으로 간 트리글리세리드 합성 효소인 DGAT의 활성 감소에 기인한다는 것을 나타내었다.

Claims

유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 간 PAP (phosphatidate phosphohydrolase) 또는 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 간 트리글리세리드(triglyceride)의 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물.
유효성분으로 치커리(Chicorium intybus) 뿌리 추출물을 함유하는 지방간의 예방 또는 개선용 기능성 식품.