KR101252362B1 - 고친화성 항체를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

고친화성 항체를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) 각각 항체를 발현하는 다수의 하이브리도마 세포를 제공하는 단계; b) 서로 다른 온도 및 서로 다른 항체 농도에서 표면 플라스몬 공명에 의해 각각의 항원에 결합된 상기 항체의 시간 의존적 양을 측정하는 단계; c) 수학식 II 내지 XIII에 근거하여 측정된 시간 의존적인 양을 이용하여 (i) 표준 회합 결합 엔트로피 식 (A), (ii) 표준 해리 결합 엔트로피 식 (B), (iii) 표준 결합 엔트로피(△S°), (iv) 자유 표준 결합 엔탈피(△G°), (v) 표준 해리 자유 결합 엔탈피 식 (C), (vi) 표준 회합 자유 결합 엔탈피 식 (D), (vii) -T△S°, (viii) 해리 속도 상수 kd, (ix) 평형 결합 상수 KD, 및 (x) 회합 속도 상수 ka 중 하나 이상의 열역학 변수를 계산하는 단계; d) i) 10 J/mol·K 미만의 표준 회합 결합 엔트로피, ii) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 해리 결합 엔트로피, iii) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 결합 엔트로피중 둘 이상을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계, e) 상기 항체를 발현하기에 적합한 조건 하에서 선택된 세포를 배양하고 상기 항체를 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수함으로써 항체를 생성하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

고친화성 항체를 스크리닝하는 방법{METHOD TO SCREEN HIGH AFFINITY ANTIBODY}
본 발명은 결합 엔트로피, 예를 들면 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass) 및 항체 결합 단계 동안의 엔트로피 부담을 평가하는 항체의 열역학 변수, 특히 전이 상태 열역학에 근거하여 고 친화성 항체를 결정하는 방법에 관한 것이다.
현저한 항원 특이성 및 뛰어난 항원 복합체 안정성을 갖는 고-친화성 항체의 생성은 진단 및 치료 항체 개발에서 주요한 목적이다.
단백질-단백질 상호작용의 열역학 분석에 관해, 주를 이루는 기술은 열량측정 분석이다([Chaires, J.B., Annu. Rev. Biophys. 37 (2008) 135-51]; [Perozzo, R., et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 24 (1-2) (2004) 1-52]; [Li, L., et al., Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008) 529-32]; [Liang, Y., Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai) 40(7) (2008) 565-76]; [Thielges, M.C., et al., Biochemistry 47(27) (2008) 7237-47]). 반응 열량 측정에 필요한 시료의 양은 많고, 예를 들면 125㎍/ml 이상의 항체 농도 및 150㎕ 이상의 시료 체적이 요구된다. 또한 반응 열량 측정은 높은 시료 순도를 요구하고, 임의의 시료 불순물 또는 시료 비균질성을 용납할 수 없고, 시료 완충액이 열역학 변수 결과에 직접적인 영향을 미친다. 반응 열량 측정은 단지 평형 열역학을 설명할 수 있을 뿐이다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 장치([Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10]; [Van Regenmortel, M.H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 163-7]; [Gunnarsson, K., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18 (2001) Unit 18.6]; [Drake, A.W., et al., Anal. Biochem. 328(1) (2004) 35-43]; [Kikuchi, Y., et al., J. Biosci. Bioeng. 100(3) (2005) 311-7])는 높은 처리량 방식으로 온도-의존적 역학 프로파일의 신속한 측정을 가능하게 한다(예를 들면, [Canziani, G.A., et al., Anal. Biochem. 325(2) (2004) 301-7]; [Safsten, P., et al., Anal. Biochem. 353(2) (2006) 181-190]; [Leonard, P., et al., J. Immunol. Methods 323(2) (2007) 172-9] 참조).
문헌[Wassaf, D., et al. Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253]은 표면 플라스몬 공명 마이크로어레이를 이용하여 높은-처리량으로 항체 친화성을 등급화함에 대해 보고한다. 바이오센서 기술을 이용한 단백질 상호작용의 열역학 분석이 [Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210]에 보고되어 있다.
본 발명은 엔탈피-구동된 항원 회합, 음의 엔트로피 부담 및 항원 해리동안의 큰 엔트로피 변화를 특징으로 하는, 온도-독립적인 항원 복합체 안정성을 갖는 고 친화성 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 양태는
- 항원의 분자량에 근거하여 표면 플라스몬 공명 측정에서의 신호 반응을 최적화하여, 이에 의해 Rmax가 측정 온도 범위에서 일정하게 유지되는 단계,
- 표면 플라스몬 공명 측정에 근거하여 하기 수학식 I의 항원-복합체-안정성을 계산함을 포함하는 동역학 스크리닝 단계를 수행하는 단계;
- 95% 초과의 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택하는 단계;
- 17℃, 21℃, 25℃, 29℃, 33℃ 및 37℃에서의 표면 플라스몬 공명에 의해 온도-의존적 동역학 자료를 측정하는 단계;
- 전이 상태 열역학 성질을 계산하는 단계;
- 항원 복합체 회합 속도 상수 ka[1/Ms]의 온도-의존적 가속화, 및 유지되거나 감소되는 항원 복합체 해리 속도 상수 kd[1/s]에 근거하여 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 항원에 결합한 다수의 항체로부터 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다:
[수학식 I]
항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
상기 식에서,
BL은 항원의 주입 종말 직전에 설정된 최근 결합 기준점을 나타내고,
SL은 복합체 해리 상의 종말 직전에 설정된 최근 안정성 기준점을 나타낸다.
이 양태의 한 실시양태는,
- 107nM의 항체 농도의 경우 17℃, 78nM의 항체 농도의 경우 21℃, 70nM의 항체 농도의 경우 25℃, 64nM의 항체 농도의 경우 29℃, 58nM의 항체 농도의 경우 33℃, 53nM의 항체 농도의 경우 37℃에서 수행된 열역학 스크리닝을 이용한 항체의 열역학 성질의 계산 및 표면 플라스몬 공명 측정에 근거하여, 온도-의존적 동역학 자료를 생성하고/하거나,
- 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 10 J/K·mol 미만의 결합 엔트로피 △S°‡ass의 열역학 성질, 및/또는
- 음 또는 0 근처의 해리 활성화 에너지(Eaddis [kJ/mol]), 음의 해리 엔탈피 (△H°‡diss [kJ/mol]), 및 큰 음의 해리 엔트로피(△S°‡diss [kJ/mol])를 나타내는 해리 상을 갖는 항체를 선택함에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는
a) 각각 항체를 발현하는 다수의 세포, 바람직하게는 하이브리도마 세포 또는 B 세포를 제공하는 단계;
b) 서로 다른 온도 및 서로 다른 항체 농도에서의 표면 플라스몬 공명에 의해 각각의 항원에 결합된 항체의 시간 의존적 양을 측정하는 단계;
c) 하기 수학식 II 내지 XIII에 근거하여 b)에서 측정된 시간 의존적 양을 이용하여 (i) 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass), (ii) 표준 해리 결합 엔트로피(△S°‡diss), (iii) 표준 결합 엔트로피(△S°), (iv) 자유 표준 결합 엔탈피(△G°), (v) 표준 해리 자유 결합 엔탈피(△G°‡diss), (vi) 표준 회합 자유 결합 엔탈피(△G°‡ass), (vii) -T△S°, (viii) 해리 속도 상수 kd, (ix) 평형 결합 상수 KD, 및 (x) 회합 속도 상수 ka 중 하나 이상의 열역학 변수를 계산하는 단계,
d) i) 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피, ii) 100 J/mol*K 이상의 절대 표준 해리 결합 엔트로피, iii) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 결합 엔트로피중 둘 이상을 갖는 항체를 생성하는 세포를 선택하는 단계;
e) 상기 항체를 발현하기에 적합한 조건하에서 상기 선택된 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법에 관한 것이다:
[수학식 II]
△G°= △H°- T*△S°
[수학식 III]
△G°= - R*T*lnKD
[수학식 IV]
lnKD = -1/T*(△H°/R)/기울기 - (△S°/R)/절편
[수학식 V]
R*T*lnKD = △H°T0 - T*△S°T0 + △C°p(T-T0) - T*△Cp°ln(T/T0)
[수학식 VI]
ka = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
[수학식 VII]
lnka/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡*R + lnkb/h)/절편
[수학식 VIII]
ka = A*e- Ea /R*T
[수학식 IX]
lnka = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
[수학식 X]
kd = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
[수학식 XI]
lnkd/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡/R + lnkB/h)/절편
[수학식 XII]
kd = A*e- Ea /R*T
[수학식 XIII]
lnkd = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
한 실시양태에서, 방법은 하기의 추가 단계중 하나 또는 둘 모두를 포함한다:
- 단계 a) 이후 및 단계 b) 이전에, a1) 단계 a)의 세포를 배양하고, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 함유하는 배양 상층액을 제공하는 단계,
- 단계 d) 이후 및 단계 e) 이전에: d1) 상기 선택된 세포로부터 상기 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 단리된 핵산에 근거하여 상기 항체의 키메릭, CDR-그래프팅된, T-세포 에피토프 결실되고/되거나 인간화된 변이체를 암호화하는 추가의 핵산을 제공하고, 발현 카세트에 개질된 핵산을 함유하는 발현 플라스미드를 제공하고, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 또는 PER.C6 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질감염시키는 단계.
본 발명의 다른 양태는 예를 들면 치료적 처치를 위해 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하되, 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass)를 갖는 항체가 선택되는 방법에 관한 것이다.
이 양태의 한 실시양태에서,
a) 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass),
b) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 해리 결합 엔트로피(△S°‡diss),
c) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 결합 엔트로피(△S°)
중 둘 이상을 갖는 항체가 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass)는 5 J/K·mol 미만이다. 다른 실시양태에서, 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass)는 0 J/K·mol 미만이다. 추가의 실시양태에서, 절대 표준 해리 결합 엔트로피(△S°‡diss)는 125 J/mol·K 이상이다. 또다른 실시양태에서, 절대 표준 해리 결합 엔트로피(△S°‡diss)는 150 J/mol·K 이상이다. 다른 실시양태에서, 절대 표준 결합 엔트로피(△S°)는 125 J/mol·K 이상이다. 추가의 실시양태에서, 절대 표준 결합 엔트로피(△S°)는 150 J/mol·K 이상이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 -50 KJ/mol 이하의 자유 표준 결합 엔탈피(△G°)를 갖는 항체를 선택하는 것을 특징으로한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 표준 회합 자유 결합 엔탈피(△G°‡ass)에 대한 표준 해리 자유 결합 엔탈피(△G°‡diss)의 비가 2.3 이상인 항체가 선택된다. 추가의 실시양태에서, 방법은 a) -80 kJ/mol 이하 또는 b) +40 kJ/mol 이상의 -T△S°를 갖는 항체가 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태는 온도가 증가함에 따라 약 2개 자리수(two orders of magnitude)까지 감소되거나 또는 동일한 자리수로 남아있는 해리 속도 상수 kd(1/s)를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 예를 들면 약학 조성물에서 사용하기 위해 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 온도가 증가함에 따라 감소되거나 일정하게 유지되되는 평형 결합 상수 KD(M)를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 예를 들면 약학 조성물에서 사용하기 위해 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 온도는 13℃ 내지 37℃의 범위이다.
본 발명의 추가의 양태는 i) 온도-의존성 동역학 자료를 측정하는 단계, ii) 전이 상태(TS) 열역학 성질을 계산하는 단계, 및 iii) 열역학 행동에 근거하여 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 예를 들면 약학 조성물에서 사용하기 위해 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 열역학 행동이 항원 복합체 회합 속도 상수 ka [1/Ms]가 온도에 의존하여 증가되고, 항원 복합체 해리 상수 kd [1/s]가 유지되거나 감소되는 것을 특징으로 한다. 추가의 실시양태에서는, 상기 열역학 행동은 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 10 J/mol·K 미만의 결합 엔트로피 △S°‡ass이다. 다른 실시양태에서, 음 또는 거의 0의 해리 활성화 에너지(Eadiss [kJ/mol]), 음의 해리 엔탈피(△H°‡diss [kJ/mol]), 및 큰 음의 해리 엔트로피(△S°‡diss [kJ/mol])를 나타내는 해리 상을 갖는 항체가 선택된다.
또다른 실시양태에서, 온도-의존적 동역학 자료의 측정은 표면 플라스몬 공명에 의해 이루어지고, 동역학 스크리닝 단계 및 열역학 스크리닝 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 동역학 스크리닝 단계는 표면 플라스몬 공명 측정에 근거한 하기 수학식 I의 항원-복합체-안정성의 계산을 포함한다:
수학식 I
항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
상기 식에서,
BL은 항원의 주입 종말 직전에 설정된 최근 결합 기준점을 나타내고,
SL은 복합체 해리 상의 종말 직전에 설정된 최근 안정성 기준점을 나타낸다.
또다른 실시양태에서, 방법은 항원의 분자량에 근거하여 표면 플라스몬 공명 측정에서의 신호 반응을 최적화시켜, 이에 의해 Rmax가 측정 온도 범위에서 일정하게 유지되는 단계를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은
a) 고형 지지체 표면에 결합된 포획 분자에 의해 고형 지지체 표면 상에 항체를 고정시키는 단계,
b) 항원을 포함하는 용액을 제공하는 단계,
c) 항원의 고정된 항체로의 회합이 허용되도록 고형 지지체 표면 상에 공지된 농도의 항원을 함유하는 용액을 유동시키는 단계,
d) 항원의 고정된 항체로부터의 해리가 허용되도록 고형 지지체 표면 상에 항원이 없는 용액을 유동시키는 단계,
e) 단계 c) 및 d) 동안 고형 지지체 표면에 결합된 항원의 시간 의존적 양을 모니터링하고, 결합 자료를 수집하되, 서로 다른 농도의 항원을 이용하여 단계 c) 및 d)를 1회 이상 반복하는 단계, 및
f) 단계 e)에서 수득된 결합 자료를 수학식 II 내지 수학식 XIII에 근거한 항원과 고정된 항체 사이의 상호작용에 대해 예측된 모델에 부합시킴으로써 동역학 및/또는 열역학 변수를 계산하는 단계
를 포함하는 표면 플라스몬 공명에 의한 측정을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 항체는 종 특이적 항체 포획 분자에 의해 고정된다.
본 발명의 한 양태는 본 발명의 방법을 이용하여 생산된 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 동역학 스크리닝에서 항체의 선택은 95%보다 큰 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택함으로써 수행된다. 또다른 실시양태에서, 항원 신호 반응은 항원의 분자량에 근거하여 최적화된다.
본 발명의 다른 양태는 전이 상태(TS) 열역학 성질을 계산하기 위해 온도-의존적 동역학 자료를 생성하고, 열역학 행동에 근거하여 항체를 선택하며, 여기서 온도-의존성 동역학 자료의 생성이 107nM의 항체 농도의 경우 17℃, 78nM의 항체 농도의 경우 21℃, 70nM의 항체 농도의 경우 25℃, 64nM의 항체 농도의 경우 29℃, 58nM의 항체 농도의 경우 33℃, 53nM의 항체 농도의 경우 37℃에서 수행된 열역학 스크리닝을 이용한 항체의 열역학 성질의 계산 및 표면 플라스몬 공명 측정에 근거한, 표면 플라스몬 공명에 의해 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 예시적인 항-PTH 항체의 최근 결합(BL) 및 최근 안정성(SL) 자료를 나타낸다.
도 2는 549개의 하이브리도마 1차 배양액의 최근 결합/복합체 안정성 플롯이다. 원안의 자료 점은 충분한 항원 반응 신호 및 100% 복합체 안정성을 나타내고, 사각형 안의 자료 점은 충분한 항원 반응을 나타내지 않는다.
도 3은 25 nM, 50 nM, 75 nM 및 100 nM에서 온도를 증가시키면서 분석물질인 모노클론 항-TSH 항체에 대한 <IgGFCγ>R 항체 포획 시스템의 2차 항체 반응을 나타낸다.
도 4a는 항체 M D1.1의 온도-의존적 항체-PTH 상호작용의 예시적인 농도-의존적 센소그램을 나타낸다. 동역학은 HBS-EP pH 7.4, 25℃, 회합 시간 3분, 해리 시간 5분, 랭뮤어 부합에 의해 측정되었다.
도 4b는 항체 M 9.3.1의 온도-의존적 항체-PTH 상호작용의 예시적인 농도-의존적 센소그램을 나타낸다. 동역학은 HBS-EP pH 7.4, 25℃, 회합 시간 3분, 해리 시간 15분, 랭뮤어 1.1 모델 부합에 의해 측정되었다.
도 5는 반트 호프, 아이링 및 아르게니우스의 선형 식에 따른 열역학 변수의 계산을 보여준다. 항체 M D1.1에 대한 예시적인 플롯이 도시된다.
도 6a는 항체 M 9.10.20의 온도-의존적 항체-PTH 상호작용의 예시적인 농도-의존적 센소그램을 나타낸다. 동역학은 HBS-EP pH 7.4, 25℃, 회합 시간 3분, 해리 시간 5분, 랭뮤어 부합에 의해 측정되었다.
도 6b는 항체 M 1F8의 온도-의존적 항체-PTH 상호작용의 예시적인 농도-의존적 센소그램을 나타낸다. 동역학은 HBS-EP pH 7.4, 25℃, 회합 시간 3분, 해리 시간 15분, 랭뮤어 1.1 모델 부합에 의해 측정되었다.
도 7a는 항체 M D1.1의 자료의 3차원 속도 지도를 나타낸다.
도 7b는 항체 M 9.3.1의 자료의 3차원 속도 지도를 나타낸다.
도 8a는 항체 M 9.10.20의 자료의 3차원 속도 지도를 나타낸다.
도 8b는 항체 M 1F8의 자료의 3차원 속도 지도를 나타낸다.
도 9a는 34개의 예시적인 항체의 온도-의존적 특징의 이중 로그 플롯을 나타낸다. 채워진 원은 온도가 증가함에 따라 친화성이 증가하는 항체이고, 비어있는 원은 온도가 증가해도 친화성이 일정한 항체이고, 사각형은 온도가 증가함에 따라 친화성이 감소하는 항체이다.
도 9b는 3개의 예시적인 항체의 온도-의존적 특징의 이중 로그 플롯을 나타낸다. 채워진 원은 온도가 증가함에 따라 친화성이 증가하는 항체이고, 비어있는 원은 온도가 증가해도 친화성이 일정한 항체이고, 사각형은 온도가 증가함에 따라 친화성이 감소하는 항체이다.
도 10a는 25 ℃(X-축) 및 37 ℃(Y-축)에서의 친화성을 나타내는 PTH 스크리닝에서 나온 13개의 항-PTH 항체의 친화성 플롯을 나타낸다.
도 10b는 25 ℃(X-축) 및 37 ℃(Y-축)에서 도 10a와 동일한 항체의 해리 속도 상수 플롯을 나타낸다.
도 11은 반트 호프에 따라 계산된 12개의 예시적인 항-PTH 항체의 평형 열역학 플롯을 나타낸다.
도 12는 아이링의 식에 따라 계산된 12개의 예시적인 항-PTH 항체의 활성 엔탈피 △H°‡ass의 일시 상태 열역학 플롯을 나타낸다.
도 13은 아이링의 식에 따라 계산된 활성 엔트로피 △S°‡ass(엔트로피 부담)의 일시 상태 열역학 플롯을 나타낸다.
도 14는 아이링의 식에 따라 계산된 13개의 예시적인 항-PTH 항체의 해리 엔트로피 △S°‡diss의 일시 상태 열역학 플롯을 나타낸다.
도 15는 상호작용의 온도- 및 농도-의존적 측정을 나타내며, 도 15a에서는 온도 구배에서의 비균질적 포획 동역학으로 인해, RMAX 값이 다양하고, 서로 다른 센소그램의 회합 상 동안 임의의 온도 단계에서 평형이 달성되지 않았고, 도 15b에서는 개조된 mAb 농도 및 연장된 회합 상으로 인해, RMAX 값이 균일하고, 35 ℃ 초과의 온도에서 평형이 달성되었다.
본 발명은 전이 상태(TS) 열역학 성질을 계산하기 위해 온도-의존적 동역학 자료를 생성하고, 열역학 행동에 근거하여 항체를 선택하는 것을 특징으로하는, 항원에 결합되는 항체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
표면 플라스몬 공명에 근거한 동역학 방법이 종래의 열량 측정 분석법에 비해 다음과 같은 여러 이점을 갖는 것으로 발견되었다:
- 높은 처리량 공정이 가능하고,
- 시료 소비가 낮고,
- 결합활성(avidity) 대신 친화성을 측정하고,
- 조질의 세포 상층액 또는 복합 배양 혼합물을 이용한다.
표면 플라스몬 바이오센서 표면은 친화성 매트릭스이고, 이는 예를 들면 세포 배양 상층액으로부터 항체의 포획을 위해 이용된다. 따라서, 조질의 복합 혼합물이 시료로서 이용될 수 있다. 상호작용 파트너중 하나는 센서 표면 상에 고정되고 제 2 화합물은 유동 시스템으로 주입되므로, FIA(유동 주입 분석) 시스템이 복합체 회합 및 해리 상을 별개로 모니터링할 수 있기 때문에, 평형 및 전이 상태 열역학의 측정이 가능하다. 이 기법을 이용함으로써, 열역학 변수인 자유 표준 결합 엔탈피 △G°, 표준 결합 엔탈피 △H°및 표준 결합 엔트로피 △S°의 계산, 및 전이 상태 변수인 자유 표준 회합 엔탈피 △G°‡ass, 표준 회합 엔탈피 △H°‡ass, 표준 회합 엔트로피 △S°‡ass, 활성화 에너지 Eaass, 자유 표준 해리 에너지 △G°‡diss, 표준 해리 엔탈피 △H°‡diss, 표준 해리 엔트로피 △S°‡diss 및 해리 에너지 Eadiss의 계산이 가능하다. 비-선형 반트 호프(van't Hoff) 방정식을 이용하는 경우, △Cp 값이 결정된다.
본 발명의 한 양태는 열역학 특징에 근거하여 항체를 선택하는 방법이다.
일반적으로 SPR에 근거한 동역학 항체 스크리닝(예를 들면 [Steukers, M., et al., J. Immunol. Methods 310(1-2) (2006) 126-35]; [Rich, R.L., et al., Anal. Biochem. 361(1) (2007) 1-6] 참고)은 그 이후에 더 높은 해상력의 열역학 SPR 분석의 제 2 단계가 잇따른다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여, 승온에서 적어도 일정하거나 증가된 친화성을 갖는 항체, 즉 승온에서 적어도 일정하거나 증가된 항원 복합체 안정성을 갖는 항체가 선택될 수 있다. 항원 복합체 안정성은 항체 스크리닝 공정에서 주요한 선택 기준이다. 각각 25℃ 또는 37℃에서 높은 안정성의 항원 복합체를 형성하는 항체를 생성하는 1차 세포 배양액 만이 선택된다.
항체 생성 세포 배양액이 생성되고, 한 실시양태에서는 전이 상태(TS) 열역학 성질을 계산하기 위해 온도-의존적 동역학 자료가 생성되는 고 처리량 분석에 가해진다. 본 발명의 방법에 따른 항체의 선택은 이의 열역학 행동에 근거하여 수행된다.
이 양태의 한 실시양태에서, 항체는 온도 의존적으로 증가하는 항원 복합체 회합 속도 상수 ka [1/Ms], 및 유지되거나 감소되는 항원 복합체 해리 속도 상수 kd [1/s]를 특징으로 선택된다. 이런 항체는 전형적으로 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 음의 결합 엔트로피 △S°‡ass(이는 본원에서 "엔트로피 부담"으로 언급된다)를 특징으로 한다. 본 발명에 따른 방법으로 선택된 항체는 결합 평형에서 큰 엔트로피-변화를 나타내는 항원 상호작용 기작을 특징으로 한다. 이 엔트로피 기여는 해리 엔트로피 △S°‡ass의 큰 양의 또는 큰 음의 변화가 일어나는 항체-항원 복합체 해리 단계에서 나온다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법으로 선택된 항체는 온도 증가에 따라 해리 속도 상수 kd [1/s]가 놀랍고 예상치못하게 감소되는 항원 해리 상에서 기원한 열역학적 예외를 가질 수 있다. 이런 항체는 i) 음 또는 거의 0의 해리 활성화 에너지 Eadiss [kJ/mol]를 나타내는 해리 상, ii) 음의 해리 엔탈피 △H°‡diss [kJ/mol], 및 iii) 큰 음의 해리 엔트로피 △S°‡diss [kJ/mol]과 같은 열역학 변수를 특징으로 한다. 이것이 이 효과의 완전히 이론적인 처리라는 점이 지적되어야만 한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 선택된 항체의 항원과의 상호작용 방식(즉, 항체가 항원에서 입체구조적 변화를 야기하거나, 항체가 그 자체로서 입체구조적 변화를 겪는다)에 대한 근거를 제공하는 열역학적 변수에 근거하여 다수의 고 친화성 항체로부터 항체를 선택하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이 방법은 고 항원 복합체 안정성을 갖는 항체를 생산하는 세포의 선택에 유용하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 동역학 스크리닝 단계 및 열역학 스크리닝 단계를 포함한다. 동역학 스크리닝의 경우, 최근 결합(BL) 기준점은 항원의 주입 종말 직전에 설정되고, 최근 안정성(SL) 기준점은 복합체 해리 상의 종말 직전에 설정된다. 한 실시양태에서, BL과 SL 자료는, X 축이 최근 결합 기준점의 반응 단위(RU) 값을 나타내고 Y축이 RU에서 최근 안정성 기준점 값을 나타내는 X-Y 플롯(예시적 플롯으로서 도 1을 참조할 수 있다)에 의해 도식적으로 가시화된다. 또한, 항원-복합체-안정성은 BL 및 SL 자료에 근거하여 하기 수학식 1에 따라 계산될 수 있다:
수학식 I
항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
다른 양태에서는, BL과 항원-복합체-안정성 자료가 X-Y-플롯(X-축은 최근 결합 기준점의 반응 단위(RU) 값을 나타내고, Y-축은 복합체 안정성에 대한 %로서의 값을 나타낸다)에 의해 도식적으로 가시화된다(예시적인 도면에 대해서는 도 2 참조). 한 양태에서는, 동역학 스크리닝 단계가 25℃에서 수행된다. 다른 실시양태에서는, 동역학 스크리닝이 37℃에서 수행된다. 다른 실시양태에서는, 13℃ 내지 42℃ 사이의 두개 이상의 상이한 온도 설정에서 동역학 스크리닝을 수행하였다.
한 실시양태에서는, 열역학 스크리닝 이전에, 단일 세포 기탁된 클론을 RPMI 1640 배지를 이용하여 100ml 스피너 배양 플라스크에서 배양한다. 다른 실시양태에서는, 열역학 스크리닝 이전에 단백질 A 세파로스(TM) 컬럼 크로마토그래피에 의해 항체를 상층액으로부터 정제한다. 한 실시양태에서, 열역학 스크리닝용 시스템 완충액은 HBS-EP이다. 다른 실시양태에서는, 비특이적 센서 매트릭스 효과를 감소시키기위해 시료 완충액에 1 mg/ml 카복시메틸덱스트란을 보충한다.
예로서 항-인간 PTH 항체의 분석을 이용하여 하기에 본 발명에 따른 방법을 개시할 것이다. 이 실시예는 본 발명에 따른 방법의 개시를 예시하기 위해 제시된 것으로, 본 발명의 방법을 이 실시예로 제한하고자 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원의 범위는 특허청구범위에 개시되어 있다.
제 1 단계에서, 하이브리도마 상층액의 동역학 스크리닝을 수행하였다. 여러 면역 및 융합 조작에서의 549개의 하이브리도마 1차 배양에서 나온 최근 결합 자료 및 최근 안정성 자료가 도 1에 예시되어 있다. 충분한 항원 반응(BL) 및 느린 항원 복합체 해리(SL)을 가진 하이브리도마 세포가 추가의 스크리닝 단계를 위해 선택되었다. 예를 들면 123번, 119번, 499번, 133번 및 295번 세포를 후속적인 처리(도 1의 원 참조)에 이용하였고, 189번, 263번 및 341번 세포는 복합체 안정성이 불충분하므로 불합격시켰다(도 1의 프레임 참조).
높은 항원 반응 및 높은 복합체 안정성을 가진 항체를 확인하는 것이 용이해지도록, [%]로 표현되는 결과적인 복합체 안정성이 최근 결합 반응 신호에 대해 플롯팅된 다이어그램을 이용할 수 있다(예를 들면 도 2 참고). 한 실시양태에서는, 동역학 스크리닝에서 항체를 선택하기 위해, 95% 이상의 복합체 안정성을 갖는 높은 항원 복합체 안정성 결합제를 선택하였다.
SPR에 근거한 측정을 이용하는 대부분의 문헌은 센서 표면 제시 기법으로서 항체 포획 시스템을 이용하지 않는다. 일반적으로, 항체 또는 이의 절편은 센서 상에 공유결합적으로 고정되어 있다. 표면이 다목적 항체 제시에 적합하지 않고, 리간드로 고정되는 센서의 수에 의해 기술적으로 제한되기 때문에, 이 기법은 높은 처리량 형식에서는 이용될 수 없다.
열역학적 측정을 위해 포획 시스템을 이용한다면, 동역학의 온도 민감성으로 인해 항체 포획 수준이 달라진다(도 15 참조). 열역학을 위해 항체 포획 시스템을 이용하기 위해서는, 균일한, 온도-독립적인 항체 포획 수준을 보장하는 것이 절대적으로 필요하다.
저온에서의 열역학 측정의 경우 2가지 주요 문제점이 있다. 먼저, 항체 포획 시스템의 동역학은 저온 분석용 2차 항체를 충분히 포획하기에는 너무 느리다. 두번째로, 항원-항체 상호작용의 열역학 또한 느려진다. 동역학은 4℃ 및 11℃에서의 느린 동역학으로 인해 분석 분해에서 강한 손실을 나타낸다. 완전한 온도 범위에서 평형이 달성될 수 없다. 온도 구배에서 Rmax 값은 작고 균질하지 않다. 온도를 증가시키면, 2차 항체의 더 빠른 회합 속도로 인해 포획된 mAb의 양이 일정하게 증가된다. 온도가 증가함에 따라, 항체 동역학 또한 가속되고 항원 Rmax 값이 증가된다. 평형이 달성되지 않기 때문에, 이들 추정된 Rmax 값은 어느 쪽인가 하면 실수로 인한 에러이다. 비균질한 센서 성능이 열역학 계산의 높은 오차의 원인이다. 계산된 변수의 95% 유의성이 달성될 수 없다.
따라서, 실험에 사용된 온도 구배 및 또한 센서 표면의 제조가 최적화될 필요가 있다. 센서 성능은 주로 항체 포획 시스템의 온도-의존적 적정에 의해, 그리고 완전히 시행하였을 때 Rmax 값이 일정하도록 최적화된 온도 구배 및 개조된 주입 시간을 이용하여 최적화된다. 결과는 도 15에서 비교되어 있다. Rmax 평균은 35 RU ± 3 RU이다. 30℃ 초과의 온도에서 평형이 달성되었다. 여기서 사용된 가장 낮은 온도는 15℃이다. 표 1은 종래의 분석법 대 최적화된 분석법을 이용하여 평형에 대한 열역학적 변수 계산(선형 반트 호프), 회합 상(아이링 및 아레니우스(Eyring and Arrhenius)) 및 해리 상(아이링 및 아레니우스)을 비교하고 있다
Figure 112011013851475-pct00001
"최적화되지 않음" 열의 자료가 높은 오차(SE)를 나타내는 반면, "최적화됨" 의 자료는 훨씬 낮은 오차를 나타낸다. "최적화되지 않음" 열의 모든 R2 값은 95% 유의성 미만인 반면, 최적화된 분석법은 95% 초과의 R2를 나타낸다.
△S°‡ass 값에 초점을 맞추면, 최적화되지 않은 시스템은 55%의 오차를 나타내지만, 최적화된 분석법은 단지 5%의 오차를 나타낸다.
적절한 온도 범위, 회합 시간 및 포획 동역학의 적정("온도 적정")이 열역학 측정을 높은 처리량 형식으로 성공적으로 실현하기 위한 주요 변수이다. 여지가 있는 오차를 갖는 SPR-계 항체 항원 상호작용을 측정하기 위해서 이들 변수가 최적화되었다.
열역학 스크리닝을 수행할 수 있도록, 적절한 온도-의존성 2차 항원 복합체 안정성을 갖는 종 특이적 포획 시스템이 확립되어야만 했다. 따라서, 최적화된 방법을 이용하여 바이오센서가 계산되었고, 이 것이 본 발명의 제 2 양태이다. 이 방법을 이용하여, 에피토프 특이성이 다양한 설치류 항-PTH IgG 항체의 결합 특성을 높은 처리량 형식으로 측정하는 것이 가능하였다. 열역학 스크리닝은 자료의 온도-의존적 설정을 제공한다(도 3 참고). 더 낮은 온도에서는 더 적은 반응이 관찰되었고, 이는 포획 시스템의 회합 속도가 감소되기 때문이다(실시예 5, 표 2 참고). 더 높은 온도에서는, 회합 속도가 가속되어, 한 실시양태에서는, 너무 많은 항체를 포획하지 않도록 문제가 되는 항체의 농도 및/또는 주입 시간이 감소되어야만 했다. 한 실시양태에서는, 항원의 분자량에 근거하여 항원 신호 반응이 최적화된다. 예를 들면 PTH 분자량(9.4 kDa)에 따라, Rmax에서의 항원 신호 반응이 최적화되고 25 RU를 초과하지 않았다.
따라서, 열역학 성질에 근거하여 항체를 선택하는 방법의 한 양태에서는, 열역학 스크리닝 단계가 107nM의 (2차) 항체 농도의 경우 17℃, 78nM의 항체 농도의 경우 21℃, 70nM의 항체 농도의 경우 25℃, 64nM의 항체 농도의 경우 29℃, 58nM의 항체 농도의 경우 33℃, 53nM의 항체 농도의 경우 37℃에서 수행된다. 항-PTH 항체의 경우, 하이브리도마 상층액을 이용하여 센서 표면 상에서 320 RU의 일정한 항체 반응 수준을 포획하였고, 이에 의해 320 RU의 항체가 Rmax에서 20 RU로 전체 길이 9.4 kDa PTH 분석물을 포획하였다. 본 발명에 따른 방법의 다른 양태에서는, 항원의 중량에 근거하여 표면 플라스몬 공명 칩에 적용되는 용액 중의 항체 농도를 최적화함으로써 13℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 Rmax 값이 일정하게 유지된다.
열역학 변수를 계산하기 위해서는 온도 의존적 KD를 가능한 한 정확하게 측정하는 것이 필수적인 것으로 발견되었다. 또한 놀랍게도, 랭뮤어(Langmuir) 모델에 따른 KD 평가를 위해 포괄적인, 즉 일정한 Rmax 값이 계산되도록 복합체 회합동안 분석물-리간드 포화가 달성되면, 계산된 열역학 변수의 오차가 극적으로 감소될 수 있는 것으로 발견되었다. 또한, 13℃ 미만의 온도에서는 포획 시스템의 회합 동역학이 충분한 항체 반응을 위해서는 너무 느린 것으로 발견되었다. 13℃ 미만과 37℃ 초과에서, 항체의 항원 결합 동역학 측정은 반트 호프, 아이링 및 아레니우스 식에 따른 비-선형화가능한 자료를 제공한다.
한 실시양태에서, 열역학 스크리닝은 13℃ 또는 17℃ 내지 37℃ 사이의 온도에서 수행된다. 이 온도 범위에서는 반트 호프 식의 선형 형태에 따른 열역학 평형 자료의 단순한 계산 및 선형 아이링 및 선형 아레니우스 식에 따른 전이 상태 열역학의 단순한 계산이 가능한 것으로 발견되었다([Wear, M.A., et al., Anal. Biochem. 359(2) (2006) 285-7]; 또한 도 5 참조). 한 실시양태에서는, 높은 처리량 스크리닝(HTS: high-throughput-screening)이 가능해지도록 모든 측정이 동일한 조건 하에서 수행된다.
계산을 위해서, 하기 수학식들을 이용하였다:
a) 반트 호프 계산
수학식 II
△G°= △H°- T*△S°
수학식 III
△G°= - R*T*lnKD
수학식 IV
lnKD = -1/T*(△H°/R)/기울기 - (△S°/R)/절편
수학식 V
R*T*lnKD = △H°T0 - T*△S°T0 + △C°p(T-T0) - T*△Cp°ln(T/T0)
b) 아이링 회합 상:
수학식 VI
ka = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
수학식 VII
lnka/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡*R + lnkb/h)/절편
수학식 VIII
ka = A*e- Ea /R*T
수학식 IX
lnka = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
c) 아이링 해리 상:
수학식 X
kd = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
수학식 XI
lnkd/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡/R + lnkB/h)/절편
수학식 XII
kd = A*e- Ea /R*T
수학식 XIII
lnkd = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
상기 식에서,
△H°는 표준 결합 엔탈피이고, △S°는 표준 결합 엔트로피이고, △G°는 자유 표준 결합 엔탈피이고, T*△S°는 엔트로피 항이고, △H°‡ass는 표준 회합 결합 엔탈피이고, △S°‡ass는 표준 회합 결합 엔트로피이고, △G°‡ass는 표준 회합 자유 결합 엔탈피이고, Ea ass는 회합에 대한 아레니우스 변수이고, △H°‡diss는 표준 해리 결합 엔탈피이고, △S°‡diss는 표준 해리 결합 엔트로피이고, △G°‡diss는 표준 해리 자유 결합 엔탈피이고, Eadiss는 해리에 대한 아레니우스 변수이고, kD는 친화성 상수이고, ka는 회합 속도 상수이고, kb는 볼츠만(Boltzmann) 상수(1.3806503 X 10-23 m2 kg s-2 K-1)이고, kd는 해리 속도 상수이고, h는 플랑크(Planck) 상수이고, Cp는 몰 열용량이다.
놀랍게도, 25℃ 부근의 대칭적인 온도 범위와 +4℃의 단계(예를 들면 한 실시양태에서는 13℃, 17℃, 21℃, 25℃, 29℃, 33℃, 37℃)를 이용하면, △H°, △H°‡ass, △H°‡diss, △S°, △S°‡ass, △S°‡diss의 절대 오차를 감소시키는 것이 가능한 것으로 발견되었다([Zhukov, A., et al., J. Mol. Recognit. 20(5) (2007) 379-385]). 예시적인 값에 대해서는 표 2를 참조할 수 있다.
Figure 112011013851475-pct00002
자유 결합 엔탈피 △G°의 온도 의존성은 식 △G°= - R*T*lnKD을 이용하여 13℃ 내지 37℃의 범위에서 각각의 온도에 대해 계산된다. 값이 일정하면, 반트 호프식의 선형 형태가 이용된다. △G°가 변화되면, 비-선형 형태가 바람직하다.
서로 다른 항-PTH 항체의 서로 다른 특징을 다이어그램에서 볼 수 있고, 이는 하기 문단에서 설명된다:
a) 도 4a에 도시된 바와 같은 항-PTH 항체 M D1.1은 높은 친화성, 및 17℃에서의 나노몰 이하의 친화성에서 37℃에서의 나노몰 친화성까지의 전형적인 온도-유도된 친화성 감소(KD)를 나타낸다. 이는 주로 승온에서 감소된 항원 복합체 안정성에 기인한다. 이 해리 속도는 복합체 안정성에서 2개의 자릿수의 감소를 포함한다. 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수 둘 모두 증가하고, 즉, 회합 및 또한 해리가 촉진되어 전반적으로 결합 친화성을 감소시킨다. 도 7a에는, 항-PTH 항체 M D1.1의 회합 속도 상수 ka [1/Ms], 해리 속도 상수 kd [1/s] 및 온도 [℃]가 플롯팅되어 있다. 항체는 열역학적으로 통상적으로 작용한다. 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수 둘 모두 온도의 증가와 함께 촉진된다. 친화성은 kd/ka = KD로서 계산된다. 결과는 지수적으로 감소되는 친화성 KD[M]이다. 그래프의 기울기는 음이 된다. 이 항체는 본 발명에 따른 방법에서 선택되지 않을 것이다.
b) 도 4b에 도시된 바와 같은 항-PTH 항체 M 9.3.1은 온도가 증가함에 따라 약간 감소되지만 동일한 자릿수에서 유지되는 친화성(KD)을 나타낸다. 해리 속도 상수 ka가 증가되어 강하게 촉진된 해리 속도 상수 kd가 친화성 KD에 크게 영향을 미칠 수 없다. 항체 M 9.3.1는 한편으로는 나노몰 이하의 친화성을 갖지만, 승온에서는 항원-항체-복합체 안정성이 없음을 나타낸다. 이 항체는 본 발명의 방법에 따라 선택되지 않는 항체에 대한 전형적인 예이다. 도 7b에서는 항체 M 9.3.1에 대한 회합 속도 상수 ka [1/Ms], 해리 속도 상수 kd [1/s] 및 온도[℃]가 도시되어 있다. 항체는 열역학적으로 정규적으로 기능하고, 이는 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수 둘 모두가 온도 증가에 따라 증가하였음을 의미한다. 친화성은 kd/ka = KD로서 계산된다. 결과는 지수적으로 감소되는 친화성 KD[M]이다. 이 항체는 본 발명에 따른 방법에서 선택되지 않을 것이다.
c) 도 6a에 도시된 바와 같은 항-PTH 항체 M 9.10.20은 온도가 증가함에 따른 회합 속도 상수 ka의 촉진, 즉, 회합 속도의 증가를 나타낸다. 회합 속도 상수는 2개의 자릿수의 범위이지만, 해리 속도 상수는 1개의 자릿수 이내에서 유지된다. 37℃ 이전에는 동역학 힘의 전체 범위가 최종적으로 달성되지 않는다. 해리 속도 상수 kd가 단지 온화하게 촉진되기 때문에, 항체 M 9.10.20은 본 발명에 따른 방법에서 선택될 항체의 예이다. 항체는 37℃에서 높은 복합체 안정성을 제공한다. 도 8a에는 항체 M 9.10.20의 회합 속도 상수 ka [1/Ms], 해리 속도 상수 kd [1/s] 및 온도[℃]가 도시되어 있다. 항체는 열역학적으로 정상으로 기능하지만, 13℃ 내지 29℃ 구간에서는 친화성이 일정하게 유지되고, 29℃ 내지 37℃ 구간에서는 단지 약하게 감소된다. 더 높은 온도에서는 해리 속도가 약하게 증가하지만, 그럼에도 불구하고 이 항체는 37℃에서 여전히 높은 항원 복합체 안정성을 나타내고, 따라서, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득된 긍정적인 스크리닝 결과이다.
d) 도 6b에 도시된 바와 같은 항-PTH 항체 M 1F8은 승온에서의 매우 높은 항원-항체-복합체 안정성(kd)으로 인해 온도가 증가함에 따른 친화성 증가(KD 감소)를 나타낸다. 회합 속도 상수 ka가 증가하고, 해리 속도 상수 kd가 감소, 즉 느려지므로, 고온에서 증가된 친화성이 측정될 수 있다. 항체는 17℃에서 1.7nM의 KD를 갖고, 37℃에서는 0.4nM의 KD를 갖는다. 해리 속도 상수 kd가 감소되기 때문에, 항-PTH 항체 M 1F8은 본 발명에 따른 방법의 양의 스크리닝 결과에 대한 예이다. 이 항체는 37℃에서 가장 높은 항원-항체-복합체 안정성을 제공한다. 도 8b에는 항체 M 1F8의 회합 속도 상수 ka[1/Ms], 해리 속도 상수 kd[1/s] 및 온도[℃]가 플롯팅되어 있다. 이 항체는 열역학적 예외를 나타낸다. 온도가 증가함에 따라 회합 속도는 증가되지만, 항체 M　9.3.1, M　D1.1 및 M　9.10.20과는 대조적으로, 온도가 증가함에 따라 해리 속도가 감소된다. 그 결과 온도가 증가함에 따라 친화성이 증가된다. 곡선의 기울기는 양이 된다. 이 항체는 본 발명에 따른 방법으로 수득되는 전형적인 양성 스크리닝 결과이다.
열역학 스크리닝에서 수득되는 자료는 도 9a에 도시된 바와 같은, 동역학 속도 상수 (kon) ka [1/Ms] 및 (koff) kd [1/s]가 각각 X-축 및 Y-축에 도시되어 있는 이중 로그 플롯에서 가시화될 수 있다. 등적 선(솔리드 선)은 동일한 친화성 영역을 나타내고, 이는 다이어그램의 오른쪽에 볼드체로 플롯팅되어 있다. kd/ka의 몫이 평형 상수 KD[M]에 대해 제공되기 때문에, 각각의 자료점은 각각의 온도에서의 친화성과 같은 뜻이다. 위쪽의 화살표는 13℃ 또는 17℃에서 시작하여 37℃에서 끝나고, +4℃씩 증가하는 온도 구배를 나타낸다. 각각의 항체의 온도-의존성 친화성 경향이 선으로 연결되어 있다. 온도-의존적 친화성 스크린은 34개의 표시된 항체중에서 단지 하나의 항체(채워진 흑색 다이아몬드 모양)가 찾고자하는 온도-의존적 행동을 나타냄을 보여준다. 이런 항체가 본 발명의 방법으로 선택될 것이다. 3개의 예시적인 친화성 경향이 도 9b에 도시되어 있다. 이 속도 지도에서는 3개의 예시적인 항체의 +4℃씩 증가되는 KD가 도시되어 있고, 이중 하나는 온도가 증가됨에 따라 증가된 친화성을 갖는 항체이고, 하나는 온도가 증가됨에 따라 일정한 친화성을 갖는 항체이고, 하나는 온도가 증가함에 따라 감소된 친화성을 갖는 항체이다. (도 9b에서 사각형으로 표시되는 것들과 같은) 대부분의 항체는 항원 복합체 안정성의 결여로 인해 친화성 손실을 나타낸다. Kon 및 koff가 증가하면 친화성은 일정하게 유지된다(원). 따라서, 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서는 온도가 증가함에 따라 kon 및 koff의 증가를 나타내는 항체가 선택된다. 한 실시양태에서는 더 높은 온도에서 kon은 증가되고, koff는 감소되어, 친화성이 증가되고 복합체가 안정성을 획득한다(채워진 원). 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 17℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 온도가 증가함에 따라 kon이 증가하고, koff가 감소되는 항체가 선택된다. 온도 항정성 항체 항원 상호작용의 높은 처리량 스크리닝이 개시된 높은 처리량 방법의 핵심이다. 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서는 17℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 항원에 대해 증가되거나 일정한 친화성을 갖는 항체가 선택된다. 본 발명에 따른 방법에서는 이들과 같은 항체가 선택된다. 본 발명에 따른 방법의 다른 실시양태에서는, 17℃ 내지 37℃의 온도 범위에서 증가된 친화성을 갖는 항체가 선택된다. 온도-의존적 동역학을 이용하여 개선된 항원 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택한다.
도 9에 도시된 바와 같은 온도-의존적 동역학의 모니터링이 본 발명의 방법을 이용하여 온도-독립적 또는 온도-증가성 항원 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택하기 위한 근거이다.
상기에 이미 약술한 바와 같이, 항체 M 9.10.20 및 M 1F8은 온도-의존성 복합체 안정성을 나타내고, 본 발명에 따른 방법을 이용하여 선택될 것이다. 도 10a에서는 항체의 37℃에서의 친화성(KD)이 25℃에서의 친화성에 대해 플롯팅된다. 이중 단 한가지 항체(8번: 항-PTH 항체 M 1F8)가 온도가 증가함에 따라 친화성이 증가함을 보여준다. 다른 항체의 친화성은 일정하게 유지되거나 감소된다. 도 10b를 살펴보면, 친화성 지수가 개시된 방법의 유일한 항목인 이유가 명확해진다. 도 10b에서는 13개의 항-PTH 항체중 2개(8번: 항-PTH 항체 M 1F8, 및 13번: 항-PTH 항체 M 9.10.20)가 충분한 항원 복합체 안정성을 가짐을 보여준다. 이들 항체는 본 발명에 따른 방법을 이용하여 선택될 것이다. 따라서, 항체 M 9.10.20은 도 10a의 왼쪽 측면의 친화성 플롯의 상관성 밀집지대에 있기 때문에, 단지 친화성 지수에 초점을 맞추어서는 선택되지 않을 것이다.
도 5의 왼쪽에는 항-PTH 항체 M D1.1의 열역학 계산의 예시적인 자료 플롯이 도시되어 있다. 도 5의 오른쪽에는 상응하는 식이 도시되어 있다. 예로서의 항체 M D1.1은 규칙적인 방식으로 작용하고, 이는 모든 선형화의 음의 기울기에 의해 입증된다.
표 2는 항체 M 9.10.20이 높은 결합 엔탈피(△H°= -100 kJ/mol)를 갖는 엔탈피 결합제임을 보여준다. 높은 음의 엔트로피 값(△S°= -180 J/mol·K)은 해리 상에서 일어난다(△S°‡diss = 160 J/K·mol). 항체 M 1F8은 엔트로피 힘(△H°= 53 kJ/mol, △S°= 350 J/mol·K)에 의해 평형쪽으로 구동된다. 온도가 증가함에 따라 항체 M 1F8의 친화성이 증가하기 때문에, 변수 △H°‡diss, △S°‡diss 및 Eadiss는 음의 값으로 변화된다(표 2, 우측 컬럼, 마지막 5개 열 참조). 실제로, 이것이 의미하는 바는 M 1F8/PTH 복합체가 해리되기 위해 동결되어야만 한다는 것이다. 이는 열역학적 예외로 보여질 수 있다. 따라서 해리 상에서 나온 항체 M 1F8의 값은 단지 상응하는 식의 형식적인 정확함을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 2가지 항체가 모두 동일한 자유 결합 엔탈피(△G°= -51 J/mol)를 나타낸다. 평형 상태에서의 높은 엔트로피 변화에도 불구하고, 2가지 항체는 모두 엔탈피 해리 상 및 음의 엔트로피 부담을 나타낸다(M 9.10.20 △S°‡ass = -14 J/K·mol, M 1F8 △S°‡ass = -35 J/K·mol ). 한 실시양태에서, 엔탈피 회합 상 및 음의 엔트로피 부담을 갖는 항체가 선택된다. 두가지 경우 모두에서 항체-항원 상호작용의 속도 제한 단계는 해리 상이다(M 9.10.20 △G°‡diss = 100 kJ/mol, M 1F8 △G°‡diss = 94 kJ/mol). 이들 값은 △G°‡ass의 두 배 이상이고, 항원 복합체 안정성에 따른 동역학 스크리닝 및 선택을 반영한다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 양태에서, 스크리닝 목적은 2.3 이상의 △G°‡diss/△G°‡ass 비를 갖는 항체를 선택하는 것이다. 본 발명의 방법의 한 양태에서는, 80 kJ/mol 이상의 △G°‡diss를 갖거나 속도 제한 해리 상을 갖는 항체가 선택된다.
도 11에서는 반트 호프 식(III)에 따라 계산된 12개의 예시적인 항-PTH 항체의 평형 열역학 변수가 도시되어 있다. 항체 M 1F8(왼쪽) 및 M 9.10.20(오른쪽)은 열역학 평형 변수를 나타내고, 이는 이들 항체가 본 발명에 따른 방법에 따라 선택된 항체가 되게 한다. 도 11에서 예시된 항체 중에서 항체 M 1F8 및 M 9.10.20은 높은 -T△S°값을 갖고 있다. 항체 M 1F8은 가장 높은 양의 엔트로피 기여를 나타내고, 항체 M 9.10.12는 항원 상호작용에 대한 가장 높은 음의 엔트로피 기여를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, a) -80 kJ/mol 이하 또는 b) +40 kJ/mol 이상의 반트 호프 식(III)에 따른 -T△S°값을 갖는 항체가 선택된다. 도 11의 수 2 내지 10을 갖는 항체는 본 발명의 방법에 의해 선택되지 않을 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 엔트로피 기여의 근원이 해명되어야만 한다. 이는 전이 상태 열역학 변수의 계산에 의해 수행된다. 온도-독립적 결합 성질을 갖는 항체를 선택하기 위해서는 시간 분석된 전이 상태 열역학 및 따라서 열역학적 구동력의 근원이 해명되어야만 하는 것으로 발견되었다. 이는 결합 엔트로피 △S°‡ass의 측정에 의해 잠재적 혼합 항원 결합 경향의 위험을 평가하기 위해서 특히 중요하다. 예를 들면, 엔트로피-구동된 결합 평형을 나타냄에도 불구하고, 항체 M 1F8은 엔탈피-구동된 회합 상을 특징으로 한다(도 12 및 표 2 참조). 항체 M 9.10.20 또한 엔탈피-구동된 회합 상을 특징으로 한다(도 12 및 표 2 참조). 이미 개시되고 도 13에 도시된 바와 같이 항체 M 1F8 및 M 9.10.20 둘 모두는 음의 엔트로피 부담 △S°‡ass을 나타낸다. 이 엔트로피 부담은 상응하는 항체가 엔탈피적으로, 즉 매우 특이적 방식으로 항원과 회합함을 의미하는 것으로 밝혀졌다. 엔탈피-구동된 회합 상은 항원과의 비-공유결합적 상호작용, 예를 들면 H-결합, 이온 상호작용, 반 데르 발스 상호작용의 형성을 특징으로 하고, 아미노산 측쇄 이동이나 분자 주위의 수화물 층의 집중적인 재편성에 인한 것은 아니다. 음의 엔트로피 부담은 시스템의 배열 자유도가 감소됨을 보여준다. 항체 결합시, 면역 복합체는 구조적 조절로 인해 또는 물 분자의 규칙적인 재배열로 인해 복합체 형성 이전에 비해 보다 경직된다. 이 특징은 항체의 매우 낮은 교체 반응성 또는 심지어는 교차반응성이 없는데서 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시양태는 교차반응성이 낮거나 없는 엔탈피-구동된 회합 상을 갖는 항체의 선택에 관한 것이다. 결합 평형에 대한 엔트로피 기여가 회합 상으로부터 일어나지 않기 때문에, 이들은 해리 상으로부터 내려온다(도 14 참조). 항체 M 1F8 및 M 9.10.20 둘 모두 항원 해리 상으로부터 기원한 큰 엔트로피 변화 △S°‡diss을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 해리 상으로부터 나온 큰 엔트로피 변화를 갖는 항체가 선택된다. 항체 M 1F8은 열역학적 예외를 나타내고, 음의 엔트로피 변화 -380 J/K·mol의 △S°‡diss를 특징으로 한다. 항체 M 9.10.20은 큰 양의 엔트로피 변화 +160 J/K·mol의 △S°‡diss를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법의 한 실시양태에서는 100 J/K·mol 이상의 절대 △S°‡diss 값을 갖는 항체가 선택된다. 한 실시양태에서는 150 J/K·mol 이상의 절대적 △S°‡diss를 갖는 항체가 선택된다. 한 실시양태에서, 절대적 △S°‡diss 값은 100 J/K·mol 내지 1000 J/K·mol의 범위이다. 음의 결합 엔트로피 △S°‡ass, 엔트로피 부담은 항원 회합 상동안 빠른 복합체 회합 속도 및 낮은 활성화 에너지 Eaass와 관련이 있고, 이는 매우 진화된 성숙한 항체의 전형적인 특징이다([Thorpe, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(21) (2007) 8821-6]). 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 방법에 따라 선택된 항체는 입체구조적 에피토프에 결합하는 항체이다.
따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 서로 다른 종의 동일한 항원중 하나인 서로 다른 항원, 또는 밀접하게 관련된 항원, 예를 들면 IL-1a 및 IL-1b에 대해 교차 반응성을 갖는 항체를 선택하는 것이 또한 가능하다. 또한 예를 들면 촉매적 항체로서 유용한 항원에서 입체구조적 변화를 도입하는 항체를 선택하는 것 또한 가능하다.
본 발명에 따른 항체가 생산될 수 있다. 항체의 재조합 생산 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 원핵세포 및 진핵 세포에서의 단백질 발현 및, 후속적인 항체 단리, 및 일반적으로 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 숙주 세포에서 전술된 바와 같은 항체의 발현을 위해, 각각의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터로 삽입한다. 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예를 들면 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6(R) 세포, 효모 또는 에스케리치아 콜리(E. Coli) 세포에서 발현이 수행되고, 항체가 세포(상층액 또는 용균 후의 세포)로부터 회수된다. 항체의 제조합 생산을 위한 일반적인 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; [Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; [Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160]; [Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 개시되어 있다.
본원에서 이용되는 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 한 실시양태에서, HEK293 세포 및 CHO 세포는 숙주 세포로서 이용된다. 본원에서 이용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 상호교환되어 사용되고, 모든 이런 지칭은 자손들을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포, 및 이동 횟수와는 무관하게 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 모든 자손은 고의적인 또는 우연한 돌연변이로 인해 그의 DNA 내용물이 정확하게 동일하지 않을 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
NS0 세포에서의 발현은 예를 들면 [Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; [Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 개시되어 있다. 일시적 발현은 예를 들면 [Durocher, Y., et al., Nucl. Acids Res. 30 (2002) E9]에 개시되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 [Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; [Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 [Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 개시되어 있다. 일시적 발현 시스템(HEK 293)은 [Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 [Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 보고되어 있다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 개시되어 있다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않고 개시된 방법이 변형될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
마우스의 면역화
8 내지 12주된 Balb/c 마우스를 완전 프롱드 아쥬방트 중의 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌) 융해물로 배합된 인간 재조합 PTH(부갑상선 호르몬) 유도체 100 ㎍을 이용하여 복강내 면역화하였다.
재조합 N-말단 및 C-말단 PTH 단편, 및 전장(1 내지 84) PTH를 항원으로 이용하였다. PTH 유도체를 펩타이드 합성에 의해 합성적으로 제조하였다.
면역화를 4회 수행하였다: 초기 부스팅, 및 초기 부스팅 6주후, 10주후 및 14주후. 2차 및 3차 면역화는 불완전 프롱드 아쥬방트를 이용하여 수행되었다. 하이브리도마 융합이 일어나기 3일 전에 100 ㎍ 항체를 이용하여 정맥내로 최종 부스트를 수행하였다. 하이브리도마 1차 배양액의 생산을 쾰러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)에 따라 수행하였다([Kohler, G., et al., Nature 256(5517) (1975) 495-497]). 하이브리도마를 제한 희석에 의해 96웰 마이크로타이터 플레이트(MTP)에 단리하고, 제조자의 매뉴얼에 따라 ELISA 방법에 의해 항원 결합에 대해 스크리닝하였다. ELISA에서 항원 결합시 양의 색 형성을 나타내는 1차 하이브리도마 세포 배양액을 동역학 스크리닝 과정으로 이동시켰다.
실시예 2
CM5 센서 칩의 제조
소프트웨어 V.1.1의 제어하의 바이아코어(BIAcore) A100 시스템을 다음과 같이 준비하였다: 바이어코어 CM5 센서(시리즈 S)를 시스템에 탑재하고, 제조자의 추천에 따라 유체 역학적으로 접근하였다. 30 ㎍/ml의 폴리클론 토끼 IgG 항체(<IgGFCγM>R, 미국 소재의 잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)의 제품)를 예비 농축 완충액으로서 10mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.5를 이용하여 제조자의 지시에 따라 EDC/NHS 화학을 통해 유동 세포 1, 2, 3 및 4에서 점 1, 2, 4 및 5 상에 10,000 RU로 고정시켰다.
실시예 3
1차 하이브리도마 배양 상층액의 동역학적 스크리닝
실시예 1에 따라 수행된 서로 다른 PTH 면역화 캠패인에서 나온 하이브리도마 배양 상층액을 하기 개시된 바와 같이 처리하였다.
실시예 2에 따라 수득된 센서 칩의 점 2 및 4를 기준(1-2, 5-4)으로 이용하였다. 센서 표면 상의 항체를 포획하기 위하여, 하이브리도마 배양 상층액을 러닝 완충액 HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1　mM EDTA, 0.05　% P20, 바이어코어)로 희석시키고, 1분동안 30 ㎕/분으로 주입하였다. 그런 다음, 각각의 항원을 2분의 회합 시간동안 30 ㎕/분으로 주입하였다. 해리 상을 5분동안 모니터링하였다. 최종적으로, 100 mM 인산을 2분간 주입하여 표면을 재생시켰다.
항체 포획 및 재생의 주기를 반복함으로써 센서를 예비컨디셔닝시켰다. 모노클론 마우스 항체인 mAb<TSH>M-1.20 IgG1k (독일 만하임 소재의 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))를 HBS-EP 중의 50 nM로 30 ㎕/분으로 2분동안 반복적으로 주입하고, 100mM H3PO4를 30 ㎕/분으로 2분동안 주입함으로써 칩을 재생하였다.
1차 하이브리도마의 선택을 위해, 다음 과정을 이용하였다: 최근 결합 (BL) 기준점을 항원 주입이 끝나기 직전에 설정하였다. 최근 안정성 (SL) 기준점을 복합체 해리 상의 종결 직전에 설정하였다. BL 및 SL 자료를 그래프로 시각화시켰다(도 1). 하기 수학식 I을 이용하여 항원 복합체 안정성을 계산하는데 자료를 이용하였다(도 2 참조):
수학식 I
항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
예를 들면 원 내부의 자료 점은 충분한 항원 반응 신호 및 100% 복합체 안정성을 보여주지만, 사각형 내부의 자료 점은 충분한 항원 반응을 나타내지 않는다.
따라서, 항원 반응 신호 및 복합체 안정성에 따라 상위 10%의 하이브리도마가 선택되었다.
실시예 4
하이브리도마 클로닝 및 항체 생성
실시예 3에서 선택된 항-PTH 항체 생성 하이브리도마 1차 배양액을 제어 소프트웨어 V4.1.2 하에서 세포 분류기 팩사리아(FACSaria)(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 서브클로닝하였다. 맡겨진 단일 클론을 24웰 플레이트에서의 추가의 증식에 적합한 조건 하에서 배양하고, 후속적으로 제조자의 지시에 따른 ELISA 방법을 이용하여 용액 중의 항체 농도를 결정한 후에 실시예 5에 따라 열역학 스크리닝 과정으로 이동시켰다.
실시예 5
2차 하이브리도마 배양 상층액의 열역학 스크리닝
높은 항체-항원-복합체 안정성을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포가 확인되는 역학적 스크리닝 후에, 항원-항원 복합체 열안정성을 측정하기 위해 그리고 열역학적 성질을 계산하기 위해, 온도-의존성 열역학의 측정을 이용한 열역학 스크리닝에 의해 분비된 항체를 추가로 특성화하였다.
CM 5 센서 시리즈 S를 제어 소프트웨어 V1.1.1 하에서 구동되는 바이어코어 T100 시스템에 탑재하고, 0.1% SDS, 50 mM NaOH, 10 mM HCl 및 100 mM H3PO4를 포함하는 혼합물 100 ㎕/분을 1분동안 주입함으로써 예비 컨디셔닝하였다.
설치류 기원의 항체를 스크리닝하는 경우, 예비-농축 완충액으로서 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.5를 이용하여 제조자의 지시에 따라 ECD/NHS 화학을 이용하여 유동 세포 1, 2, 3, 4 상에 30 ㎍/ml의 폴리클론 토끼 항-설치류-IgG 항체(<IgGFCγM>R, 미국 소재의 잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈 인코포레이티드)를 6,000 RU로 고정시켰다. 최종적으로, 센서 표면을 에탄올아민으로 블록킹하였다.
시스템의 포획능을 측정하기 위해서, 기준 항체로서 모노클론 설치류 항-TSH 항체 1.20 (IgG1k, 마우스)를 상기 준비된 포획 시스템 상에서 서로 다른 농도로 온도-의존적 적정하였다(도 3 참고).
Figure 112011013851475-pct00003
서로 다른 온도에서 유사한 2차 항체 반응 수준을 달성하기 위해서, 모노클론 설치류 항-TSH 항체 1.20의 이들 농도 값을 하이브리도마 배양액에서 나온 항체 포획을 계산하기 위한 기준으로 이용하였다.
서로 다른 온도에서의 동역학 측정을 20 ㎕/분에서 수행하였고, 유속은 각각 30 ㎕/분, 50 ㎕/분, 100 ㎕/분이다. 재조합 합성 전장 PTH 1 내지 84 (9.4 kDa)의 시료를 각각 30초, 90초, 180초동안 주입하거나, 리간드 포화를 달성하거나, 복합체 회합 상동안 결합 평형으로 들어가기에 적합한 다른 주입 시간동안 주입하였다(도 4a 참조). 해리 속도를 먼저 300초 까지 모니터링한 후 추가 15분동안 모니터링하였다(도 4b 참조). 5가지 이상의 농도의 서로 다른 농도 단계에서 PTH 주입을 반복하였다. 대조군으로서, 분석법의 재현성을 조절하기 위해 하나의 농축 단계를 2회 분석하였다. 유동 세포 1을 기준으로 이용하였다. 완충액 신호 공제에 의해 자료를 이중 참조하기 위해서 항원 주입 대신 완충액 주입을 이용하였다. 100 mM H3PO4을 100 ㎕/분으로 2분동안 주입함으로써 포획 시스템을 재생시켰다. 또한 13℃, 17℃ 및 21℃에서 정량적 표면 재생을 보증하기 위해 재생 과정을 최적화시켰다. 이들 온도에서, 재생 용액을 3회 주입하였고, 25℃, 29℃, 33℃ 및 37℃에서는 재생 용액을 1회 주입하엿다.
서로 다른 온도에서 회합 속도 상수 ka[1/Ms], 해리속도 상수 kd[1/s] 및 결과적인 친화성 상수 KD[M]를 계산하기 위해서, 수득된 자료를 1:1 2원 랭뮤어 상호작용 모델에 따라 평가하였다. 반트 호프 식의 선형 형태에 따라 열역학적 평형 자료를 계산하였다. 예를 들면 바이어코어 T100 평가 소프트웨어 V.1.1.1 또는 프로그램 오리진(Origin) 7sri v. 7.0300을 이용한 아이링과 아레니우스 식에 따라 전이 상태 열역학을 계산하였다.
실시예 6
균일 R MAX 값 조절 필요성에 대한 실시예
바이어코어 T100 장치를 CM5 시리즈-S 바이어코어 센서와 함께 탑재하고, 제조자의 지시에 따라 각각의 유동 세포 상에 6000 RU <IgGFCyM>R (미국 소재의 잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리스 인코포레이티드)를 고정시켰다. 비-최적화된 실험은 HBS-EP 완충액(0.05% P20) 중의 20 ㎕/분에서 40 nM의 포획 항체를 이용하였다. 시료 완충액은 1 mg/ml의 CMD로 보충된 시스템 완충액이었다.
1.2nM, 4nM, 11nM, 33nM, 100nM 및 300 nM의 6가지 농도 단계에서 2차 항체를 포획한 후 항원을 주입하였고, 11nM을 이중 대조군으로 이용하였고, 0nM을 참조로서 이용하였다. 100 ㎕/분에서 2분의 회합 및 5분의 해리동안 항원을 주입한 후, 30 ㎕/분에서 15분동안 HBS-EP 세척하고, 3 ㎕/분에서 3분동안 10 mM 글라이신 pH 1.7을 이용하여 재생하였다. 4℃, 11℃, 18℃, 25℃, 32℃ 및 40℃에서 농도-의존적 측정을 수행하였다.
최적화된 시스템을 상기 개시된 바와 같이 이용하지만, 단 포획되는 항체를 15℃에서 100 nM, 20℃에서 80 nM, 25℃에서 60 nM, 30℃에서 50nM, 35℃에서 40 nM 및 40℃에서 40 nM의 서로 다른 농도 단계에서 3분의 회합 시간동안 주입하였다.
바이어코어 평가 소프트웨어를 이용하여 최종적으로 동역학 및 열역학을 측정하였다.

Claims (30)

  1. - 항원의 분자량에 근거하여 표면 플라스몬 공명 측정에서의 신호 반응을 최적화시키고, 이에 의해 Rmax 값이 측정 온도 범위에서 일정하게 유지되는 단계;
    - 표면 플라스몬 공명 측정에 근거하여 하기 수학식 I에 따른 항원-복합체-안정성의 계산을 포함한 동역학 스크리닝 단계를 수행하는 단계;
    - 95% 초과의 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택하는 단계;
    - 17℃, 21℃, 25℃, 29℃, 33℃ 및 37℃에서의 표면 플라스몬 공명에 의해 온도-의존적 동역학 자료를 측정하는 단계;
    - 하기 수학식 II 내지 XIII에 근거하여 전이 상태 열역학 성질을 계산하는 단계;
    - 항원 복합체 회합 속도 상수 ka [1/Ms]의 온도-의존적 증가 및 유지되거나 감소되는 항원 복합체 해리 속도 상수 kd [1/s]에 근거하여 항체를 선택하는 단계
    를 포함하는, 다수의 항체로부터 항체를 선택하는 방법:
    수학식 I
    항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
    [상기 식에서,
    BL은 항원의 주입 종말 직전에 설정된 최근 결합 기준점을 나타내고,
    SL은 복합체 해리 상의 종말 직전에 설정된 최근 안정성 기준점을 나타낸다.]
    수학식 II
    △G°= △H°- T*△S°
    수학식 III
    △G°= - R*T*lnKD
    수학식 IV
    lnKD = -1/T*(△H°/R)/기울기 - (△S°/R)/절편
    수학식 V
    R*T*lnKD = △H°T0 - T*△S°T0 + △C°p(T-T0) - T*△Cp°ln(T/T0)
    수학식 VI
    ka = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 VII
    lnka/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡*R + lnkb/h)/절편
    수학식 VIII
    ka = A*e-Ea/R*T
    수학식 IX
    lnka = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
    수학식 X
    kd = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 XI
    lnkd/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡/R + lnkB/h)/절편
    수학식 XII
    kd = A*e-Ea/R*T
    수학식 XIII
    lnkd = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
  2. 제 1 항에 있어서,
    - 열역학적 성질이 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 10 J/K·mol 미만의 결합 엔트로피 △S°‡ass이거나,
    - 음의 해리 활성화 에너지(Eaddis [kJ/mol]), 음의 해리 엔탈피 (△H°‡diss [kJ/mol]), 및 큰 음의 해리 엔트로피(△S°‡diss [kJ/mol])를 나타내는 해리 상을 갖는 항체를 선택하거나,
    - 열역학적 성질이 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 10 J/K·mol 미만의 결합 엔트로피 △S°‡ass이고; 음의 해리 활성화 에너지(Eaddis [kJ/mol]), 음의 해리 엔탈피 (△H°‡diss [kJ/mol]), 및 큰 음의 해리 엔트로피(△S°‡diss [kJ/mol])를 나타내는 해리 상을 갖는 항체를 선택함을
    특징으로 하는 방법.
  3. 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass)를 갖는 항체를 선택하는 것에 의한, 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    a) 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피 (△S°‡ass),
    b) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 해리 결합 엔트로피 (△S°‡diss), 및
    c) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 결합 엔트로피(△S°)
    중 둘 이상을 갖는 항체를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    표준 회합 결합 엔트로피 (△S°‡ass)가 5 J/K·mol 미만임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    표준 회합 결합 엔트로피 (△S°‡ass)가 0 J/K·mol 미만임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    절대 표준 해리 결합 엔트로피 (△S°‡diss)가 125 J/mol·K 이상임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    절대 표준 해리 결합 엔트로피 (△S°‡diss)가 150 J/mol·K 이상임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서,
    절대 표준 결합 엔트로피(△S°)가 125 J/mol·K 이상임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    절대 표준 결합 엔트로피(△S°)가 150 J/mol·K 이상임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 3 항에 있어서,
    -50 kJ/mol 이하의 자유 표준 결합 엔탈피(△G°)를 갖는 항체를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 3 항에 있어서,
    표준 회합 자유 결합 엔탈피 (△G°‡ass)에 대한 표준 해리 자유 결합 엔탈피 (△G°‡diss)의 비가 2.3 초과인 항체를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 3 항에 있어서,
    a) -80 kJ/mol 이하 또는 b) +40 kJ/mol 이상의 -T△S°값을 갖는 항체를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  14. 동일한 자릿수(order of magnitude)로 유지되거나 또는 온도 증가에 따라 2개 자릿수(two orders of magnitude)까지 감소되는 해리 속도 상수 kd (1/s)를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법.
  15. 온도가 증가함에 따라 감소되거나 일정하게 유지되는 평형 결합 상수 KD(M)를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법.
  16. 제 3 항, 제 14 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    온도가 13℃ 내지 37℃의 범위임을 특징으로 하는 방법.
  17. i) 온도-의존성 동역학 자료를 측정하는 단계,
    ii) 전이 상태(TS) 열역학 성질을 계산하는 단계, 및
    iii) 열역학 행동에 근거하여 항체를 선택하는 단계
    를 포함하는, 다수의 항체로부터 온도-독립적 항원 결합 항체를 선택하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    열역학 행동이 항원 복합체 회합 속도 상수 ka [1/Ms]의 온도-의존적 증가 및 유지되거나 감소되는 항원 복합체 해리 속도 상수 kd [1/s]임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    열역학 행동이 엔탈피-구동된 △H°‡ass 항원 복합체 회합 상 및 10 J/K·mol 미만의 결합 엔트로피 △S°‡ass임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    음의 해리 활성화 에너지(Eadiss [kJ/mol]), 음의 해리 엔탈피(△H°‡diss [kJ/mol]), 및 큰 음의 해리 엔트로피(△S°‡diss [kJ/mol])를 나타내는 해리 상을 갖는 항체를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 3 항 또는 제 17 항에 있어서,
    온도-의존적 동역학 자료의 측정이 표면 플라스몬 공명에 의해 수행되고, 동역학 스크리닝 단계 및 열역학 스크리닝 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    동역학 스크리닝 단계가 표면 플라스몬 공명 측정에 근거하여 하기 수학식 I에 따른 항원-복합체-안정성의 계산을 포함하는 방법:
    수학식 I
    항원-복합체-안정성 = (1-[BL (RU) - SL (RU) / BL (RU)])
    [상기 식에서,
    BL은 항원의 주입 종말 직전에 설정된 최근 결합 기준점을 나타내고,
    SL은 복합체 해리 상의 종말 직전에 설정된 최근 안정성 기준점을 나타낸다.]
  23. 제 21 항에 있어서,
    항원의 분자량에 근거하여 표면 플라스몬 공명 측정에서 신호 반응을 최적화시키는 단계를 포함하고, 이에 의해 Rmax가 측정 온도 범위에서 일정하게 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서,
    표면 플라스몬 공명에 의한 측정이
    a) 고형 지지체 표면에 결합된 포획 분자에 의해 고형 지지체 표면 상에 항체를 고정시키는 단계;
    b) 항원을 포함하는 용액을 제공하는 단계,
    c) 항원의 고정된 항체로의 회합이 허용되도록 상기 고형 지지체 표면 상에 공지된 농도의 항원을 함유하는 용액을 유동시키는 단계,
    d) 항원의 고정된 항체로부터 해리가 허용되도록 고형 지지체 표면 상에 항원이 없는 용액을 유동시키는 단계,
    e) 단계 c) 및 d) 동안 고형 지지체 표면에 결합된 항원의 시간 의존적 양을 모니터링하고, 결합 자료를 수집하되, 서로 다른 농도의 항원을 이용하여 단계 c) 및 d)를 1회 이상 반복하는 단계, 및
    f) 단계 e)에서 수득된 결합 자료를 하기 수학식 II 내지 수학식 XIII에 근거한 항원과 고정된 항체 사이의 상호작용에 대한 예정된 모델에 부합시킴으로써 동역학, 열역학 변수 또는 이들 모두를 계산하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
    수학식 II
    △G°= △H°- T*△S°
    수학식 III
    △G°= - R*T*lnKD
    수학식 IV
    lnKD = -1/T*(△H°/R)/기울기 - (△S°/R)/절편
    수학식 V
    R*T*lnKD = △H°T0 - T*△S°T0 + △C°p(T-T0) - T*△Cp°ln(T/T0)
    수학식 VI
    ka = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 VII
    lnka/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡*R + lnkb/h)/절편
    수학식 VIII
    ka = A*e-Ea/R*T
    수학식 IX
    lnka = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
    수학식 X
    kd = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 XI
    lnkd/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡/R + lnkB/h)/절편
    수학식 XII
    kd = A*e-Ea/R*T
    수학식 XIII
    lnkd = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
  25. 제 24 항에 있어서,
    항체의 고정화가 종 특이적 항체 포획 분자에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 17 항에 있어서,
    95% 초과의 복합체 안정성을 갖는 항체를 선택함으로써 동역학 스크리닝이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21 항에 있어서,
    항원 신호 반응이 항원의 분자량에 근거하여 최적화됨을 특징으로 하는 방법.
  28. a) 각각이 항체를 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계,
    b) 서로 다른 온도 및 서로 다른 항체 농도에서 표면 플라스몬 공명에 의해 각각의 항원에 결합된 항체의 시간 의존적 양을 측정하는 단계,
    c) 하기 수학식 II 내지 XIII에 근거하여 측정된 시간 의존적 양을 이용하여 (i) 표준 회합 결합 엔트로피(△S°‡ass), (ii) 표준 해리 결합 엔트로피(△S°‡diss), (iii) 표준 결합 엔트로피(△S°), (iv) 자유 표준 결합 엔탈피(△G°), (v) 표준 해리 자유 결합 엔탈피(△G°‡diss), (vi) 표준 회합 자유 결합 엔탈피(△G°‡ass), (vii) -T△S°, (viii) 해리 속도 상수 kd, (ix) 평형 결합 상수 KD, 및 (x) 회합 속도 상수 ka 중 하나 이상의 열역학 변수를 계산하는 단계;
    d) i) 10 J/K·mol 미만의 표준 회합 결합 엔트로피, ii) 100 J/mol*K 이상의 절대 표준 해리 결합 엔트로피, iii) 100 J/mol·K 이상의 절대 표준 결합 엔트로피중 둘 이상을 갖는 항체를 생성하는 세포를 선택하는 단계;
    e) 상기 선택된 세포를 배양하고, 세포, 배양 배지, 또는 세포 및 배양 배지 모두로부터 상기 항체를 회수함으로써 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는, 항체의 제조 방법:
    수학식 II
    △G°= △H°- T*△S°
    수학식 III
    △G°= - R*T*lnKD
    수학식 IV
    lnKD = -1/T*(△H°/R)/기울기 - (△S°/R)/절편
    수학식 V
    R*T*lnKD = △H°T0 - T*△S°T0 + △C°p(T-T0) - T*△Cp°ln(T/T0)
    수학식 VI
    ka = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 VII
    lnka/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡*R + lnkb/h)/절편
    수학식 VIII
    ka = A*e-Ea/R*T
    수학식 IX
    lnka = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
    수학식 X
    kd = (kb*T/h)*e(-△G°‡/R*T)
    수학식 XI
    lnkd/T = -1/T*(△H°‡/R)/기울기 + (△S°‡/R + lnkB/h)/절편
    수학식 XII
    kd = A*e-Ea/R*T
    수학식 XIII
    lnkd = lnA/절편 - (1/T*Ea/R)/기울기
  29. 제 28 항에 있어서,
    - 단계 a) 이후 및 단계 b) 이전에, a1) 단계 a)의 세포를 배양하고, 상기 세포에 의해 발현되는 항체를 함유하는 배양 상층액을 제공하는 단계,
    - 단계 d) 이후 및 단계 e) 이전에: d1) 상기 선택된 세포로부터 상기 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 단리된 핵산에 근거하여 상기 항체의 키메릭, CDR-그래프팅되거나, T-세포 에피토프 결실되거나 인간화된 변이체를 암호화하는 추가의 핵산을 제공하고, 발현 카세트에 개질된 핵산을 함유하는 발현 플라스미드를 제공하고, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 또는 PER.C6 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질감염시키는 단계
    중 하나 또는 둘 모두의 추가 단계를 포함하는 방법.
  30. 삭제
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