KR101248350B1

KR101248350B1 - ｕＰＡＲ 영상화제

Info

Publication number: KR101248350B1
Application number: KR1020077007004A
Authority: KR
Inventors: 알란 쿠쓰버슨; 벤트 이. 아르보
Original assignee: 지이 헬스케어 에이에스
Priority date: 2004-09-29
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2013-04-01
Also published as: CN101065152A; US8568689B1; WO2006036071A3; WO2006036071A2; JP5122962B2; KR20070083604A; CA2580464A1; EP1796733A2; AU2005287934A1; RU2394837C2; JP2008514588A; MX2007003750A; BRPI0516168A; RU2007111467A; AU2005287934B2

Abstract

본 발명은 우로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체 (uPAR)의 검출을 위한 조영제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 영상형성가능한 부분으로 표지된, uPAR에 결합하는 펩티드 벡터를 포함하는 조영제에 관한 것이다.

우로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체, 펩티드 벡터, 조영제

Description

ｕＰＡＲ 영상화제 {uPAR IMAGING AGENTS}

본 발명은 우로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체 (uPAR)의 검출을 위한 조영제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 영상형성가능한 부분으로 표지된, uPAR에 결합하는 펩티드 벡터를 포함하는 조영제에 관한 것이다. 상기 조영제는 uPAR이 발현되는 부위를 확인하여 상기 수용체와 관련된 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다.

우로키나제형 플라스미노겐 활성제 (uPA)와 세포 표면의 상호 작용은 uPA가 높은 친화력으로 결합하는 그의 당지질-고정 수용체 (uPAR)에 의해서만 매개된다.

uPAR은 글리코실 포스파티딜이노시톨 결합 (GPI 고정)을 통해 세포막의 외층에 국지화된다. 그것은 3개의 상동 도메인으로 이루어진 시스테인-풍부 과글리코실화된 단백질이다. uPA는 촉매적 C-말단 세린 프로테아제 도메인 및 성장 인자-유사 도메인 (GFD; aa 1-49) 및 크린글 도메인 (aa 50-135)을 포함하는 모듈 N-말단부로 이루어져 있다. uPA와 uPAR 사이의 상호 작용은 uPA의 GFD의 잔기 19 내지 31에 의해 주로 매개된다.

세포외 매트릭스의 단백질 가수분해성 분해는 종양 침윤 및 전이에서 확증된 역할을 하기 때문에, uPAR은 진단 조영제를 위한 잠재적인 표적을 나타낸다. uPAR 은 지금까지 조사된 대부분의 인간 암종에서, 구체적으로는 종양 세포 자체에서, 혈관형성중인 종양-관련 내피 세포에서 및 대식세포에서 생체내 상향조절되는 것으로 생각된다. 암 환자에서 uPAR 과발현은 진행된 질환에서 존재하며, 다수의 인간 암종의 불량한 예후와 상관되었다. uPAR 발현은 암과 같이 세포외 매트릭스 변화 (remodeling) 및 세포 운동이 관여하는 병리학적 상태에서만 상향조절된다는 사실은 그것을 진단을 위한 흥미로운 표지자가 되게 한다.

WO 01/25410호에는 진단상 또는 치료상 표지된 uPAR-표적 단백질 및 펩티드가 기재되어 있다. 상기 펩티드 또는 단백질은 uPA의 uPAR 결합 부위의 잔기 13 내지 30을 비롯하여 38개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.

US 6,277,818호에는 진단 표지와 접합될 수 있는 uPAR-표적 시클릭 펩티드 화합물이 기재되어 있다. 상기 펩티드는 uPA의 아미노산 잔기 20 내지 30을 기재로 한다.

또한 US 6,514,710호는 uPAR에 대해 친화력을 갖는 시클릭 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 펩피드는 연결 단위에 의해 접합된 11개의 아미노산을 포함한다.

문헌 [Ploug et al., Biochemistry 2001, 40, 12457-12168]에는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 uPAR-표적 펩티드가 기재되어 있지만, 영상화와는 관련이 없다.

uPAR의 효과적인 표적화 및 영상화는 화학적으로 강하고 안정한 선택적인 고-친화력 벡터를 필요로 한다. 이러한 엄격한 조건은 본 발명의 조영제에 의해 충 족된다.

<발명의 개요>

당업계의 요구를 고려하여, 본 발명은 우로키나제 플라스미노겐 활성제 수용체 (uPAR)의 검출을 위한 조영제를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 영상형성가능한 부분으로 표지된, 높은 친화력으로 uPAR에 결합하는 펩티드 서열을 포함하는 조영제에 관한 것이다. 플라우그 (Ploug)는, 예를 들어 서열 X-Phe-X-X-Tyr-Leu-Trp-Ser (여기서, 아미노산에 대한 표준 약어가 사용되며, X는 25개의 아미노산의 군으로부터 선택된 아미노산을 나타냄)을 갖는 uPAR-표적 펩티드를 개시하고 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia의 uPAR-표적 조영제를 제공한다.

상기 식에서,

X₀는 1 내지 5개의 아미노산을 나타내고,

X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 독립적으로 하나의 아미노산을 나타내고,

Phe는 페닐알라닌을 나타내고,

Leu는 류신을 나타내고,

Trp는 트립토판을 나타내고,

X₆은 0 내지 5개의 아미노산을 나타내거나, 하기 화학식 Ib에 의해 동정되고,

W₁ 및 W₂는 동일하거나 상이한 부분을 나타내고, 개별적으로 스페이서, 바이오모디파이어 (biomodifier)이거나, 존재하지 않고,

Z₁ 또는 Z₂ 중 하나 이상이 존재하여 진단 영상화 방법에서 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 영상형성가능한 부분을 나타낸다.

상기 식에서,

기호들은 상기 화학식 Ia에서와 같이 정의되고,

β-Ala는 β-알라닌을 나타내고,

Lys는 리신을 나타낸다.

아미노산 X₀, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅ 및 X₆은 모두 천연 또는 비천연 아미노산을 나타내고, 바람직하게는 X₁ (바람직하게는 비천연임)을 제외하고는 천연이다. 모든 아미노산은 D 또는 L 형태이며, 바람직하게는 하기에 제공된 바와 같다.

화학식 Ia의 제제의 X₀-X₁-Phe-X₂-X₃-X₄-Leu-Trp-X₅-X₆ 성분은 uPAR에 대해 친화력을 가지며, 이하에서는 펩티드 벡터로 표시된다. 조영제의 펩티드 벡터는 uPA의 성장 인자 도메인과 상동성을 갖지만, 인간 uPA에서 발견되는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하지 않는다는 점에서, 종래 기술의 uPAR-표적 벡터와는 상이하다.

X₀는 1 내지 5개의 D 또는 L 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는 X₀는 알라닌 (Ala), 트레오닌 (Thr), 글리신 (Gly), 아스파르트산 (Asp) 및 글루탐산 (Glu)의 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 아미노산은, 바람직하게는 D 형태인 트레오닌을 제외하고는, 바람직하게는 L 형태이다. 가장 바람직하게는 X₀는 L-Asp, D-Thr 또는 Gly-Gly-Asp를 나타낸다.

X₁은 바람직하게는 β-시클로알킬알라닌을 나타내고, 보다 바람직하게는 β-시클로펜틸알라닌, β-시클로헥실알라닌 (Cha) 또는 β-시클로헵틸알라닌이며, 가장 바람직하게는 β-시클로헥실알라닌이다.

X₂는 바람직하게는 세린 (Ser) 또는 알라닌 (Ala), 보다 바람직하게는 세린, 가장 바람직하게는 D-세린을 나타낸다.

X₃은 바람직하게는 아르기닌 (Arg), 또는 아르기닌 모방체, 예컨대 N-메틸아르기닌 (mArg), 티로신 (Tyr) 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 D-아르기닌을 나타낸다.

X₄는 바람직하게는 티로신, 알라닌, 류신 또는 시클로헥실알라닌, 보다 바람직하게는 티로신, 가장 바람직하게는 L-티로신을 나타낸다.

X₅는 바람직하게는 세린, 히스티딘 (His), 알라닌, 티로신 또는 류신, 보다 바람직하게는 L-세린 또는 D-히스티딘을 나타낸다.

X₆은 바람직하게는 0 내지 5개의 D 또는 L 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는 X₆은 글리신, 아스파르트산, 리신, 페닐알라닌 또는 β-알라닌 (β-Ala)의 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 별법으로, X₆은 하기 화학식 Ib의 기를 포함한다.

<화학식 Ib>

상기 식에서,

모든 기호는 상기 정의된 바와 같으며, 화학식 Ib의 β-Ala는 화학식 Ia의 X₅에 연결된다. 괄호내의 펩티드 쇄는 그의 X₅를 통해 리신의 ε-아미노기에 연결된다. 이 별법에서, 조영제는, 그의 α-아미노기가 β-알라닌으로 미리 유도체화되어 리신의 α-탄소 원자에 대해 유사 대칭 이량체가 생성된, 개질된 리신 골격 상에서 합성된 이량체를 포함할 것이다. 이 별법에서, 상기 이량체는 바람직하게는, 2종의 단량체의 펩티드 서열이 동일한 동종이량체이다. 가장 바람직하게는 X₆은 존재하지 않는다.

놀랍게도, 본 발명자들은 펩티드 벡터의 X₄ 및 X₅ 자리 (여기서, 플라우그는 각각 티로신 및 세린을 사용함)가 상기 기재된 바와 같은 다른 아미노산으로 대체될 수 있다는 것을 발견하였다.

W₁ 및 W₂는 개별적으로 스페이서, 바이오모디파이어 또는 이들 둘다로 작용하는 부분을 나타내거나, 존재하지 않으며, 바람직하게는 구축 블럭 1 내지 10 단위를 포함하는 단분산 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 구축 블럭을 기재로 한다. 또한 W₁ 또는 W₂는 바람직하게는 글리신, 리신, 아스파르트산, 세린 또는 아미노헥산산을 포함하는 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다. 보다 바람직하게는, W₁ 또는 W₂는 아미노산 잔기와 PEG-기재 구조 둘다, 예컨대 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 PEG-기재 구조와 조합하여 포함한다. 바람직하게는, W₁ 또는 W₂는 바이오모디파이어를 나타내고, 바람직한 실시양태에서, W₁ 또는 W₂ 중 하나 이상은 하기 화학식 II의 단분산 PEG-기재 구조, 17-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15-테트라옥사헵타데칸산으로 이루어진 단위를 나타낸다.

상기 식에서,

m은 1 내지 10의 정수이고,

C-말단은 아미드 또는 산 부분이다.

바이오모디파이어로서, W₁ 또는 W₂는 화합물의 약동학 및 혈액 청소율 (blood clearance rate)을 개질시키는 기능을 갖는다. 바이오모디파이어는 조직, 즉 근육, 간 등에서 화합물이 덜 흡수되게 작용하여, 배경 간섭이 적어져 우수한 진단 영상화를 제공할 수 있다. 분비는 주로 신장을 통해서 일어나며, 이것은 바이오모디파이어의 또다른 이점이다.

바이오모디파이어로서, 부분 W₁ 또는 W₂는 바람직하게는 글루타르산 및/또는 숙신산 및/또는 PEG 기재 단위 (예를 들어, 화학식 II의 부분 포함)로부터 유도된다. W₁ 또는 W₂는 또한 바이오모디파이어 특성을 갖는 스페이서로서 작용하여, 영상형성가능한 부분 Z₁ 또는 Z₂를 펩티드 벡터에 연결시킬 수 있다. 다른 대표적인 스페이서 요소로는 구조-유형 다당류, 저장-유형 다당류, 폴리아미노산 및 그의 메틸 및 에틸 에스테르, 및 폴리펩티드, 올리고당 및 올리고뉴클레오티드를 들 수 있으며, 이들은 효소 분열 부위를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 스페이서 부분으로서, W₁ 또는 W₂의 한 역할은 펩티드 벡터의 수용체 결합 도메인으로부터 비교적 큰 영상형성가능한 부분을 이격시키는 것이다. 별법으로, 가장 단순한 형태에서, W₁ 또는 W₂는 기능적 결합이거나, 영상형성가능한 부분을 펩티드 벡터에 용이하게 접합시키는 관능기를 포함하며, 이러한 기로는 -NR^a-, CO₂, -N(C=S)-, -N(CO)-, -S, -O-, -0-NH₂ 및 -CHO를 들 수 있으며, 여기서 R^a기는 독립적으로 H, C_1-10 알킬, C_3-10 알킬아릴, C_2-10 알콕시알킬, C_1-10 히드록시알킬, C_1-10 할로알킬 및 α-할로아세틸이다.

Z₁이 존재하지 않고, W₁이 존재할 경우, W₁은 바람직하게는 유리 아미노기 또는 대사 억제기를 포함하는 아미노기를 갖는 N-말단을 갖는다. 용어 대사 억제기란 아미노 말단에서 펩티드 또는 아미노산의 생체내 대사를 억제하거나 중단시키는 생체적합성 기를 의미한다. 이러한 기는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 아세틸, Boc (tert-부틸옥시카르보닐), Fmoc (플루오레닐메톡시카르보닐), 베닐옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸 및 알릴옥시카르보닐의 군으로부터 적합하게 선택된다. 바람직한 대사 억제기로는 아세틸 및 벤질옥시카르보닐이 있다. Z₂ 및 W₂가 존재하지 않을 경우, 펩티드 벡터의 C-말단은 바람직하게는 아미드 또는 카르복실기이며, 보다 바람직하게는 아미드기이다. 또한, Z₂가 존재하지 않고, 아미노산을 포함하는 W₂가 존재할 경우, W₂는 바람직하게는 아미드 또는 카르복실기, 보다 바람직하게는 아미드기로 종결된다.

본 발명의 조영제는 바람직하게는 선형 펩티드를 포함하며, 이것은 임의의 아미노산 사이에, 또는 아미노산과 제제의 다른 부분들 사이에 시클릭 구조를 생성하는 가교가 없다는 것을 의미한다. 따라서, 바람직하게는 술피드, 티오에테르 가교 또는 시클릭 펩티드 구조를 형성하는 다른 가교가 존재하지 않는다. 조영제는 바람직하게는 최대 20개의 아미노산을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 화학식 Ia의 X₀-X₁-Phe-X₂-X₃-X₄-Leu-Trp-X₅-X₆으로 나타내는 펩티드 벡터는 서열 X₀-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser을 포함하여, 조 영제는 화학식 Z₁-W₁-X₀-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-X₆-W₂-Z₂ (여기서, 기호는 상기 정의된 바와 같음)을 갖는다.

보다 바람직하게, 펩티드 벡터는 서열 Asp-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser 또는 Thr-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser을 포함한다 (여기서, 이탤릭체 글꼴은 D 아미노산을 의미하고, X₆은 존재하지 않음).

본 발명의 조영제의 한 예로는 Z₁-W₁-Gly-Gly-Asp-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-NH₂ (여기서, Z₁ 및 W₁은 상기 정의된 바와 같으며, X₆, W₂ 및 Z₂는 존재하지 않고, C-말단은 아미드기임)가 있다.

Z₁ 및 Z₂ 중 하나 이상이 존재하고, 영상형성가능한 부분을 나타낸다. 이하에서는 Z를 사용하여 Z₁ 또는 Z₂를 나타낸다. Z는 임의의 영상형성가능한 부분일 수 있다. Z의 성질은 진단에서 사용되는 영상화 방식에 따라 달라질 것이다. 생체내 영상화에서 검출에 적합한 광범위한 부분은, 그의 내용이 참고로 인용된 WO 98/47541호로부터 공지되어 있다.

Z는 생체내 진단 영상화 방법, 예컨대 방사성 또는 SPECT, PET, MR, x선, 초음파 또는 광학 영상화로 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 부분이다. Z는, 예를 들어 검출가능한 방사선 (예를 들어, 방사능 붕괴, 형광 들뜸, 스핀 공명 들뜸 등)을 방출하거나, 방출되게 할 수 있는 부분, 국소 전자기장에 영향을 미치는 부분 (예를 들어, 상자성, 초상자성, 페리자성 또는 강자성 종), 복사 에너지 를 흡수하거나, 방출하거나, 산란시키는 부분 (예를 들어, 발색단, 입자 (가스 또는 액체 함유 소포 포함), 중원소 및 그의 화합물 등) 및 검출가능한 물질을 생성하는 부분 (예를 들어, 가스 마이크로기포 발생제)를 포함한다.

영상형성가능한 부분 Z는 본체 M 및 부분 Y₁ (여기서, M은 금속 이온, 상자성 금속, 금속 방사능-핵종, 중금속 및 중금속 산화물을 나타냄)에 의해 나타낼 수 있다. 부분 Y₁은 1개 또는 몇개의 부분 M을 운반할 수 있어야 한다. 운반한다는 것은 부분 Y₁과 M 사이의 임의의 형태의 회합, 예컨대 화학 결합, 예를 들어 공유 결합 또는 전자가 또는 이온 결합 또는 흡수에 의한 것 또는 임의의 다른 유형의 회합을 의미하며, 바람직하게는 M은 킬레이트 부분 Y₁에 의해 킬레이트화된다.

영상화 방식 및 영상형성가능한 부분 Z는 이하에서 보다 상세히 기재된다.

이러한 측면의 제1 실시양태에서, Z는, 부분 Y₁에 의해 임의로 운반되는, 방사성 및 SPECT 영상화 방식에 유용한 하나 이상의 부분 M, 예컨대 방사능 금속 이온 또는 감마-방출 방사능 할로겐을 포함한다. 바람직하게는 M는 알파- 및 베타-방출이 낮거나 없고 1시간 초과의 반감기를 갖는 감마 방출제이다. 바람직한 기 M은 방사능 핵종 ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^81mKr, ⁹⁹Mo, ^99mTc, ²⁰¹Tl 및 ¹³³Xe이다. 가장 바람직하게는 ^99mTc이다.

또한 M은 다음의 동위원소 또는 동위원소 쌍으로 나타낼 수 있다: ⁴⁷Sc₂₁; ¹⁴¹Ce₅₈; ¹⁸⁸Re₇₅; ¹⁷⁷Lu₇₁; ¹⁹⁹Au₇₉; ⁴⁷Sc₂₁; ¹³¹I₅₃; ⁶⁷Cu₂₉; ¹³¹I₅₃과 ¹²³I₅₃; ¹⁸⁸Re₇₅와 ^99mTc₄₃; ⁹⁰Y₃₉와 ⁸⁷Y₃₉; ⁴⁷Sc₂₁과 ⁴⁴Sc₂₁; ⁹⁰Y₃₉와 ¹²³I₅₃; ¹⁴⁶Sm₆₂와 ¹⁵³Sm₆₂; 및 ⁹⁰Y₃₉와 ¹¹¹In₄₉.

M이 방사성 또는 SPECT 영상화를 위한 금속 방사능 핵종을 나타낼 경우, Y₁은 바람직하게는 M과 안정한 킬레이트를 형성하기에 적합한 킬레이트제를 의미한다. 이러한 킬레이트제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 킬레이트제의 전형적인 예들은 WO 01/77145호의 표 I에 기재되어 있다.

하기 화학식 III의 킬레이트제 Y₁이 특히 바람직하다.

상기 식에서,

각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 H 또는 C_1-10 알킬, C_3-10 알킬아릴, C_2-10 알콕시알킬, C_1-10 히드록시알킬, C_1-10 알킬아민, C_1-10 플루오로알킬이거나, 2개 이상의 R기는 그들이 부착된 원자와 함께 카르보시클릭, 헤테로시클릭 포화 또는 불포화 고리를 형성한다.

R¹, R²및 R³이 수소 또는 메틸기이고, R⁴가 알킬 또는 알킬아민기인 화학식 III의 킬레이트제 Y₁이 보다 특히 바람직하다. 보다 바람직하게는 Y₁은 본원에서 cPN216으로 표시되는 하기 화학식 IV의 킬레이트이고, 가장 바람직하게는 영상화 부분 M은 ^99mTc이다. 별 표시는 가능한 연결 부위를 나타낸다.

다른 바람직한 킬레이트제는 하기 화학식 V를 갖는 것이다.

상기 식에서,

R1 내지 R6은 독립적으로 H, 알킬, 아릴 또는 이들의 조합을 나타내고, R1 내지 R6기는 킬레이트가 화학식 Ia의 W₁ 또는 W₂에 접합될 수 있도록 하나 이상의 관능성 부분을 함유한다. 적합한 관능성 부분으로는, 예를 들어 알킬아민, 알킬술피드, 알콕시 알킬 카르복실레이트, 아릴아민, 아릴 술피드 또는 알파-할로아세틸이 있다.

Z가 감마-방출 방사능 할로겐, 예컨대 ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I 및 ⁷⁷Br (여기서, ¹²⁵I가 바람직함)을 나타낼 경우, 그것은 당업계에 널리 공지된 치환 또는 부가 반응에 의해 W₁ 또는 W₂에, 또는 별법으로 W₁ 또는 W₂가 존재하지 않을 경우, X₀ 또는 X₆에, 또는 X₆이 존재하지 않을 경우 X₅에 직접 공유 결합될 수 있다.

제2 실시양태에서, 화학식 Ia의 화합물은 PET 영상화 방식에 유용한 부분 Z를 포함한다. 따라서, Z는 양전자-방출 특성을 갖는 방사능 방출제, 바람직하게는 양전자-방출 방사능 비금속을 포함한다. 바람직한 기 Z는 양전자방출제 ¹¹C, ¹⁸F, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁷F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br 및 ¹²⁴I를 포함한다. ¹⁸F가 특히 바람직하다. 적합한 금속 양전자-방출제는 ⁶⁴Cu, ⁴⁸V, ⁵²Fe, ⁵⁵Co, ^94mTc, ⁶⁸Ga 또는 ⁸²Rb이고, ⁶⁸Ga가 바람직하며, 킬레이트제 Y₁과 킬레이트화될 수 있다.

비금속 방사능 핵종, 예컨대 ¹⁸F를 포함하는 것은 존재할 경우 부분 W₁ 또는 W₂에, 또는 별법으로 X₀, X₅ 또는 X₆에 당업계에 널리 공지된 치환 또는 부가 반응에 의해 공유 결합될 수 있다. Z가 ¹⁸F-표지된 알데히드, 티올 또는 아미노옥시기일 경우, W₁ 또는 W₂는 바람직하게는 알파-할로 아세틸 부분, 알데히드 또는 아미노옥시기를 포함하는 관능기를 갖는다. 티올 커플링 화학 및 알데히드 및 아미노옥시 커플링 화학, 이러한 화학을 사용하여 제조된 ¹⁸F-신톤 (synthon) 및 표지된 펩티드는 그의 내용이 본원에 참고로 인용된 WO 03/080544호 및 WO 04/080492호에 기재되어 있다. 별법으로, ¹⁸F는 ¹⁸F를 포함하는 다른 부분, 예를 들어 ¹⁸F-플루오로벤즈알데히드에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 연결 부위, W₁, W₂, X₀, X₅ 또는 X₆은 바람직하게는 아미노옥시기를 포함할 것이다.

M이 PET 영상화를 위한 금속 양전자-방출제를 나타낼 경우, Y₁은 M과 안정한 킬레이트를 형성하기에 적합한 킬레이트제를 의미한다. 이러한 킬레이트제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 킬레이트제의 전형적인 예가 WO 01/77145호의 표 I 및 방사성 및 SPECT 영상화에 관한 상기 실시양태에 기재되어 있다.

바람직한 실시양태에서, Y₁은 DOTA 킬레이트제이고, M은 마이크로파 화학을 사용하여 킬레이트로 용이하게 도입될 수 있는 ⁶⁸Ga이다.

제3 실시양태에서, Z는 MR 영상화 방식에 유용한 하나 이상의 부분 M을 운반하는 부분 Y₁을 포함한다. 여기서, M은 상자성 금속을 의미하며, 적합한 이러한 금속 이온으로는 Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) 또는 Dy(III)를 들 수 있다. Gd(III), Dy(III), Fe(III) 및 Mn(II)이 특히 바람직하다. Y₁은 킬레이트제, 특히 예를 들어 US 4,647,447호 및 WO 86/02841호에 기재된 바와 같은 비시클릭 또는 시클릭 폴리아미노카르복실레이 트와 같은 킬레이트제 (예를 들어, DTPA, DTPA-BMA, DOTA 및 DO3A)를 의미한다. 또한 M은, 예를 들어 Y₁이 금속 산화물에 대한 코팅으로서 기능하도록 Y₁에 의해 흡수되거나, Y₁에 결합된 금속 산화물, 예컨대 초상자성, 페리자성 또는 강자성 종을 의미할 수 있다. MR 조영제로 사용하기 위한 금속 산화물은, 예를 들어 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,230,777호에 기재되어 있다.

제4 실시양태에서, Z는 X선 영상화 방식에 유용한 영상형성가능한 부분을 나타낸다. 여기서, Z는 중금속, 예컨대 텅스텐, 금 및 비스무스를 바람직하게는 산화물 형태로 포함한다. 또한 Z는 X선 조영제, 예를 들어 이오파미론 (Iopamiron; 상표명) 및 옴니파크 (Omnipaque; 상표명)로서 특히 널리 공지되어 있는 요오드화 아릴 유도체로 나타낼 수 있다. 이러한 제제는 그의 산 또는 아민 관능기를 통해, 임의로는 W₁ 또는 W₂를 통해, 화학식 Ia의 펩티드 벡터에 연결될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 화학식 Ia의 화합물은 Z를 가스-충전된 마이크로소포 형태로 포함한다. 이러한 초음파 영상제는, 예를 들어 그것이 당업계, 예를 들어 WO98/18500호에 기재된 바와 같이 펩티드에 결합하기 위해 관능화될 때 수용체의 영상화에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 제6 실시양태에서, 화학식 Ia의 부분 Z는 광학 영상화 방법으로 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 임의의 부분일 수 있다. 검출가능한 부분은 광산란제 (예를 들어, 착색된 또는 비착색된 입자), 광흡수제 또는 광방출제일 수 있다. 보다 바람직하게는, Z는 발색단 또는 형광 화합물과 같은 염료로 대표된다. 부분 Z는 자외선광 내지 근적외선의 파장을 갖는 전자기 스펙트럼에서 광과 상호작용하는 임의의 염료일 수 있다. 바람직한 변법에서, Z는 형광 특성을 갖는다.

바람직한 유기 염료 부분은 광범위한 비편재 전자계, 예를 들어 시아닌, 메로시아닌, 인도시아닌, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 트리페닐메틴, 포르피린, 피릴륨 염료, 티아피릴륨 염료, 스쿠아릴륨 염료, 크로코늄 염료, 아줄레늄 염료, 인도아닐린, 벤조페녹사지늄 염료, 벤조티아페노티아지늄 염료, 안트라퀴논, 나프토퀴논, 인다트렌, 프탈로일아크리돈, 트리스페노퀴논, 아조 염료, 분자내 및 분자간 전하-전달 염료 및 염료 착물, 트로폰, 테트라진, 비스(디티올렌) 착물, 비스(벤젠-디티올레이트) 착물, 요오도아닐린 염료 및 비스(S,O-디티올렌) 착물을 포함한다. 형광 염료로 시아닌계 염료가 바람직하다. 카르바시아닌, 옥사시아닌, 티아시아닌 및 아자시아닌계가 보다 더 바람직하다. Cy5- 및 Cy7-염료 군이 가장 바람직한 형광 염료이며, 이들은 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-에스테르)에 의해 펩티드 벡터에 연결될 수 있다. 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 상이한 흡수/방출 특성을 갖는 GFP의 개질체가 또한 유용하다. 특정 희토류 금속 (예를 들어, 유로퓸, 사마륨, 테르븀 또는 디스프로슘)의 착물은 형광 나노결정 (양자점)이기 때문에 특정 환경에 사용된다.

바람직한 염료는 카르바시아닌계로부터 선택되고, 인돌 유형의 카르바시아닌 염료가 보다 더 바람직하다. 이러한 유형의 바람직한 염료는 하기 화학식 VI로 예시된다.

상기 식에서,

Q₁기는 동일하거나 상이하고, 치환된 또는 비치환된 저급 알킬기, 예를 들어 임의로 치환된 C₁ 내지 C₆ 알킬기이다. 알킬기는, 예를 들어 카르복시, 술폰산, 아민, 암모늄 또는 에스테르기, 예컨대 헤테로시클릭 에스테르기 (예를 들어, NHS-에스테르)로 치환된다. Q₂기는 동일하거나 상이하고, 예를 들어 카르복시 또는 술폰산기로 임의로 치환된 저급 알킬기, 예컨대 C₁ 내지 C₆ 알킬, 바람직하게는 메틸기이다. 임의적 방향족기는 점선으로 표시되어 축합된 벤조 고리 및 축합된 나프토 고리를 포함하는 2개의 구조를 포함한다. 어느 고리든 치환되거나 비치환된다. 고리는 술폰산기, 카르복실기, 히드록실기, 알킬(술포알킬)아미노기, 비스(술포알킬)아미노기, 술포알콕시기, 술포알킬술포닐기, 알킬 또는 치환된 알킬 또는 술포알킬아미노기로부터 선택된 기 V로 치환될 수 있다. p는 양의 정수 1, 2, 3 또는 4이다. 바람직하게는 시아닌 염료는 각각 5 및 7개의 탄소 원자의 탄소-가교를 갖는 펜타메틴 또는 헵타메틴 염료이다.

Q₁, Q₂ 및 V는, 임의로는 W₁ 및/또는 W₂를 통한, 염료와 펩티드 벡터의 연결 을 위한 잠재적인 연결 부위이며, Q₁ 및 V기가 바람직한 연결 부위이다. 바람직한 측면에서, 하나의 Q₁기는 펩티드 벡터에 연결되는 한편, 다른 Q₁기는 임의로 치환된 저급 알킬기이다.

제2 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 VII의 uPAR-표적 화합물을 제공한다.

상기 식에서, 기호는 화학식 Ia에 대해 정의된 바와 같고, W₁ 및 W₂ 중 하나 이상이 존재하며 상기 기재된 바와 같은 바이오모디파이어를 나타낸다. 화학식 VII의 화합물은 제1 측면에서 기재된 바와 같은 영상형성가능한 부분에 연결되거나, 다른 용도, 예컨대 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 화학 합성의 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있지만, 자동화 펩티드 합성기를 사용하는 메리필드 (Merrifield)의 고체상 방법이 특히 유용하다 (문헌 [J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1964)] 참조). 전형적으로, 목적하는 서열은 고체상 펩티드 합성에 의해 조립된다. 본 발명의 실시예에 사용된 합성 방법을 위한 표준 절차는 문헌 [E. Atherton & R.C. Sheppard, "Solid phase peptide synthesis: a practical approach", 1989, IRL Press, Oxford]에 기재되어 있다.

예를 들어, 다양한 산-불안정성 링커 (linker)기를 갖는 수지를 사용하면 C-말단 산, 아민 또는 아미드를 갖는 펩티드가 생성될 것이다. 그 후 아미노 보호기를 제거하고, 서열 중 제2 아미노산을 적합한 축합 시약을 사용하여 커플링시킨다. 관능성 측쇄를 위해 반영구 아미노 보호기 및 영구 보호기를 갖는 아미노산을 사용한다.

그 후, 목적하는 서열이 조립될 때까지, 아미노-탈보호 및 커플링 사이클이 교호 단계로 반복된다.

별법으로, 펩티드는 포괄적인 또는 최소의 보호 방법을 사용하여, 카르복실 말단으로부터 순차적인 방식으로 및/또는 단편 축합 또는 라이게이션 방법의 적용을 통해 당업계에 공지된 용액 펩티드 합성 방법을 통해 합성될 수 있다. 조합된 용액-고체상 단편 축합 접근법 또한 적용될 수 있다.

일반적으로, 존재하는 반응성 측쇄기 (예를 들어, 아미노, 히드록실, 구아니디노 및 카르복실기)는 상기 지시된 바와 같이, 전체 합성 동안 보호될 것이다. 아미노산을 위한 보호기의 광범위한 선택에 대해서는 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Greene, T.W. & Wuts, P. G. M. (1991) Protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons, New York] 참조). 사용될 수 있는 아미노 보호기로는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 및 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)을 들 수 있다. 사용될 수 있는 측쇄 보호기로는 t-부틸 (tBu), 트리틸 (Trt), Boc 및 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 (Pmc)을 들 수 있다. 광범위한 다른 이러한 기가 당업계에 공지되어 있다는 것을 인지하여야 한다.

마지막으로, 영구 측쇄 보호기는 제거되고, 펩티드는 보통 동시에 적합한 산성 시약, 예를 들어 트리플루오로아세트산 (TFA)을 이용한 처리를 통해 수지로부터 절단된다.

W₁ 및/또는 W₂는 공지된 화학 합성 방법을 사용하여 펩티드 벡터에 접합될 수 있다. 펩티드 벡터의 제조에 관한 한, 아미드 결합 형성에 의한 W₁ 및/또는 W₂의 펩티드 벡터로의 직접적인 접합이 특히 유용하다. 별법으로, 펩티드 N-말단 상의 이탈기가 W₁ 및/또는 W₂ 상의 친핵성 기로 대체되는 친핵성 치환 반응이 사용될 수 있다. 이러한 이탈기는 카르보닐기에 대해 알파 위치에 부착된 브로마이드일 수 있으며, 이러한 친핵체는 질소일 수 있다.

Z는 W₁ 및/또는 W₂의 펩티드 벡터로의 접합 방법과 동일한 방법을 사용하여 펩티드에 직접 접합될 수 있다. Z가 W₁ 및/또는 W₂를 통해 펩티드에 부착된 경우, 임의의 화학 합성 방법이 Z와 W₁ 또는 W₂의 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 영상형성가능한 부분 사이에 아미드 결합을 생성하는 Z의 자동 커플링이 특히 유용하다. 리포터 (reporter) 부분을 펩티드에 연결시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 선택되는 리포터 및 사용되는 스페이서에 따라 달라질 것이다.

펩티드 벡터 및 조영제는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 정제될 수 있고, 질량 분광측정법 및 분석용 HPLC에 의해 특성화될 수 있다.

uPA/uPAR계의 효과적인 조영제로서 기능하기 위한 본 발명의 화합물의 요건은, 한편으로는 펩티드 벡터가 수용체에 대해 높은 친화력을 가져야 하며, 다른 한편으로는 벡터가 가능한 한 오랫동안 수용체 상에 "체류"해야 한다는 것이다. 따 라서, 조영제/uPAR 계는 바람직하게는 느린 해리 속도 (소위 "오프-속도 (off-rate)") (해리 속도 상수 K_diss로 편리하게 표시될 수 있음)를 나타내어야 한다. 본 발명의 조영제는 크게 개선된 수용체-결합 속도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것을 바탕으로, 특히 바람직한 본 발명의 조영제는 uPA의 성장 인자 도메인 (GFD)에 대해 바람직하게는 50 미만, 보다 바람직하게는 20 미만, 보다 더 바람직하게는 10 미만, 가장 바람직하게는 1 미만의 해리 속도 상수 (K_diss)를 갖는다.

본 발명의 조영제는 바람직하게는 uPA와 세포-표면 uPAR의 결합을 억제시킬 수 있다. 본 발명의 조영제는 바람직하게는 디이소프로필 플루오로포스페이트 불활성화된 uPA와 동등한 효능을 갖는다. 파라미터 IC₅₀은 uPA의 50％가 결합되지 않는 농도를 제공한다. 본 발명의 바람직한 조영제는 50 nM 미만, 바람직하게는 25 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 더 바람직하게는 3 nM 미만의 IC₅₀을 갖는다.

본 발명에 따른 조영제는 바람직하게는 uPAR이 발현되는 부위를 확인하여 수용체의 상향조절과 관련된 질환을 진단하는데 사용된다. 수용체는 바람직하게는 주변 조직보다 50％ 초과로 병에 걸린 조직에 더 많은 양이 존재한다. 보다 바람직하게는, 수용체는 주변 조직보다 2배 초과로 병에 걸린 조직에 더 많은 양이 존재한다. 보다 더 바람직하게는, 수용체는 주변 조직보다 5배 초과로 병에 걸린 조직에 더 많은 양이 존재한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 병적 상태로 인해 uPAR이 과발현된 것으로 생각 되는 세포의 표면, 조직, 기관 또는 생물학적 샘플에서 uPAR의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 샘플을 본 발명의 조영제와 접촉시키는 단계; 및 b) 세포, 조직, 기관 또는 샘플과 회합된 영상형성가능한 부분의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 접촉 단계 및 검출 단계 둘다 시험관내에서 수행될 수 있고, 별법으로 접촉 단계는 생체내에서 수행되고, 검출 단계는 시험관내에서 수행되며, 바람직하게는 접촉 단계 및 검출 단계가 생체내에서 수행된다.

바람직한 방법은 상기 기재된 바와 같은 조영제를 인간 또는 동물 신체, 예를 들어 혈관계에 투여하고, 상기 조영제가 분산된 상기 신체의 적어도 일부분의 영상을 생성하는 것을 포함하는, 진단 영상화에 의해 인간 또는 동물 신체의 영상을 생성하는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 조영제를 포함하는 조영제 조성물을 미리 투여하고, 인간 또는 동물 신체의 적어도 일부분의 영상을 생성하는 것을 포함하는, 영상화에 의해 인간 또는 동물 신체의 강화된 영상을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 신규 조영제는 선택된 영상형성가능한 부분에 따라, 임의의 영상화 방식에서 조영제로 사용될 수 있다. 따라서, 조영제를 진단 영상화에 사용하는 것은 본 발명의 일 측면이다. 바람직한 측면은 상이한 형태의 암 및 전이, 예를 들어 유방, 피부, 직장, 췌장, 전립선, 폐 또는 난소 암의 영상화 및 진단에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 조영제이다. 별법으로, 상기 조영제는 활성화된 대식세포가 존재하는 질환, 예컨대 죽상경화증에서 취약판의 검출을 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 유효량의, 예를 들어 생체내 영상화에서 영상 조영을 강화시키는데 유효한 양의 본 발명의 조영제 또는 그의 염을 1종 이상의 제약학적으로 허용가능한 보조약, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 조영 강화제를 인간 또는 동물 신체에 투여하고, 상기 신체의 적어도 일부분의 영상을 생성하는 것을 포함하는 진단 방법에 사용하기 위한 조영 강화제의 제조를 위한 본 발명의 조영제의 용도를 제공한다.

이제 본 발명은 하기 약어들이 사용된 비제한적인 실시예를 이용하여 더 예시될 것이다:

BAEEG: 비스-(아미노에틸)에틸렌 글리콜

Boc: t-부틸옥시카르보닐

Cy: 시아닌

DEG: 디에틸렌글리콜

DMF: N,N-디메틸포름아미드

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

HATU: 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

크리토픽스 (Krytofix) 222: 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로 -(8,8,8)헥사코산

LC: 액체 크로마토그래피

MS: 질량 분광법

NHS: N-히드록시숙신이미드

NMM: N-메틸모르폴린

PEG: 폴리에틸렌 글리콜

PBS: 포스페이트 완충액

Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐

PyAOP: (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

링크 아미드 (Rink Amide) MBHA 수지: 폴리스티렌 매트릭스에 연결된 4-메틸벤즈히드릴아민

RP-HPLC: 역상 HPLC

RT: 실온

Sep-Pak: C18-수지를 갖는 분리 컬럼

TFA: 트리플루오로아세트산

TIS: 트리이소프로일실란

실시예 1:

Cy5(비스-SO ₃ )- Thr -Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-OH (2)

H- Thr -Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-OH (1)의 합성

상기 서열에 상응하는 펩티드를 표준 고체상 펩티드 화학에 의해 합성하였다.

Cy5(비스 SO ₃ ) 모노 NHS 에스테르와 펩티드 (1)의 접합

Cy5(비스 SO₃) 모노 NHS 에스테르 (1.18 mg, 0.0017 mmol)를 DMF에 용해시키고, 펩티드 (1) (2 mg, 0.0015 mmol)을 고체로서 용액에 첨가한 후, NMM (0.55 ㎕, 0.005 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기를 호일로 감싸고, 진탕기 장치에 16시간 동안 두었다. 목적하는 생성물을 전기분무 MS에 의해 확인하였다: 생성물의 [M+H]⁺ 예상치 1850.85 m/z, 실측치 1850.9 m/z.

실시예 2:

Cy5(비스-SO ₃ )-Gly-Gly-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-NH ₂ (3)

Cy5(비스-SO ₃ )-Gly-Gly-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-NH ₂ (3)의 합성

상기 서열 중 아미노산을 표준 고체상 펩티드 화학에 의해 조립하였다. 그 후, Cy5(비스SO₃) 모노 NHS 에스테르 (0.5 당량)를 DMF에 용해시키고, H-Gly-Gly-Asp(OtBu)-Cha-Phe-Ser(tBu)-Arg(Pmc)-Tyr(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Ser(tBu)-링크 아미드 MBHA 수지 (1 당량)에 첨가한 후, NMM (3 당량)을 첨가하였다. 반응 용기를 호일로 감싸고, 진탕기 장치에 16시간 동안 두었다. Cy5 염료 접합된 펩티드를 탈보호하고, 2.5％ 물 및 2.5％ TIS를 함유하는 TFA로 1 시간 동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 목적하는 생성물을 전기분무 MS에 의해 확인하였다: 생성물의 [M+H]⁺예상치 1977.88 m/z, 실측치 1977.8 m/z.

실시예 3:

Cy5(비스-SO ₃ )-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-βAla-Lys(Cy5(비스- SO ₃ )-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser)-NH ₂ (5)

H-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-βAla-Lys(H-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser)-NH ₂ (4)의 합성

상기 서열에 상응하는 펩티드를 표준 고체상 펩티드 화학에 의해 조립하였다.

Cy5(비스SO ₃ ) 모노 NHS 에스테르와 펩티드 (4)의 접합

Cy5(비스SO₃) 모노 NHS 에스테르 (2.2 당량)를 DMF에 용해시키고, 펩티드 (4 ) (1 당량)를 고체로서 상기 용액에 첨가한 후, NMM (3 당량)을 첨가하였다. 반응 용기를 호일로 감싸고, 진탕기 장치에 24시간 동안 두어 목적하는 이접합 (bis- conjugated) 생성물을 얻었다. 생성물을 RP-HPLC 및 전기분무-MS에 의해 분석하였다.

실시예 4:

N-(4-18F-플루오로벤질리덴)아미노옥시아세틸-PEG(4)-디글리콜로일-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-NH ₂ (8)

N-Boc-아미노옥시아세틸-PEG(4)-디글리콜로일-Asp-Cha-Phe- Ser-Arp -Tyr- Leu-Trp-Ser-NH ₂ (7)의 합성

Boc-아미노옥시아세틸-PEG(4)-디글리콜산은 Boc-아미노옥시아세트산의 활성 에스테르를 사용하고, 이것을 상응하는 아미노-PEG(4)-디글리콜산과 반응시킴으로써 당업자에 의해 제조될 수 있다. 수득된 생성물 Boc-아미노옥시아세틸-PEG(4)-디글리콜산 (1.4 당량) 및 PyAOP (1.2 당량)를 DMF에 용해시켰다. NMM (2 당량, 200 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. DMF 중 펩티드 (6) (1 당량) 및 NMM (4 당량)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. DMF를 진공하에 증발시키고, 생성물을 정제 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 0.3％ 암모니아 (NH₃)/물을 사용하여 pH 5로 조정한 후, 동결건조시켜 Boc 보호기의 제거를 방지하였다. 생성물을 PR-HPLC 및 전기분무-MS에 의해 분석하였다.

펩티드 (7)의 18F 표지화

¹⁸F-플루오라이드를 질소 흐름 하에 20분 동안 110℃로 가열함으로써 크립토픽스 222 (ACN 0.5 ml 중 5 mg) 및 탄산칼륨 (0.1 M 용액 50 ㎕)의 존재하에 공비 건조시켰다. 이 시간 동안, 3 x 0.5 ml ACN을 첨가하고 제거하였다. 혼합물을 40℃ 미만으로 냉각시키고, 문헌 [Haka et al, J. Labelled Cpds. & Radiopharms 1989 27(7) 823]에 기재된 절차에 따라 합성된 트리메틸암모늄 벤즈알데히드 트리플레이트 (디메틸술폭시드 0.4 ml 중 1 mg)를 첨가하였다. 반응 용기를 밀봉하고, 15분 동안 90℃로 가열하여 표지화를 수행하였다. 그 후, 조 4-18F-플루오로벤즈알데히드 용액을 실온으로 냉각시켰다. 그 동안 펩티드 (7) (6 mg)를 실온에서 TFA (200 ㎕) 중 5％ 물로 5분 동안 처리하여 Boc-보호기를 제거하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. Boc-탈보호된 펩티드를 0.1 M 암모늄아세테이트 용액 (pH 4, 0.4 ml)에 재용해시키고, 반응 용기에서 조 4-18F-플루오로벤즈알데히드 용액과 조합하였다. 용기를 밀봉하고 15분 동안 70℃로 가열시켜 접합을 수행하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 조 접합체를 정제 HPLC로 정제하였다. 목적하는 접합체를 함유하는 분획을 물 10 ml로 희석하고, C18 Sep-Pak (에탄올 10 ml 및 물 20 ml로 순차적으로 세척함으로써 미리 제조됨)에 로딩하였다. Sep-Pak을 물 10 ml로 세정한 후, 에탄올 2 ml로 용리하였다. 에탄올을 진공하에 제거하고, 생성물 (8)을 PBS 중에서 제제화하였다.

실시예 5:

아세틸-PEG(4)-디글리콜로일-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-Gly-BAEEG-Glut-cPN216 (10)

아세틸-PEG(4)-디글리콜로일-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-Gly- BAEEG-NH ₂ (9)의 합성

상기 서열에 상응하는 펩티딜 수지를 표준 고체상 펩티드 화학에 의해 합성하였다. 아세틸-PEG(4)-디글리콜산 (5 당량) 및 PyAOP (4.5 당량)를 DMF에 용해시켰다. NMM (10 당량, 200 ㎕)을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 그 후 , 혼합물을 DMF 중에서 예비팽윤된 펩티드 수지에 첨가하고, 반응을 밤새 계속하였다. 그 후, 펩티드를 탈보호하고, 2.5％ 물 및 2.5％ TIS를 함유하는 TFA를 사용하여 1시간 동안 수지로부터 절단하였다. 생성물을 RP-HPLC 및 전기분무-MS에 의해 분석하였다.

cPN216과 펩티드 (9)의 접합

펩티드 (9) (1 당량)를 DMF에 용해시키고, cPN216-글루타릴-테트라플루오로티오페닐 에스테르 (2 당량)를 첨가한 후, NMM (3 당량)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 용매를 감압하에 제거함으로써 반응 혼합물을 후처리하고, 생성물 (10)을 정제 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 RP-HPLC 및 전기분무-MS에 의해 분석하였다.

펩티드 (10)의 ^99m Tc-표지화

펩티드 (10) (0.1 mg)를 염수 또는 메탄올 (0.1 ml) 중에서 재구성하고, 부형제의 동결 건조된 툴박스 키트 (Toolbox kit)로 옮겼다. 아민 기재 킬레이트에 대한 일반적인 방사능 표지화 조건을 제공하도록 설계된 툴박스 키트는 염화주석 이수화물 (16 ㎍), 메틸렌 디포스폰산 (25 ㎍), 탄산수소나트륨 (4500 ㎍), 탄산나트륨 (600 ㎍), 나트륨 파라-아미노벤조에이트 (200 ㎍), 키트 pH=9.2를 함유하였다. 그 후, 염수 (3 ml) 중 나트륨 퍼테크네테이트 (^99mTc) 주사액 (2.1 GBq)을 첨가하고, 키트를 수회 전화시켜 내용물을 용해시킨 후, 실온에서 15 내지 20분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 즉시 HPLC 및 ITLC에 의해 분석하고, 키트의 재구성 후 1 내지 3시간 사이에 ^99mTc-표지된 펩티드 (11)를 실험 대상체에 투여하였다.

실시예 6:

아세틸-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-Gly-BAEG-Glut-DOTA (15)의 가돌리늄(III) 착물

아세틸-Asp-Cha-Phe- Ser-Arg -Tyr-Leu-Trp-Ser-Gly-DEG-NH ₂ (12)의 합성

트리-tBu-DOTA (13)의 합성

트리-tBu-D03A (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N"-트리아세트산, 트리-tert-부틸 에스테르, 10 mmol) 및 브로모아세트산 (10 mmol)을 MeOH (50 ml)에 용해시켰다. 물 (50 ml)에 용해된 K₂CO₃ (30 mmol)를 첨가하고 (MeOH/물 혼합물 중 pH 11), 반응 혼합을 24시간 동안 교반한 후, 추가의 24시간 동안 40℃에서 가열하였다. 조 생성물을 RP-HPLC (페노메넥스 루나 (Phenomenex Luna) 5 미크론, C18, 250 x 21.2 mm, 10 ml/분으로 40분에 걸쳐 구배 5 내지 50％ B)에 의해 정제하였다. 목적하는 생성물을 80℃에서 전기분무-MS (생성물의 [M+Na]⁺ 예상치 595.4 m/z, [M+Na]⁺실측치 595.3 m/z) 및 ¹H-NMR에 의해 확인하였다.

DOTA-접합된 펩티드 (14)의 합성

트리-tBu-DOTA (13) (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산, 트리-tert-부틸 에스테르 1 당량)를 5분 동안 NMM (3 당량)의 존재하에 DMF 중 HATU (1 당량)로 활성화시켰다. 혼합물을 펩티드 (12)에 첨가하고, 반응을 밤새 진행시켰다. 용매를 진공하에 제거하고, 생성물을 5％ 물을 함유하는 TFA에서 tBu-탈보호시켰다. 생성물을 RP-HPLC에 의해 정제하고, RP-HPLC 및 전기분무-MS에 의해 분석하였다.

Gd(III)와의 착물화

DOTA-접합된 펩티드 (14) (1 당량)를 pH 6.5 및 실온에서 수용액 중 GdCl₃ (1 당량)와 반응시켰다. 비착물화된 Gd(III)를 염기성 pH에서 용액의 원심분리에 의해 제거하였다. 생성물 (15)를 동결건조에 의해 단리시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> Amersham Health AS <120> uPAR-targeting contrast agents <130> PN0453 PCT <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> cyclohexylalanine <400> 1 Asp Xaa Phe Ser Arg Tyr Leu Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> cyclohexylalanine <400> 2 Thr Xaa Phe Ser Arg Tyr Leu Trp Ser 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> cyclohexylalanine <400> 3 Gly Gly Asp Xaa Phe Ser Arg Tyr Leu Trp Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> cyclohexylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> cyclohexylalanine <400> 4 Asp Xaa Phe Ser Arg Tyr Leu Trp Ser Ala Lys Ser Trp Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Ser Phe Xaa Asp 20 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> cyclohexylalanine <400> 5 Asp Xaa Phe Ser Arg Tyr Leu Trp Ser Gly 1 5 10

Claims

하기 화학식 Ia인 uPAR 영상화제

<화학식 Ia>

상기 식에서,

X₀는 1 내지 5개의 아미노산을 나타내고,

X₁, X₂, X₃, X₄ 및 X₅는 독립적으로 하나의 아미노산을 나타내고,

Phe는 페닐알라닌을 나타내고,

Leu는 류신을 나타내고,

Trp는 트립토판을 나타내고,

W₁ 및 W₂는 동일하거나 상이한 부분을 나타내고, 개별적으로 단분산 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 구축 블럭 1 내지 10 단위의 바이오모디파이어 (biomodifier)이거나, 존재하지 않고,

Z₁ 또는 Z₂ 중 하나 이상이 존재하여 진단 영상화 방법에서 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 영상형성가능한 부분을 나타내고,

X₆은 0 내지 5개의 아미노산을 나타내거나, 하기 화학식 Ib에 의해 동정됨

<화학식 Ib>

상기 식에서,

기호들은 상기 화학식 Ia에서와 같이 정의되고,

β-Ala는 β-알라닌을 나타내고,

Lys는 리신을 나타내고,

화학식 Ib의 β-Ala는 화학식 Ia의 X₅에 연결됨.
제1항에 있어서, X₀가 알라닌, 트레오닌, 글리신, 아스파르트산 및 글루탐산의 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₁이 β-시클로알킬알라닌을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₂가 세린 또는 알라닌을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₃이 아르기닌, N-메틸아르기닌, 티로신 또는 알라닌을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₄가 티로신, 알라닌, 류신 또는 시클로헥실알라닌을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₅가 세린, 히스티딘, 알라닌, 티로신 또는 류신을 나타내는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, X₆이 글리신, 아스파르트산, 리신, 페닐알라닌 또는 β-알라닌의 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나, 존재하지 않는 것인 영상화제.
제1항에 있어서, 펩티드 서열 Z₁-W₁-X₀-Cha-Phe-Ser-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-X₆-W₂-Z₂ (여기서, Cha는 시클로헥실알라닌을 나타내고, Ser은 세린을 나타내고, Arg는 아르기닌을 나타내고, Tyr은 티로신을 나타내고, 그 밖의 모든 기호는 상기에 정의된 바와 같음)를 포함하는 영상화제.
제1항에 있어서, Z₁ 및 Z₂ 중 하나 또는 둘다가 방사성, SPECT, PET, x선, MR, 초음파 또는 광학 영상화로 검출가능한 부분을 포함하는, 생체내 진단에서 사용하기 위한 영상형성가능한 부분을 나타내는 것인 영상화제.
제10항에 있어서, Z₁ 및 Z₂ 중 하나 또는 둘다가 ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^81mKr, ⁹⁹Mo, ^99mTc, ²⁰¹Tl 및 ¹³³Xe으로부터 선택된, 방사성 또는 SPECT 영상화를 위한 감마 방출 부분을 나타내는 부분 M을 포함하는 것인 영상화제.
제10항에 있어서, Z₁ 및 Z₂ 중 하나 또는 둘다가 ¹¹C, ¹⁸F, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁷F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²⁴I, ⁶⁴Cu, ⁴⁸V, ⁵²Fe, ⁵⁵Co, ^94mTc, ⁶⁸Ga 또는 ⁸²Rb로부터 선택된, PET 영상화를 위한 양전자 방출 특성을 갖는 방사능 방출제를 나타내는 부분 M을 포함하는 것인 영상화제.
제10항에 있어서, Z₁ 및 Z₂ 중 하나 또는 둘다가 Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) 또는 Dy(III)의 군으로부터 선택된 상자성 금속 또는 금속 산화물을 나타내는 부분 M을 포함하는 것인 영상화제.
제13항에 있어서, 상기 금속 산화물이 MR 영상화를 위한 초상자성, 페리자성 또는 강자성 종인 영상화제.
제10항에 있어서, Z₁ 및 Z₂ 중 하나 이상이 광학 영상화를 위한 광산란제, 광흡수제 또는 광방출제를 나타내는 것인 영상화제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 영상화제를 1종 이상의 제약학적으로 허용가능한 보조약, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 진단 영상화에 사용하기 위한 영상화제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 영상화제를 포함하는, 진단 영상화에 의해 인간 또는 동물 신체의 영상을 생성하기 위한 제약 조성물.