JP2012500979A - 高親和性抗体をスクリーニングするための方法 - Google Patents
高親和性抗体をスクリーニングするための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
発明の背景
発明の概要
− 抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答の最適化(それによりRmaxを測定の温度範囲において一定に保つ)、
− 動態スクリーニング工程の実施(式(I)
(I)抗原−複合体−安定性=(1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)])
(抗原注入の終了直前に設定されたBinding Late参照ポイントを表わすBL、複合体解離段階の終了直前に設定されたStability Late参照ポイントを表わすSLを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく)の抗原−複合体−安定性の計算を含む)、
− 95%超の複合体の安定性を有する抗体の選択、
− 17℃、21℃、25℃、29℃、33℃、及び37℃での表面プラズモン共鳴による温度依存的な動態データの測定、
− 遷移状態の熱力学的特性の計算、
− 抗原複合体の会合速度定数ka[1/Ms]の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数kd[1/s]に基づく抗体の選択
の工程を含む。
− 表面プラズモン共鳴の測定及び抗体濃度107nMでは17℃、78nMでは21℃、70nMでは25℃、64nMでは29℃、58nMでは33℃、及び53nMでは37℃で実施された熱力学的スクリーニングを用いた前記抗体の熱力学的特性の計算に基づく温度依存的な動態データを作成すること、及び/又は
− 熱力学的特性が、エンタルピー促進性のΔH°‡ass抗原複合体の会合段階及び10J/K*mol未満の結合エントロピーΔS°‡assであること、及び/又は
− 負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー(Eadiss[kJ/mol])、負の解離エンタルピー(ΔH°‡diss[kJ/mol])、及び大きな負の解離エントロピー(ΔS°‡diss[kJ/mol])を示す解離段階を用いて抗体を選択することである。
a)複数の細胞、好ましくはハイブリドーマ細胞又はB細胞(各々が抗体を発現する)の準備、
b)異なる温度及び異なる抗体濃度で表面プラズモン共鳴によりそれぞれの抗原に結合した前記抗体の時間依存的な量の測定、
c)式(II)〜(XIII)に基づいてb)で測定された時間依存的な量を用いた計算
(II)ΔG° = ΔH° − T*ΔS°
(III)ΔG° = − R*T*lnKD
(IV)lnKD = −1/T * (ΔH°/R)/傾き − (ΔS°/R)/切片
(V)R*T*lnKD = ΔH°T0 − T*ΔS°T0+ΔC°p(T−T0)−T*ΔCp° ln(T/T0)
(VI)ka = (kb *T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(VII)lnka/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡*R + lnkb/h)/切片
(VIII)ka = A*e−Ea/R*T
(IX)lnka = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
(X)kd = (kb *T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(XI)lnkd/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡/R + lnkB/h)/切片
(XII)kd = A*e−Ea/R*T
(XIII)lnkd = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
少なくとも熱力学的パラメーター
(i)標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)、
(ii)標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)、
(iii)標準結合エントロピー(ΔS°)、
(iv)自由標準結合エンタルピー(ΔG°)、
(v)標準解離自由結合エンタルピー(ΔG°‡diss)、
(vi)標準会合自由結合エンタルピー(ΔG°‡ass)、
(vii)−TΔS°、
(viii)解離速度定数kd、
(ix)平衡結合定数KD、及び
(x)会合速度定数ka、
d)以下の少なくとも2つを用いた抗体を産生する細胞の選択:
i)10J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー、
ii)100J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー、
iii)100J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー、
e)前記抗体の発現に適した条件下で前記の選択された細胞を培養し、細胞又は/及び培養培地から前記抗体を回収することによる抗体の製造
を含む抗体を産生するための方法である。
− a)の後及びb)の前:a1)a)の細胞を培養し、前記細胞により発現される抗体を各々が含む培養上清を準備すること、
− 工程d)の後及び工程e)の前:d1)前記の選択された細胞から前記抗体をコードする核酸を単離し、前記の単離核酸に基づき、前記抗体のキメラ、CDR移植、T細胞エピトープ欠乏及び/又はヒト化変異体をコードするさらなる核酸を準備し、発現カセット中に前記の改変核酸を含む発現プラスミドを準備し、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、又はPER.C6細胞に前記の発現プラスミドをトランスフェクトすること
の追加工程の1つ又は両方を含む。
a)10J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)、
b)100J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)、
c)100J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー(ΔS°)
の少なくとも2つに基づいて選択される。
a)−80kJ/mol以下、又は
b)+40kJ/mol以上
の−TΔS°値に基づいて選択されることを特徴とする。
i)温度依存的な動態データの測定、
ii)遷移状態(TS)の熱力学的特性の計算、及び
iii)熱力学的挙動に基づく抗体の選択
の工程を含む。
(I)抗原−複合体−安定性=(1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)])
(抗原注入の終了直前に設定されたBinding Late参照ポイントを表わすBL、複合体解離段階の終了直前に設定されたStability Late参照ポイントを表わすSLを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく)の抗原−複合体−安定性の計算を含む。さらなる実施態様において、本方法は、抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化する工程を含み、それによりRmaxは、測定の温度範囲において一定に保たれる。
a)固体支持体表面に結合された捕捉分子による前記固体支持体表面上での抗体の固定化、
b)抗原を含む溶液の準備、
c)固定化抗体への抗原の会合を可能にするための、固体支持体表面上に既知濃度の抗原を含む溶液の流入、
d)固定化抗体からの抗原の解離を可能にするための、固体支持体表面上に抗原を含まない溶液の流入、
e)工程c)及びd)の間での、固体支持体表面に結合された抗原の時間依存的な量のモニタリング及び結合データの収集(それにおいて工程c)及びd)を異なる濃度の抗原で少なくとも1回繰り返す)、及び
f)式(II)〜(XIII)に基づく、抗原と固定化抗体の間での相互作用についての所定のモデルに、e)で得られた結合データを適合することによる動態学的及び/又は熱力学的パラメーターの計算
を含むことを特徴とする。
本発明は、抗原に対する抗体結合の選択のための方法を報告し、その温度依存的な動態データは、遷移状態(TS)の熱力学的特性を計算するために作成され、抗体は、熱力学的挙動に基づいて選択されることを特徴とする。
− ハイスループットプロセッシングが可能である、
− 低いサンプル消費、
− 結合力の代わりに親和性の測定、及び
− 粗細胞上清又は複合体培養混合物の使用
を有することが見出されている。
− 自由標準結合エンタルピー ΔG°、
− 標準結合エンタルピー ΔH°、
− 標準結合エントロピー ΔS°、
及び以下の遷移状態パラメーター
− 自由標準会合エンタルピーΔG°‡ass、
− 標準会合エンタルピーΔH°‡ass、
− 標準会合エントロピーΔS°‡ass、
− 活性化エネルギーEaass、
− 自由標準解離エネルギーΔG°‡diss、
− 標準解離エンタルピーΔH°‡diss、
− 標準解離エントロピーΔS°‡diss、及び
− 解離エネルギーEadissの計算が可能である。非線形のファントホッフ式を使用する場合において、ΔCp値を決定する。
抗原−複合体−安定性=(1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)])(I)
に従って計算することができる。
a)ファントホッフ計算:
(II)ΔG° = ΔH° − T*ΔS°
(III)ΔG° = − R*T*lnKD
(IV)lnKD = −1/T * (ΔH°/R)/傾き − (ΔS°/R)/切片
(V)R*T*lnKD = ΔH°T0 − T*ΔS°T0+ΔC°p(T−T0)−T*ΔCp° ln(T/T0)
b)アイリング会合段階:
(VI)ka = (kb*T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(VII)lnka/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡*R + lnkb/h)/切片
(VIII)ka = A*e−Ea/R*T
(IX)lnka = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
c)アイリング解離段階:
(X)kd = (kb *T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(XI)lnkd/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡/R + lnkB/h)/切片
(XII)kd = A*e−Ea/R*T
(XIII)lnkd = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
ΔH° − 標準結合エンタルピー、
ΔS° − 標準結合エントロピー、
ΔG° − 自由標準結合エンタルピー、
T*ΔS° − エントロピー時間、
ΔH°‡ass − 標準会合結合エンタルピー、
ΔS°‡ass − 標準会合結合エントロピー、
ΔG°‡ass − 標準会合自由結合エンタルピー、
Ea ass − 会合についてのアレニウスパラメーター、
ΔH°‡diss − 標準解離結合エンタルピー、
ΔS°‡diss − 標準解離結合エントロピー、
ΔG°‡diss − 標準解離自由結合エンタルピー、
Eadiss − 解離についてのアレニウスパラメーター、
kD − 親和性定数、
ka − 会合速度定数、
kb − ボルツマン定数=(1.3806503 × 10−23m2kgs-2K-1)、
kd − 解離速度定数、
h − プランク定数、
Cp− モル熱容量
の式が使用されている。
マウスの免疫化
CM5センサーチップの調製
初代ハイブリドーマ培養上清の動態スクリーニング
(I) (1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)]
(図2を参照のこと)を使用して抗原複合体の安定性を計算した。例えば、丸で囲んだデータスポットが、十分な抗原応答シグナル及び100%複合体の安定性を示すのに対し、フレームで囲んだデータスポットは十分な抗原応答を示さない。
ハイブリドーマクローニング及び抗体産生
二次ハイブリドーマ培養上清の熱力学的スクリーニング
均一なRMAX値を調整する必要性についての例
Claims (30)
- 複数の抗体からの抗体の選択のための方法であって、該方法が:
− 抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化すること、それによりRmax値を測定の温度範囲において一定に保つ、
− 式(I)
(I)抗原−複合体−安定性=(1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)])
(抗原注入の終了直前に設定されたBinding Late参照ポイントを表わすBL、複合体解離段階の終了直前に設定されたStability Late参照ポイントを表わすSLを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく)の抗原−複合体−安定性の計算を含む動態スクリーニング工程を実施すること、
− 95%超の複合体の安定性を有する抗体を選択すること、
− 17℃、21℃、25℃、29℃、33℃、及び37℃での表面プラズモン共鳴による温度依存的な動態データを測定すること、
− 式(II)〜(XIII)に基づく、遷移状態の熱力学的特性を計算すること、
− 抗原複合体の会合速度定数ka[1/Ms]の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数kd[1/s]に基づき抗体を選択すること
の工程を含む、方法。 - 請求項1記載の方法であって、
− 熱力学的特性が、エンタルピー促進性のΔH°‡ass抗原複合体の会合段階及び10J/K*mol未満の結合エントロピーΔS°‡assである、及び/又は
− 抗体が、負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー(Eadiss[kJ/mol])、負の解離エンタルピー(ΔH°‡diss[kJ/mol])、及び大きな負の解離エントロピー(ΔS°‡diss[kJ/mol])を示す解離段階に基づいて選択されること
を特徴とする、方法。 - 複数の抗体、例えば、治療処置のための抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、それにより抗体が、10J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)に基づいて選択される方法。
- 抗体が以下
a)10J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)、
b)100J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)、
c)100J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー(ΔS°)
の少なくとも2つに基づいて選択されることを特徴とする、請求項3記載の方法。 - 標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)が、5J/K*mol未満であることを特徴とする、請求項3又は4のいずれか一項記載の方法。
- 標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)が、0J/K*mol未満であることを特徴とする、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
- 絶対標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)が、125J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項3〜6のいずれか一項記載の方法。
- 絶対標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)が、150J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。
- 絶対標準結合エントロピー(ΔS°)が、125J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項3〜8のいずれか一項記載の方法。
- 絶対標準結合エントロピー(ΔS°)が、150J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項3〜9のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が、−50kJ/mol以下の自由標準結合エンタルピー(ΔG°)に基づいて選択されることを特徴とする、請求項3〜10のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が、2.3を上回る標準解離自由結合エンタルピー(ΔG°‡diss)と標準会合自由結合エンタルピー(ΔG°‡ass)の比率に基づいて選択されることを特徴とする、請求項3〜11のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が、
a)−80kJ/mol以下、又は
b)+40kJ/mol以上
の−TΔS°値に基づいて選択されることを特徴とする、請求項3〜12のいずれか一項記載の方法。 - 同じ桁で一定、又は、温度増加に伴い2桁まで減少する解離速度定数kd(1/s)に基づいて抗体を選択する工程を含む、複数の抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法。
- 温度増加に伴い一定又は減少する平衡結合定数KD(M)に基づいて抗体を選択する工程を含む、複数の抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法。
- 温度が13〜37℃の範囲であることを特徴とする、請求項3〜15のいずれか一項記載の方法。
- 複数の抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、以下の工程:
i)温度依存的な動態データを測定すること、
ii)遷移状態(TS)の熱力学的特性を計算すること、及び
iii)熱力学的挙動に基づく抗体を選択すること
を含む、方法。 - 熱力学的挙動が、抗原複合体の会合速度定数ka[1/Ms]の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数kd[1/s]であることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 熱力学的挙動が、エンタルピー促進性のΔH°‡ass抗原複合体の会合段階及び10J/K*mol未満の結合エンタルピーΔS°‡assであることを特徴とする、請求項17又は18のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が、負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー(Eadiss[kJ/mol])、負の解離エンタルピー(ΔH°‡diss[kJ/mol])、及び大きな負の解離エントロピー(ΔS°‡diss[kJ/mol])を示す解離段階に基づいて選択されることを特徴とする、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
- 温度依存的な動態データの測定が、表面プラズモン共鳴により行われ、動態スクリーニング工程及び熱力学的スクリーニング工程を含むことを特徴とする、請求項3〜20のいずれか一項記載の方法。
- 動態スクリーニング工程が、式(I)
(I)抗原−複合体−安定性=(1−[BL(RU)−SL(RU)/BL(RU)])
(抗原注入の終了直前に設定されたBinding Late参照ポイントを表わすBL、複合体解離段階の終了直前に設定されたStability Late参照ポイントを表わすSLを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく)の抗原−複合体−安定性の計算を含むことを特徴とする、請求項21記載の方法。 - 方法が、抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化する工程を含み、それによりRmaxは、測定の温度範囲において一定に保たれることを特徴とする、請求項21又は22のいずれか一項記載の方法。
- 表面プラズモン共鳴による測定が、以下の工程:
a)固体支持体表面に結合された捕捉分子によって前記固体支持体表面上での抗体を固定化すること、
b)抗原を含む溶液を準備すること、
c)固定化抗体に対する抗原の会合を可能にするために、前記固体支持体表面上に既知濃度の抗原を含む溶液を流入させること、
d)固定化抗体からの抗原の解離を可能にするための、固体支持体表面上に抗原を含まない溶液を流入させること、
e)工程c)及びd)の間での、固体支持体表面に結合された抗原の時間依存的な量をモニタリングすること及び結合データを収集すること、ここで、工程c)及びd)を異なる濃度の抗原で少なくとも1回繰り返す、及び
f)式(II)〜(XIII)に基づき、抗原と固定化抗体の間での相互作用についての所定のモデルに、e)で得られた結合データを適合することによる動態学的及び/又は熱力学的パラメーターを計算すること
を含むことを特徴とする、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。 - 抗体の固定化が、種特異的な抗体捕捉分子によることを特徴とする、請求項24記載の方法。
- 動態スクリーニングが、95%を上回る複合体の安定性を有する抗体を選択することにより実施されることを特徴とする、請求項17〜25のいずれか一項記載の方法。
- 抗原シグナル応答が、抗原の分子量に基づき最適化されることを特徴とする、請求項21〜26のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程:
a)各々が抗体を発現する複数の細胞を準備すること、
b)異なる温度及び異なる抗体濃度で表面プラズモン共鳴によりそれぞれの抗原に結合した前記抗体の時間依存的な量を測定すること、
c)式(II)〜(XIII)に基づいてb)で測定された時間依存的な量を用いて計算すること
(II)ΔG° = ΔH° − T*ΔS°
(III)ΔG° = − R*T*lnKD(IV)lnKD = −1/T * (ΔH°/R)/傾き − (ΔS°/R)/切片
(V)R*T*lnKD = ΔH°T0 − T*ΔS°T0+ΔC°p(T−T0)−T*ΔCp° ln(T/T0)
(VI)ka = (kb *T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(VII)lnka/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡*R + lnkb/h)/切片
(VIII)ka = A*e−Ea/R*T
(IX)lnka = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
(X)kd = (kb *T/h)*e(−ΔG°‡/R*T)
(XI)lnkd/T = −1/T * (ΔH°‡/R)/傾き + (ΔS°‡/R + lnkB/h)/切片
(XII)kd = A*e−Ea/R*T
(XIII)lnkd = lnA/切片 − (1/T*Ea/R)/傾き
少なくとも熱力学的パラメーター
(i)標準会合結合エントロピー(ΔS°‡ass)、
(ii)標準解離結合エントロピー(ΔS°‡diss)、
(iii)標準結合エントロピー(ΔS°)、
(iv)自由標準結合エンタルピー(ΔG°)、
(v)標準解離自由結合エンタルピー(ΔG°‡diss)、
(vi)標準会合自由結合エンタルピー(ΔG°‡ass)、
(vii)−TΔS°、
(viii)解離速度定数kd、
(ix)平衡結合定数KD、及び
(x)会合速度定数ka
d)以下の少なくとも2つを用いた抗体を産生する細胞を選択すること
i)10J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー、
ii)100J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー、
iii)100J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー、
e)前記抗体の発現に適した条件下で選択された細胞を培養し、細胞又は/及び培養培地から前記抗体を回収することにより抗体を産生すること
を含む、抗体を製造するための方法。 - 以下:
− a)の後及びb)の前:a1)a)の細胞を培養し、前記細胞により発現される抗体を各々が含む培養上清を準備すること、
− 工程d)の後及び工程e)の前:d1)前記選択された細胞から前記抗体をコードする酸を単離し、前記単離核酸に基づき、前記抗体のキメラ、CDR移植、T細胞エピトープ欠乏及び/又はヒト化変異体をコードするさらなる核酸を準備し、発現カセット中に前記改変核酸を含む発現プラスミドを準備し、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、又はPER.C6細胞に前記発現プラスミドをトランスフェクションすること
の追加工程の1つ又は両方を含む、請求項28記載の方法。 - 請求項1〜29のいずれか一項記載の方法を用いて産生される抗体を含む医薬組成物。
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PCT/EP2009/006136 WO2010022910A1 (en) | 2008-08-27 | 2009-08-25 | Method to screen high affinity antibody |
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