KR101228204B1 - 염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는핵산 - Google Patents

염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는핵산 Download PDF

Info

Publication number
KR101228204B1
KR101228204B1 KR1020057014739A KR20057014739A KR101228204B1 KR 101228204 B1 KR101228204 B1 KR 101228204B1 KR 1020057014739 A KR1020057014739 A KR 1020057014739A KR 20057014739 A KR20057014739 A KR 20057014739A KR 101228204 B1 KR101228204 B1 KR 101228204B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
leu
ala
ser
glu
Prior art date
Application number
KR1020057014739A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20050099545A (ko
Inventor
피에터 얍 가일라드
보어 알베르투스 게리트 드
아르젠 브링크
Original Assignee
투-비비비 홀딩 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 투-비비비 홀딩 비.브이. filed Critical 투-비비비 홀딩 비.브이.
Publication of KR20050099545A publication Critical patent/KR20050099545A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101228204B1 publication Critical patent/KR101228204B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/832—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving bacterial toxin that has modified amino acid sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/701—Integrated with dissimilar structures on a common substrate
    • Y10S977/712—Integrated with dissimilar structures on a common substrate formed from plural layers of nanosized material, e.g. stacked structures
    • Y10S977/714—Containing protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/797—Lipid particle
    • Y10S977/798—Lipid particle having internalized material
    • Y10S977/799—Containing biological material
    • Y10S977/801—Drug
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/802—Virus-based particle
    • Y10S977/806—Virus-based particle with exterior chemical attachment
    • Y10S977/808—Exterior attachment for targeting, e.g. drug targeting

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

본 발명은 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 다이나믹 염증 유도의 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는, 신규 핵산 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 본원에서 "지다당류-민감성" 폴리펩티드(LPSS 폴리펩티드)로 칭해진다. 본 발명은 또한 뇌혈관 장벽 성질의 제어의 생물학적 효과가 필요한 포유동물의 뇌혈관 장벽 성질을 조절하기에 유용한 방법에 관한 것이다. 이는 뇌혈관/망막 장벽의 질환, 뇌(눈 포함) 장애 및 말초 혈관 장애의 진단 및 치료를 포함한다. 부가적으로, 본 발명은 또한 항-LPSS 폴리펩티드 항체 또는 리간드의 진단용 프로브, 뇌혈관 장벽 표적화제, 또는 치료제로서의 용도, 및 LPSS 폴리펩티드의 발현, 활성화 또는 생물활성의 리간드 또는 조절제의 진단용 프로브, 치료제 또는 약물 전달 증진제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는 핵산 {DIFFERENTIALLY EXPRESSED NUCLEIC ACIDS IN THE BLOOD-BRAIN BARRIER UNDER INFLAMMATORY CONDITIONS}
본 발명은 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 다이나믹 염증 유도의 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는, 신규 핵산 및 그에 의해 코딩된 폴리펩티드에 관한 것이다. 이 폴리펩티드는 본원에서 "리포폴리사카리드-민감성" 폴리펩티드(LPSS 폴리펩티드)로 칭해진다. 본 발명은 또한 뇌혈관 장벽 성질의 제어의 생물학적 효과가 필요한 포유동물의 뇌혈관 장벽 성질을 조절하기에 유용한 방법에 관한 것이다. 이는 뇌혈관/망막 장벽의 질환, 뇌(눈 포함) 장애 및 말초 혈관 장애의 진단 및 치료를 포함한다. 부가적으로, 본 발명은 또한 항-LPSS 폴리펩티드 항체 또는 리간드의 진단용 프로브, 뇌혈관 장벽 표적화제, 또는 치료제로서의 용도, 및 LPSS 폴리펩티드의 발현, 활성화 또는 생물활성의 리간드 또는 조절제의 진단용 프로브, 치료제 또는 약물 전달 증진제로서의 용도에 관한 것이다.
뉴런은 적절하게 기능하기 위해 치밀하게 제어되는 세포외 환경을 필요로 한다. 이 본질적이고 잘 확립된 마이크로환경은 아스트로사이트 (또는 astroglia)라고 불리는 뇌 세포를 간호함으로써 국소적으로 유지된다. 혈액과 뇌의 세포외 구획 간의 상당하고 가변적인 상이성의 문제에 대응하기 위해, 중추신경계(CNS)는 또한 수많은 혈관-CNS 장벽, 즉 뇌혈관 장벽, 뇌혈관척수액(CSF) 장벽, 혈관-CSF 장벽, 뇌실막 및 교세포경계, 또한 혈액-망막 장벽, 혈액-신경 장벽, 혈관-척수 장벽에 의해 일반 혈액 순환으로부터 차폐된다. 뇌혈관 장벽(BBB)은 다른 혈관-CNS 장벽들에 비해, 1000배 더 큰 표면적을 덮고 있고 때문에, 가장 중요한 혈관-CNS 장벽으로 간주된다. BBB는 CNS에서의 모세혈관을 덮는 독특한 치밀 내피 세포 층을 그 특징으로 한다. 또한, 아스트로사이트는 모세혈관 상에 있는 '신경아교족(glialfoot)'을 보호함으로써 상기 내포 세포에서 BBB 성질을 주로 유도한다.
특히, BBB 이온(Na+, F. Ca2 +), 물, 영양소, 대사물, 신경전달물질(글루탐산, 트립토판), 혈장 단백질(알부민, 피브리노겐, 면역글로불린), 면역계로부터의 세포 및 뇌의 유입 및 유출성 생체이물(약물)의 수송을 제어한다. 뇌의 모세혈관 상피세포는 말초 모세혈관에 비해 특수한 성질들을 가진다. 그것은 좁은 밀착성 결합을 가지고, 창이 없으며, 낮은 포음(pinocytotic) 활성 및 연속적 기저막을 가진다. 좁은 밀착성 결합은 1500 내지 2000 Ohm.cm2의 높은 전기저항을 초래한다. 게다가, 내피 세포는 음으로 하전된 화합물을 거부하는 음성 표면 전하를 가진다. 그것은 영양소 및 기타 화합물을 뇌에서 활성적으로 유출 및 유입 수송하는 화합물 및 선택적 운송 시스템을 파괴하는 많은 미토콘드리아 및 효소를 가진다. 건강한 상태 하에서, BBB는 약물 또는 내인성 화합물이 뇌로 들어가는 제어할 뿐만 아니라, 세포성 침윤이 말초 기관에 비해 낮다. 정상적 내피 세포 층은 혈소판 및 백혈구의 접착, 및 임의의 응고 시스템의 활성화를 방지하는 내혈소판 표면을 제공한다. 고분화된 뇌 미세혈관 내피 세포는 면역 감시로부터 뇌를 단리하는 치밀한 장벽을 형성하고, 단지 수개의 단핵 세포(예컨대, 활성화된 T-세포)만이 CNS로 이동하도록 한다. 주조직 적합성 복합체 항원의 낮은 발현, 건강한 CNS 중의 항원-제시 세포의 적은 수, 및 CNS가 매우 발달된 임파성 맥관구조에 의해 적절히 배수되지 않는다는 사실은 뇌를 "면역격리된" 부위가 되게 한다.
BBB의 해부학적 기초의 본 이해는, 그것이 말초(예컨대 코티솔, 아드레날린) 및 국소(예컨대 사이토킨, 케모킨) 호르몬에 의해 영향을 받는 동적 제어 기관으로서 기능한다는 것이다. 아스트로사이트에 부가하여, 혈관주위세포, 뉴런 및, 면역계의 세포와 같은 수개의 다른 세포는 그것의 성질에 영향을 준다. 그 다음, 상피세포는 응고, 베스토너스의 조절, 항원-제시 및, 예컨대 성장 인자에 의한 기저막의 조절과 같은 다른 공정들에 관여한다. 특히, 뇌 및 대뇌 염증, 뇌 종양의 신생혈관형성과 같은 병리학적 상태 하에서는, 활성화된 상피세포가 중요한 역할을 한다.
일반적으로, BBB는 뇌의 항상성을 보호하는 작용을 하는 기관으로 간주될 수 있다. 당연하게, BBB의 기능장애는 매우 대부분의 뇌 장애들에 있어 중심적인 역할을 한다. 일부 예들은 다음과 같다:
i. 뇌 혈관인성 부종은 뇌 조직으로의 혈관으로부터의 물 및 혈장 단백질의 질병(염증)-유도 누출의 결과이다. 이는 발작, 뇌 감염, 두부 외상, 뇌 종양 및 다발성 경화증과 같은 장애들에 있어 불능 및 죽음의 주요 원인이다. 부종은 뇌가 스 컬의 경질 환경 내에서 팽창하도록 유발한다. 그에 따른 두개강내 압력의 상승은 이어서 뇌의 헤르니화를 초래할 수 있고, 그 후 호흡과 같은 본질적인 뇌의 기능이 불량해지고, 비치료된 경우, 심각한 장애, 코마 및 심지어는 죽음을 초래한다.
ii. 다발성 경화증에서, 활성화된 자동반응 T 세포는 활성화된 BBB를 통과한다. CNS 내에서, 이 T 세포는 수초에 대해 표적화된 염증 반응을 유도하고, 이는 또한 BBB의 파멸을 유발한다. 자동항체 및 보체 인자가 이제 파멸된 BBB에 걸쳐 있고, 이는 탈수초화 공정을 초래한다. 이제, 수초 단편은 또한 파멸된 BBB를 통해 말초로 다시 누출되고, 여기에서 그것은 더 많은 자동반응 T 세포를 활성화시키고, 이는 더 많은 자동항체의 생산을 증진시킨다.
iii. 세포외 유체 내에서의 신경전달물질과 미세한 이온들의 균형을 확실히 하지 못하면, 손상된 뉴런 신호전달을 초래하고, 이에 손상된 인식 기능화, 신경정신 장애 또는 간질성 발작이 초래된다.
iv. 혈류로의 BBB 전반에 걸친 손상된 독성 단백질 제거는 최근 알쯔하이머병과 같은 신경퇴행 장애 및 크로츠펠트-제이야콥병 및 BSE와 같은 프라이온 질병의 병인으로 이어졌다. 병리학적 그러한 단백질의 병리학적 축적은 신경 세포의 죽음, 및 그에 이은 손상된 인식 기능화를 초래한다.
이에 따른 기능장애 BBB의 치료는 뇌 장애의 치료를 위한 새로운 해결책을 제시한다. 뇌 장애는 서양 세계에서 사망률 및 장애의 주요 원인이다. 유전자 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 동적 염증-유도 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는 신규 LPSS 폴리펩티드의 동정 및 특성화는 상기 필요를 충족시키는 데 유용한 것으로 입증될 것이다.
뇌 장애의 치료를 위한 BBB-치료 성능을 가지는 바람직한 약물에 부가하여, 적절한 기능의 BBB도 또한 면역 반응을 중재하는 임파구의 뇌부로의 도입을 막거나 감소시키기 위해 필수적이다. 이는 전이암 세포의 두뇌부로의 도입을 막는다. 유전자 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 동적 염증-유도 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는 신규 LPSS 폴리펩티드의 동정 및 특성화는 상기 필요를 충족시키는데 유용한 것으로 입증될 것이다.
그러나 BBB는 또한 생체이물(예컨대, 약물 및 진단제)의 뇌로의 전달을 제한하며, 이는 뇌 장애의 정통적 약물 치료법(즉 뉴런에 대해 표적화된 치료법)을 복잡하게 만든다. 그러므로 BBB를 가역적으로 개방함으로써 혈액-매개성, 막-비투과성 약물을 뇌에 전달하거나, 혹은 내인성 BBB 운송 시스템에 의해 약물을 뇌에 선택적으로 표적화하기 위해 BBB의 투과를 조작하는 것도 또한 바람직하다. 이는 혈액-고환 장벽 및 혈액-태반 장벽에 걸친 약물 전달을 막는다. 유전자 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 동적 염증-유도 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는 신규 LPSS 폴리펩티드의 동정 및 특성화는 상기 필요를 충족시키는데 유용한 것으로 입증될 것이다.
혈관 장애를 앓는 뇌 또는 눈 이외의 다른 기관의 미세혈관의 BBB 성질들을 조작하는 것도 또한 바람직하다. 말초 미세혈관에 BBB 성질들을 도입하는 것은 (미세)혈관병증, 병리학적 신생혈관형성, 혈액-고환 장벽 또는 혈액-태반 장벽의 불량과 관련된 상태, 및 폐 부종과 같은 상태, 세균성 내독소, 섬유소 과다용해 및 과 민성 쇼크에 의해 유발되는 쇼크에서 유익할 것이다. 유전자 발현이 뇌혈관 장벽 기능성의 초기 동적 염증-유도 변화를 겪는 뇌 미세혈관 내피 세포에서 조절되는 신규 LPSS 폴리펩티드의 동정 및 특성화는 상기 필요를 충족시키는데 유용한 것으로 입증될 것이다.
뇌 아스트로사이트가 말초혈관 종말단추의 보호에 의해 뇌 모세혈관 내피 세포(BCEC)의 BBB 성질들을 유도한다는 것이 오랫동안 공지되어 있다 (Arthur 등, 1987, Brain Res. 433: 155-159, Janzer 및 Raff, 1987, Nature 325: 253-257). 아스트로사이트 컨디셔닝된 매질(ACM)이 유동성 효과들 중 일부를 재생할 수 있기 때문에, 가용성 인자(들)에 의해 일어날 수 있다는 것도 오랫동안 공지되어 있다 (Tio 등, 1990, Eur. J. Morphol. 28(2-4): 289-300). BCEC에서의 ACM-매개 장벽 유도의 측면을 모방할 수 있는 수개의 후보물질 분자들이 동정되어 왔으며, 이에는 TGF베타, GDNF, bFGF, IL-6 및 스테로이드가 포함된다. 다른 이들은 인자가 단백질 또는 펩티드가 아니며, 그것은 철-I 질산화물 부가물을 함유한다는 것을 밝혀내었다 (Federici 등, 1995, J. Neurochem. 64(3): 1008-1015, Regina 등, 2001, Biochim. Biophys. Acta 1540(3): 233-242). 따라서, 수개의 연구 그룹들의 노력에도 불구하고, 원인이 되는 아스트로사이트-유도 인자가 아직 동정되지 못했다고 결론지을 수 있다.
이전 실험들에서, 본인들은 ACM에 노출된 1차적 단리 BCEC이 배양물 내에서 많은 본질적 BBB 성질들을 보유한다는 것을 밝혀내었다(Gaillard 등, 2001, Eur J Pharm Sci. 12(3): 215-222). 세포 배양 웰의 기저에 1차적 배양된 뇌 아스트로사이트를 도입함으로써, 상기 필터 삽입부 상에 배양된 BCEC 단층에 걸친 내피통과 전기저항(TEER)을 ACM 단독에서 배양된 BCEC 단층의 약 150%까지 증가시켰다. 더욱이, 필터 삽입부의 기저면 상에, 따라서 BCEC에 아주 근접하여 아스트로사이트를 배양할 때, TEER은 인자 3 - 8의 곱으로 증가하였다. 게다가, 나트륨 플루오레신(FLU, 분자량 376 Da) 및 FITC-표지 덱스트란(FD4, 분자량 4 kDa)의 세포간 운송을 ACM 단독에서 배양된 BCEC의 약 50%로 감소하였다. 결론적으로, 아스트로사이트가 BCEC로부터 근접함은 그것으로 인해 BCEC와의 물리적 접촉이 생기지 않았을지라도, 효과의 중도(magnitude)를 결정하였다 (Gaillard 등, 2001, 이하 상기한 바와 동일함).
TEER은 BCEC 간의 치밀 결합을 통한 작은 이온의 투과능을 정량하기 위한 감도높은 측정법이다. 이에 따라, TEER은 BBB의 주요 특징으로 간주되는 치밀 결합의 기능성을 나타낸다. TEER의 절대값은 주로 세포 간의 치밀 결합의 양 및 복합성에 의존한다. 마찬가지로, 이는 또한 크고 친수성인 화합물의 세포간 수송의 제한 인자이다.
부가적 연구들에서, 본 발명자들은 필터 삽입부의 기저면에서 배양된 아스트로사이트가: 1) 첫번째 통과 후 BCEC 상에 P-당단백질(Pgp, 다중약물 내성에 관여하는 약물 배출 펌프)의 발현을 유지(또는 (재)유도)하였고 (Gaillard 등, 2000, Pharm. Res. 17(10): 1198-1205); 2) 빈블라스틴 유도 BBB 파괴에 대한 감도를 감소시켰으며(Pgp 기능성 검정) (Gaillard 등, 2000, 이하 상기한 바와 동일함); 3) 기저측부(CNS)면으로부터 필터의 정점(혈액)면으로의 Pgp 기질의 활성 수송을 유도 하였고, 다만 이는, Pgp가 BCEC 단층에서는 관찰되었음에도 불구하고, BCEC 단층에서는 관찰되지 않았으며 (Gaillard 등, 2000, 이하 상기한 바와 동일함), 4) LPS-유도의 BCEC 파괴에 대한 보호 반응을 매개하였다 (Gaillard, 2000a, Ph. D. Thesis, 레이덴 대학, p. 81-97)는 것을 발견하였다. 이 효과들은 모두 ACM 단독에 의해서는 유도되지 않았다. 명백히, 필터 삽입부의 기저면 상의 아스트로사이트의 물리적 및 근사적 존재는 ACM 단독에 비해, BCEC에서의 BBB 성질들을 유도함에 있어 우수하다.
이에 따라, BBB 성질들을 조절하거나, BBB 기능성의 초기 동적 염증 유도 변화에 대한 세포 반응 및 그러한 반응에 대한 조직 반응을 동정 및 조절하기 위한 수단을 제공하는 부가적 생성물, 방법 및 검정이 필요하다. 그러한 생성물, 방법 및 검정은 상기 언급한 것들과 같은, 수많은 의학적 조건 및 절차들에 이점을 제공할 것이다.
정의
본원에서의 "폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태(steady state) 수준의 변경"은 건강한 개인의 정상적 활성 또는 정상 상태에 비한, 폴리펩티드에 의해 발휘되는 생물학적 활성 및 단백질의 정상 상태 수준의 임의의 검출가능한 변화를 의미한다.
본원에서의 "효능제"는 생물학적 활성, 바람직하게는 폴리펩티드, 수용체 또는 그것의 리간드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자로서 정의된다. 길항제는 그러한 생물학적 활성을 부분적으로나 완전히 막거나, 억제하거나, 중화하는 임의의 분자이다.
혈관 장애의 용어 "치료"는 특히 개인의 하나 이상의 증상을 감소 또는 경감시키는 것, 또는 하나 이상의 증상이 악화 또는 진전되는 것을 막는 것, 회복을 촉진하거나 예후를 개선시키는 것, 및/또는 질병이 없는 개인으로부터 질병을 예방하는 것, 또한 상기 존재 질병의 진전을 완화시키거나 감소시키는 것을 가리킨다. 소정의 개인에게 있어, 증상의 개선, 그것의 악화, 퇴보 또는 진전은 객관적 또는 주관적 측정법에 의해 결정될 수 있다. 치료 효능은 사망률 또는 치사율의 개선(예컨대, 선택된 모집단에 대한, 생존 곡선의 연장)으로서 측정될 수 있다.
내피/혈관 장벽의 증가된 투과능은 그것이 더 잘 누출되도록 한다(즉, 덜 치밀하고, 더 투과가능하게 함). 내피/혈관 장벽의 감소된 투과능은 더욱 치밀하게 만든다(즉, 덜 누출되게 하고, 덜 투과가능하게 함). 이에 따라 혈관 장애의 치료는 혈관 투과능을 감소시키는 것을 의미하고, 반면 이에 따라 약물 전달을 증가시키는 것은 증가된 혈관 투과능을 요한다. BCEC-아스트로사이트 동시배양물로부터의 BCEC에서의 비제어된 본 발명의 LPSS 폴리펩티드는 증가된 혈관 투과능에 관여한다. BCEC-아스트로사이트 동시배양물로부터의 BCEC에서 하향제어된 본 발명의 LESS 폴리펩티드는 증가된 혈관 투과능에 관여한다. BCEC 단층 및 BCEC- 아스트로사이트 동시배양물 간의 차등적으로 상향- 또는 하향제어되는 본 발명의 LESS 폴리펩티드는 염증성 자극으로부터의 회복능에 관여한다(도 2).
내피 투과능의 조절
본 발명의 첫번째 측면은 내피 세포의 투과능의 조절 방법에 관한 것이다. 방법은 내피 세포에서 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 변경하는 것을 포함한다. 본원에서의 서열 동일성 또는 유사성은 하기 기재된 바와 같이 정의된다. 내피 세포는 바람직하게 혈관 내피 세포, 더욱 바람직하게는 미세혈관 내피 세포이다. 가장 바람직하게는, 내피 세포는 미세혈관이거나, 혈액-중추신경계 (CNS) 장벽, 예컨대 뇌혈관 장벽, 혈액-망막 장벽, 혈액-신경 장벽, 혈액-척수 장벽 중 하나의 일부이거나 그것들을 구성하는 내피세포이고, 이들 중 뇌 미세혈관 내피 세포가 가장 바람직하다.
그러한 내피 장벽 세포는 예컨대 특정 내피 세포 마커, 특정 장벽 마커에 의해, 또한 장벽 기능적 검정에 의해, 인-시츄(in-situ), 엑스-시츄(즉, 단리된 모세혈관 내), 또는 생체외에서 특성화될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 내피 세포는 그것의 인-시츄 형태, 즉 혈관주위의 혈관주위세포가 있고, 그 위에 아스트로사이트 종말단추가 돌출된, 연속적 기저 라미나에 의해 둘러싸인 단일(또는 3개 이하의) 연속 연결 내피 세포에 의해 형성된 직경이 약 10 내지 20 마이크로미터인 관형 구조에 의해 특성화될 수 있다. 인-시츄 및 엑스-시츄, 및 생체외, 장벽상 내피 세포는 1 내지 5 마이크로미터 두께이고, 많은 미토콘드리아들을 가지며, 치밀 결합에 의해 연결되고, 세포간 틈새가 없고, 개창술(fenestration)이 없으며, 포음 소낭이 거의 없고, 예컨대 전자현미경으로 관찰될 수 있다. 생체외 모세혈관 구조는 배양물 내 그것의 형태, 즉 약 10 내지 20 마이크로미터의 직경, 50 내지 200 마이크로미터의 길이를 가지는 관형 구조에 의해 특성화될 수 있다. 생체외, 내피 세포는 배양물 내의 그것의 형태, 즉 예컨대 상-대조 현미경에 의해 관찰될 수 있는 바와 같이, 중심의 타원형 핵을 가지는 방추 모양(합류시) 및 자갈 모양(예컨대 모세혈관으로부터 클러스터로 성장할 때)에 의해 특성화될 수 있다. 그것들은 또한 일반적 내피 세포 특이적 마커 및 기능, 예컨대 분화(CD) 항원(VCAM(CD106), CD31, EN-4, ICAM, E-셀렉틴, PECAM, RBA)의 내피 특이적 클러스터, 카드헤린, 인테그린, 액틴, 비멘틴, 인자 VIII 관련(vWF), 콜라겐 I 및 IV, 피브로넥틴, 기질 메탈로프로테이나제, 메탈로프로테이나제의 조직 억제제의 발현; 비-혈전형성; 낮은 백혈구 응착, 혈관작용 화합물(질산화물, 엔도텔린-1 및 프로스타사이클린)의 방출; DiI-표지-아세틸화 저밀도 지질단백질(DiI-Ac-LDL)의 흡취; 렉틴 결합; 안지오텐신 커버 효소, 알칼리성 포스파타제, 모노아민 옥시다제 및 음이온성 부위의 존재의 패널을 이용함으로서 특성화될 수 있다. 게다가, 치밀 결합 또는 치밀 결합-관련 단백질(ZO-1)의 가시화 및 기준 화합물(예컨대, (알부민에 결합하는) 에반스 블루(Evans blue), 만니톨, 수크로스, 플루오레신, 덱스트란, 알부민, AIB)의 제한된 세포간 I 수송; 소낭성 수송의 부재; PAL-E와 같은 비-장벽 마커의 부재; 감마-글루타밀-트랜스펩티타제(γ-GTP)의 발현; P-당단백 (Pgp), 다중-약물 내성 단백질 1 - 7, 글루코스 수송물질, 뉴클레오티드 수송물질, 유기 음이온 수송물질, 크고 중성의 아미노산 수송물질의 발현 및 기능성; 트랜스페린 수용체, 인슐린-성장 인자 수용체, 스캐빈저 수용체; 변연 F-아가틴 국소화 및 많은 미토콘드리아의 발현과 같은 전형적 장벽 마커 및 기능을 사용할 수 있으나, 이들은 모두 내피 세포에 대해 특이적이지 않다. 이 마커의 (기능적) 발현은, 예컨대 분자생물학적, 생화학적, (면역)-조직(세포)화학적 기술에 의해, 또한 알려진 기질, 리간드 및/또는 수송 시스템의 억제제를 이용하는 기능적 검정에 의해 결정될 수 있다. 이 마커는 국제적 과학 저널들 (de Boer 등, 1999, Eur J Pharm Sci. 8(1): 1-4; Hotman 등, 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci. (5): 895-901, Schlingemann 등, 1997, Ophthalmic Res. 29(3): 130-8; Schlingemann 등, 1999, Diabetologia. 42(5): 596- 602; Vorbrodt 등, 1986, Brain Res. 394(1): 69-79; Dai 등, 2002, Brain Res. 954(2): 311-316)에 기재되어 검토되었다.
본원에서의 내피 세포의 투과능은 화합물[이는 이온(예컨대, Na+, K+, Ca2 +), 물, 영양소(예컨대, 글루코스, 아미노산), 대사물, 신경전달물질(예컨대, 글루탐산, 트립토판), 호르몬, 펩티드, 혈장 단백질(예컨대, 알부민, 피브리노겐, 면역글로불린, 사이토킨, 성장 인자), 세포 및 생체이물(예컨대, 약물, 진단 마커)일 수 있음]은 상피 내의 내피 세포 층으로, 또는 그 층을 가로질러, 바깥으로 둘러싸는 방향 또는 그 역방향으로 수송되거나 가로질러 확산될 수 있는 용이함의 척도이다. 내피 세포의 투과능의 변화는 또한 소정의 화합물[이는 영양소 (예컨대, 글루코스, 아미노산), 대사물, 신경전달물질(예컨대, 글루탐산, 트립토판), 호르몬, 펩티드, 혈장 단백질(예컨대, 알부민, 피브리노겐, 면역글로불린, 사이토킨, 성장 인자), 세포 및 생체이물(예컨대, 약물, 진단 마커)일 수 있음]의 내피 생물학적 변형의 결과일 수 있다. 투과능의 조절은 투과능의 증가 및 감소를 모두 포함한다. 투과능은 실시예에 기재된 바와 같이 내피통과 전기저항(TEER)을 결정함으로써 편리하게 생체외 결정될 수 있다. TEER은 세포 간의 치밀 결합을 통해 이온의 투과능을 정량화하기 위한 감도있는 측정법이다. 본 발명의 방법에서, 내피 세포의 투과능의 조절은 바람직하게 적어도 20, 50, 100, 300 또는 1000%의 TEER의 변화를 가져오는 조절이다 (Gaillard 등, 2000b, Eur J Pharm Sci. 12(2): 95 102). 투과능을 결정하기 위한 다른 방법에는 예컨대, 분자생물학적, 생화학적, (면역)-조직(세포)화학적 기술에 의해, 또한 알려진 기질, 리간드 및/또는 수송물질 시스템의 억제제를 이용하는 기능적 검정에 의한 투과능 조절과 관련된 상기 기재된 내피/장벽 마커의 (기능적) 발현의 변화를 증명하는 것이 포함된다. 더욱 구체적으로, 투과능의 변화는, 예컨대 전자현미경에 의해 관찰될 수 있는, 치밀 결합 발현의 소실, 세포 간 틈새의 출현, 개창술 및/또는 포음 소낭의 수 및 위치결정에 의해 증명될 수 있다 (HoLman 등, 2001, 이하 상기한 바와 동일함). ZO-1, PAL-E, RBA, F-액틴, 인자 VIII 관련 항원 (vWF), γ-GTP, Pgp, 글루코스 수송물질, PECAM; 인테그린, 카드헤린-5, 트랜스페린 수용체, 렉틴-결합 부위 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 내피 투과능 관련 내피 세포 마커의 발현 수준 변화는 모두 내피 투과능의 지시자이다 (Gaillard 등, 2001, 이하 상기한 바와 동일함; de Boer 등, 1999, 이하 상기한 바와 동일함; Schlingemann 등, 1997, 이하 상기한 바와 동일함; Schlingemann 등, l999, 이하 상기한 바와 동일함; Tio 등, 1990, 이하 상기한 바와 동일함; Vorbrodt 등, 1986, 이하 상기한 바와 동일함; Dai 등, 2002, 이하 상기한 바와 동일함). (예컨대, 베라파밀, PSC-833, 온도에 의해) 극성 및 활성의 억제가능한 기준 화합물 (예컨대, 만니톨, 수크로스, 플루오레신, 덱스트란, 알부민)의 제한된 세포간 수송, 내피 세포 층을 가로지르는 Pgp-기질 (로다민 123, 빈블라스틴 등) 또는 트랜스페린의 수송에 대한 기능적 검정은 은 내피 투과능의 변화에 대한 지시자이다 (Gaillard 등, 2000, 이하 상기한 바와 동일함; Gaillard 등, 2001, 이하 상기한 바와 동일함).
내피 세포의 생체내 투과능은 (예컨대, 분자생물학적, 생화학적, (면역)-조직(세포)화학적 기술에 의해, 또한 알려진 기질, 리간드 및/또는 수송물질 시스템의 억제제에 의한) 생체외 상황에 대해 상기한 바와 같은 투과능 조절에 관여하는 내피 장벽 마커의 (기능적) 발현의 변화의 입증에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 내인성 (예컨대, 피브리노겐, IgG) 또는 (형광- 또는 방사능표지) 외인성 (예컨대, (알부민에 결합하는) 에반스 블루, 만니톨, 수크로스, 플루오레신, 덱스트란, 알부민, AIB) 기준 화합물의 분출은 뇌 흡취 지수 (BUI, Oldendorf, 1970 Brain Res. 24(2):372-376), 뇌 방출 지수 (BEI, Kakee 등, 1996 J Pharmacol Exp Therap. 277(3):1550-1559), 인-시츄 살포 (Takasato 등, 1984 Am J Physiol. 247(3 Pt 2): H484-493), 단일 또는 다중 통과 뇌 살포 (Brodie 등, 1960 J Pharmacol Exp Ther. 130: 519-528), CSF 샘플링 (단일 충격 반응(unit impulse response), van Bree 등, 1989. J. Pharmacokin. Biopharm. 17(4): 441 462), 위치 양전자단층촬영술 (PET, Hendrikse 등, 1998 Br J Pharmacol. 124(7): 1413-1418), 자기 공명 기술(MRI, MRS, Jenkins 등, 1999! Ann N Y Acad Sci. 893:214-242), 정량 자기방사술(QAR, Smith, 1989 In I Implications of the blood-brain barrier and its manipulation, vol. 1: Basic science aspects. New York: Plenum Publ. Corp., ed. EA Neuwelt, 85-118), 및 뇌내 미세투석법 (de Lange 등, 2000 Adv Drug Deliv Rev. 45(2-3): 125-148)와 같은, 수개의 생체내 샘플링 방법들에 의해, (면역)-조직(세포)화학적 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은, 예컨대 LPSS 폴리펩티드를 외인성 원으로부터의 내피 세포에 제공하거나, LPSS 폴리펩티드의 길항제 또는 억제제를 내피 세포, 예컨대 LPSS 폴리펩티드에 대한 항체에 첨가함으로써 폴리펩티드 자체의 수준에서 변경될 수 있다. 외인성 원으로부터 LPSS 폴리펩티드를 제공하기 위해, LPSS 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같은 적당한 숙주 세포에서 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 편리하게 생성될 수 있다. LPSS 폴리펩티드에 대한 항체는 하기와 같이 수득할 수 있다.
대안적으로, LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준을 제어함으로써 변경시킬 수 있다. 바람직하게, 뉴클레오티드 서열의 발현 수준은 내피 세포에서 제어된다. LPSS 폴리펩티드의 발현 수준은 내피 세포로의 발현 벡터의 도입에 의해 상향제어될 수 있으며, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동(driving)할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다. LPSS 폴리펩티드의 발현 수준은 내피 세포로의 발현 벡터의 도입에 의해 또한 상향제어될 수 있고, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 뉴클레오티드 서열의 트랜스-활성화할 수 있는 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
대안적으로, LPSS 폴리펩티드의 발현 수준은 세포에 안티센스 분자를 제공함으로써 하향제어될 수 있고, 여기에서 안티센스 분자는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 분자는 그대로 제공되거나, 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써 제공될 수 있으며, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다. LPSS 폴리펩티드의 발현 수준은 또한 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써 하향제어될 수 있고, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 뉴클레오티드 서열의 트랜스-억제할 수 있는 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일반적으로, LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은 하기에 의해 변형될 수 있다:
1. 예컨대, 이하를 제공함으로써, 유전자 발현을 증가시킴,
(a) LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(b) LPSS 폴리펩티드 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(c) LPSS 폴리펩티드 수용체의 효능제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터 LPSS에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(d) LPSS 폴리펩티드 수용체의 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 프로모터 LPSS에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터.
2. 예컨대, 이하를 포함하는 임의의 기능적 RNA 분자를 제공함으로써 유전자 발현을 감소시킴, 예컨대 [Famulok 등(2002, Trends Biotechnol., 20(11): 462-466)]에 의해 최근 검토됨;
(a) LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 분자;
(b) LPSS 폴리펩티드 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 분자;
(c) LPSS 폴리펩티드 수용체 효능제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 분자;
(d) LPSS 폴리펩티드 수용체 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 분자;
(e) LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(f) LPSS 폴리펩티드 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(g) LPSS 폴리펩티드 수용체 효능제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터;
(h) LPSS 폴리펩티드 수용체 길항제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 핵산 서열이 프로모터에 작용적으로 연결된 발현 또는 유전자 치료 벡터.
3. 예컨대, 이하를 포함하는 효능제;
(a) LPSS 폴리펩티드의 완전 또는 부분 효능제, 예컨대,
(i) 자연 리간드;
(ii) LPSS 폴리펩티드 또는 그것의 단편;
(iii) 펩티드모의체;
(iv) 효능제 항체 또는 항체 단편;
(v) 작은 분자, 또는 또 다른 하나의 약물;
(b) LPSS 폴리펩티드 수용체의 완전 또는 부분 효능제, 예컨대
(i) 자연 리간드;
(ii) LPSS 폴리펩티드 또는 그것의 단편;
(iii) 펩티드모의체;
(iv) 효능제 항체 또는 항체 단편;
(v) 작은 분자, 또는 또 다른 하나의 약물.
4. 예컨대, 이하를 포함하는 길항제;
(a) LPSS 폴리펩티드의 완전 또는 부분 길항제, 예컨대
(i) 자연 길항제;
(ii) LPSS 폴리펩티드 단편;
(iii) 펩티드모의체;
(iv) 길항 또는 중성화 항체 또는 항체 단편;
(v) 작은 분자, 또는 또 다른 하나의 약물,
(b) LPSS 폴리펩티드 수용체의 부분 또는 역 효능제, 예컨대
(i) 자연 리간드;
(ii) LPSS 폴리펩티드 단편;
(iii) 펩티드모의체;
(iv) 항체 또는 항체 단편;
(v) 작은 분자, 또는 또 다른 하나의 약물,
(c) LPSS 폴리펩티드 수용체의 완전 또는 부분 길항제
(i) LPSS 폴리펩티드 수용체의 자연 길항제;
(ii) LPSS 폴리펩티드 단편;
(iii) 펩티드모의체;
(iv) 길항 또는 중화 항체 또는 항체 단편;
(v) 작은 분자, 또는 또 다른 하나의 약물.
따라서, 본 발명의 방법에서, 내피 세포의 투과능은 바람직하게 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 증가시킴으로써 감소된다. 더욱 바람직하게, 투과능은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 비제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택되는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 증가시킴으로써 감소된다. LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은, 예컨대 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써, 상기 수단들 중 임의의 수단에 의해 증가시킬 수 있고, 여기에서 상기 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다.
대안적으로, 본 발명의 방법에서, 내피 세포의 투과능은 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 감소시킴으로써 감소시킬 수 있다. 더욱 바람직하게, 투과능은 비제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 비제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 감소시킴으로써 감소된다. LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은 상기 수단들 중 임의의 수단에 의해 감소될 수 있고, 예컨대 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써 감소시킬 수 있고, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다.
본 발명의 방법에서, 내피 세포의 투과능은 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 더욱 바람직하게, 투과능은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 비제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택되는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 감소시킴으로써 감소된다. LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은. 예컨대 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써 상기 수단들 중 임의의 수단에 의해 증가시킬 수 있고, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다.
대안적으로, 본 발명의 방법에서, 내피 세포의 투과능은 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 더욱 바람직하게, 투과능은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 상향제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택되는 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 증가시킴으로써 감소된다. LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은 상기 수단들 중 임의의 수단에 의해 감소될 수 있으며, 예컨대 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준은, 예컨대 발현 벡터를 내피 세포에 도입함으로써 감소시킬 수 있고, 여기에서 발현 벡터는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 안티센스 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다.
미세혈관 투과능 변형 장애의 치료 또는 예방
또 다른 한 측면에서, 본 발명은 대상자의 미세혈관 투과능 변형 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 방법은 서열번호 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의, 대상자의 미세혈관 내피 세포 내에서의 활성 또는 정상 상태 수준을 약물학적으로 변경시키는 것을 포함한다. 바람직하게, 그 변경은 미세혈관 투과능 변형 장애의 증상을 감소시키기에 충분하다. 방법은 바람직하게 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드, 또는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 상기 열거된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 변경시키는데 유효한 또 다른 하나의 실체를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게, 그 방법에서, LPSS 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게, 투과능은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 상향제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 증가시킴으로써 감소된다. 핵산 분자는 바람직하게 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있는 유전자 치료 벡터이다.
대안적으로, 그 치료 방법은 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이고, 여기에서 길항제는 바람직하게 LPSS 폴리펩티드에 대한 항체이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다. 동일한 효과가 유전자 치료 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법으로 달성될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 바람직하게 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22 에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 안티센스 뉴클레오티드 서열은 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 치료 방법에서, 미세혈관 투과능 장애는 바람직하게 신경퇴행성 장애, 예컨대 뇌혈관질환(CVA), 알쯔하이머병(AD), 혈관-관련 치매, 크로츠펠트-야콥병(CJD), 소해면양뇌증(BSE), 파키슨병(PD), 뇌 외상, 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤 무도병; CNS 요소에서의 말초 장애, 예컨대 패혈성 쇼크, 간선 뇌장애, (당뇨)고혈압, 당뇨 미세혈관병증, 수면병, 휘플병, 뒤시엔느 근위 영양증(DMD), 아스파르틸글루코스아민뇨증, 콜레스테롤 에스테르 축적증, 월만병, 시스틴증, 다논병, 페브리병, 파버 지방육아종증, 파버병, 푸코시드축적증, I/II형 갈락토시알리도시스, I/II/III형 고셔병, 고셔병, 거대 세포 백질이양증, 크라베병, II 글리코겐 축적증, 폼페병, I/II/III형 GM1-강글리오시도시스, I형 GM2-강글리오시도시스, 테이삭스병, II형 GM2-강글리오시도시스, 샌드호프병, GM2-강글리오시도시스, I/II형 알파-만노축적증, 만노축적증, 이염성 백질이양증, I형 뮤코리피드증, I/II형 시알리도시스, II/III형 뮤코리피드증, 1-세포병, IIIC형 뮤코리피드증, 유사-허얼러 폴리디스트로피, I형 뮤코폴리삭카라이드증, II형 뮤코폴리삭카라이드증, 헌터증후군, IIIA형 뮤코폴리삭카라이드증, 산필리포증후군, IIIB형 뮤코폴리삭카라이드증, IIIC형 뮤코폴리삭카라이드증, IIID형 뮤코폴리삭카라이드증, 뮤코폴리삭카라이드증 IVA형 모르키오증후군, 뮤코폴리삭카라이드증 IVB형 모르키오증후군, VI형 뮤코폴리삭카라이드증, VII형 뮤코폴리삭카라이드증, 슬라이증후군, IX형 뮤코폴리삭카라이드증, 다발성 술파타제 결핍증, 신경 세로이드 리포푸스신증, CLN1 바텐병, A/B형 니이만-픽병, 니이만-픽병, C1형 니이만-픽병, C2형 니이만-픽병, 농축이골증, VII형 쉰들러병, 쉰들러병, 및 정지산 축적증, 자간(전)증, 신경정신 장애, 예컨대 우울증, 자폐증, 불안 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD), 신경정신 전신성 홍반성 낭창, 양극성 장애, 정신분열증 및 기타 정신병, 기타 CNS 장애, 예컨대 뇌 종양, 간질, 편두통, 기면증, 불면증, 만성피로증후군, 고산병, 뇌염, 수막염, AIDS-관련 치매, 및 신생혈관형성-관련 장애, 예컨대 혈관 종양, 증식성 유리체망막증, 류마티스 관절염, 크론병, 동맥경화증, 난소 과자극, 건선, 혈관신생 관련의 자궁내막증, 풍선혈관형성술에 후속하는 재협착, 반흔 조직 과생산, 말초 혈관 질병, 고혈압, 염증성 맥관염, 레이노병, 레이노 현상, 동맥류, 동맥 재협착, 혈전성정맥염, 림프관염, 임파부종, 상처 치료 및 조직 수복, 허혈재관류손상, 협심증, 심근경색증, 만성심장질환, 울혈성 심부전과 같은 심부전, 노화성 황반 변성, 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상자에게, 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 LPSS 폴리펩티드, 또는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 상기 열거된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 변형하는데 유효한 또 다른 하나의 실체를 포함하는 약제학적 조성물을 미세혈관 투과능을 증가시키기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, LPSS 폴리펩티드는 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열이 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있는 유전자 치료 벡터이다. 이 방법에서, 미세혈관 투과능에서의 투과능 증가의 가역성은 바람직하게 뉴클레오티드 서열의 일시적 발현만을 가능하게 하는 유전자 치료 벡터(하기 참고), 및/또는 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터를 이용함으로써 달성된다. 더욱 바람직하게, 유도성 프로모터는 작은 유기 또는 무기 화합물의 투여에 의해 유도될 수 있는 프로모터이다(하기 참고).
대안적으로, 대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법일 수도 있고, 여기에서 길항제는 바람직하게 LPSS 폴리펩티드에 대한 항체이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 l9), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 비제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된다. 유사하게, 방법은 또한 유전자 치료 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상자에게 투여하는 단계를 또한 포함할 수 있고, 여기에서 유전자 치료 벡터는 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기에서 안티센스 뉴클레오티드 서열은 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 비제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된다.
대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 방법은 혈액-매개성, 막 비투과성 약물을 뇌로 전달하기를 원할 때 유리하게 적용될 수 있다. 약물은 뇌혈관에 정상적으로 비투과성이거나, 적어도 불충분하게 투과하는, 임의의 약제학적으로, 수의학적으로 또는 진단적으로 유용한 화합물 또는 화합물들의 조성물일 수 있다. 그와 달리 약물의 약물학적 성질은 중요하지 않다. 그러므로 본 발명은 뇌혈관 장벽과 같은 생리학적 장벽을 가로지르는 광범위한 약물의 전달에 유용하다. 그러나, 본 발명의 이 측면에 의한 전달을 위한 1차적 후보물질들 중에는, 항-종양 화합물, 예컨대 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 시스플라틴, 및 하기 정의된 기타 항종양제 또는 세포독성 약물 (예컨대, PCT 출원 영문 제24-27면 참고); 신경퇴행질환의 치료에 사용되는 성장 인자, 예컨대 NGF, RDNF 및 CNTF; 이미징제, 특히 항체 기재의 이미징제, 및 뇌혈관 장벽을 통과하지 않는 신경전달물질 길항제 또는 효능제 (예컨대, 일부 NMDA 수용체 차단물질)이 있음이 예상된다.
미국을 제외한 대부분의 국가들의 경우, 다른 한 측면에서, 본 발명은 미세혈관 투과능 변형 장애를 치료 또는 예방하는 의약품의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 각종 용도들에 관한 것이다. 예컨대, 그러한 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드, 또는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 상기 열거된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 변형하는데 유효한 또 다른 하나의 실체의, 미세혈관 투과능 변형 장애의 치료를 위한 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 바람직하게, LPSS 폴리펩티드는 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 상향제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된다. 핵산 분자는 바람직하게 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터이고, 여기에서 뉴클레오티드 서열은 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다. 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 길항제도 또한 미세혈관 투과능 변형 장애의 치료 또는 예방을 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있고, 여기에서 길항제는 바람직하게 LPSS 폴리펩티드에 대한 항체이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터로서, 상기 안티센스 뉴클레오티드 서열이 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있는 상기 벡터는 미세혈관 투과능 변형 장애의 치료 또는 예방을 위한 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다.
미세혈관 투과능 변형 장애를 치료하는 의약품을 제조하기 위한 본 발명의 화합물의 상기 용도들에서, 장애는 바람직하게 상기한 바와 같은 미세혈관 투과능 변형 장애이다.
유사하게, 미국을 제외한 대부분의 국가들에서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 의약품 또는 조성물의 제조를 위한 본 발명의 화합물의 각종 용도들에 관한 것이다. 바람직하게, 화합물은 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드, 또는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 상기 열거된 LPSS 폴리펩티드의 활성 또는 정상 상태 수준을 변형하는데 유효한 또 다른 하나의 실체이다. 바람직하게, LPSS 폴리펩티드는 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21 및 22에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16 및 17), 차등 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 18), 및 비제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22)로 구성된 군으로부터 선택된다. 핵산 분자는 바람직하게 유전자 치료 벡터이고, 여기에서 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있다.
대안적으로, 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드의 길항제는, 대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 여기에서 바람직하게 길항제는 LPSS 폴리펩티드에 대한 항체이다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 비제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 비제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된다. 또는, 서열번호 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 23, 24 및 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터로서, 상기 안티센스 뉴클레오티드 서열이 내피 세포, 바람직하게 미세혈관 내피 세포에서 안티센스 뉴클레오티드 서열의 발현을 추동할 수 있는 프로모터의 조절 하에 있는 상기 벡터는 대상자의 미세혈관 투과능을 가역적으로 증가시키는 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 하향제어된 분비 인자(서열번호 2, 3, 4 및 23), 하향제어된 신호 전달 경로(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11), 차등 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 19), 하향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 20), 및 차등 상향제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 유전자 치료 벡터는 일시적 발현을 위한 벡터(하기 참고)이고/이거나, 바람직하게는 유도성 프로모터이다. 더욱 바람직하게, 유도성 프로모터는 작은 유기 또는 무기 화합물의 투여에 의해 유도될 수 있는 프로모터이다(하기 참고).
미세혈관 내피 장벽에의 표적화
다른 한 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 - 25에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드에 대해 그 제제, 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 담체를 표적화함으로써, CNS 또는 미세혈관 장애가 있거나 그것이 생길 위험이 있는 환자에게 치료제 또는 진단제를 투여함으로써 CNS 또는 미세혈관 장애를 치료 또는 진단하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 신경활성제 또는 그것의 담체는 서열번호 1, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 - 25에 표시된 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 상향제어된 LPSS 폴리펩티드에 표적화된다. 더욱 바람직하게, 아미노산 서열은 상향제어된 분비 인자(서열번호 1, 13, 14 및 22), 상향제어된 신호 전달 경로(서열번호 5, 12, 15, 16, 17 및 19), 상향제어된 수용체 및 접착 분자(서열번호 21 및 22), 및 상향제어된 대사적 효소(서열번호 23 - 25)의 아미노산 서열들로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 서열번호 21 또는 22에 표시된 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 가지는 상향제어된 LPSS 폴리펩티드이다.
표적화제는 LPSS 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, LPSS 폴리펩티드 효능제, LPSS 폴리펩티드 길항제, 펩티드모의체, 작은 분자, 또는 LPSS 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 또 다른 하나의 화합물에 대한 항체일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 비특이적 상호작용과 상당히 다른 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 가지지 않는 유사한 구조의 분자, 예컨대 특이적 결합 서열이 결여된 유사 크기의 펩티드인 대조 분자의 결합이 대비하여, 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 특이적 결합은 분자가 대조 분자보다 LPSS 폴리펩티드에 대한 친화성이 상당히 더 큰 경우에 존재한다. 결합 특이성은, 예를 들어 표적에 대해 결합하는 것으로 알려진 대조 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 본원에 사용되는 "특이적 결합"은 저친화성 및 고친화성 특이적 결합들을 모두 포함한다. 특이적 결합은 예컨대, 약 10-4 M 이상의 Kd를 가지는 저친화성 표적화제에 의해 나타날 수 있다. 예컨대, LPSS 폴리펩티드는 표적화제에 대한 하나 초과의 결합 부위를 가질 경우, 저친화성을 가지는 표적화제는 미세혈관 상피세포를 표적화하는데 유용할 수 있다. 특이적 결합은 또한 고친화성 표적화제, 예컨대 약 10-7 M 이상, 약 10-8 M 이상, 약 10-9 M 이상, 약 10-10 M 이상의 Kd를 가지는 표적화제에 의해 나타날 수 있거나, 혹은 적어도 약 10-11 M 또는 10-12 M 또는 그 이상의 Kd를 가질 수 있다. 저친화성 및 고친화성 모두의 표적화제가 미세혈관 상피세포를 표적화하는데 유용하다.
표적화제는 바람직하게 치료제 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 담체에 포합된다. "포합체"는 본원에서, 함께 공유 결합되는 2개의 실체로 구성되는 것으로 정의된다. 본 발명의 영역 내에서, 첫번째 실체는 주로 본원에서 상기 정의된 바와 같은 표적화제일 것이며, 반면 두 번째 실체는 치료 또는 진단 단자, 예컨대 CNS 또는 미세혈관 장애의 치료 또는 진단에 유용한 분자 또는 구조물일 수 있다.
그러한 치료 또는 진단용 단자는 예컨대, 항-종양 화합물, 예컨대 항종양제 또는 세포독성 약물, 예컨대 알킬화제, 예컨대 메클로르에타민(Mechlorethamine) 히드로클로라이드 [질소 머스타드)(Nitrogen Mustard), 머스타르겐(Mustargen), HN2)], 시클로포스파미드(Cyclophosphamide) [사이토반(Cytovan), 엔독사나(Endoxana)], 이포스파미드(Ifosfamide)(IFEX), 클로람부실(Chlorambucil) [류케란(Leukeran)], 멜팔란(Melphalan) [페닐알라닌 머스타드(Phenylalanine Mustard), L-사르콜리신, 알케란(Alkeran), L-팜(L-PAM)], 부술판(Busulfan) [미에란(Myleran)], 티오테파(Thiotepa) [트리에틸렌티오포스포르아미드(Triethylenethiophosphoramide)], 카르무스틴(Carmustine)(BiCNU, BCNU), 로무스틴(Lomustine)(CeeNU, CCNU), 스트렙토조신(Streptozocin)(Zanosar) 등, 식물 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴(Vincristine) [온코빈(Oncovin)], 빈블라스틴 [벨반(Velban), 벨베(Velbe)], 파클리탁셀(Paclitaxel) [탁솔(Taxol)] 등; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate)(MTX), 머캅토푸린(Mercaptopurine) [푸리네톨(Purinethol), 6-MP], 티오구아닌(Thioguanine)(6-TG), 플루오로우라실(Fluorouracil)(5-FU), 시타라빈(Cytarabine) [시토사르(Cytosar)-U, Ara-C], 아카시티딘(Azacitidine) [마일로사르(Mylosar), 5-AZA] 등; 항생제, 예컨대 닥티노마이신(Dactinomycin) [악티노마이신(Actinomycin) D, 코스메겐(Cosmegen)], 독소루비신(Doxorubicin) [아드리아마이신(adriamycin)], 다우노루비신(Daunorubicin) [다우노마이신(daunomycin), 세루비딘(Cerubidine)], 이다루비신(Idarubicin) [이다마이신(Idamycin)], 블레오마이신(Bleomycin) [블레녹산(Blenoxane)], 피카마이신(Picamycin) [미트라마이신(Mithramycin), 미트라신(Mithracin)], 미토마이신(Mitomycin) [무타마이신(Mutamycin)] 등, 및 기타 항세포증식제, 예컨대 히드록시우레아(Hydroxyurea) [히드레아(Hydrea)], 프로카르바진(Procarbazine) [무탈란(Mutalane)], 다카르바진(Dacarbazine)(DTIC Dome), 시스플라틴(cisplatin) [플라티놀(Platinol)], 카르보플라틴(Carboplatin) [파라플라틴(Paraplatin)], 아스파라기나제(Asparaginase) [엘스파르(Elspar)], 에토포시드(Etoposide)(VePesid, VP-16-213), 암사르크린(Amsarcrine)(AMSA, m-AMSA), 미토탄(Mitotane) [리소드렌(Lysodren)], 미톡산트론(Mitoxantrone) [노바트론(Novatrone)] 등; 게피티니브(gefitinib) [ZD1839 또는 이레사(Iressa)TM] 및 이마티니브 메실레이트 [글리이벡(Gleevec)
Figure 112009028088773-pct00001
또는 글리벡(Glivec)
Figure 112009028088773-pct00002
]; 항체를 포함하는 항암 생물 약제학적 약물 [리툭산(Rituxan)
Figure 112009028088773-pct00003
또는 리툭시마브(rituximab); 헤르셉틴(Herceptin)
Figure 112009028088773-pct00004
또는 트라스투주마브(trastuzumab); 제발린(Zevalin)
Figure 112009028088773-pct00005
또는 이브리투모마브 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(방사능표지됨); 에르비툭스(Erbitux)
Figure 112009028088773-pct00006
또는 세툭시마브; 아바스틴(Avastin)TM 또는 베바시주마브 또는 rhuMAb-VEGF) 및 사이토킨(인트론
Figure 112009028088773-pct00007
또는 알파-인터페론; 프로류킨
Figure 112009028088773-pct00008
IL-2 또는 알데스류킨)] (체성 종양의 뇌 대사 또는 1차적 뇌 종양의 치료를 위함); 항체를 포함하는 항-염증성 약물 [엔브렐(Enbrel)
Figure 112009028088773-pct00009
또는 이태너셉트(etanercept); 레미케이드(Remicade)
Figure 112009028088773-pct00010
또는 이플릭시마브(infliximab); 시물렉트(Simulect)
Figure 112009028088773-pct00011
또는 바실릭시마브(basiliximab); 제나팍스(Zenapax)
Figure 112009028088773-pct00012
또는 다클리주마브(daclizumab); 키네레트(Kineret)
Figure 112009028088773-pct00013
또는 아나킨라(anakinra); 졸라이르(Xolair)
Figure 112009028088773-pct00014
또는 오말리주마브(omalizumab); 후미라(Humira)
Figure 112009028088773-pct00015
또는 아달리무마브(adalimumab); 안테그렌(Antegren)
Figure 112009028088773-pct00016
또는 나탈리주마브(natalizumab); RhuFabTM 또는 라니비주마브(ranibizumab); 랍티바(Raptiva)TM 또는 에팔리주마브(efalizumab)] 및 사이토킨, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타 [아보넥스(Avonex)
Figure 112009028088773-pct00017
또는 인터페론 베타-la; 베타세론(Betaseron)
Figure 112009028088773-pct00018
/베타페론(Betaferon)
Figure 112009028088773-pct00019
또는 인터페론 베타-lb; 레비프(Rebif)
Figure 112009028088773-pct00020
또는 인터페론-베타-la), 인터페론-감마, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 5 (IL-5), 인터류킨 6 (IL-6), TNF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 [GM-CSF: 류킨(Leukine)
Figure 112009028088773-pct00021
또는 사르그라모스티(sargramostim)], 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: 뉴포겐(Neupogen)
Figure 112009028088773-pct00022
또는 필그라스팀(filgrastim)), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 혈소판-유도 성장 인자(PDGF); (예컨대, 신경퇴행 장애 관련의 신경염증을 치료하기 위함); 신경촉진 인자(예컨대, NGF 또는 신경 성장 인자; BDNF 또는 뇌 유래 신경촉진 인자; NT3 또는 뉴로트로핀-3; NT4 또는 뉴로트로핀-4; NT5 또는 뉴로트로핀-5; RDGF 또는 망막 유도의 성장 인자; CNTF 또는 모양체 신경촉진 인자; 악티빈(activin); bFGF 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자; aFGF 또는 산성 섬유아세포 성장 인자; GDNF 또는 신경교세포주 유래 신경촉진 인자 또는 뉴블라스틴, 아르테민 또는 에노빈, 프레세핀, 뉴투린; CTGF 또는 결합조직 성장 인자; EGF 또는 상피 성장 인자); 에리트로포이에틴(EPO)[프로크리트(Procrit)
Figure 112009028088773-pct00023
/에프렉스(Eprex)
Figure 112009028088773-pct00024
또는 에리트로포이에틴 알파; 에포겐(Epogen)
Figure 112009028088773-pct00025
또는 에리트로포이에틴; 네오레코르몬(NeoRecormon)
Figure 112009028088773-pct00026
또는 에리트로포이에틴 베타; 아라네스프(Aranesp)
Figure 112009028088773-pct00027
또는 다르베포이에틴 알파]; 성장 호르몬 또는 소마토트로핀[후마트로프(Humatrope)
Figure 112009028088773-pct00028
; 프로트로핀(Protropin)
Figure 112009028088773-pct00029
/누트로핀(Nutropin)
Figure 112009028088773-pct00030
; 세로스팀(Serostim)
Figure 112009028088773-pct00031
; 사이젠(Saizen)
Figure 112009028088773-pct00032
]; 항-NogoA Mab(IN-1); Nogo66 억제제(NEP1 40)의 NogoA 길항제(예컨대, 신경퇴행 장애를 치료하기 위함); 효소 (예컨대, 세레자임(Cerezyme)
Figure 112009028088773-pct00033
또는 글루코세레브로시다; 알두라자임(Aldurazyme)TM 또는 라로니다제; 아리플라제(Aryplase)TM 또는 아릴술파타제 B; I2S 또는 이두로네이트-2-술파타제; 알파-L-이두로니다제; N-아세틸갈락토사민 4-술파타제; 페닐라제; 아스파르틸글루코사미니다제; 산 리파제; 시스테인 수송물질; 람프-2; 알파 갈락토시다제 A; 산 세라미다제; 알파-L-푸코시다제; ss-헥소사미니다제 A; GM2 활성자 결핍; 알파-D-만노시다제; ss-D-만노시다제; 아릴술파타제 A; 사포신 B; 뉴라미니다제; 알파-N-아세틸글루코사미니다제 포스포트랜스퍼라제; 포스포트랜스퍼라제 7-서브유니트; 헤파란-N-술파타제; a-N-아세틸글루코사미니다제; 아세틸CoA: N-아세틸트랜스퍼라제; N-아세틸글루코사민 6-술파타제; 갈락토스 6-술파타제; O-갈락토시다제; 히알루로노글루코사미니다제; 다발성 술파타제; 팔미토일 단백질 티오에스테라제; 트리펩티딜 펩티다제 I; 산 스핑고미엘리나제; 콜레스테롤 소통; 카텝신 K; 알파-갈락토시다제 B; 시알산 수송물질; SOD 또는 Cu/Zn 과산화물 디스뮤타제) (예컨대, 리소좀 축적증 또는 기타 신경퇴행 장애(및 그와 관련된 신경증상)을 치료하기 위함); 뇌-작용 호르몬 및 신경전달물질, 예컨대 소마토스타틴, 옥시토신, 바소프레신, 구아라닌, VIP, 아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH), 콜레시스토키닌(CCK), 물질-P, 봄베신, 모틸린, 글리센틴, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1); 및 뉴로펩티드 및 그것의 유도체, 예컨대 펩티드 YY(PYY), 뉴로펩티드 Y(NPY), 췌장 폴리펩티드(PP), 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 엔도르핀, 엔케팔린, 뉴로텐신, 뉴로메딘 K, 뉴로메딘 L, 칼시토닌 관련 펩티드(CGRP), 엔도텔린, ANP("심방 나트륨배설촉진 펩티드"), BNP("뇌 나트륨배설촉진 펩티드"), CNP(C-형 나트륨배설촉진 펩티드"), 및 PACAP("뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 펩티드"); 이미징제, 특히 항체 기재의 이미징제; 뇌혈관 장벽을 통과하지 않는 신경전달물질 길항제 또는 효능제(예컨대, 일부 NMDA 수용체 차단물질); 항생제, 예컨대 아미노글리코시드, 예컨대 아미카신, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 디히드로스트렙토마이신, 포르티미신, 겐타미신, 이세파미신, 카나마이신, 미크로노미신, 네오마이신, 네틸미신, 파로마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 트로스펙토마이신; 암페니콜, 예컨대 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 테이마페니콜; 안사마이신, 예컨대 리파미드, 리팜핀, 리파마이신, 리파펜틴, 리팍시민; 베타-락탐, 예컨대 카르바세펨, 카르바페넴, 세팔로스포린, 세파마이신, 모노박탐, 옥사펨, 페니실린; 린코사미드, 예컨대 클리나마이신, 린코마이신; 마크롤리드, 예컨대 클라리트로마이신, 디르트로마이신, 에리트로마이신 등; 폴리펩티드, 예컨대 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신 등; 테트라사이클린, 예컨대 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린 등; 합성 항세균제, 예컨대 2,4-디아미노피리미딘, 니트로푸란, 퀴놀론 및 그것의 유사체, 술폰아미드, 술폰; 항진균제, 예컨대 폴리엔, 예컨대 암포테리신 B, 칸디시딘, 데르모스타틴, 필리핀, 펑기크로민, 하키마이신, 하마이신, 루센소마이신, 메파르트리신, 나타마이신, 니스타틴, 페실로신, 페리마이신; 합성 항진균물질, 예컨대 알릴아민, 예컨대 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀; 이미다졸, 예컨대 비포나졸, 부토코나졸, 클로르단토인, 클로르미다졸 등; 티오카르바메이트, 예컨대 톨시클레이트, 트리아졸, 예컨대 플루코나졸, 이트라코나졸, 테르코나졸; 구충제, 예컨대 아레콜린, 아스피딘, 아스피디놀, 디클로로펜, 엠벨린, 코신, 나프탈렌, 니클로사미드, 펠레티에린, 퀴나크린, 알란토락톤, 아모카르진, 아모스카네이트, 아스카리돌, 베페늄, 비토스카네이트, 사염화탄소, 카르바크롤, 자크롤, 시클로벤다졸, 디에틸카르바마진 등; 항말라리아제, 예컨대 아세다프손, 아모디아퀸, 아르테에테르, 아르테메테르, 아르테수네이트, 아토바퀀, 베베에린, 베베린, 키라타, 클로르구아니드, 클로로퀸, 클로르프로가우닐, 신코나, 신코니딘, 신코닌, 시클로구아닐, 겐티오피크린, 할로판트린, 히드록시클로로퀸, 메플로퀸, 히드로클로라이드, 3-메틸아르사세틴, 파마퀸, ㅍ프플라스모시드, 프리마퀸, 피리메타민, 퀴나크린, 퀴닌, 퀴닌, 퀴노시드, 퀴닌, 이염기성 나트륨 아르세네이트; 항원충제, 예컨대 아크라닐, 티니다졸, 이프로니다졸, 에틸스티바민, 펜타미딘, 아세트아르손, 아미니트로졸, 아니소마이신, 니푸라텔, 티니다졸, 벤지다졸, 수라민 등; 폴리펩티드(바람직하게 네프리라이신, 및 단백질, 펩티드, 효소, 사이토킨, 인터류킨, 호르몬 및 본원에서 상기 기재한 바와 같은 성장 인자들)를 코딩하는 유전자 (발현 벡터 및/또는 프로모터, 바람직하게 GFAP- 및/또는 감마-GTP 프로모터 포함), 또는 폴리펩티드의 안티센스 DNA; 및 안티센스 프로프(핵산 또는 펩티드 핵산)일 수 있다. 치료 또는 진단 부분과 표적화제 간의 직접적 포합에 부가하여, 그러한 치료 또는 진단 단자는 나노컨테이너, 예컨대 나노입자, 리포솜 또는 나노겔 내에서 캡슐화될 수 있고, 그 안에서 표적화제는 바람직하게 그러한 나노컨테이너에 공유결합된다. 나노컨테이너에 대한 그러한 포합은 직접적인 것이거나, 공지된 중합체성 포합제, 예컨대 스핑고미엘린, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 기타 유기 중합체 중 임의의 것, 및 단일 표적화제 또는 공지된 표적화제와 함께, 또는 뇌혈관 장벽 및 뇌 세포 막 상의 인슐린, 트랜스페린, IGF, 렙틴, LRP (1B) 또는 LDL 수용체에 대한 공지된 뇌혈관 장벽 표적 단자들 중 임의의 것과 조합되어 이루어질 수 있다. 표적화된 (PEG) 리포솜을 포함하는 그러한 약제학적 조성물의 제조의 상세 내용이 US 특허 No.6,372,250에 기재되어 있다.
치료 또는 진단 부위에 표적제를 접합시키기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되었다. 이러한 방법은, 예를 들어 헤르만슨(Hermanson)에 의한 [1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press], US 6,180,084호 및 US 6,264,914호에 개시되었으며, 응용 면역학에 통상 사용되는 담체 단백질에 합텐을 결합시키기 위해 사용되는 방법을 포함한다 (참조: Harlow ans Lane, 1988, "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 일부의 경우, 접합 과정 또는 이 과정에 사용된 화학 그룹에 따라 접합시에 표적제 또는 치료 또는 진단 부위가 효능 또는 기능을 손실할 수 있다고 인식되고 있다. 그러나, 주어진 각종 접합 방법에서 당업자들은 접합되는 엔터티의 효능 또는 기능에 영향을 미치지 않거나 또는 최소한으로 영향을 미치는 접합 방법을 찾아낼 수 있다.
치료 또는 진단 부위에 표적제를 접합시키기에 적합한 방법은 예를 들어 카보디이미드 접합을 포함한다 (Bauminger and Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70: 151-159). 또한, 치료 또는 진단 부위는 네이기 등에 의한 바와 같이 표적제에 커플링될 수 있다 [각각 본 원에 참고로 인용되는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7269-7273(1996); 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1794-1799(1998)]. 사용하기에 적합할 수 있는 다른 접합 방법은 예를 들어 과요오드화나트륨 산화후, 적합한 반응물을 환원적으로 알킬화하고 글루타르알데히드 가교결합시키는 것이다.
표적제 및 치료 부위 둘다가 (폴리)펩티드인 경우 특히 유리한 접합 방법이 적용될 수 있다. 이 경우, 두 엔터티는 표적제 및 치료 펩티드 둘 모두의 아미노산 서열을 포함하는 싱글 (폴리)펩티드 사슬로 합성될 수 있다. 표적제 및 치료 펩티드의 아미노산 서열 합이 50, 80 또는 100개의 아미노산을 넘지 않는 경우, 접합체는 본 원에 상술된 고체상 펩티드 합성으로 합성될 수 있다. 또한, 아미노산 서열 합이 표적제 및 치료 펩티드를 포함하는 싱글 (폴리)펩티드 사슬보다 큰 경우, 접합체는 본 원에 후술하는 바와 같이 재조합 발현 기술로 제조될 수 있다. 이 경우, 예를 들어 각각의 표적제 및 치료 펩티드를 코딩하는 두개의 핵산 서열이 프레임에 작동가능하게 결합하여 단일 개방 판독 프레임을 형성할 수 있다. 이어서, 단일 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산 서열은 적합한 숙주에서 발현에 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 이때 접합체는 본 원에 후술하는 바와 같이 회수후, 임의로 추가로 정제될 수 있다. 이 방법에서, 표적 펩티드는 치료 펩티드상에 또는 그의 양 말단부에 위치할 수 있거나, 각각의 펩티드의 효능 또는 기능을 방해하지 않는 하나 이상의 위치에서 치료 펩티드의 아미노산 서열내에 삽입될 수 있다. 당업자들은 통상적인 방법을 이용하여 치료 펩티드에 대한 표적 펩티드(들)의 최적의 위치를 확립할 수 있다.
미세혈관 투과성 진단
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 미세혈관 투과성 상태를 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 바람직하게는 하기 단계 (a) 및 (b)로 구성된다: (a) 대상체의 미세혈관 내피에서 서열 번호 1-25에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현 수준을 결정하고; (b) 핵산 서열의 발현 수준과 핵산 서열의 발현 수준에 대한 기준값을 비교하는 단계(여기에서, 기준값은 바람직하게는 건강한 개체의 미세혈관 내피에서의 발현 수준의 평균값이다). 핵산 서열의 발현 수준은 핵산 서열에 의해 코딩되는 LPSS 폴리펩티드의 양을 정량화함으로써 간접적으로 결정될 수 있다. 바람직한 방법으로, 복수개의 핵산 서열의 발현 수준이 비교된다. 복수개의 핵산 서열이 분석되는 경우, 이는 하기 설명 및 실시예에 기술된 상보 핵산을 포함하는 마이크로어레이를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 발현 수준은 대상체로부터 수득한 샘플에서 생체밖에서 결정될 수 있다. 이 방법은 바람직하게는 미세혈관 투과 장애를 진단하거나 미세혈관 투과 장애 민감성을 진단하는 방법으로, 여기에서 미세혈관 투과성은 상술된 바와 같을 수 있다. 이 방법은 또한 미세혈관 투과성의 복원 치료 효능을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
내피 투과성을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝
본 발명의 다른 측면은 미세혈관 내피세포의 투과성을 조절할 수 있는 물질을 동정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 바람직하게는 하기 단계 (a) 내지 (e)로 구성된다: (a) 서열 번호 1-25에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 발현할 수 있는 시험 세포 군집을 제공하고; (b) 시험 세포 군집을 시험하고자 하는 물질을 포함하는 조성물과 접촉시킨 후; (c) 물질과 접촉된 시험 세포 군집에서 서열 번호 1-25에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 가지는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현 수준을 결정하며; (d) 핵산 서열의 발현을 물질과 접촉되지 않은 시험 세포 군집에서의 핵산 서열의 발현 수준과 비교하고; (e) 물질과 접촉된 시험 세포 군집 및 물질과 접촉되지 않은 시험 세포 군집의 핵산 서열의 발현 수준 차를 야기하는 물질을 동정하는 단계. 이 방법에서, 핵산 서열의 발현 수준은 핵산 서열에 의해 코딩된 LPSS 폴리펩티드의 양을 정량화하여 간접적으로 측정할 수 있다. 복수개의 핵산 서열의 발현 수준이 비교될 수 있다. 바람직한 방법으로, 시험 세포 군집은 내피세포, 바람직하게는 혈관 내피세포, 보다 바람직하게는 미세혈관 내피세포, 가장 바람직하게는 뇌 미세혈관 내피세포를 포함한다. 시험 세포 군집의 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다. 바람직하게, 이 방법에서 물질과 접촉된 시험 세포 군집 및 물질과 접촉되지 않은 시험 세포 군집은 하나의 세포 군집, 바람직하게는 하나의 세포주, 보다 바람직하게는 하나의 세포로부터 유래된다. 또 다른 바람직한 방법으로, 시험 세포 군집은 조력세포 군집과 공배양되며, 이때 시험 세포 군집은 필터의 한쪽 면에서 배양되며, 조력 세포 군집은 필터의 다른 면에서 배양되고, 조력 세포는 바람직하게는 아스트로사이트를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 LPSS 폴리펩티드
본 발명자들은 본 원에서 혈관 투과성 증가에 관여하는 특이적이고 차별적으로 발현된 폴리펩티드를 개시한다. 따라서, 본 발명자들은 이들 폴리펩티드를 "리포폴리사카라이드-민감성" 폴리펩티드 또는 LPSS 폴리펩티드로 언급하기로 한다. LPSS 폴리펩티드는 뇌혈관 장벽 기능의 조절에 관여하는 수개의 상이한 타입의 메카니즘에 연루된다. 이들은 분비 인자, 시그널 형질도입 경로, 수용체, 부착 분자 및 대사 효소를 포함한다. 이하, LPSS 폴리펩티드 및 이들 메카니즘을 좀 더 상세히 논의하기로 하겠다. 공지 또는 적용가능한 각 LPSS 폴리펩티드에 대해 하기 정보가 주어진다:
· LPSS 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 코딩(서열 목록)
· 수용체, 수용체 작용제, 수용체 길항제;
· 작용제 LPSS 폴리펩티드 또는 단편(들);
· 완전 또는 부분 LPSS 폴리펩티드 수용체 작용제(들);
· 작용성 펩티도미메틱(peptidomimetic)(들);
· 작용성 항체 또는 항체 단편(들);
· 작용성 소형 분자 또는 다른 약물;
· 길항성 LPSS 폴리펩티드 단편(들);
· 길항성 펩티도미메틱(들);
· 길항성 소형 분자 또는 다른 약물;
· 길항성 또는 중화 항체 또는 항체 간편(들);
· 부분 또는 역 LPSS 폴리펩티드 수용체 작용제;
· 완전 또는 부분 LPSS 폴리펩티드 수용체 길항제.
당업자들은 이들 각 엔터티가 본 원에 개시된 본 발명의 방법에 적용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
분비 폴리펩티드
세포외로 분비되거나 작동가능한 LPSS 폴리펩티드(호르몬, 효소, 성장인자, 사이토킨, 케모킨, 결합 단백질 등)는 바람직하게는 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하거나 추적하는데 사용된다. 본 발명자들은 pre-B-세포 콜로니-증가 인자, 골 형태형성 단백질 4, 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2, 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6, 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자(디프테리아 독소 수용체) 및 포스포리파제 A2, 그룹 VII을 포함하여 상기의 새로운 특이적이고 차별적으로 발현된 수개의 폴리펩티드를 동정하였다. 이하, 디프테리아 독소 수용체(서열 번호 22) 및 포스포리파제 A2, 그룹 VII(서열 번호 23)을 제외한 상기 성분들을(각각 수용체 및 부착 분자 및 대사 효소) 다른 섹션에서 좀더 상세히 논의하였다.
pre-B-세포 콜로니-증가 인자를 코딩하는 PBEF 유전자(서열 번호 1; LPSS01)는 BCEC 단층 및 BCEC-아스트로사이트 공배양물 둘다에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다(표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. pre-B-세포 콜로니-증가 인자는 초기 B-리니지(lineage) 전구체 세포상에 작용하는 사이토킨이다. 이는 줄기세포 인자(MGF) 및 인터류킨 7(IL7)의 pre-B-세포 콜로니 형성 활성을 증가시킨다. PBEF 유전자 또는 pre-B-세포 콜로니-증가 인자가 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, PBEF(pre-B-세포 콜로니-증가 인자)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. pre-B-세포 콜로니-증가 인자 활성은 PBEF 유전자의 안티센스 저해에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, pre-B-세포 콜로니-증가 인자 활성은 PBEF 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 pre-B-세포 콜로니-증가 인자에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 또한, Ognjanovic 등(2001, J Mol Endocrinol. 26(2): 107-117)은 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있는 pre-B-세포 콜로니-증가 인자에 대한 유용한 항체를 개발하였다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, PBEF 단백질에 대한 항체뿐 아니라 PBEF 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
골 형태형성 단백질 4를 코딩하는 BMP4 유전자(서열 번호 2, 3 및 4; LPSS02)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 하향조정된다 (표 1 및 표 2). 하향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 골 형태형성 단백질 4 (또는 골 형태형성 단백질 2B(BMP2B 또는 BMP2B1) 또는 ZYME)는 전환 성장인자-베타 슈퍼패밀리의 일부인 골 형태형성 단백질 패밀리의 멤버이다. 슈퍼패밀리는 성장 및 분화 인자의 대형 패밀리를 포함한다. 골 형태형성 단백질은 뼈외 부위에서 연골내 골신생을 생체내로 유도하는 탈무기질화 골 추출물의 활성에 의해 최초로 동정되었다. 이러한 특정 패밀리 멤버는 인간에서 연골내 골형성을 개시하는데 중요한 역할을 하며, 발현 감소는 유전적 장애 선천골화섬유형성이상을 포함하여 각종 골 질환과 연관된다. 이 유전자의 5' 비해독 영역에서 또 다른 스플라이싱이 밝혀졌고 세개의 변이체가 설명되었으며, 이들은 모두 동일한 단백질을 코딩한다. BMP4 유전자 또는 골 형태형성 단백질 4가 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, BMP4 유전자 산물(골 형태형성 단백질 4)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 골 형태형성 단백질 4 활성은 BMP4 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 내피세포를 골 형태형성 단백질 4 저해제 노긴 또는 코르딘에 노출하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 골 형태형성 단백질 활성은 BMP4 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 골 형태형성 단백질에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 또한, R&D Systems Europe Ltd.(UK)는 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있는 골 형태형성 단백질 4에 대한 유용한 항체를 개발하였다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, BMP4 단백질에 대한 항체뿐 아니라 BMP4 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2를 코딩하는 LTBP2 유전자(서열 번호 13; LPSS06)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다(표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2(이전에 LTBP3으로 공지되었다)는 세포외 매트릭스에서 tgf-베타 결합에 관여한다. 이는 tgf-베타 기능을 조절하는데 중요한 메카니즘을 제공한다. 비정형 마르판 증후군(atypical Marfan Syndrome)의 두 경우에서 LTBP2의 돌연변이가 동정되었다. LTBP2 유전자 또는 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2가 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, LTBP2 유전자 산물(잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2 활성은 LTBP2 유전자의 안티센스 저해에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2 활성은 LTBP2 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 또한, Elastin Products Company, Inc.(Missouri, USA)는 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있는 잠재성 전환 성장인자 베타 결합 단백질 2에 대한 유용한 항체를 개발하였다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, LTBP2 단백질에 대한 항체뿐 아니라 LTBP2 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6을 코딩하는 TNFAIP6 유전자(서열 번호 14; LPSS07)는 BCEC 단층 및 BCEC-아스트로사이트 공배양물 둘다에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다(표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6(또는 종양 괴사 인자-자극 유전자-6 또는 TSG6 또는 히알루로네이트-결합 단백질 또는 종양 괴사 인자-유도성 단백질 6 또는 종양 괴사 인자 알파-유도성 단백질 6)는 히알루로난-결합 도메인을 함유하는 분비 단백질이며, 따라서 히알루로난-결합 단백질 패밀리의 한 멤버이다. 히알루로난-결합 단백질은 세포외 매트릭스 안정성 및 세포 이동에 관여하는 것으로 알려졌다. 이 단백질은 인터-알파-저해제(I 알파 I)와 안정한 복합체를 형성하는 것으로 나타났으며, 따라서 염증에 수반되는 프로테아제 네트워크에 중요한 I 알파 I의 분비 프로테아제 저해제 활성을 증가시킨다. 이러한 유전자의 발현은 정상 섬유모세포, 말초 혈액 단핵세포, 윤활세포 및 연골세포에서 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨-1 및 LPS에 의해 유발될 수 있다. 발현은 또한 혈관 평활근세포에서 메카니즘적 자극에 의해 유도될 수 있으며, 프로테오글리칸 합성 및 응집과 상호관련이 있는 것으로 밝혀졌다. TNFAIP6은 부착 수용체 CD44와 유사하다. TNFAIP6 유전자 또는 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, TNFAIP6 유전자 산물(종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6 활성은 TNFAIP6 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 TNFAIP6 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6 활성은 TNFAIP6 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 종양 괴사 인자 알파-유도 단백질 6에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, TNFAIP6 단백질에 대한 항체뿐 아니라 TNFAIP6 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
시그널 형질도입 경로
세포내 시그널 형질도입 경로에 연루되는 폴리펩티드가 바람직하게는 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 사용된다. 본 발명자들은 망막모세포종-결합 단백질 6, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마, 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질, GTP-결합 단백질 RHO6, 포스듀신 이성체(isoform) 포스듀신-유사 단백질/오르판 1, 칼레티큘린 전구체 및 G 단백질-커플링된 수용체 유도 단백질을 포함하여 특이적으로 차별화된 수개의 새로운 발현 폴리펩티드를 동정하였다. 이하, 이에 대해 좀 더 상세히 설명하기로 하겠다.
망막모세포종-결합 단백질 6을 코딩하는 RBBP6 유전자(서열 번호 5; LPSS03)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다(표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 망막모세포종-결합 단백질 6(또는 RBQ-1 또는 DKFZp761B2423)은 도처에서 발현된 핵 단백질이다. 세포 증식을 조절하는 망막모세포종 단백질에 직접 결합하는 수개의 단백질이 발견되었다. 이것은 포스포릴화부족 망막모세포종 단백질과 우선적으로 상호작용한다. RBBP6 유전자 또는 망막모세포종-결합 단백질 6의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, RBBP6 유전자 산물(망막모세포종-결합 단백질 6)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 망막모세포종-결합 단백질 6 활성은 RBBP6 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 RBBP6 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 망막모세포종-결합 단백질 6 활성은 RBBP6 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 망막모세포종-결합 단백질 6에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, RBBP6 단백질에 대한 항체뿐 아니라 RBBP6 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마를 코딩하는 CAMK2G 유전자(서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11; LPSS04)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 하향조정된다 (표 1 및 표 2). 하향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마 (또는 CAMK, CAMKG, CAMK-11, MGC26678)는 세린/트레오닌 단백질 키나제 패밀리 및 Ca(2+)/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 서브패밀리에 속한다. 칼슘 시그널링은 글루탐산성 시냅시스에서 수개의 형성성(plasticity) 측면에서 중요하다. 포유동물 세포에서 효소는 알파, 베타, 감마 및 델타의 네개의 상이한 사슬로 구성된다. 이 유전자의 산물은 감마 사슬이다. 오늘날, 여섯개의 상이한 이성체를 코딩하는 여섯개의 교대로 스플라이싱된 변이체가 특정화되었다. 상이한 이성체를 코딩하는 추가의 다른 스플라이스 변이체가 밝혀졌으나, 그의 전장 성질은 결정되지 않았다. CAMK2G 유전자 또는 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, CAMK2G 유전자 산물 (또는 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마 활성은 CAMK2G 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 CAMK2G 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마 활성은 CAMK2G 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제(CaM 키나제) II 감마에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, CAMK2G 단백질에 대한 항체뿐 아니라 CAMK2G 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다. 또한, Bui 등 (2000, Cell 100 (4): 457-67)은 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽을 특이적으로 조사하는데 유용할 수 있는 CaMKIIgammaB*(T287D), CaMKIIgammaB의 부분 칼슘-비의존성 돌연변이체를 발현하는 형질전환 마우스를 생산하였다.
대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질을 코딩하는 MACMARCKS 유전자(서열 번호 12; LPSS05)는 BCEC 단층 및 BCEC-아스트로사이트 공배양물 둘다에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다 (표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질 (또한 F52, 또는 MARCKS-유사 단백질 또는 MLP 또는 MLP1, 또는 MARCKS-관련 단백질, MRP로도 칭해진다)은 칼모듈린 시그널 형질도입 및 단백질 키나제 C 시스템을 커플링하는 작용을 한다. 이는 중추 신경계 발달에 관여한다. MACMARCKS 유전자 또는 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, MACMARCKS 유전자 산물(대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질 활성은 MACMARCKS 유전자의 안티센스 저해 또는 MACMARCKS 단백질에 대한 항체에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질 활성은 MACMARCKS 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 대식세포 미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C 키나제 기질에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, MACMARCKS 단백질에 대한 항체뿐 아니라 MACMARCKS 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다. 또한, Wu 등 (1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93(5): 2110-2115)은 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽을 특이적으로 조사하는데 유용할 수 있는 F52-결손 마우스를 생산하였다.
GTP-결합 단백질 RHO6을 코딩하는 RHO6 유전자(서열 번호 15; LPSS08)는 BCEC 단층 및 BCEC-아스트로사이트 공배양물 둘다에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다 (표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. GTP-결합 단백질 RHO6 (또는 round1, RND1)는 액틴 세포골격 및 세포 부착 조절에 관여한다. RHO6은 ARHE(또는 RND3 또는 Rho8 또는 RhoE)와 매우 유사하다. RHO6 유전자 또는 GTP-결합 단백질 RHO6이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, RHO6 유전자 산물(GTP-결합 단백질 RHO6)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. GTP-결합 단백질 RHO6 활성은 RHO6 유전자의 안티센스 저해 또는 RHO6 단백질에 대한 항체에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, GTP-결합 단백질 RHO6 활성은 RHO6 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 GTP-결합 단백질 RHO6에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, RHO6 단백질에 대한 항체뿐 아니라 RHO6 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1을 코딩하는 PDC 유전자(서열 번호 16 및 17; LPSS09)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다(표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 포스듀신(포스듀신-유사 단백질 또는 PhLP1, 또는 포스듀신, 솔방울샘, 또는 G 베타 감마 결합 단백질 또는 33kDA 광형질도입 단백질, 또는 PHD 또는 MEKA로도 또한 공지되었음)은 망막에서 막대세포의 외부 및 내부 세그먼트에 위치한다. 포스듀신은 시각적 광형질도입 조절 또는 광수용체 대사의 통합에 참여할 수 있다. 포스듀신은 망막 G-단백질 트랜스듀신의 베타 및 감마 서브유니트와의 상호작용으로 광형질도입 캐스케이드를 조절한다. 두개의 교대로 스플라이싱된 전사 변이체가 밝혀졌다. 변이체에 의해 코딩된 이성체중 하나인 포스듀신-유사 오르판 단백질은 G 단백질에 결합하지 않는다. 포스듀신 단백질 및 그의 이성체이 또한 다른 조직에 존재하여 시그널 형질도입 경로에 참여할 수 있다. 이러한 단백질을 코딩하는 유전자가 망막색소변성 및 어셔 증후군(Usher syndrome) 타입 II에 대한 가능성 있는 후보 유전자이다. PDC 유전자, 또는 포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, PDC 유전자 산물(포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1 활성은 PDC 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 PDC 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1 활성은 PDC 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 포스듀신 이성체 포스듀신-유사 단백질/오르판 1에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, PDC 단백질에 대한 항체뿐 아니라 PDC 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
칼레티큘린 전구체를 코딩하는 CALR 유전자(서열 번호 18; LPSS10)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 차별적으로 하향조정된다(표 1 및 표 2). BCEC 단층과 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 차별적으로 하향조정된 LPSS 폴리펩티드는 LPS 자극으로부터의 회수 성능에 연루된다 (도 2). 칼레티큘린 (또는 자가항원 Ro, 또는 시카 증후군(Sicca syndrome) 항원 A 또는 SSA 또는 cC1qR)은 세포질 세망 주머니에서 주요 Ca(+2)-결합(저장) 단백질로 작용하는 다기능성 단백질이다. 이는 또한 핵에서 발견되는데, 이는 전사 조절에 한 역할을 담당할 수 있음을 제시한다. 칼레티큘린은 핵 수용체의 슈퍼패밀리의 DNA-결합 도메인에 있는 아미노산 서열과 거의 동등한 합성 펩티드 KLGFFKR에 결합한다. 칼레티큘린은 항-Ro/SSA 항체를 함유하는 전신성 루푸스 및 쇼그렌병 환자의 특정 영역 항체에 결합하고, 종에서 고도로 보존되며, 세포질 및 근육세포질 세망에 위치하여 칼슘에 결합할 수 있다. 칼레티큘린의 아미노 말단은 글루코코르티코이드 수용체의 DNA-결합 도메인과 상호작용하여 수용체가 그의 특이적 글루코코르티코이드 반응 원소에 결합하는 것을 방지한다. 칼레티큘린은 안드로겐 수용체가 그의 호르몬-반응성 DNA 원소에 결합하는 것을 방해하여 생체내에서 안드로겐 수용체 및 레티노산 수용체 전사 활성뿐 아니라 레티노산-유도된 신경세포 분화를 저해할 수 있다. 따라서, 칼레티큘린은 핵 호르몬 수용체에 의한 유전자 전사의 조절에 중요한 조절제로서 작용할 수 있다. 전신성 홍반성 루푸스는 칼레티큘린에 대한 자가항체 역가 증가와 관련이 있으나, 칼레티큘린은 Ro/SS-A 항원이 아니다. 초기 논문은 칼레티큘린을 Ro/SS-A 항원으로 언급하였으나, 이는 후에 입증되지 않았다. 인간 칼레티큘린에 대한 자가항체 역가 증가는 IgG 및 IgM 양 부류의 선청성 완전 심장차단을 앓고 있는 유아에서 발견되고 있다. CALR 유전자 또는 칼레티큘린 전구체의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, CALR 유전자 산물(칼레티큘린 전구체)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 칼레티큘린 전구체 활성은 CALR 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 CALR 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 칼레티큘린 전구체 활성은 CALR 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 칼레티큘린 전구체에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, CALR 단백질에 대한 항체뿐 아니라 CALR 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질을 코딩하는 C8FW 유전자 (서열 번호 19; LPSS11)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 차별적으로 상향조정된다 (표 1 및 표 2). BCEC 단층 및 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 차별적으로 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 LPS 자극으로부터의 회수 성능에 연루된다(도 2). C8FW (또는 GIG2)은 인테림 유전자 부호이며, 분열촉진 경로에 의해 조절되는 인단백질을 칭한다. 이러한 G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질은 단백질 키나제와 유사하다. C8FW 유전자 또는 G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, C8FW 유전자 산물(G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질 활성은 C8FW 유전자의 안티센스 저해에 의해 또는 C8FW 단백질에 대한 항체를 사용하여 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질 활성은 C8FW 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 G-단백질에 커플링된 수용체 유도된 단백질에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, C8FW 단백질에 대한 항체뿐 아니라 C8FW 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
수용체 및 부착 분자
막(시그널링 또는 내재화) 수용체 또는 (시그널링) 부착 분자로 작용하는 폴리펩티드가 바람직하게는 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하기 위해 사용된다. 본 발명자들은 케모킨(C-X-C 모티브) 수용체 4, 성장 호르몬 수용체 및 디프테리아 독소 수용체(헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자)를 포함하여 특이적이고 차별적으로 발현된 수개의 새로운 폴리펩티드를 동정하였다. 이하, 이들에 대해 좀 더 상세히 설명하기로 하겠다.
케모킨(C-X-C 모티브) 수용체 4를 코딩하는 CXCR4 유전자(서열 번호 20; LPSS12)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 하향조정된다(표 1 및 표 2). 하향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 케모킨 수용체 4는 CXC 사이토킨에 결합하는 G 단백질-커플링된 수용체이다. 이는 세포내 칼슘 플럭스를 매개한다. 케모킨 수용체 4는 MAPK, 세포자멸사, 화학주성, 조직발생 및 기관형성, 면역반응, 염증반응, 침습성장, 신경발생, 바이러스 및 발병력(세포내 HIV-1 유입에 대한 공동수용체) 반응 활성화에 관여한다. 어떤 성질을 조사하느냐에 따라, 이 단백질은 신경펩티드 Y 수용체 Y3(NPY3R); 퓨진(fusin); 백혈구-유래 7-막-도메인 수용체(LESTR); 7-막-세그먼트 수용체, 비장; 리포폴리사카라이드(LPS)-연관 단백질 3(LAP3), 각종 명칭(HM89, NPYR, HSY3RR, NPYY3R, D2S201E)으로 지칭된다. CXCR4 유전자 또는 케모킨 수용체 4의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, CXCR4 유전자 산물(케모킨 수용체 4)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 케모킨 수용체 4 활성은 CXCR4 유전자의 안티센스 저해 또는 CXCR4 단백질에 대한 항체를 포함하는 케모킨 수용체 4 길항제에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 케모킨 수용체 4 활성은 CXCR4 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 케모킨 수용체 4에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 지금까지 다음과 같은 CXCR4 길항제가 밝혀졌다: 펩티드 화합물 (T22, T134, T140, ALX40-4C, CGP64222), 비사이클람 유도체 (AMD3100), 중화 항체 (12G5, 44717-111) 및 천연 길항제 (HIV-1 tat 단백질) (Sachpatzidis et al., 2003, J Biol Chem 278 (2): 896-907; De Clercq et al., 2001, Antivir ChemChemother 12 Suppl 1:19-31; Tamamura et al., 1998, Biochem Biophys Res Commun 253(3): 877-882). 지금까지, 다음과 같은 CXCR4 작용제가 밝혀졌다: 펩티드 화합물(RSVM, ASLW) 및 천연 작용제(간질세포-유래 인자 1 알파 및 베타(CXCL12) (Sachpatzidis et al., 2003, 상동). 또한, R&D Systems Europe Ltd.(UK)는 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있는 재조합 인간 및 마우스 CXCL12 및 케모킨 수용체 4에 대한 유용한 항체 및 그의 리간드 CXCL12를 제공하였다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, CXCR4 단백질에 대한 항체뿐 아니라 CXCR4 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
성장 호르몬 수용체를 코딩하는 GHR 유전자 (서열 번호 21; LPSS13)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다 (표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다. 생물학적 활성 성장 호르몬은 그의 막 수용체(GHR)에 결합하고, 이량화하여 세포내 시그널 형질도입 경로를 활성화하여 인슐린-유사 성장인자 I(IGF1)의 합성 및 분비를 야기한다. 혈장에서, IGF1은 가용성 IGF1 수용체(IGF1R)에 결합한다. 표적 세포에서, 이러한 복합체는 시그널-형질도입 경로를 활성화하여 분열촉진 및 동화 반응을 야기하여 성장하도록 한다. GHR은 또한 GHR의 세포외 호르몬-결합 영역으로부터 유도된 성장 호르몬 결합 단백질(GHBP)로도 알려져 있으며, GHBP는 순환시에 성장 호르몬에 결합하여 순환시에 성장 호르몬을 안정화시키는 작용을 한다. GHR 유전자 또는 성장 호르몬 수용체의 발현이 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실이 이전에는 보고되지 않았고, 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 따라서, GHR 유전자 산물(성장 호르몬 수용체)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 성장 호르몬 수용체 활성은 GHR 유전자의 안티센스 저해, 성장 호르몬 수용체 길항제(고농도의 성장 호르몬 포함하여 후에 길항적으로 된다) 또는 GHR 단백질에 대한 항체에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 성장 호르몬 수용체 활성은 GHR 유전자를 세포에 도입하거나, 외인성 성장 호르몬 수용체(유사 성장 호르몬)에 내피세포를 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, GHR 단백질에 대한 항체뿐 아니라 GHR 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
디프테리아 독소 수용체 (또는 헤파린-결합 외피 성장인자-유사 성장인자)를 코딩하는 DTR(또는 HEGFL) 유전자 (서열 번호 22; LPSS14)는 BCEC-아스트로사이트 공배양물에서 LPS에 2시간 동안 노출후 BCEC에서 상향조정된다 (표 1 및 표 2). 상향조정된 LPSS 폴리펩티드는 혈관 투과성 증가에 연루된다.
디프테리아 독소 수용체(또는 HB-EGF 또는 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자 전구체 또는 디프테리아 독소 감수성, DTS로도 지칭)는 코리네박테리움 디프테리애의 용원화 균주에 의해 생산된 강력한 외독소인 디프테리아 독소(DT)에 대한 수용체이다. DT, 58 kDa 단백질은 감수성 포유동물 세포를 죽이는 다기능성 단백질이다. 이는 둘다 중독 과정에 필요한 두개의 디설파이드-결합된 단백질 단편으로 구성된다. A-단편은 진핵세포 연장 인자 2의 ADP-리보실화를 촉매화하여 단백질 합성을 저해한다. B-단편은 세포에 독소 결합에 관여하며, A-단편을 세포질로 유입하는 것을 돕는데 필수적이다. 특이적 세포-표면 DT 수용체의 존재가 1973년에 최초로 입증되었고, 현재 DT는 수용체-매개된 세포내 이입을 통해 감수성 포유동물 세포에 유입되는 것으로 밝혀졌다. 초기 단계는 DT를 DTR에 결합시키고, 코팅된 피트에 독소:수용체 복합체를 내재화시킨 후, 세포질에 A-단편을 전위시키는 단계를 포함한다. 실제로, 세포 수용체에 DT 독소 결합후, 세포내 이입되며, 세포내 이입된 소포에서 산성 pH 환경에 노출된다. 산성 pH는 독소 분자의 구조 변화를 야기하여 막 삽입 및 세포질로의 전위를 강제한다. 모든 포유동물 세포가 DT에 감수성인 것은 아니다. 예를 들어, 베로 세포와 같은 원숭이 신장 세포는 매우 감수성인 반면, 예를 들어 인간, 토끼, 기니 피그 및 햄스터 세포는 적당한 정도로 감수성이며, 마우스 및 래트 세포는 내성적이다. 또한 닭 세포는 DT에 감수성이다. 실시예 2에 예시된 바와 같이, DT는 정상 및 측저 노출후 농도 및 시간 의존 방식으로 소 BCEC에 (서브)나노몰 범위로 독성을 나타낸다.
HB-EGF가 1990년에 대식세포-분비된 헤파린 결합 성장인자에서 최초로 동정되었다. EGF 패밀리의 다른 멤버와 마찬가지로, HB-EGF는 EGF 수용체(EGF-R) 분자의 erb 부류에 결합하여 그의 생물학적 효과를 발휘한다. HB-EGF는 두개의 EGF 수용체 서브타입, HER1 및 HER4를 활성화하며, 세포 표면 HSPG에 결합한다. 그러나, EGF를 포함한 대부분의 EGF 패밀리와 달리, HB-EGF는 고치환성으로 헤피린에 결합한다. 헤파린은 HB-EGF를 시그널-형질도입 EGF-R에 결합시킬 가능성이 있는 것으로 나타났으며, 또한 세포 이동 및 증식을 포함하여 표적 세포상의 성장인자의 생물학적 효과를 조절할 수 있다. HB-EGF는 섬유모세포, 평활근세포 및 외피세포의 분열을 촉진하나, 내피세포는 분열을 촉진하지 않는다. 또한, HB-EGF는 내피세포에 의해 생산되며, 이들 세포에 대한 자가분비 성장인자로 작용한다. 이는 내열성이며, 양이온성 단백질이고, 분자량이 약 22 kDa로, 1.0M NaCl을 사용하여 헤파린-친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출된다. HB-EGF 유전자 발현은 예를 들어 산화, 허혈, 삼투(고 글루코스 또는 과다 오스몰농도), 전기 및 기계(전단) 스트레스에 반응 및 사이토킨 (TNF-알파, IL-1베타, TGF-알파), LPS, 성장인자 (EGF, HB-EGF, 암피레귤린, bFGF, PDGF), 리소-포스파티딜콜린, 염화수은, 포르볼 에스테르, Ca-이오노포어, 혈청, 트롬빈, 엔도텔린-1, 안지오텐신 II, 지질단백질, 혈소판 활성 인자(PAF), 알파-아드레날린성 작용제 및 전사 인자, 예를 들어 MyoD, Raf, v-Ha-ras에 노출후 고도로 상향조절된다. 가용성 성숙 HB-EGF는 매트릭스 금속 프로테이나제 (MMP, 특히 MMP-3) 및 ADAM (ADAM9, ADAM10/쿠즈바니안, ADAM12/멜트린-알파, 및 ADAM17/TACE (TNF-알파 전환 효소)를 포함한 디스인테그린 및 금속 프로테아제 패밀리)에 의해 대형 막-고정 전구체로부터 단백질 분해적으로 처리된다. 이러한 과정은 외부도메인 셰딩(ectodomain shedding)이라 불리며, UV-광, IL-1베타, 아니소마이신, 소르비톨, LPS, 과산화수소, 페닐에프린, 엔도텔린-1, 안지오텐신 II, 인슐린-유사 성장인자-1, 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)에 의해, 단백질 키나제 C 델타 활성화후 ADAM9/MDC9/멜트린-감마의 세포형질 도메인 결합 또는 리조포스파티드산(LPA)에 의해, Ras-Raf-MEK 및 소형 GTPase Rac 시그널링 경로를 통해 또는 스트레스- 및 염증성 사이토킨-유도된 p38 MAPK-매개 경로에 의해 유도되거나 상향조정된다 (Takenobu et al., 2003, J. Biol. Chem., 278: 17255-17262; Umata et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:30475-30482; Asakura et al., 2002, Nature Medicine, 8:35-40). Pro-HB-EGF 셰딩은 하이드록삼산-기제 KB-R8301, 일반적인 MMP 저해제 (TIMP 포함) 및 BB-94 (바티마스타트(batimastat)) 및 ADAM12 저해제 KB-R7785 및 ADAM10 저해제 XL784 및 XL081 또는 이들의 유사체 등의 MMP 저해제에 의해 저해된다. TPA-유도된 셰딩은 PKC 저해제 Ro-31-8220, MEK 길항제 PD98059에 의한 LPA-유도 셰딩 및 SB203580에 의한 p38 MAPK-매개 셰딩에 의해 저해된다 (Takenobu et al., 2003, 상동). 막으로부터 단백질 분해 절단 과정후에도, 여전히 상당량의 HB-EGF 전구체가 세포 표면상에 비절단 상태로 존재한다 (Nakamura et al., 1995, J. Cell Biol. 129:1691-1705).
HB-EGF는 영양포 이식 및 상처 치유와 같은 정상적인 각종 생리학적 과정 및 종양 성장, SMC 과다형성 및 죽상경화증과 같은 병리 과정에 참여자로서 연루된다. HB-EGF 유전자 발현이 혈관 외피 및 평활근 세포, 염증세포 (주로 NK-세포), 골격근 및 심장근, 신장 혈관간 세포, 각질세포, 소장, 뇌 (신경 및 아교세포), 전관절, 영양막, 영양포, 난소 및 자궁, 태반, 피부, 림프절, 방광 및 종양 세포(신경아교종 포함)에서 입증되었다.
HB-EGF 전구체가 디프테리아 독소에 대한 수용체로 작용한다는 사실이 최근에 밝혀졌다 (Naglich et al., 1992, Cell, 69:1051-1061). HB-EGF 전구체가 조직 분포가 유사한 인간, 원숭이, 래트 및 마우스를 포함한 종에서 발현되나, 인간 및 원숭이에서 DT (HB-EGF상의 DT에 대한 수용체-결합 도메인)에 의해 특이적으로 인식되는 서열의 아미노산 치환으로 설치류 HB-EGF에 대한 DT의 결합을 감소시키기 때문에 래트 및 마우스는 DT에 내성이다 (Mitamura et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 1015-1019). 최근, AA141(Glul4l)이 DT-결합 및 독소 감수성에 중요한 잔기인 것으로 밝혀졌다 (Hooper and Eidels, 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun., 220: 675-680). 그후, Mitamura 등 (1997, J. Biol. Chem., 272: 27084-27090)은 DT-결합 및 독소 감수성에 대한 두개의 추가의 중요한 잔기를 발견하였다(AA115(Phe115) 및 AA127(Leu127). 표 3은 상이한 DT-비감수성(마우스, 래트) 및 DT-감수성(중국 햄스터, 토끼, 돼지, 원숭이, 인간 및 닭) 종에 대한 HB-EGF의 DT-수용체 결합 도메인(AA106-147) 서열을 나타낸다.
[표 3]
DT-비감수성(마우스(Ms), 래트(Rt)) 및 DT-감수성(중국 햄스터(CH), 토끼(Rb), 돼지(P), 원숭이(Mk), 인간(H) 및 닭(C)) 종에 대한 HB-EGF의 DT-수용체 결합 도메인(AA106-147) 서열. 인간과 상이한 잔기는 이탤릭체로 표시하였으며, 굵은 글씨체로 나타낸 잔기는 DT-결합 및 독소 감수성에 대한 중요한 잔기(AA115 (Phe115), AA127(Leu127) 및 AA141(Glu141))이다.
Figure 112005044121898-pct00034
헤파린, 황산헤파란 및 황산헤파란 프로테오글리칸(HSPG), 및 CD9/DRAP27 및 알파3-베타1-인테그린과 같은 다른 연합 단백질은 그의 리간드에 대한 DTR 친화성 (및 그의 수용체에 대한 HB-EGF 결합 (Shishido et al., 1995, J. Biol. Chem. 49: 29578-29585))을 증가시켜 DTR 기능을 조절한다. 안티-CD9/DRAP27 모노클로날 항체(IgGl: ALB-6 및 TP82, 및 IgG2a: BU16 및 007, 및 MAB1206)는 인간 세포에 대한 DT의 결합 및 독성을 저해한다 (Nakamura et al., 1995, 상동; Mitamura et al., 1992, J. Cell Biol. 118: 1389-1399; Iwamoto et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 20463-20469).
DTR 유전자 (또는 디프테리아 독소 수용체(또는 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자))가 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포상에서 발현되고 (실시예 1 및 2에 예시), DTR의 생물학적 활성이 자극 감소 (실시예 1 및 3에서 LPS에 대해 예시된 바와 같이), 헤파린 결합 (실시예 3에서 외인성 헤파린에 대한 노출로 예시), 길항제 (실시예 2에서 CRM197(DT의 경쟁 길항제) 및 실시예 2 및 4에서 가용성 HB-EGF (DT의 비경쟁 길항제)), 외부도메인 셰딩 저해제 (실시예 3에서 매트릭스 금속 프로테아제 BB-94 (또는 바티마스타트에 대한 노출로 예시) 또는 이들의 조합 (실시예 3에 예시)에 의해 조절된다는 발견은 표적 약물을 뇌혈관 장벽 및/또는 세포내 격막, 특히 리소좀에 이를 관통하여 특이적으로 전달할 새로운 가망성을 제공한다. DTR 유전자 산물 (즉, 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽에 대한 표적 용량을 특이적으로 조절하는데 유용하다. DTR(DT(부분), DT의 B-단편(부분), CRM197(부분) (실시예 4에 예시) 또는 임의의 다른 리간드)에 특이적으로 결합하는 임의의 리간드가 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽에 약물을 표적하는데 유용하다.
막을 통해서 세포질내로 도입되도록 예를 들어 펩티드 및 단백질에 대한 담체로서 단백질 독소 (또는 그의 비독소 유도체)를 사용하는 일반적인 개념은 새로운 것이 아니다 (이러한 주제의 참조예: Sandvig 및 van Deurs(2002, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 18: 1-24)의 최근 보고). DT는 그의 수용체 HB-EGF에 결합된 후 수용체-매개된 세포내 이입이라 지칭되는 과정에 의해 내재화된다. 수용체 매개된 엔도/트랜스사이토시스(transcytosis)는 뇌에 약물을 선택적으로 표적화하는데 널리 알려진 안전하고 효과적인 카고-수반 운반 메카니즘이다 (Pardridge, 2002, Nat. Rev. Drug Discov.,1 :131-139). 그러나, 예를 들어 트랜스페린 수용체에 대해 알려진 바와 같이 수용체-매개된 엔도/트랜스사이토시스를 수반하는 메카니즘에 의해 뇌혈관 장벽을 통해 CNS로 직접 약물을 운반하는데 DTR에 특이적인 리간드를 사용하는 것은 이전에 결코 알려진 바가 없다. 실제로, 파상풍 독소 단백질의 비독성 C 단편 (TTC 또는 Tet451) 및 파상풍 독소 단백질의 비독성 유도체 (Ala에 의한 Glu234 치환)는 말초신경 말단에 흡수되고 그의 세포체에 역행 축삭 운반된 후 중추신경으로 트랜스-시냅시스를 전달하는 과정을 수반하는 명백히 상이한 작용 메카니즘(뇌혈관 장벽에서 수용체-매개된 엔도/트랜스사이토시스와 비교하여)으로 CNS에 약물을 운반하는 것을 활용한다(U.S. 5,780,024호 및 여기에 인용된 문헌, 및 Li 등의 2001 J. Biol. Chem. 276:31394-31401). 래트의 뇌에서 신경, 신경아교세포 및 혈관에서의 구성 및 질병-유발 HB-EGF 발현이 Mishima 등 (1996, Neurosci. Lett., 213: 153-156), Nakagawa 등 (1998, Dev. Brain Res., 108: 263-272), Hayase 등 (1998, Brain Res., 784: 163-178) 및 Tanaka 등 (1999, Brain Res., 827: 130-138)에 의해 최초로 밝혀졌으나, 이들 저자의 누구도 뇌의 이들 세포 (세포내 격막)에 대해 DTR의 리간드에 커플링된 약물을 표적 전달하는 가망성에 대해 논의하지 않았다. 이러한 임무는 설치류 HB-EGF가 DT에 대한 수용체가 아니라는 사실로 가장 잘 설명된다. 실제로, 설치류에서, 뇌종양의 미세혈관을 통한 DT의 투과성은 수동 확산후 뇌내에 종양세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다 할지라도 (Arguello et al., 1996. Blood. 87 (10): 4325-4332), 다른 대형 단백질의 투과성과 동등하거나 이보다 작다 (Wrobel et al., 1990, J. Neurosurg. 72 (6): 946-950). 따라서, 이러한 조사는 HB-EGF의 자가- 및 적스타크린(juxtacrine) 성장- 및 부착 인자 성질에 대해서만 보고되었다. 더욱 놀랍게도, 잘 알려진 CNS 약물 전달은 수용체-매개된 엔도/트랜스사이토시스 (Pardridge 및 Rapoport에 의해 출간된 이 주제에 대한 다수의 과학 및 논문 잡지/책자, 특허 및 특허 출원)에 대해 연구하지 않았으며, 가장 최근 공개된 US 특허 출원 (명칭: "Covalent conjugates of biologically-active compounds with amino acids and amino acid derivatives for targeting to physiologically-protected sites", Yatvin et al.(US20030087803), 뇌에 약물 전달이 가능한 기술이 포괄적으로 검토되었고, 참고로 인용되었다)도 뇌의 세포(세포내 격막)에 대해 DTR의 리간드에 커플링된 약물을 표적 전달하는 가망성에 대해 논의하지 않았다.
DT가 감수성 포유동물 세포에 매우 독성적이라는 사실은 그의 천연 리간드 DT로 DTR에 약물을 표적화하는데 바람직하지 못하도록 만든다. 그러나, DT의 B-단편(부분) 또는 CRM197(부분) (DT의 비독성 돌연변이체 단백질)을 포함한 DT의 비독성 부분의 동정은 DTR을 통해 뇌에 약물을 안전하고 효과적으로 표적화할 기회를 제공한다. CRM197에 접합된 폴리사카라이드가 예방접종 프로그램 (예컨대 헤모필루스 b형 인플루엔자 올리고사카라이드 CRM197 접합체 백신(HibTiterTM); 뉴모코칼(Pneumococcal) 7-가 접합체 백신(PrevnaTM); 메닝고코칼(meningococcal) C 올리고사카라이드 접합체 백신(MenjugateTM 및 MeningtecTM))에서 수백만의 인간(신생아, 유아, 청소년 및 성인)에 안전하게 적용되었기 때문에, CRM197이 가장 바람직하다. 이러한 현상으로부터, CRM197 단백질은 사카라이드에 대한 안전하고 효과적인 T-세포 의존성 담체라는 것을 알 수 있다. 마찬가지로, CRM66(교차반응 66 kDa 단백질)은 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체-관련 단백질(LRP) 및 LRP 1B에 특이적으로 결합하는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 엑소톡신 A의 비활성 돌연변이체 형태이며, 데메울레(Demeule) 등(2002, J. Neurochem. 83 (4): 924-933)에 의해 동일한 수용체에 결합하는(WO 03009815) p97(멜라노트랜스페린)에 대해 개시된 바와 유사한 방식으로 뇌혈관 장벽을 통해 약물을 전달하는 것을 활용할 수 있다.
CRM197은 독소발생 코리네파지(베타)의 니트로소구아니딘 돌연변이 유발에 의해 생성된 비독소 발생 파지(베타 197tox-)에 의해 감염된 코리네박테리움 디프테리아로 생산된다 (Uchida, et al. 1971, Nature New Biology, 233: 8-11). CRM197 단백질은 디프테리아 독소와 동일한 분자량을 가지지만, 구조 유전자에 단일 염기 변화(구아닌에서 아데닌으로)에 의해 상이하다. 이러한 단일 염기 변화는 성숙 단백질에 아미노산 치환 (AA52: 글리신에 대한 글루탐산)을 야기하여 디프테리아 독소의 독성을 제거한다.
백신에서 담체 단백질이 하기 착상을 바탕으로 개발되었다. 완전(비활성) 바이러스 또는 박테리아로 예방접종하는 것이 효과적이나, 많은 단점 및 부작용을 수반한다. 이러한 이유로, 바이러스 및 박테리아의 면역원성 부분 (또는 모방체)만을 사용한 예방접종 프로그램(예: (폴리)사카라이드 또는 피막 단백질)이 개발되었다. 그러나, 이러한 백신은 대부분 감염 위험을 가지면서 일부 나이군에 최소한의 효과를 보인다: B-세포 면역손상 개체, 면역 보호에 T-세포 반응에 의존하는 장년 및 두살 미만의 유아. 이러한 백신은 T-세포 면역 반응에 불충분한 유발제이기 때문에, 바이러스 및 박테리아의 면역원성 부분을 T-세포 반응을 유도할 수 있는 면역원으로 전환시키는 것이 표적 군에 적절한 보호를 제공하는데 결졍적이다. 바이러스 및 박테리아의 면역원성 부분을 적합한 단백질 담체, 예를 들어 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 파상풍 변성독소(TT), 디프테리아 변성독소 (포르말린 처리된 DT), 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 형철 알부민(HSA)에 연결하는 것은 비특이적 작용 메카니즘으로 면역원을 생산한다. 실제로, 본 원에서는 디프테리아 변성독소-접합체에 대한 작용 메카니즘이 림프구상에서 DTR에 대한 결합으로 매개된 효과와 결부되지 않았다. 디프테리아 변성독소-접합체의 잔류 독성을 제거하기 위해, 디프테리아 변성독소는 후에 DT의 비독성 돌연변이체, CRM197로 대체된다. 담체 단백질이 비특이적 작용 메카니즘에 기초해 이용된다는 생각은 CRM197-접합체 백신의 효능이 DT-비감수성 마우스에서 일상적으로 시험된다는 사실에 의해 보다 확실해 진다. Gupta 등 (1997, Vaccine 15:1341-1343)은 CRM197-접합체 백신의 커다란 면역원성 차이가 DT-비감수성 마우스와 DT-감수성 기니 피그에서 증명될 수 있음을 보였으며, 이는 CRM197-접합체 백신이 실제로 DT-감수성 종에서 특이적 DTR-매개된 세포 흡수를 사용할 수 있음을 제기한다.
DT(수용체-결합 도메인)에 대한 중화 항체는 DTR 상에서 CRM197에 접합하는 약물 (또는 DT-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 화합물)의 특이적 결합을 방지할 수 있는 수용체 혈청에 존재하여(코리네박테리움 디프테리아, DT의 B-단편(부분) 또는 CRM197(부분) (또는 다른 비독성 DT(부분))에 조기 노출 또는 예방접종으로 인해), 약물 전달 시스템의 총 효율을 감소시킬 수 있다. 이러한 중화 항체는 수용체를 효과적인 최소량의 유리 CRM197 또는 중화 항체상에서 DT-결합 도메인(DT의 B-단편(부분) 또는 CRM197의 CRM197 단편(부분), 소형 분자, 펩티드, 모방체, 항-이디오타입 항체 등과 같은)에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 화합물에 노출시켜 약물 전달 시스템의 적용전에 불활성화시키는 것이 바람직하다.
또한, DTR 유전자 또는 디프테리아 독소 수용체 (또는 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자)가 뇌혈관 장벽을 구성하는 세포에서 LPS에 의해 변형된다는 놀라운 사실은 뇌혈관 장벽 기능을 변형하거나 추적하는데 새로운 가망성을 제공한다. 또한, DTR 유전자 산물 (즉, 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자)의 생물학적 활성을 변경하는 임의의 약물이 본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조절하는데 유용하다. 디프테리아 독소 수용체(헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자) 활성은 DTR 유전자의 안티센스 저해 또는 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자 길항제에 의해 또는 DTR 단백질 항체에 의해 편리하게 감소시킬 수 있는 반면, 디프테리아 독소 수용체(헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자) 활성은 DTR 유전자를 세포에 도입하거나, 내피세포를 외인성 헤파린-결합 표피 성장인자-유사 성장인자에 노출함으로써 편리하게 증가시킬 수 있다. 또한, R&D Systems Europe Ltd.(UK)은 진단 또는 치료 목적으로 사용될 수 있는 재조합 인간 HB-EGF 및 HB-EGF에 대한 유용한 항체를 개발하였다. 이러한 유전자의 발현 변화는 본 발명의 구체예에서 혈관 투과 상태를 진단할 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, HB-EGF 단백질에 대한 항체뿐 아니라 HB-EGF 유전자에 상보적인 핵산 둘 다가 적용될 수 있다.
본 발명의 구체예에서 뇌혈관 장벽의 투과성을 특이적으로 조사하는데 있어서 관련 동물 질병 모델의 실험 용이성 및 유효성을 현저히 향상시키기 위하여, 인간형 HB-EGF 유전자 형질전환 또는 녹-인(knock-in)(KI) 마우스를 생산하는 것이 매우 바람직하다. 인간형 HB-EGF 형질전환 마우스를 구조적으로 활성(예: 종양)인 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 GFAP 및/또는 감마-GTP 프로모터의 조절하에 인간 DTR 유전자(HB-EGF 코딩)에 유전자 공학적으로 도입하여 유전자의 뇌 및/또는 뇌혈관 발현을 얻을 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 것은 유전자 공학적 Hegfl 유전자(내인성 프로모터(들)하에 마우스 HB-EGF 유전자 코딩)의 ES 세포에 동종 재조합으로 도입되어 엑손 2 및 3이 바람직하게는 양성 및 음성 선택 표지 서열을 함유하는 디프테리아 독소의 수용체-결합 도메인에 대한 인간 서열을 갖도록 하는 것이다. 디프테리아 독소에 대한 수용체-결합 도메인의 코딩 서열이 엑손 2의 말단 및 엑손 3의 개시부에 위치한다. 이를 위해, 마우스 게놈 DNA 클론이 PAC 라이브러리, 바람직하게는 pPAC4 라이브러리(129/SvevTACfBr 균주)로부터 유래된다. 표적 벡터에서, 기원 제 2 및 제 3 엑손이 유전자 공학적으로 디프테리아 독소에 대한 수용체-결합 도메인의 인간 특이적 서열로 대체되어 디프테리아 독소 민감성 수용체-결합 도메인을 만들어 낸다. 인트론 2내 또는 엑손 3의 하류에 LoxP 부위에 의해 플랭크된 PGK-유도 네오 카세트가 존재한다. 배아 줄기세포(E14)가 전기천공되며 외부 프로브를 사용한 서던 블롯 분석에 의해 동종 재조합에 대한 클론이 선택된다. 디프테리아 독소에 대한 수용체-결합 도메인의 인간 서열 존재가 엑손 2 및 3의 서열 분석뿐 아니라 바람직하게는 제한 효소에 의한 후속 분해와 함께, 인간 특이적 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 시험된다. 표적 ES 세포를 영양포에 주입하여 키메라 동물을 생산하였다. F1 아고우티 프로제니 (agouti progeny)는 돌연변이체 대립유전자 전사에 대한 유전형으로, 형질전환 라인 인간형 HB-EGF +NEO를 생산한다. EIIA-Cre 균주의 마우스로 이형접합 인간형 HB-EGF +NEO 마우스를 생산하여 (Lakso et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (12): 5860-5865) 네오 카세트를 제거한다. 이에 의해, 젬라인(germline) 전사가 얻어 지며, 형질전환 라인 인간형 HB-EGF KI가 확립된다. C57B1/6J로 마우스를 5대 생산한다. 이형접합 인간형 HB-EGF KI 및 wt 리터메이트(littermate)를 추가 분석에 사용하였다(~97% C57B16J 백그라운드). 그후, 인간형 HB-EGF KI 마우스에서 이종 종양 이식물을 성장시키기 위하여, 다수의 면역결핍 마우스가 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 마우스에는 누드 마우스, 시드 마우스(scid mice) 및 rag-1 및 rag-2 유전자 결핍 마우스가 포함되나, 이에만 한정되지 않는다. 특정 유전자 위치의 돌연변이 결과로 다양한 형태의 면역결핍을 가지는 다른 동물을 웹사이트 immunology.tch.harvard. edu에서 찾아 볼 수 있다. 이들 마우스를 상기 언급된 인간형 HB-EGF KI 마우스와 교배하여 면역기능은 결핍되었으나 인간형 HB-EGF를 발현하는 프로젠을 생산한다. 또한, 외인성 담체 단백질에 면역원성 반응이 없는 (예를 들어 중화 항체 초래) CRM197 등이 이들 마우스에서 기대된다. 또한, 상기 언급된 인간형 HB-EGF KI (오리지날 및/또는 면역결핍) 마우스를 질병 모델을 제공하기 위해 당업계에 알려진 임의의 녹아웃(knockout)형 형질전환/KI 마우스와 교배하여 외인성 담체 단백질, CRM197 등에 감수성이고 질병 표현형을 가지는 프로젠을 제공한다. 마찬가지로, 이에 따라 형질전환 래트 및 돼지가 또한 생산될 수 있다.
서열 동일성
"서열 동일성"은 본 원에서 서열을 비교하여 결정되는 바, 두개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 두개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 간의 관계로 정의된다. 당업계에서, "동일성"는 또한 서열 스트링의 매치로 결정되는 바, 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 관계도를 의미한다. 두개의 아미노산 서열의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 그의 보존된 아미노산 치환을 제 2 폴리펩티드 서열과 비교하여 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988))에 개시되었으나 이들에 한정되지 않는 공지된 방법으로 용이하게 산정될 수 있다.
동일성를 결정하기에 바람직한 방법이 시험된 서열을 가장 잘 매치하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 분류된다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기에 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 예를 들어 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)를 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공개적으로 입수가능하다 (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). 알려진 스미스 워터만 (Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교에 바람직한 파라미터는 다음 파라미터를 포함한다: 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); 비교 매트릭스: BLOSSUM62 (Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)); 갭 패널티: 12; 및 갭 길이 패널티: 4. 이들 파라미터에 유용한 프로그램은 Ggenetics Computer Group(Madison, WI에 소재)로부터 "Ogap" 프로그램으로 공개적으로 입수가능하다. 상기 언급된 파라미터는 아미노산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다 (말단 갭에 대한 패널티가 없음).
핵산 비교를 위해 바람직한 파라미터는 다음 파라미터를 포함한다: 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); 비교 매트릭스: 매치 = +10, 미스매치 = 0; 갭 패널티: 50; 갭 길이 패널티: 3. 이들 파라미터에 유용한 프로그램은 Ggenetics Computer Group (Madison, WI에 소재)로부터 Gap 프로그램으로 입수가능하다. 상기 언급된 파라미터는 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
임의로, 아미노산 유사성를 결정하는데 있어서, 당업자들은 또한 당업자들에게 명백한 바와 같이 소위 "보존" 아미노산 치환을 고려한다. 보존 아미노산 치환이란 유사한 측쇄를 가지는 잔기의 호환성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미노-함유 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 가지는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본 원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 기술된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되며 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게, 아미노산 변화는 보존된다. 자연적으로 발생하는 각 아미노산에 대한 바람직한 보존 치환은 다음과 같다: Ala → ser; Arg → lys; Asn → gln 또는 his; Asp → glu; Cys → ser 또는 ala; Gln → asn; Glu → asp; Gly → pro; His → asn 또는 gln; Ile → leu 또는 val; Leu → ile 또는 val; Lys → arg; gln 또는 glu; Met → leu 또는 ile; Phe → met, leu 또는 tyr; Ser → thr; Thr → ser; Trp → tyr; Tyr → trp 또는 phe; 및 Val → ile 또는 leu.
폴리펩티드를 재조합 생산하기 위한 재조합 기술 및 방법
본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드는 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 여기에서 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 정의된 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 벡터는 벡터에 적합한 숙주에서 벡터 증식을 보장하는 복제 기원(또는 독립적 복제 서열)을 포함하는 복제 벡터이다. 또한, 벡터는 동종 재조합 또는 다른 방식을 통해 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있다. 특히 바람직한 벡터는 상기 정의된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 벡터에 대한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 결합된 발현 벡터이다.
본 원에 사용된 용어 "프로모터"는 유전자의 전사 개시부의 전사 방향에 대해 상류에 위치하는 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하는 작용을 하고, 전사인자 결합 부위, 리프레서 및 활성제 단백질 결합 부위를 포함하나 이들에 한정되지 않는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 전사 개시부 및 임의의 다른 DNA 서열에 대한 결합 부위, 및 프로모터로부터 전사량을 직간접적으로 조절하는 작용을 하는 것으로 당업자들에게 공지된 뉴클레오타이드의 임의의 다른 서열의 존재에 의해 구조적으로 동정되는 핵산 단편을 의미한다. "구조" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건하에 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 생리학적 또는 발달 조건에 따라 조절되는 프로모터이다. "조직 특이적" 프로모터는 분화 세포/조직의 특이 타입에서만 활성인 프로모터이다.
발현 벡터는 상기 정의된 LPSS 폴리펩티드가 재조합 기술을 이용하여 제조되도록 할 수 있으며, 여기에서는 관심의 대상이 되는 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 적합한 세포, 예를 들어 Ausubel 등에 의해 "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1987) 및 Sambrook 및 Russell에 의해 (2001, 상동)(둘 다 본 원에 참고로 인용된다)에 개시된 바와 같은 배양 세포 또는 다세포 유기체의 세포에서 발현된다. 또한, Kunkel에 의한 Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 488 (1985)(부위 지정 돌연변이 유발 기재) 및 Roberts 등에 의한 Nature 328: 731-734 (1987) 또는 Wells, J. A. 등에 의한 Gene 34:315 (1985)(카세트 돌연변이 유발 기재)를 참조.
전형적으로, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 발현 벡터에 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 일반적으로 서열에 적합한 숙주에서 유전자의 발현을 수행할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 프로모터 서열 및 임의로 전사 종결 시그널을 포함한다. 발현을 수행하는데 필요하거나 도움이 되는 추가의 인자가 또한 본 원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 시험관내 세포 배양물에서 도입 및 발현이 가능한 DNA 작제물로 혼입된다. 구체적으로, DNA 작제물은 원핵생물 숙주, 예를 들어 대장균(E. coli)의 복제에 적합하거나, 배양 포유동물, 식물, 곤충, 예컨대 Sf9, 효모, 진균 또는 다른 진핵생물 세포주에 도입될 수 있다.
특정 숙주의 도입을 위해 제조된 DNA 작제물은 전형적으로 숙주에 의해 인식되는 복제 시스템, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 의도된 DNA 세그먼트 및 폴리펩티드-코딩 세그먼트에 작동가능하게 연결된 전사, 해독 개시 및 종결 조절 서열을 포함한다. DNA 세그먼트가 다른 DNA 세그먼트와 기능적 관계로 위치하는 경우 "작동가능하게 결합"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열 전사를 자극하는 경우 작동가능하게 결합된다. 시그널 서열에 대한 DNA가 폴리펩티드 분비에 참여하는 프리단백질로 발현되는 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, 작동가능하게 결합되는 DNA 서열은 인접하며, 시그널 서열의 경우에는 인접하고 리딩 단계이다. 그러나, 인핸서는 전사를 조절하는 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 결합은 편리한 제한 부위 또는 어댑터에서 결찰에 의해 또는 그의 장소에 삽입된 링커에 의해 수행된다.
적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 세그먼트의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 좌우된다. 적합한 프로모터 서열의 예에는 당업계에 널리 알려진 원핵 및 진핵 프로모터가 포함된다 (참조: Sambrook and Russell, 2001, 상동). 전사 조절 서열은 전형적으로 숙주에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 숙주에 따라 달라지나, trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당용해 효소 프로모터와 같은 프로모터들이 공지되었고 이용가능하다 (참조예: Sambrook and Russell, 2001, 상동). 발현 벡터는 사용될 수 있는 폴리펩티드 코딩 세그먼트에 대한 삽입 부위와 함께 복제 시스템 및 전사 및 해독 조절 서열을 포함한다. 세포주 및 발현 벡터의 작업가능한 조합예가 Sambrook 및 Russell, 2001, 상동 및 Metzger 등(1988)에 의한 Nature 334:31-36에 기재되었다. 예를 들어, 효모, 예컨대 S. cerevisiae, 곤충 세포, 예컨대 Sf9 세포, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포 및 박테리아 세포, 예컨대 E. coli에서 적합한 발현 벡터가 발현될 수 있다. 따라서 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 액체 또는 고체 매질에서 배양하기에 적합한 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 상기 정의된 바와 같은 LPSS 폴리펩티드를 생산하는 방법에 사용된다. 이 방법은 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다. 임의로, 이 방법은 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어 당업계에 알려진 각종 크로마토그래피 방법 자체를 포함하는 표준 단백질 정제 기술에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 형질전환 식물 또는 동물, 바람직하게는 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 부분인 세포이다. 형질전환 식물은 적어도 그의 세포 일부에 상기 정의된 벡터를 포함한다. 형질전환 식물의 생산 방법이 U.S. 6,359,196호 및 여기에 인용된 참조문헌에 개시되었다. 이러한 형질전환 식물은 상기 정의된 LPSS 폴리펩티드를 제조하는 방법에 사용될 수 있으며, 이 방법은 그의 세포에 벡터를 포함하는 형질전환 식물의 일부 또는 이러한 형질전환 식물의 후손의 일부를 회수하고 (여기에서, 식물 부분은 폴리펩티드를 포함한다), 임의로 식물 부분으로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 U.S. 6,359,196호 및 여기에 인용된 참조문헌에 개시되었다. 유사하게, 형질전환 동물은 그의 신체 및 배아세포에 상기 정의된 벡터를 포함한다. 형질전환 동물은 바람직하게는 비인간 동물이다. 형질전환 동물의 생산 방법이 WO 01/57079호 및 여기에 인용된 참조문헌에 개시되었다. 이러한 형질전환 동물은 상기 정의된 LPSS 폴리펩티드를 제조하는 방법에 사용될 수 있으며, 이 방법은 벡터 또는 그의 암컷 후손을 포함하는 형질전환 동물로부터 폴리펩티드를 포함하는 체액을 회수하고, 임의로 체액으로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 WO 01/57079호 및 여기에 인용된 참조문헌에 개시되었다. 폴리펩티드를 포함하는 체액은 바람지하게는 혈액 또는 보다 바람직하게는 젖이다.
폴리펩티드를 제조하는 또 다른 방법은 시험관내 전사/해독 시스템을 사용하는 것이다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 상기 참조문헌에 기술된 바와 같이 발현 벡터내로 클로닝된다. 이어서, 발현 벡터는 시험관내에서 전사 및 해독된다. 해독 산물은 직접 사용될 수 있거나 일차 정제될 수 있다. 시험관내 해독으로부터 얻은 폴리펩티드는 전형적으로 생체내에서 합성된 폴리펩티드상에 존재하는 해독후 변형을 함유하지 않으나, 미세소체의 고유적인 존재로 일부 해독후 변형이 일어날 수 있다. 시험관내 해독에 의해 폴리펩티드를 합성하는 방법이 예를 들어 [Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987]에 개시되었다.
유전자 요법
본 발명의 일부 태양은 상기에 정의되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한 것인데, 본 벡터는 유전자 요법에 적합한 벡터이다. 유전자 요법에 적합한 벡터는 Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science285 : 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin.Biotechnol. 10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med.2 : 308-16; Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10 : 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3; 및 상기 문헌에 인용된 참고 문헌에 기술되어 있다.
특히 적합한 유전자 요법용 벡터는 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated virus, AAV) 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 다수의 분열 및 비분열 세포 형태에 감염된다. 또한 아데노바이러스 벡터는 트랜스진 (transgene)을 고수준으로 발현할 수 있다. 그러나 세포 엔트리 (entry) 후의 아데노바이러스 및 AAV 벡터의 에피좀 성질 때문에 이들 바이러스 벡터는 상기에 나타낸 바와 같이 트랜스진의 일시적 발현만을 필요로 하는 치료적 용도에 가장 적합하다 (Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604). 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Russell (2000, supra)에 의해 개관된 바와 같이 숙주 응답을 감소시키도록 변형된다.
상기에 나타낸 바와 같이 일반적으로 유전자 요법용 벡터는 이들이 발현될 LPSS 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 그에 의해 이 뉴클레오티드 서열은 적절한 조절 서열에 작동가능하게 결합된다는 점에서 상기한 발현 벡터로서 존재한다. 이러한 조절 서열은 적어도 프로모터 서열을 포함한다. 유전자 요법용 벡터로부터 유래되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 프로모터는 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 중간 초기 (intermediate early) 프로모터, 긴 말단 반복 서열 (long terminal repeat) 프로모터 (LTRs), 예를 들어 쥐과 몰로니 백혈병 바이러스(murine moloney leukaemia virus, MMLV), 라우스 육종 바이러스 (rous sarcoma virus), 또는 HTLV-1으로부터 유래된 것, 시미안 바이러스 40 (simian virus 40, SV 40) 초기 프로모터 및 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus) 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다.
작은 유기 또는 무기 화합물의 투여에 의해 유도될 수도 있는 여러 유도성 프로모터 시스템이 기술되었다. 그러한 유도성 프로모터는 메탈로티오닌 프로모터 (Brinster et al. 1982 Nature 296: 39-42; Mayo et al. 1982 Cell 29: 99-108)와 같이 중금속에 의해, RU-486 (프로게스테론 길항제)에 의해 (Wang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180-8184), 스테로이드에 의해 (Mader and White, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607), 테트라사이클린에 의해 (Gossen and Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; 미국 특허 제5,464,758호; Furth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302-9306; Howe et al. 1995 J. Biol. Chem. 270: 14168-14174; Resnitzky et al. 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 1669-1679; Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526), 그리고 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인 및 VP16의 활성화 도메인으로서 tetR 폴리펩티드로 구성된 다중-키메라 트랜스액티베이터 (transactivator)를 기재로 하는 tTAER 시스템에 의해 (Yee et al., 2002, US 6,432, 705) 제어되는 것을 포함한다.
유전자 요법용 벡터는 제2 또는 추가의 단백질을 코딩하는 제2 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 포함할 수도 있다. 제2 또는 추가의 단백질은 발현 제작물을 포함하는 세포의 동정, 선발 및/또는 스크리닝을 가능하게 하는 (선발가능한) 마커 단백질일 수도 있다. 이러한 목적에 적합한 마커 단백질로는 예를 들어 형광 단백질 GFP, 및 선발가능한 마커 유전자 HSV 티미딘 키나제 (HAT 배지 상에서의 선발의 경우), 박테리아 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (하이그로마이신 B 상에서의 선발의 경우), Tn5 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (G418 상에서의 선발의 경우), 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) (메토트렉세이트 상에서의 선발의 경우), 저 친화성 신경 성장 인자 유전자, CD20이 있다. 상기 마커 유전자의 수득원 및 그의 사용 방법이 Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 제공되어 있다.
대안적으로는 제2 또는 추가의 뉴클레오티드 서열은 필요하다고 생각될 경우 트렌스제닉 세포로부터 대상이 구제 (cure)되게 하는 절대 안전 (fail-safe) 기전을 제공하는 단백질을 코딩할 수도 있다. 자살 유전자로 종종 칭해지는 이러한 뉴클레오티드 서열은 전구약을 단백질이 발현되는 트랜스제닉 세포를 사멸시킬 수 있는 독성 물질로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩한다. 이러한 자살 유전자의 적합한 예는 예를 들어 대장균 (E. coli) 시토신 데아미나제 유전자 또는 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 바리셀라-조스터 바이러스 (Varicella-Zoster virus)로부터 유래되는 티미딘 키나제 유전자 중 하나를 포함하는데, 이 경우 간시클로비르 (ganciclovir)가 대상에 있어서 IL-10 트랜스제닉 세포의 사멸을 위한 전구약으로 사용될 수도 있다 (예를 들어 Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849 참조).
이하에 정의되는 바와 같이 유전자 요법용 벡터는 적합한 제약 담체를 함유하는 제약 조성물 중에 제형화되는 것이 바람직하다.
항체
본 발명의 일부 태양은 상기에 정의되어 있는 본 발명의 LPSS 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 항체 또는 항체 단편의 용도에 관한 것이다. 주어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 항체 또는 항체 단편의 제조 방법이 예를 들어 Harlow and Lane (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 및 WO 91/19818; WO 91/18989; WO 92/01047; WO 92/06204; WO 92/18619와; 미국 특허 제6,420,113호 및 그에 인용된 참고 문헌에 기술되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "특이적 결합"이라는 용어는 저 친화성 및 고 친화성의 특이적 결합 둘 모두를 포함한다. 특이적 결합은 예를 들어 Kd가 약 10-4 M 이상인 저 친화성 항체 또는 항체 단편에 의해 나타내어질 수 있다. 특이적 결합은 또한 고 친화성 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 Kd가 약 10-7 M 이상, 약 10-8 M 이상, 약 10-9 M 이상, 약 10-10 M 이상이거나, 적어도 약 10-11 M 또는 10-12 M 또는 그 이상일 수 있는 항체 또는 항체 단편에 의해 나타내어질 수 있다.
펩티드 유사체 (Peptidomimetics)
LPSS 폴리펩티드 또는 LPSS 폴리펩티드 수용체에 특이적으로 결합하며 본 명세서에 정의된 본 발명의 방법 중 임의의 방법에서 적용될 수도 있는 펩티드 유사 분자 (펩티드 유사체로 칭해짐) 또는 비-펩티드 분자는 당업계에 공지된 방법 그 자체, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,180,084호에 상세하게 개시된 방법을 사용하여 동정할 수도 있다. 이러한 방법은 예를 들어 펩티드 유사체의 라이브러리, 펩티드, DNA 또는 cDNA 발현 라이브러리, 조합 화학에 의한 특히 유용한 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 상기 라이브러리는 이 라이브러리를 상당히 정제된 LPSS 폴리펩티드, LPSS 폴리펩티드 수용체, 그의 단편 또는 그의 구조적 유사체와 접촉시킴으로써 LPSS 폴리펩티드 또는 그의 수용체의 작동제 및 길항제에 대하여 스크리닝할 수도 있다.
제약 조성물
본 발명은 또한 활성 성분으로 상기에 정의되어 있는 LPSS 폴리펩티드, 항체 또는 유전자 요법용 벡터를 함유하는 제약 제제에 관한 것이다. 본 조성물은 활성 성분에 더하여 제약적으로 허용가능한 담체를 적어도 함유하는 것이 바람직하다.
일부 방법에 있어서 포유류, 곤충 또는 미생물 세포 배양물로부터, 트랜스제닉 포유류 또는 기타 원천의 유액 (milk)으로부터 정제된 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체가 제약 담체와 함께 정제된 형태로 제약 조성물로서 투여된다. 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 제조 방법이 미국 특허 제5,789,543호 및 동 제6,207,718호에 개시되어 있다. 바람직한 형태는 의도되는 투여 양식 및 치료적 용도에 따라 달라진다.
제약 담체는 폴리펩티드, 항체 또는 유전자 요법용 벡터를 환자에게 전달하기에 적합한 임의의 상용성의 비-독성 물질일 수 있다. 살균 물, 알콜, 지방, 왁스 및 불활성 고체가 담체로 사용될 수도 있다. 제약적으로 허용가능한 아쥬반트 (adjuvant), 완충제, 분산제 등이 본 제약 조성물 내로 또한 혼입될 수도 있다.
제약 조성물 중의 본 발명의 LPSS 폴리펩티드 또는 항체의 농도는 광범하게 다양할 수 있는데, 즉, 약 0.1 중량%보다 작은 농도에서부터, 일반적으로 약 1 중량% 이상에서부터 20 중량% 또는 그 이상만큼 큰 농도일 수 있다.
경구 투여에 있어서 활성 성분은 고체 투여 형태, 예를 들어 캡슐, 정제, 및 분말, 또는 액체 형태, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 및 현탁액으로 투여될 수 있다. 활성 성분(들)은 불활성 성분 및 분말형 담체, 예를 들어 글루코스, 락토스, 수크로스, 만니톨, 전분, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 소듐 사카린, 탈쿰 (talcum), 탄산마그네슘 등과 함께 젤라틴 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직한 색, 맛, 안정성, 완충능, 분산 특징 또는 기타 공지된 바람직한 특징의 제공을 위하여 첨가될 수도 있는 추가의 불활성 성분의 예로는 적색 산화철, 실리카 겔, 소듐 라우릴 술페이트, 이산화티타늄, 식용 화이트 잉크 등이 있다. 유사한 희석제를 사용하여 압축형 정제를 제조할 수 있다. 정제 및 캡슐 둘 모두 지속 방출형 제품으로 제조되어 수시간에 걸친 의약의 연속 방출을 제공할 수 있다. 압축형 정제는 당 코팅 또는 필름 코팅되어 모든 불쾌한 맛을 차폐하고 정제를 분위기 (atmosphere)로부터 보호하거나, 위장관에서의 선택적 붕해를 위하여 장 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 투여 형태는 착색제 및 착향제를 포함하여 환자의 수용성을 증가시킬 수 있다.
LPSS 폴리펩티드, 항체 또는 유전자 요법용 벡터는 바람직하게는 비경구 투여된다. 비경구 투여용 제제를 위한 폴리펩티드, 항체 또는 벡터는 살균하여야 한다. 동결 건조 및 재구성 이전 또는 이후 살균 여과 막을 통한 여과로 손쉽게 살균이 성취된다. LPSS 폴리펩티드, 항체 또는 벡터의 비경구 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병소내, 두개내, 경막내, 경피, 비강, 협측, 직장, 또는 질 경로에 의한 주사 또는 주입에 따른 것이다. 본 폴리펩티드, 항체 또는 벡터는 주입 또는 볼루스 (bolus) 주사로 연속적으로 투여된다. 정맥내 주입용의 전형적인 조성물은 20%의 알부민 용액으로 선택적으로 보충된 10 내지 50 ml의 살균 0.9% NaCl 또는 5% 글루코스 및 1 내지 50 ㎍의 본 LPSS 폴리펩티드, 항체 또는 벡터를 함유하도록 만들어질 수 있다. 근육내 주사용의 전형적인 제약 조성물은 예를 들어 1 - 10 ml의 살균 완충수 및 1 내지 100 ㎍의 본 발명의 LPSS 폴리펩티드, 항체 또는 벡터를 함유하도록 만들어진다. 비경구 투여가 가능한 조성물의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science (15th ed. , Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (실제로 전체 내용이 참고로 포함됨)를 비롯한 다양한 문헌에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
치료적 용도에 있어서, 본 제약 조성물은 미세 혈관 투과성 장애를 앓고 있는 환자에게 징후의 중증도를 감소시키고/시키거나 징후의 추가의 발병을 예방하거나 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 이루기에 적당한 양은 "치료적으로-" 또는 "예방적으로-유효한 용량"으로 정의된다. 이러한 유효 투여량은 질병의 중증도 및 종합적인 환자 건강 상태에 따라 달라진다. 일반적으로 치료적으로- 또는 예방적으로-유효한 용량은 바람직하게는 미세 혈관 투과성을 병에 걸리지 않은 정상적인 건강한 개체에서 발견되는 평균 수준으로 복구시키는 용량이다.
본 발명의 방법에 있어서 LPSS 폴리펩티드 또는 항체는 일반적으로 주 당 약 1 ㎍/환자 체중 (kg) 이상의 투여량으로 투여된다. 종종 투여량은 10 ㎍/kg/주 초과이다. 투여량 투약 계획은 10 ㎍/kg/주 내지 적어도 1 mg/kg/주의 범위일 수 있다 . 일반적으로 투여량 투약 계획은 10 ㎍/kg/주, 20 ㎍/kg/주, 30 ㎍/kg/주, 40 ㎍/kg/주, 60 ㎍/kg/주,80 ㎍/kg/주 및 120 ㎍/kg/주이다. 바람직한 투약 계획에 있어서 10 ㎍/kg, 20 ㎍/kg 또는 40 ㎍/kg이 매주 1회, 2회 또는 3회 투여된다. 치료제는 비경구 경로로 투여되는 것이 바람직하다.
마이크로어레이
본 발명의 다른 태양은 상기에 정의된 핵산, 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 마이크로어레이 (또는 기타 고처리량의 스크리닝 장치)에 관한 것이다. 마이크로어레이는 핵산 또는 아미노산 서열 또는 그의 혼합물의 분석을 위한 하나 이상의 고정화 핵산 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 고체 지지체 또는 담체이다 (예를 들어 WO 97/27317, WO 97/22720, WO 97/43450, EP 0 799 897, EP 0 785 280, WO 97/31256, WO97/27317, WO 98/08083 및 Zhu and Snyder, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 40-45 참조). 본 핵산을 포함하는 마이크로어레이는 예를 들어 상기에 나타내어져 있는 유전자형 또는 발현 패턴의 분석 방법에 있어서 적용될 수도 있다. 폴리펩티드를 포함하는 마이크로어레이는 폴리펩티드와 상호 작용하는 기질, 리간드 또는 기타 분자의 적합한 후보의 탐지에 사용될 수도 있다. 항체를 포함하는 마이크로어레이는 상기에 나타내어져 있는 폴리펩티드의 발현 패턴의 분석 방법에 사용될 수도 있다.
도 1은 BCEC-ACM 단일층 (패널 a) 및 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 (패널 b)을 포함하는 필터 삽입체의 상세한 개략도이다.
도 2는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출시킨 후 시험관 내에서 BBB에서 일어나는 사건의 상세한 개략도이다. BCEC를 50% ACM에서 단일층으로 배양하거나 아스트로사이트와 공동 배양하였다. 아스트로사이트는 시험관 내에서 BBB 성능을 증가시켰다 (시기 1). LPS에 의한 질환 유도에 의해 BCEC 단일층은 파괴된 반면 (시기 2), BCEC + 아스트로사이트 공동 배양물은 회복될 수 있었다 (시기 3). 이러한 회복 과정은 드 노보 (de novo) 단백질 합성을 포함하는데, 이는 시클로헥시미드 (CHX)가 이 복구 시기를 완전히 억제할 수 있기 때문이다.
도 3은 옴 (Ohm).cm2 단위로 (평균 +/- 표준 오차, 패널 a), 그리고 대조의 %로서 (즉, 미처리 BCEC-ACM 단일층, 평균 +/- 표준 오차, 패널 b) 표현되는, LPS에 2시간 노출시킨 BCEC-ACM 단일층을 가로지르는 TEER에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 4는 옴.cm2 단위로 (평균 +/- 표준 오차, 패널 a), 그리고 대조의 %로서 (즉, 미처리 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물, 평균 +/- 표준 오차, 패널 b) 표현되는, LPS에 2시간 노출시킨 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 5는 필터의 정점 (혈액) 측 상에서 다양한 농도 (1 ng/ml 내지 최대 10 마이크로그램/ml)의 DT에 노출된 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER (대조의 평균 %로 표현됨)에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 6은 필터의 기저 (뇌) 측 상에서 다양한 농도 (25 ng/ml 내지 최대 1 마이크로그램/ml)의 DT에 노출된 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER (대조의 평균 %로 표현됨)에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 7은 필터의 정점 측에의 노출 전에 DT의 수용체 결합 도메인에 결합함으로써 DTR의 비-경쟁성 길항제로 작용하는 다양한 농도의 용해성 HB-EGF (0.1 - 10 마이크로그램/ml)와 함께 예비 인큐베이션된 (실온에서 1시간) 100 ng/ml의 DT에 노출된 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER (대조의 평균 %로 표현됨)에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 8은 BCEC의 100 ng/ml의 DT에의 노출 전에 DT의 수용체 결합 도메인에 결합함으로써 DTR에서 경쟁성 길항제로 작용하는 5 마이크로그램/ml의 CRM197로 1시간 동안 예비처리한 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다 (대조의 평균 %로 표현됨).
도 9는 BCEC의 100 ng/ml의 DT에의 노출 전에 DT의 수용체 결합 도메인에 있어서 배좌 변화를 유도함으로써 DTR에서 DT 결합 증강제로 작용하는 헤파린 (125 마이크로그램/ml)로 1시간 동안 예비처리한 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER (대조의 평균 %로 표현됨)에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 10은 BCEC의 100 ng/ml의 DT에의 노출 전에 1 마이크로그램/ml의 LPS (혈청형: 055:B5)에 2시간 동안 정점에서 노출시킴으로써 DTR의 발현 수준을 증가시키거나, 엑토도메인 (ectodomain) 탈피 (shedding) 과정에 연루된 MMP의 억제제로 작용하는 10 마이크로몰의 BB94 (바티마스타트)에 1시간 동안 노출시킴으로써 세포막 상에서의 DTR의 이용도를 증가시키거나, LPS와 BB94의 조합물에 노출시킴으로써 세포막 상에서의 DTR의 이용도 및 발현 수준 둘 모두를 증가시키는 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER (대조의 평균 %로 표현됨)에 대한 영향을 도시하는 다이아그램이다.
도 11은 5 마이크로그램/ml의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응하는 농도의 HRP-콘쥬게이션된 단백질 (CRM197, BSA 및 홀로-트랜스페린)에의 노출 후 BCEC 용해물 (lysate)에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램이다.
도 12는 5 마이크로그램/ml의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응하는 농도의 HRP-콘쥬게이션된 CRM197, HRP-콘쥬게이션된 BSA 및 CRM197의 수용체 결합 도메인에 결합함으로써 DTR-매개 섭취에 있어서의 비-경쟁성 길항제로 작용하는 10 마이크로그램/ml의 용해성 HB-EGF와 함께 예비 인큐베이션한 HRP-콘쥬게이션된 CRM197에의 노출 후 BCEC 용해물에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램이다.
도 13은 시험관내 뇌-혈관 장벽을 가로지르는 HRP-콘쥬게이션된 CRM197의 능동적이며 선택적인 트랜스사이토시스 (transcytosis) (즉, 섭씨 37도 (채워진 (filled) 기호를 포함하는 선) 및 섭씨 4도 (비어 있는 (open) 기호를 포함하는 선)에서 5 마이크로그램/ml의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응하는 농도의 HRP-콘쥬게이션된 CRM197 (원을 포함하는 선) 및 HRP-콘쥬게이션된 BSA (정사각형을 포함하는 선)에의 정점 노출 후 기저 구획에 있어서의 활성)를 도시하는 다이아그램이다.
도 14는 섭씨 37도 및 섭씨 4도에서 (능동적 섭취의 억제를 위하여) 5 마이크로그램/ml의 농도의 자유 HRP에 상응하는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀에의 노출 후 BCEC 용해물에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램인데, 이는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀이 BCEC에 의해 능동적으로 흡수됨을 나타낸다.
도 15는 (담체 특이성의 측정을 위하여) 5 마이크로그램/ml의 자유 HRP에 상응하는 농도의 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 또는 HRP-로딩된 BSA-코팅 PEG 리포좀 중 어느 하나에의 노출 후 BCEC 용해물에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램인데, 이는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀이 BCEC에 의해 특이적으로 흡 수됨을 나타낸다.
도 16은 (DTR의 특이적 연루성의 결정을 위하여) 5 마이크로그램/ml의 농도의 자유 HRP에 상응하는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀에의 노출 후 50 마이크로그램/ml의 자유 CRM197로 1시간 동안 예비처리한 BCEC에서의 섭취율과 비교한 BCEC 용해물에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램인데, 이는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀이 실로 DTR을 통하여 BCEC에 의해 특이적으로 흡수됨을 나타낸다.
도 17은 CRM197-코팅된 PEG-리포좀을 통하여 시험관 내 뇌-혈관 장벽을 가로지르는 HRP의 선택적 트랜스사이토시스 (즉, 5 마이크로그램/ml의 자유 HRP에 상응하는 농도의 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 (원을 포함하는 선) 및 HRP-로딩된 BSA-코팅 PEG-리포좀 (정사각형을 포함하는 선, 담체 특이성을 결정하기 위한 것임)에의 정점 노출 후 기저 구획에서의 HRP 활성)를 도시하는 다이아그램이다.
도 18은 CRM197-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물에 있어서 3가지의 뇌 피질 균질화물 샘플 (즉, 완전한 균질화물 ("균질화물"로 나타냄), 뇌 실질 ("실질"로 나타냄) 및 대뇌혈관계 ("미세 혈관"으로 나타냄))에서의 HRP 활성을 도시하는 다이아그램이다. TrF-HRP 콘쥬게이트가 주사된 동물과, 자유 HRP가 주사된 동물로부터 유래되는 모든 샘플에 있어서의 HRP 활성 수준은 HRP 분석의 검출 한계치 미만이었는데, 이는 40 kDa의 적하물 (즉, HRP)에 콘쥬게이션된 CRM197만이 자유 HRP 및 TrF에 콘쥬게이션된 HRP가 존재하지 않는 뇌 피질에서 특이적으로 흡수됨을 나타낸다.
도 19는 하기의 대표적인 사진을 보여준다:
(패널 A) 내인성 퍼옥시다제 활성에 대하여 TMB로 직접 염색된 비-관류된 대조 뇌 (전 부분 전반에 걸쳐 혈관에 특징적인 독특하며 강력한 염색 패턴을 주의);
(패널 B) 내인성 퍼옥시다제 활성에 대하여 TMB로 직접 염색된 잘 관류된 대조 뇌 (심장 대동맥을 통한 염수를 이용한 관류 절차에 의해 패널 A에서 보여지는 내인성 퍼옥시다제 활성이 완전히 제거될 수 있음을 주의);
(패널 C 및 D) 자유 HRP를 주사한 2마리의 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB 염색된 동결-부분 (잘 관류된 대조 뇌에서와 같이 가시적인 염색은 전혀 관찰될 수 없음을 주의);
(패널 E 및 F) CRM197-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB-염색된 2가지의 동결-부분 (작은 혈관을 가로지르는 삼출 (extravasated) (즉, 수송) HRP에 특징적인 독특한 염색 영역 뿐만 아니라 이 혈관과 결부된 것에 특징적인 염색 패턴을 주의);
(패널 G 및 H) CRM197-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 추가의 2가지의 잘 관류된 뇌의 TMB-염색된 동결-부분 (혈관을 가로지르는 삼출 (즉, 수송) HRP에 특징적인 독특한 염색 영역을 또 주의);
(패널 I 및 J) TrF-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB-염색된 2가지의 동결-부분 (작은 혈관과 결부된 것에 특징적인 (존재할 경우) 약간의 매우 희미한 염색 패턴을 주의);
(패널 K 및 L) TrF-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 잘 관류된 다른 뇌의 TMB-염색된 2가지의 동결-부분 (작은 혈관과 결부된 것에 특징적인 (존재할 경우) 약간의 매우 희미한 염색 패턴을 또 주의);
총체적으로는 이러한 결과는 40 kDa의 적하물 (즉, HRP)에 콘쥬게이션된 CRM197이 자유 HRP 및 TrF에 콘쥬게이션된 HRP가 존재하지 않는 뇌 피질에서 특이적으로 흡수됨을 나타낸다. 뇌 피질 동결-부분의 모든 배율은 40x이다.
도 20은 하기의 대표적인 사진을 보여준다:
(패널 A 및 D) 생쥐-항-디프테리아 독소에 의한 디프테리아 독소에 대한 면역 조직 화학에 의해 CRM197에 대하여 염색한 CRM197-HRP 콘쥬게이트 주사 동물의 동결-부분 (전 부분 전반에 걸쳐 균질하게 분포된 희미한 염색 패턴을 주의, 패널 A: 20×의 배율, 패널 D: 100×의 배율);
(패널 B 및 E) 생쥐-항-디프테리아 독소에 의한 디프테리아 독소에 대한 면역 조직 화학에 의해 CRM197에 대하여 염색한 자유 HRP 주사 동물의 동결-부분 (염색 패턴은 존재하지 않음을 주의, 패널 B: 20×의 배율, 패널 E: 100x의 배율);
(패널 C 및 F) 생쥐-항-디프테리아 독소에 의한 디프테리아 독소에 대한 면역 조직 화학에 의해 CRM197에 대하여 염색한 TrF-HRP 콘쥬게이트 주사 동물의 동결-부분 (염색 패턴은 존재하지 않음을 또 주의, 패널 C: 20×의 배율, 패널 F: 100x의 배율).
총체적으로는 이러한 결과는 (절단되거나 HRP에 여전히 콘쥬게이션된) CRM197이 뇌에서 흡수됨을 나타낸다.
1. 방법 및 재료
1.1 세포 배양
1.1.1 소 뇌 모세 혈관의 단리
뇌 모세 혈관을 도살장에서 새로 죽인 동물로부터 수득한 소 (송아지) 뇌로부터 단리하였다. 빙냉 포스페이트 완충 염수 (LPSS, 1.1 mM KH2P04, 5.6 mM Na2HP04 및 150 mM NaCl, pH 7.4) 중의 뇌를 실험실로 수송하였다. 수막 및 백질을 제거하고 회백질을 10% (v/v)의 가열 불활성화 (56℃에서 30분) 송아지 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) (DMEM+S)에 수집하였다. 고 D-글루코스 (4.5 g/l), NaHCO3 (3.7 g/l) 및 HEPES (25 mM)와 함께 제형화된 DMEM은 여분의 MEM 비-필수 아미노산, L-글루타민 (2 mM), 스트렙토마이신 술페이트 (0.1 g/l) 및 페니실린 G 소듐 (100000 U/l)을 포함한다. 혈관 단편은 Wheaton 균질화기를 사용한 수동 균질화로 제조하고 그 후 150 ㎛ 나일론 메쉬 상에 트래핑 (trapped)하였다. 혈관을 DMEM+S 중 콜라게나제 CLS3 (210 U/ml), 트립신 TRL (91 U/ml) 및 DNAseI (170 U/ml, 최종 농도)으로 37℃에서 1시간 동안 절단시키고 그 후 200 ㎛ 메쉬를 통하여 여과하였다. 뇌 모세 혈관 분획을 냉동 믹스 (10% (v/v) DMSO를 포함하는 송아지 태아 혈청 (FCS)) 중에 재현탁시키고 -80℃에서 보관하였다.
1.1.2 아스트로사이트의 단리
아스트로사이트를 신생 Wistar 쥐 새끼 (Harlan B. V., 네델란드 제이스트 소재)로부터 단리하였다. 단리된 피질을 단편화하고 37℃에서 진탕 수조 (80 rpm, 30분)에서 DMEM (HEPES로 충분히 완충되었으며 (50 mM), NaHCO3는 포함하지 않음) 중의 0.016% (w/v) 트립신-EDTA (최종 농도)와 함께 인큐베이션하였다. 현탁물을 각각 120 및 45 ㎛ 나일론 메쉬를 통하여 여과하였다. 세포 현탁물을 공기와 10% CO2와의 혼합물에서 37℃에서 축축한 인큐베이터 (Napco Scientific Company, 미국 오레곤주 투알라틴 소재)에서 250 ml의 플라스틱 조직 배양 플라스크 (Greiner B. V., Alphen a/d Rijn, 네델란드)에서 DMEM+S에서 3일 동안 배양하였다. 그 후 배지를 격일로 새로 공급하였다. 배양한지 7일 후 아스트로사이트 외의 세포를 실온에서 하룻밤 진탕 수조 (80 rpm)에서 배양물을 진탕함으로써 제거하였다. 2일 후 폴리-D-라이신 코팅된 플라스크로 1:3의 분할 비로 0.05% (w/v) 트립신-EDTA를 이용하여 배양물을 계대 배양하였다 (10 ㎍/ml의 폴리-D-라이신 용액을 하룻밤 교반시키고, 공기 건조시키고 LPSS로 (3회) 세척함). 융합성이 될 경우 아스트로사이트 조절 배지를 2-4주 동안 격일로 수집하고 살균 여과하고 -20℃에 보관하였다. 공동 배양 목적에 있어서는 2주령의 배양물을 계대 배양하고 액체 질소에서 동결 믹스로 보관하였다.
1.1.3 뇌 모세 혈관의 차별적 접종 및 BCEC의 배양
뇌 모세 혈관을 콜라겐 (인간 태반 제IV형, 0.1% (v/v)의 아세트산 중 10 ㎍/ml 용액 2시간 및 LPSS를 이용한 3회 세척) 및 인간 혈장 피브로넥틴 (LPSS 중 10 ㎍/ 용액, 30분) 코팅된 250 ml 플라스틱 조직 배양 플라스크에 접종하고 인큐베이터에서 4시간 동안 점착되게 하였다. 그 후 배양 배지를 성장 배지 (125 ㎍/ml의 헤파린이 보충된, 50% (v/v)의 아스트로사이트 조절 배지를 포함하는 DMEM+S)로 대체하고 빨리 성장하는 세포, 두드러지게는 BCEC 및 일부 주위 세포 (pericytea)를 37℃, 10% CO2에서 배양하였다.
1.1.4 필터 상의 시험관내 BBB의 제조
시험관내 BBB 모델을 (상기의) 콜라겐 코팅된 Transwell 폴리카르보네이트 필터 (표면적: 0.33 cm2, 기공 크기: 0.4 ㎛, Corning Costar, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 상에서 제조하였다. 약 70%의 융합도에서 (뇌 모세 혈관을 접종한지 4일 또는 5일 후) BCEC를 대략 1분 동안 내피 세포용의 트립신-EDTA (500 BAEE 단위의 돼지 트립신 및 180 ㎍의 EDTA/ml)를 이용하여 계대 배양하고, 대부분의 주위 세포는 기층에 여전히 점착하게 두었다. BCEC 및 아스트로사이트의 공동 배양물은 필터 당 45000개의 아스트로사이트의 밀도로 필터의 기저부 상에 접종한 아스트로사이트로 제조하였다. 아스트로사이트는 필터의 기저부에 8분 동안 점착되게 하고 2일 또는 3일 후에 BCEC를 계대 배양하였다. 필터 당 30000개의 BCEC의 밀도로 BCEC를 접종하였다. BCEC+아스트로사이트 공동 배양물을 첫번째의 2일 동안 125 ㎍/ml의 헤파린이 보충된 DMEM+S에서, 그리고 마지막 2일 동안 DMEM+S에서 타이트한 (tight) 단일층으로 배양하였다. 배양 배지에 50% (v/v) 아스트로사이트 조절 배지를 첨가한 것을 제외하고는 BCEC 단일층을 그에 상응하게 배양하였다.
1.2 Affymetrix GeneChip (등록상표) 유전자 발현 분석
1.2.1 전체 RNA의 단리
BCEC+아스트로사이트 공동 배양물의 경우, 아스트로사이트를 Transwell 필터의 기저측을 긁어냄으로써 BCEC RNA 단리 이전에 제거하였다. 전체 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 BCEC (< 5%의 주위 세포를 포함함 (Gaillard et al., 2001, supra))로부터 단리하였다. 이를 위해서는 세포 배양 배지를 제거하고 Transwell 필터 당 40 ㎕의 용해 완충제로 대체하였다. 그 후 동물 세포로부터 전체 RNA를 단리하는 데 있어서의 제조자의 권고 절차에 따라 용해물을 재현탁시키고 다중 (12-18) Transwell 필터로부터 수집하였다. QIAshredders를 사용하여 세포 용해물을 균질화하였다. 필요할 경우 전체 RNA를 아세트산나트륨 및 에탄올로 농축시켰다.
1.2. 2 표지 RNA의 제조
Affymetrix GeneChip (등록상표) 유전자 발현 분석에 있어서 전체 RNA로부터의 바이오티닐화 cRNA의 제조를 위한 그 후의 프로토콜을, Affymetrix GeneChip (등록상표) 발현 분석 안내서 (Affymetrix, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 기술되어 있는 바와 같이 제조자의 권고 사항에 따라 수행하였다. 간단히 말해, Gibco BRL Superscript Choice System (Life Technologies, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)을 사용하여 이중 가닥 cDNA를 합성하는 데에 샘플 당 6-16 ㎍의 전체 RNA를 사용하였다. T7-dT24 프라이머 및 Superscript II 역전사효소 (Life Technologies, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)를 제1 가닥의 합성에 이용하였다. 제 2 가닥의 합성은 대장균 DNA 폴리머라제 I (Life Technologies, 미국 ㅁ메메릴랜드주 로크빌 소재)을 포함하였다. 이어서 이중 가닥 cDNA를 페놀/클로로포름 추출 (상 고정 겔 (phase lock gel) (Eppendorf AG, 독일 함부르크 소재)을 이용함), 이어서 아세트산암모늄 및 에탄올을 이용한 침전법을 사용하여 정제하였다. BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics, 미국 뉴욕주 파밍데일 소재)를 사용한 cDNA로부터의 시험관내 전사, 37℃에서의 5시간 동안의 인큐베이션에 의해 바이오티닐화 cRNA를 합성하였다. 이어서 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, 독일 힐덴 소재)의 RNA 정화 프로토콜을 사용하여 표지 cRNA를 정제하였다. 그 후 15-20 ㎍의 표지 cRNA를, 단편화 완충제 (40 mM 트리스-아세테이트 (pH 8.1), 125 mM KOAc, 30 mM MgOAc)에서 94℃에서의 35분 동안의 가열에 의해 단편화하였다.
1.2.3 GeneChip (등록상표) 혼성화
표지 및 단편화 cRNA를 제조자가 권고하는 조건 하에서 HG-U95Av2 및 HG-U133A 어레이에 혼성화하였다. cRNA를 먼저 Test2Chip (Affymetrix)에 혼성화하여 이 제제의 품질을 보증하였다. 간단히 말하면, cRNA를 혼성화 믹스 (1x MES 혼성화 완충제, 100 ㎍/ml의 청어 정자, 50 ㎍/ml의 아세틸화 BSA, 대조 올리고뉴클레오티드 B2 및 진핵 생물 혼성화 대조) 중에 희석시키고 변성시키고 이어서 60 rpm에서 45℃에서 16시간 동안 혼성화하였다. 혼성화에 이어 어레이를 세척하고 Affymetrix Genechip (등록상표) Fluidics Station 400을 사용하여 스트렙타비딘-피코에리트린으로 염색하였다. 어레이 상의 형광 신호를 Hewlett-Packard Affymetrix GeneArray (등록상표) 스캐너를 사용하여 측정하였다.
실시예 1
BCEC-ACM 단일층과 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 중 및 이들 사이에서 차별적으로 발현되는 "리포폴리사카라이드-민감성" 유전자의 동정
(참고 문헌으로 포함된 문헌[Gaillard (2000a, supra)]에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이) 이전의 실험에 있어서 본 발명자들은 아스트로사이트 및 염증 과정 (리포폴리사카라이드 LPS에 의해 모방됨)이 본 발명자들의 동적인 BBB 공동 배양물 모델에 있어서 반대되는 효과를 나타낸다는 것을 알아내었다. 간단히 말하면, 아스트로사이트는 장벽 기능성을 증가시키며 반면 LPS는 이것을 감소시킨다. 또한 아스트로사이트는 아스트로사이트의 물리적인 존재 없이는 관찰되지 않는 LPS로부터의 회복 과정을 초래한다 (즉, BCEC-ACM 단일층에서). 마지막으로 이 회복 과정은 단백질 합성에 의존적인데, 이는 특정 유전자 전사가 연루됨을 나타낸다. 도 2에 이러한 실험적 접근법이 개략적으로 상세하게 도시되어 있다.
(참고 문헌으로서, 그리고 본 명세서에서 간략하게 "1.1 세포 배양"에 포함되어 있는 Gaillard et al., 2001, supra에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이) 연루된 LPSS 유전자의 동정 및 회복 과정에서의 그의 연루성의 확인에 있어서 송아지 뇌로부터 일차 단리한 뇌 모세 혈관으로부터 배양한 본 발명자들의 BCEC를 위한 하기의 4가지의 상이한 세포 배양 조건을 사용하였다: 1) 50% ACM 중 필터 삽입체 상의 BCEC 단일층 (도 1a: BCEC-ACM); 2) 1 마이크로그램/ml의 LPS (혈청형: 055:B5)에 1시간 동안 정점 노출시킨 50% ACM 중 필터 삽입체 상의 BCEC 단일층; 3) 필터 삽입체의 기저부 측에서 배양된 일차 단리된 신생 쥐의 뇌 아스트로사이트를 포함하는 필터 삽입체 상의 BCEC 단일층 (도 1b: BCEC-아스트로사이트); 4) 필터 삽입체의 기저부 측에서 배양되었으며 1 마이크로그램/ml의 LPS (혈청형: 055:B5)에 2시간 동안 정점 노출시킨 일차 단리된 신생 쥐의 뇌 아스트로사이트를 포함하는 필터 삽입체 상의 BCEC 단일층. LPS 처리된 BCEC (조건 2 및 4)를 미처리 BCEC (조건 1 및 3)에서 밝혀진 결과와 비교하였다.
LPS에 노출한지 2시간 후 BBB 기능성을 전류 통과 및 전압 측정 전극을 포함하는 전기 저항 시스템 (ERS) (Millicell-ERS, Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)을 사용하여 필터를 가로지르는 TEER로 평가하였다. 세포를 포함하지 않는 콜라겐 코팅 필터의 전기 저항을 빼고 필터 표면적에 대하여 보정함으로써 정보 판독 (readout) 스크린 상의 전기 저항 표시치로부터 TEER (옴.cm2)을 계산하였다. 기저부에 아스트로사이트만을 포함하는 콜라겐 코팅 필터를 가로지르는 TEER은 0에 가까웠다 (Gaillard et al., 2001, supra).
BCEC-ACM 단일층을 가로지르는 평균 TEER은 LPS에의 노출 전에는 29.3 +/- 2.1 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=12)이었으며 LPS에 노출한지 2시간 후에는 21.2 +/- 4.2 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=18)로 감소되었다. 이 결과를 그래프로 나타낸 것에 대해서는 도 3a 참조. 이러한 TEER 감소는 비대응 표본 (Unpaired) t-검정 (p > 0.05)에 따르면 유의한 것으로 간주될 수 없다. 따라서 TEER은 미처리 BCEC-ACM 단일층과 비교시 72.4 +/- 14.3 % (평균 +/- 표준 오차, n=18)로 감소하 였다 (그래프로 나타낸 것에 대해서는 도 3b 참조).
BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 평균 TEER은 LPS에의 노출 전에는 149.8 +/- 5.4 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=18)이었으며 LPS에 노출한지 2시간 후에는 65.5 +/-2.1 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=18)으로 감소되었다. 이 결과를 그래프로 나타낸 것에 대해서는 도 4a 참조. 이러한 TEER 감소는 비대응 표본 t-검정 (p < 0. 0001)에 따르면 극도로 유의한 것으로 간주될 수 있다. 따라서 TEER은 미처리 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물과 비교시 43.7 +/- 1.4 % (평균 +/- 표준 오차, n=18)로 감소하였다 (그래프로 나타낸 것에 대해서는 도 4b 참조).
모든 실험 조건 (BCEC-ACM 단일층 +/- LPS 및 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 +/- LPS)에 있어서 RNA 단리, cRNA의 표지 및 혼성화 프로토콜은 삼중으로 수행하였으며 모든 샘플은 HG-U95Av2 및 HG-U133A 어레이 둘 모두에서 분석하였다. Affymetrix Microarray Suite 5.0 및 Affymetrix Data Mining Tool 2.0을 획득된 강도 데이타의 일차 분석에 사용하였다. Microsoft Excel (Microsoft, 미국 소재)을 추가의 분석에 사용하였다. 각각의 칩의 데이타를 사용자에 의해 정의되는 표적 강도로 축척할 경우 범용 축척을 수행하여 실험을 비교할 수 있게 하였다. 모든 샘플에 있어서 Affymetrix Microarray Suite 5.0에 의해 "부재"로 명시되는 유전자는 추가의 분석에서 제외하였다. 적용가능할 경우 모든 3가지의 "삼중" 샘플에 있어서 "존재" 또는 "약간 존재"로 명시되는 유전자만을 추가의 분석에 포함시 켰다. Mann-Whitney 검정을 수행하여 (대조 BCEC-ACM 단일층과 LPS-처리 BCEC-ACM 단일층 사이; 대조 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물과 LPS-처리 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 사이; LPS-처리 BCEC-ACM 단일층과 LPS-처리 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 사이에서) 통계학적으로 유의하게 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. 차이는 p-값이 <0.05일 경우 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 또한 BCEC-ACM 단일층과 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 사이의 LPS 효과에 있어서는 평균 강도 값에 기초하여 변화 배수를 계산하였다 (단지 2배 이상을 생물학적으로 관련된 것으로 간주함).
동정된 유전자는 본 명세서에서 "리포폴리사카라이드-민감성 (LPSS)" 유전자로 명시하였으며, 표 1에서 그에 상응하게 코딩하여 (LPSS01-LPSS25) 제시하였다. 또한 LPSS 유전자에 있어서 서열 번호, LPS 효과 (상향, 하향, 차별 발현 (dif+ 또는 dif-)), 공공 접근성 데이타베이스의 참고 서열 (RefSeq)에 대한 접근 코드, 유전자 기호, 및 설명 (표제 또는 유전자 명칭)이 포함되어 있다. 각각의 동정된 LPSS 유전자에 있어서 구체적인 결과가 표 2에 제시되어 있다.
실시예 2
BCEC-아스트로사이트 공동 배양물 중 LPSS14 (DTR)의 특성화
뇌-혈관 장벽 상의 LPSS14 (DTR)의 특성화에 있어서, 송아지 뇌로부터 일차 단리한 뇌 모세 혈관으로부터 배양한 BCEC를 필터 삽입체의 기저부 측에서 배양한 일차 단리한 신생 쥐의 뇌 아스트로사이트를 포함하는 필터 삽입체 상의 단일층으로 사용하였다 (도 1b: 참고 문헌으로서, 그리고 본 명세서에서 "1.1 세포 배양"에 간략하게 포함된 Gaillard et al., 2001, supra에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이 BCECC-아스트로사이트). 본 발명자들은 1) 필터의 정점 (혈액) 측 상의 다양한 농도의 (1 ng/ml 내지 최대 10 마이크로그램/ml)의 DT에 노출시킨 BCEC (결과를 도 5에 도시함); 2) 그 후 DT를 필터의 기저 (뇌) 측에 노출시키는 것을 제외하고는 1과 유사 (결과를 도 6에 도시함); 3) 필터의 정점 측에 노출시키기 전에 DT의 수용체 결합 도메인에의 결합에 의해 DTR의 비-경쟁성 길항제로 작용하는 다양한 농도의 용해성 HB-EGF (0.1-10 마이크로그램/ml)와 함께 예비 인큐베이션 (실온에서 1시간)시킨 100 ng/ml의 DT에 노출시킨 BCEC (결과를 도 7에 도시함); 4) BCEC를 100 ng/ml의 DT에 노출시키기 전에 DT의 수용체 결합 도메인에의 결합에 의해 DTR에서 경쟁성 길항제로 작용하는 5 마이크로그램/ml의 CRM197로 1시간 동안 예비 처리한 BCEC (결과를 도 8에 도시함)를 사용하였다.
DT에의 노출 후 매시간 전류 통과 및 전압 측정 전극을 포함하는 전기 저항 시스템 (ERS) (Millicell-ERS, Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)을 사용하여 필터를 가로지르는 TEER로 BBB 기능성을 평가하였다. 세포를 포함하지 않는 콜라겐 코팅 필터의 전기 저항을 빼고 필터 표면적에 대하여 보정함으로써 정보 판독 스크린 상의 전기 저항 표시치로부터 TEER (옴.cm2)을 계산하였다. 기저부에 아스트로사이트만을 포함하는 콜라겐 코팅 필터를 가로지르는 TEER은 0에 가까웠다 (Gaillard et al., 2001, supra). TEER에 대한 영향은 대조 처리 필터에 대하여 정상화하고 그대로 제시하였다.
1 ng/ml 내지 최대 10 마이크로그램/ml의 DT에의 정점 노출 후, BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER은 농도 및 시간에 의존하는 방식으로 감소하였으며, 반면 1 ng/ml만큼 작은 농도는 하룻밤의 인큐베이션 기간 후에는 유독하였다 (도 5). 이러한 결과는 DT가 독성 효과를 발휘할 수 있는 BCEC에 의해 정점 부위로부터 DT가 효과적으로 흡수됨을 나타낸다.
25 ng/ml 내지 최대 1000 ng/ml의 DT의 기저 노출 후 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 TEER은 농도 및 시간에 의존적인 방식으로 감소하였으며, 반면 등몰량의 정점 농도 또는 양의 DT와 비교시 이 효과는 약 1시간 더 일찍 나타났다 (도 6). 이러한 결과는 정점 노출과 비교시 DT가 기저 부위로부터의 BCEC에 의해 더 효과적으로 흡수된다는 것을 나타낸다.
용해성 HB-EGF와 함께 예비 인큐베이션한 100 ng/ml의 DT에의 정점 노출 후 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에 대한 DT의 독성 효과는 농도에 의존적인 방식으로 감소하였다 (도 7). 실제, 10 마이크로그램/ml의 용해성 HB-EGF와 함께 100 ng/ml의 DT를 예비 인큐베이션시키면 심지어 하룻밤의 평가 후에도 DT에 의해 유도되는 BCEC에 대한 독성 효과가 완전히 방지되었다. 이러한 결과는 BCEC에서의 DT 섭취가 그의 용해성 수용체에의 DT의 이전의 특이적 결합에 의해 효과적으로 차단되어 BCEC 내에서는 독성 효과를 발휘할 수 없게 된다는 것을 나타낸다.
BCEC를 CRM197과 함께 예비 인큐베이션한 후, BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에 대한 100 ng/ml의 DT에의 정점 노출 후의 독성 효과는 감소하였다 (도 8). 이러한 결과는 BCEC에서의 DT 섭취가 DTR에의 CRM197의 이전의 특이적 결합에 의해 효과적으로 길항되어 BCEC 내에서는 DT가 독성 효과를 발휘하는 것이 덜 유효하게 된다는 것을 나타낸다.
실시예 3
BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에서의 LPSS14 (DTR)의 생물학적 활성의 조정
뇌-혈관 장벽 상에서의 LPSS14 (DTR)의 생물학적 활성의 조정에 있어서 송아지 뇌로부터 일차 단리한 뇌 모세 혈관으로부터 배양한 BCEC를 필터 삽입체의 기저부 측에서 배양한 일차 단리된 신생 쥐의 뇌 아스트로사이트를 포함하는 필터 삽입체 상의 단일층으로 사용하였다 (도 1b: 참고 문헌으로서, 그리고 본 명세서에서 "1.1 세포 배양"에 간략하게 포함된 Gaillard et al., 2001, supra에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이 BCEC-아스트로사이트). 본 발명자들은 1) BCEC를 100 ng/ml의 DT에 노출시키기 전에 DT의 수용체 결합 도메인에서 배좌 변화를 유도함으로써 DTR에서 DT 결합 증강제로 작용하는 헤파린 (125 마이크로그램/ml)과 함께 1시간 동안 예비 처리한 BCEC (결과를 도 9에 도시함); 2) BCEC를 100 ng/ml의 DT에 노출시키기 전에 1 마이크로그램/ML의 LPS (혈청형: 055:B5)에 정점 노출시킴으로써 DTR의 발현 수준이 증가된 BCEC (결과를 도 10에 도시함); 3) BCEC를 100 ng/ml의 DT에 노출시키기 전에 엑토도메인 탈피 과정에 연루된 MMP의 억제제로 작용하는 10 마이크로몰의 BB94 (바티마스타트)에 1시간 동안 정점 노출시킴으로써 세포막 상의 DTR의 이용도가 증가된 BCEC (결과를 도 10에 도시함); 4) BCEC를 100 ng/ml의 DT에 노출시키기 전에 세포막 상의 DTR의 이용도 및 발현 수준 둘 모두를 증가 시키는 LPS (2) 및 BB94 (3)의 조합물 (결과를 도 10에 도시함)을 사용하였다.
DT에의 노출 후 매시간 전류 통과 및 전압 측정 전극을 포함하는 전기 저항 시스템 (ERS) (Millicell-ERS, Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)을 사용하여 필터를 가로지르는 TEER로 BBB 기능성을 평가하였다. 세포를 포함하지 않는 콜라겐 코팅 필터의 전기 저항을 빼고 필터 표면적에 대하여 보정함으로써 정보 판독 스크린 상의 전기 저항 표시치로부터 TEER (옴.cm2)을 계산하였다. 기저부에 아스트로사이트만을 포함하는 콜라겐 코팅 필터를 가로지르는 TEER은 0에 가까웠다 (Gaillard et al., 2001, supra). TEER에 대한 영향은 대조 처리 필터에 대하여 정상화하고 그대로 제시하였다.
BCEC를 헤파린과 함께 예비 인큐베이션한 후 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에 대한 100 ng/ml의 DT의 정점 노출 후의 독성 효과는 이 효과가 미처리 대조보다 약 1시간 더 일찍 일어나는 방식으로 증가하였으며 (도 9) 이는 10배 더 높은 농도의 DT에의 노출 후 측정한 독성 수준과 일치하였다. 이러한 결과는 BCEC에서의 DT 섭취가 헤파린에 의해 효과적으로 증가된다는 것을 나타낸다.
BCEC를 LPS 또는 BB94와 함께 예비 인큐베이션한 후 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에 대한 100 ng/ml의 DT의 정점 노출 후의 독성 효과는 이 효과가 미처리 대조에서 더 빨리 일어나는 방식으로 약간 증가하였다 (도 10). 또한 BCEC를 LPS 및 BB94 둘 모두와 함께 예비 인큐베이션할 경우, BCEC-아스트로사이트 공동 배양물에 대한 100 ng/ml의 DT의 정점 노출 후의 독성 효과는 이 효과가 미처리 대조 및 개별적으로 처리된 BCEC에서 훨씬 빨리 일어나는 방식으로 증가하였다 (도 10). 이러한 결과는 BCEC에서의 DT 섭취가 LPS (아마도 DTR 발현 증가로 인한 것임) 및 BB94 (아마도 엑토도메인 탈피 억제에 의한 DTR 이용도 증가로 인한 것임)에 의해 효과적으로 증가되며, 이는 부가적인 (additive) 효과임을 나타낸다.
실시예 4
LPSS14 (DTR)를 통한 뇌-혈관 장벽으로의 약물 표적화: 시험관내 섭취 연구
LPSS14 (DTR)을 통한 뇌-혈관 장벽 약물 표적화 능력의 평가에 있어서, 송아지 뇌로부터 일차 단리한 뇌 모세 혈관으로부터 배양한 BCEC를 96-웰 플레이트 중의 단일층으로 사용하였다 (도 1b: 참고 문헌으로서, 그리고 본 명세서에서 "1.1 세포 배양"에 간략하게 포함된 Gaillard et al., 2001, supra에 상세하게 설명됨). 본 발명자들은 1) 10:1의 중량/중량 비로 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP, 40 kDa 효소)에 콘쥬게이션된 단백질 (CRM197, BSA 및 홀로-트랜스페린 (TrF)) (도 11); 및 2) CRM197의 수용체 결합 도메인에의 결합에 의해 DTR-매개 섭취에 있어서 비-경쟁성 길항제로 작용하는 10 마이크로그램/ml의 용해성 HB-EGF와 함께 예비 인큐베이션한 (실온에서 1시간) 10:1의 중량/중량 비로 HRP에 콘쥬게이션된 CRM197 및 10:1의 중량/중량 비로 HRP에 콘쥬게이션된 CRM197 (도 12); 및 3) 섭씨 37도 및 섭씨 4도에서 활성제 흡수의 측정을 위한 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 (도 14). 섭씨 4도의 실험 부문에 있어서는, BCEC를 냉장고에서 1시간 동안 냉각시킨 후 섭취 실험을 시작. 이 특정 실험에 있어서 BCEC는 완전 HEPES 완충된 DMEM+S에서 마지막 2일 동안 배양함; 및 4) 특이적 섭취의 측정을 위한 HRP-로딩된 CRM197- 코팅 PEG-리포좀 및 HRP-로딩된 BSA-코팅 PEG-리포좀 (도 15); 및 5) CRM197-코팅 PEG-리포좀의 수용체 결합 도메인에의 결합에 의해 DTR에서 경쟁성 길항제로 작용하는 50 마이크로그램/ml의 CRM197과 함께 1시간 동안 예비 처리한 BCEC 상의 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 및 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 (도 16)을 사용하였다.
제조자의 지시에 따라 HRP 콘쥬게이션 키트 (Alpha Diagnostic International, 미국 텍사스주 샌 안토니오 소재)로 단백질을 HRP에 콘쥬세이션시켰다. 또한 콘쥬세이션된 단백질을 Sephacryl S-200 HR 매트릭스가 패킹된 HiPrep 16/60 컬럼 (Amersham Biosciences,영국 소재) 상에서 추가로 정제하였다.
리포좀 (100 nm)은 본질적으로 Mastrobattista et al.(1999, Biochim. Biophys. Acta. 1419: 353-363)에 따라 제조하였으며 이는 2:1의 비의 EPC-35 및 콜레스테롤로 구성되어 있는데, 2.5%의 PEG2000-DSPE 및 2.5%의 PEG2000-말레이미드-PE는 리포좀 당 약 3-60개의 CRM197 단백질에 콘쥬게이션된다. 간단히 말하면 유기 용매의 증발 후 지질 필름을 μmol의 PL 당 0.3 mg의 HRP를 포함하는 pH 6.5의 HBS에 재현탁시키고 리포좀을 일련의 필터 (200-50 nm)를 통하여 3-5회 사출하였다. CRM197을 Bloemen et al. (1995, FEBS Lett. 357: 140-144)에 따라 SATA를 사용하여 티올기로 변형시켰다. CRM197 및 SATA (1:8의 몰 비)를 일정한 진탕 하에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 자유 SATA를 30 kDa 컷-오프 (cut-off) 필터 (Vivaspin) 상에서 원심 분리로 제거하였다. PEG2000-말레이미드-PE에의 커플링 직전에 0.1 M의 히드록실아민 (pH 7.4)과 함께 실온에서 45분 동안 인큐 베이션함으로써 티올기를 활성화하였다 (탈보호). 티올기의 양 및 안정성은 엘만 시약으로 측정하였다 (Ellman, 1959, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77). HRP-예비로딩 리포좀을 삽입 후 방법에 따라 CRM197-콘쥬게이션된 PEG2000으로 코팅하였다 (Iden et al., 2001, Biochim Biophys Acta. 1513 (2): 207-216). 간단히 말하면, 2.5%의 CRM197-콘쥬게이션된 PEG2000-말레이미드-PE 및 2.5%의 PEG2000-DSPE의 미셀을, 섭씨 40도에서의 2시간 인큐베이션 동안 예비 형성한 HRP-로딩된 리포좀 내로 옮긴 후 Sephadex CL4B 컬럼 상에서 분리하고 이어서 한외 원심 분리 (60.000 g, 30분, 섭씨 10도)를 사용하여 농축시켰다. (각각의 실시예에 대하여 나타낸) 특정 실험에 있어서, 본 명세서에서 상기한 프로토콜을 겪는 CRM197을 BSA로 대체하였는데 이는 대조 리포좀으로 작용한다. 제조 후 인지질 함량을 Fiske 및 Subarrow법에 따라 측정하고, 단백질 함량을 Biorad 단백질 분석법 (Bradford 변형법)으로 측정하였다. CRM197-코팅된 PEG-리포좀은 리포좀 당 3.3개의 단백질을 포함하였는데, BSA-코팅된 PEG-리포좀은 리포좀 당 26.9개의 단백질을 포함하였다. 또한 크기 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 112 nm, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 104 nm) 및 다분산도 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 0.21, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 0.08)는 Malvern 4700 시스템 (Malvern Ltd. 영국 말베른 소재)으로 동적 광 산란에 의해 측정하였다. 제타전위 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 -18.6 +/- 0.7, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 -25.2 +/- 11.2)는 Malvern 3000 HSa 제타사이저 (zetasizer) (Malvern Ltd. 영국 말베른 소재)로 측정하였다.
콘쥬게이션된 단백질의 HRP 활성, 리포좀 및 세포 용해물 샘플에서의 HRP 함량은 적절한 교정 곡선을 이용하여 표준 비색 분석법을 사용하여 탐지하였다. 세포 및 리포좀은 0.1%의 Na-데옥시콜레이트 수용액 40 마이크로리터로 용해시켰다 (세포를 냉각 PBS로 완전히 세척한 후).
5 마이크로그램/ml 농도의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응하는 HRP-콘쥬게이션된 단백질과 함께 BCEC를 인큐베이션한 후 BSA- 및 트랜스페린-HRP 콘쥬게이트와 비교시 바람직하게는 CRM197-HRP 콘쥬게이트가 BCEC에 의해 흡수되었다 (도 11). 이러한 결과는 40 kDa의 적하물에 콘쥬게이션된 CRM197이 BCEC에 의해 특이적으로 흡수된다는 것을 나타낸다.
10 마이크로그램/ml의 용해성 HB-EGFF와 함께 예비 인큐베이션시킨 CRM197-HRP-콘쥬게이트 (5 마이크로그램/ml의 농도의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응함)와 함께 BCEC를 인큐베이션한 후 BSA-HRP-콘쥬게이트의 특이적 섭취와 비교시 CRM197-HRP 콘쥬게이트의 특이적 섭취는 완전히 억제되었다 (도 12). 이러한 결과는 40 kDa의 적하물에 콘쥬게이션된 CRM197이 DTR-매개된 섭취 과정을 통하여 BCEC에 의해 특이적으로 흡수된다는 것을 나타낸다.
5 마이크로그램/ml의 농도의 자유 HRP에 상응하는 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀과 함께 BCEC를 인큐베이션시킨 후, 섭씨 37도의 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀은 섭씨 4도에서의 섭취와 비교시 BCEC에 의해 능동적으로 (도 14), 그리고 HRP -로딩된 BSA-코팅 PEG-리포좀의 섭취와 비교시 특이적으로 (도 15) 흡수되었으며 (도 14), 50 마이크로그램/ml의 자유 CRM197과 함께 1시간 동안 예비 처리한 BCEC에 의한 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀의 섭취량과 비교시 DTR에 의해 특이적으로 매개되었다 (도 16). 총체적으로는, 이러한 결과는 CRM197-코팅 PEG-리포좀이 BCEC에서 DTR에 의해 능동적으로, 그리고 특이적으로 흡수된다는 것을 나타낸다.
실시예 5
LPSS14 (DTR)를 통한 뇌-혈관 장벽을 가로지르는 약물의 표적화: 시험관내 트랜스사이토시스 연구
트랜스사이토시스에 의한 LPSS14 (DTR)을 통한 뇌-혈관 장벽 약물 표적화 능력의 평가에 있어서, 송아지 뇌로부터 일차 단리한 뇌 모세 혈관으로부터 배양한 BCEC를 필터 삽입체의 기저부 측에서 배양한 일차 단리한 신생 쥐의 뇌 아스트로사이트를 포함하는 필터 삽입체 상의 단일층으로 사용하였다 (도 1b: 참고 문헌으로서, 그리고 본 명세서에서 "1.1 세포 배양"에 간략하게 포함된 Gaillard et al., 2001, supra에 상세하게 설명된 바와 같이 BCEC-아스트로사이트). 본 실시예에 기술된 트랜스사이토시스 실험에 있어서, 세포를 312.5 μM의 8-(4-클로로페닐티오(CTP))-cAMP로, 그리고 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물의 견고함의 극적 증가 (즉, 세포옆 (paracellular) 누출성의 감소)를 위하여 마지막 2일 또는 3일 동안 완전 HEPES 완충된 DMEM+S 중의 17.5 μM의 RO-20-1724로 처리하였다. 본 발명자들은 1) 섭씨 37도 및 섭씨 4도 둘 모두에서 능동적인 특이적 트랜스사이토시스의 측정을 위하여 2:1의 중량/중량 비로 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP, 40 kDa 효소)에 콘쥬게이션된, 표적화 부분으로 작용하는 CRM197, 및 대조 단백질로 작용하는 BSA (도 13). 섭씨 4도의 실험 부문에 있어서는 필터를 냉장고에서 1시간 동안 냉각시킨 후 수송 실험을 시작하였음; 및 2) 특이적 트랜스사이토시스의 측정을 위한 HRP-로딩된 CRM197-코팅 PEG-리포좀 및 HRP-로딩된 BSA-코팅 PEG-리포좀 (도 17)을 사용하였다.
BBB 기능성은 전류 통과 및 전압 측정 전극을 포함하는 전기 저항 시스템 (ERS) (Millicell-ERS, Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)을 사용하여 필터를 가로지르는 TEER로 평가하였다. 세포를 포함하지 않는 콜라겐 코팅 필터의 전기 저항을 빼고 필터 표면적에 대하여 보정함으로써 정보 판독 (readout) 스크린 상의 전기 저항 표시치로부터 TEER (옴.cm2)을 계산하였다. 기저부에 아스트로사이트만을 포함하는 콜라겐 코팅 필터를 가로지르는 TEER은 0에 가까웠다 (Gaillard et al., 2001, supra).
제조자의 지시에 따라 HRP 콘쥬게이션 키트 (Alpha Diagnostic International, 미국 텍사스주 샌 안토니오 소재)로 단백질을 HRP에 콘쥬세이션시켰다. 또한 콘쥬세이션된 단백질을 Sephacryl S-200 HR 매트릭스가 패킹된 HiPrep 16/60 컬럼 (Amersham Biosciences,영국 소재) 상에서 추가로 정제하였다.
리포좀 (100 nm)은 본질적으로 Mastrobattista et al.(1999, Biochim. Biophys. Acta. 1419: 353-363)에 따라 제조하였으며 이는 2:1의 비의 EPC-35 및 콜레스테롤로 구성되어 있는데, 2.5%의 PEG2000-DSPE 및 2.5%의 PEG2000-말레이미드-PE는 리포좀 당 약 3-60개의 CRM197 단백질에 콘쥬게이션된다. 간단히 말하면 유기 용매의 증발 후 지질 필름을 μmol의 PL 당 0.3 mg의 HRP를 포함하는 pH 6.5의 HBS에 재현탁시키고 리포좀을 일련의 필터 (200-50 nm)를 통하여 3-5회 사출하였다. CRM197을 Bloemen et al. (1995, FEBS Lett. 357: 140-144)에 따라 SATA를 사용하여 티올기로 변형시켰다. CRM197 및 SATA (1:8의 몰 비)를 일정한 진탕 하에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 자유 SATA를 30 kDa 컷-오프 필터 (Vivaspin) 상에서 원심 분리로 제거하였다. PEG2000-말레이미드-PE에의 커플링 직전에 0.1 M의 히드록실아민 (pH 7.4)과 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션함으로써 티올기를 활성화하였다 (탈보호). 티올기의 양 및 안정성은 엘만 시약으로 측정하였다 (Ellman, 1959, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77). HRP-예비로딩 리포좀을 삽입 후 방법에 따라 CRM197-콘쥬게이션된 PEG2000으로 코팅하였다 (Iden et al., 2001, Biochim Biophys Acta. 1513 (2): 207-216). 간단히 말하면, 2.5%의 CRM197-콘쥬게이션된 PEG2000-말레이미드-PE 및 2.5%의 PEG2000-DSPE의 미셀을, 섭씨 40도에서의 2시간 인큐베이션 동안 예비 형성한 HRP-로딩된 리포좀 내로 옮긴 후 Sephadex CL4B 컬럼 상에서 분리하고 이어서 한외 원심 분리 (60.000 g, 30분, 섭씨 10도)를 사용하여 농축시켰다. (각각의 실시예에 대하여 나타낸) 특정 실험에 있어서, 본 명세서에서 상기한 프로토콜을 겪는 CRM197을 BSA로 대체하였는데 이는 대조 리포좀으로 작용한다. 제조 후 인지질 함량을 Fiske 및 Subarrow법에 따라 측정하고, 단백질 함량을 Biorad 단백질 분석법 (Bradford 변형법)으로 측정하였다. CRM197-코팅된 PEG-리포좀은 리포좀 당 3.3개의 단백질을 포함하였는데, BSA-코팅된 PEG-리포좀은 리포좀 당 26.9개의 단백질을 포함하였다. 또한 크기 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 112 nm, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 104 nm) 및 다분산도 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 0.21, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 0.08)는 Malvern 4700 시스템 (Malvern Ltd. 영국 말베른 소재)으로 동적 광 산란에 의해 측정하였다. 제타전위 (CRM197-코팅된 PEG-리포좀의 경우 -18.6 +/- 0.7, 그리고 BSA-코팅된 PEG-리포좀의 경우 -25.2 +/- 11.2)는 Malvern 3000 HSa 제타사이저 (zetasizer) (Malvern Ltd. 영국 말베른 소재)로 측정하였다.
CRM197 또는 BSA에 콘쥬게이션된 HRP, 또는 CRM197 또는 BSA 중 어느 하나에 콘쥬게이션된 HRP-로딩된 PEG-리포좀을 필터 삽입체의 정점 측에 첨가하고 이 필터를 가온한 (또는 HRP-콘쥬게이션된 단백질의 경우 냉각한) 250 마이크로리터의 HEPES 완충 DMEM+S를 포함하는 새로운 웰 내로 직접 옮겼다. CRM197 또는 BSA 중 어느 하나에 콘쥬게이션된 HRP-로딩된 PEG- 리포좀 또는 HRP-콘쥬게이션된 단백질의 알부민 측의 BCEC에 의한 가능한 재-엔도사이토시스 (endocytosis)의 방지를 위하여 최대 총 4시간까지 매시간 이 절차를 반복하였다. 적절한 교정 곡선으로 표준 비색 분석법을 사용하여 기저 구획 내로 트랜스사이토시스된 HRP의 누적 HRP 활성을 탐지하였다.
8-4-CPT-cAMP 및 RO-20-1724를 이용한 처리 후 BCEC-아스트로사이트 공동 배양물을 가로지르는 평균 TEER은 149.8 +/- 5.4 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=18)에서 834 +/- 77 옴.cm2 (평균 +/- 표준 오차, n=24)로 증가되었다. 미처리 세포와 상기와 같이 처리한 세포 사이의 DT 민감도에서의 차이는 전혀 관찰되지 않았다 (데이타는 예시하지 않음).
BCEC를 5 마이크로그램/ml의 농도의 미-콘쥬게이션된 HRP에 상응하는 HRP-콘쥬게이션된 단백질과 함께 인큐베이션한 후, CRM197-HRP 콘쥬게이트는 BSA-HRP 콘쥬게이트와 비교시 바람직하게는 BCEC를 가로질러 트랜스사이토시스되었다 (도 13). 섭씨 4도에서의 CRM197-HRP 콘쥬게이트의 수송 수준은 섭씨 37도 및 4도에서의 BSA-HRP 콘쥬게이트와 동일하였다 (도 13). 이러한 결과는, CRM197이 심지어 40 kDa의 단백질 적하물에 콘쥬게이션될 때에도 뇌-혈관 장벽을 가로질러 특이적으로, 그리고 능동적으로 트랜스사이토시스된다는 것을 나타낸다.
BCEC를 5 마이크로그램/ml의 농도의 자유 HRP에 상응하며 CRM197 또는 BSA 중 어느 하나에 콘쥬게이션된 HRP-로딩된 PEG-리포좀과 함께 인큐베이션한 후, CRM197-코팅된 PEG-리포좀은 BSA-코팅된 PEG-리포좀과 비교시 바람직하게는 BCEC를 가로질러 트랜스사이토시스되었다 (도 17). 이러한 결과는, CRM197이 심지어 약 100 nm의 리포좀에 콘쥬게이션될 때에도 뇌-혈관 장벽을 가로질러 그의 40 kDa 단백질 적하물을 특이적으로 전달할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6
LPSS14 (DTR)를 통한 뇌-혈관 장벽을 가로지르는 약물의 표적화: 기니아 피그에서의 생체내 뇌 분포 연구
어린 수컷 기니아 피그 (Dunkin-Hartley HsdPoc:HD, 250-300 g)에 있어서, HRP에 콘쥬게이션된 CRM197 또는 홀로-트랜스페린 (TrF) (2:1의 중량/중량 비)의 뇌 섭취를, 이 콘쥬게이트 (미-콘쥬게이션된 HRP의 0.5 ml 염수 중 500 마이크로그램/ml의 농도에 상응함)를 경내 볼루스 주사한지 1.5시간 후에 측정하고 동일한 농도의 자유 HRP와 비교하였다. 제조자의 지시에 따라 HRP 콘쥬게이션 키트 (Alpha Diagnostic International, 미국 텍사스주 샌 안토니오 소재)로 단백질을 HRP에 콘쥬세이션시켰다. 또한 콘쥬세이션된 단백질을 Sephacryl S-200 HR 매트릭스가 패킹된 HiPrep 16/60 컬럼 (Amersham Biosciences,영국 소재) 상에서 추가로 정제하였다. 간단히 말하면, 동물을 공기/산소 혼합물 (2:1)에서 이소플루란 흡입 (4% 유도, 1-1.5% 유지)으로 마취시켰다. 캐뉼라를 혈액 샘플 수집 및 약물 투여를 위하여 경동맥 내에 두었다. 단백질을 주사한지 1.5시간 후 동물을 4% 이소플루란으로 깊이 마취시키고 (1-2분) 그 후 전 동물 (뇌 포함)에 심장 대동맥을 통하여 염수를 관류시켜 (<5분) 혈관에서 혈액을 제거하였다. 그 직후 동물을 참수하고 추가의 분석을 위하여 뇌를 두개골로부터 옮겼다. (뇌의 시각적 조사에 기초하여) 모든 혈액이 제거된 뇌만을 추가의 분석에 사용하였다.
관류된 뇌 (및 하나의 비-관류된 대조 뇌)의 피질을 해부하고 중량을 재었다. 그 직후 피질 단편을 균질화하고 1/2 부피의 이 균질화물을 120 마이크로미터의 나일론 메쉬를 통하여 여과하였다. 완전한 균질화물 외에도 여과액 (도관 구조 포함) 및 용출액 (뇌 실질 (parenchymal) 세포 포함)을 사용하여 3가지의 뇌 피질 샘플 (즉, 완전한 균질화물 (도 18에서 "균질화물"로 나타냄), 뇌 실질 (도 18에서 "실질"로 나타냄) 및 대뇌혈관계 (도 18에서 "미세 혈관"으로 나타냄)) 내로 트랜스사이토시스되는 HRP의 HRP 활성을 분석하였다. 조직/세포를 0.1% Na-데옥시콜레 이트 (최종 농도)의 수용액으로 용해시킨 후 적절한 교정 곡선 및 상청액의 단백질 함량과 희석에 대한 보정을 이용하여 표준 비색 분석법을 사용하여 스펀-다운 (spun-down) 균질화물의 투명한 상청액에서 HRP 활성을 탐지하였다.
관류 뇌 (및 하나의 비-관류 대조 뇌 (즉, HRP 또는 HRP-콘쥬게이트를 주사하지 않음))의 약 0.5 cm의 중앙 단면 (귀에서 귀)을 해부하고 이소펜탄에 직접 즉석 냉동시키고 섭씨 -80도에서 사용할때까지 보관하였다. 조직 부분을 냉각기 상에서 14 마이크로미터의 동결 부분으로 절단하였다. 일부 부분을 공기 고정시키고 HRP (또는 비-관류 대조 뇌의 경우 내인성 퍼옥시다제) 활성을 TMB (퍼옥시다제 기질 키트의 TMB, Vector Laboratories)로 30분 동안 직접 염색하고, 적은 물로 5분 동안 세척하고 일련의 에탄올 및 자일렌 (90% 에탄올 2x 1분; 100% 에탄올 2x 1분; 자일렌 2x 1분)으로 탈수시키고 마지막으로 Entellan (Merck)에 묻히게 하였다. 다른 부분을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 (15분) 뇌에서의 CRM197의 분포를 1:10의 생쥐-항-디프테리아 독소 (OBT0746, ImmunologicalsDirect. com), 및 1:250의 이차 HRP-염소-항-생쥐 항체 (Jackson Immunoresearch)에 의한 디프테리아 독소에 대한 면역 조직 화학에 의해 염색하였다. 상기 일차 항체는 순수 단백질 샘플 및 CRM197-HRP 콘쥬게이션 균질화물 샘플 둘 모두에서 도트-블롯 파일롯 실험에 있어서 CRM197과, CRM197-HRP 콘쥬게이트를 선택적으로 염색시킬 수 있었다 (데이타는 예시하지 않음). 내인성 퍼옥시다제를 차단하고 (0.3% H202 및 0.1 % NaN3을 포함하는 PBS에서 20분) 비특이적 염색을 5%의 보통의 염소 혈청으로 방지하였다. 이차 항체의 HRP 활성은 TMB (퍼옥시다제 기질 키트의 TMB, Vector Laboratories)로 10분 동안 염색하고 적은 물로 5분 동안 세척하고 일련의 에탄올 및 자일렌 (90% 에탄올 2x 1분; 100% 에탄올 2x 1분; 자일렌 2x 1분)으로 탈수시키고 마지막으로 Entellan (Merck)에 묻히게 하였다. 대조 염색은 수행하지 않았다.
CRM197-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물에 있어서, 기니아 피그에 HRP-콘쥬게이션된 CRM197 및 TrF (둘 모두 500 마이크로그램/ml 농도의 미처리 HRP에 상응함)와, 동일 농도의 자유 HRP를 주사한지 1.5시간 후, 모든 3가지의 뇌 피질 균질화물 샘플 (즉, 완전한 균질화물 (도 18에서 "균질화물"로 나타냄), 뇌 실질 (도 18에서 "실질"로 나타냄) 및 대뇌혈관계 (도 18에서 "미세 혈관"으로 나타냄))에서 HRP 활성만이 관찰되었다 (도 18). 뇌에 혈액이 절대적으로 없다는 것에 기초하여 (이는 하기되어 있는 동결-부분에서도 확인함) 세 동물로부터의 데이타를 이 분석에 있어서 포함시켰다. TrF-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물과, 자유 HRP를 주사한 동물로부터 유래되는 모든 샘플에서의 HRP 활성 수준은 검출 한계치 미만이었다 (두 군 모두의 경우 n=2, 뇌에 혈액에 절대적으로 없다는 것에 기초한 선별 후 (이는 하기되어 있는 동결-부분에서도 확인함)). 이러한 결과는 40 kDa의 적하물 (즉, HRP)에 콘쥬게이션된 CRM197이 TrF에 콘쥬게이션된 HRP 및 자유 HRP가 없는 뇌 피질에서 특이적으로 흡수됨을 나타낸다. 불행하게도, 주사된 HRP-콘쥬게이트 및 자유 HRP의 혈장에서의 동력학적 특성은 대조 (즉, 0.5 마이크로리터의 염수)를 주사한 동물에서 시간이 지남에 따라 또한 변화되는 혈액에 존재하는 높은 수준의 내인성 퍼옥시다제로 인하여 (아마도 모든 동물에서 관찰되는 주사된 염수 부피로 인한 온 화한 일시적인 용혈로 인하여) HRP에 대한 표준 비색 분석법에 기초해서는 결정할 수 없다. 결과적으로 CRM197-HRP 콘쥬게이트에 있어서 뇌 피질 분포 부피는 계산할 수 없다.
비-관류 대조 뇌의 동결-부분을 TMB로 내인성 퍼옥시다제 활성에 대하여 직접 염색한 후 혈관에 특징적인 독특하며 강력한 염색 패턴이 전 부분 전반에 걸쳐 관찰되었다. 이러한 패턴의 전형적인 예가 도 19의 패널 A에 도시되어 있다. 도 19의 패널 B에서 알 수 있듯이, 심장 대동맥을 통한 염수를 이용한 관류 절차에 의해 상기 내인성 퍼옥시다제 활성을 완전히 제거할 수 있다. 이러한 결과는 혈장 샘플에서의 HRP에 대한 표준 비색 분석법으로 손쉽게 관찰되듯이, 실로 간섭성의 내인성 퍼옥시다제가 혈액 중에 존재한다는 것을 나타낸다. 자유 HRP를 주사한 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB 염색된 동결-부분은 잘 관류된 대조 뇌와 마찬가지로 가시성 염색을 전혀 보이지 않았다 (도 19의 패널 C 및 D는 두 상이한 동물의 대표적인 사진을 예시함). 그러나 CRM197-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB-염색된 동결-부분은 작은 혈관과 결부된 것에 특징적인 염색 패턴을 보였다 (도 19의 패널 E 및 F는 대표적인 사진을 예시함 (E 및 F는 동일 동물로부터의 것임)). 또한 혈관을 가로질러 삼출된 (즉, 수송된) HRP에 특징적인 전 부분에 걸친 여러 독특한 염색 영역이 상기 동물에서 관찰되었다 (도 19의 패널 F, G 및 H는 세 상이한 동물의 대표적인 사진을 예시함). 이와는 대조적으로, TrF-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물의 잘 관류된 뇌의 TMB-염색된 동결-부분은 작은 혈관과 결부된 것에 특징적인 약간의 (존재할 경우) 매우 희미한 염색 패턴을 보였다 (도 19의 패널 I 및 J와, K 및 L은 두 상이한 동물의 두 대표적인 사진을 예시함). 총체적으로는, 이러한 결과는 뇌 피질 균질화물로부터 수득되는 데이타와 일치하며 40 kDa의 적하물 (즉, HRP)에 콘쥬게이션된 CRM197이 자유 HRP 및 TrF에 콘쥬게이션된 HRP가 존재하지 않는 뇌 피질에서 특이적으로 흡수된다는 것을 한번 더 나타낸다.
뇌에서의 CRM197 분포를 생쥐-항-디프테리아 독소에 의한 디프테리아 독소에 대한 면역 조직 화학에 의해 염색한 동결-부분은 전 부분 전반에 걸쳐 균질하게 분포된 희미한 패턴을 보였다 (도 20의 패널 A 및 D는 동일한 동물로부터의 두 배율의 대표적인 사진을 예시함). 이러한 염색 패턴은 자유 HRP 및 TrF-HRP 콘쥬게이트를 주사한 동물에서는 관찰되지 않았다 (도 20의 패널 B 및 E와 C 및 F는 각각 동일한 동물로부터의 두 배율의 대표적인 사진을 예시함). 총체적으로는, 이러한 결과는 (절단되거나 HRP에 여전히 콘쥬게이션된) CRM197이 뇌에서 흡수된다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 포함된 바와 같이 DTR을 고려하여 모든 예시적 방법을 고려하고 이를 이용가능한 종래 기술과 조합할 경우, 하기의 뇌-혈관 장벽 내로의, 그리고 이를 가로지르는 약물의 전달 작용 기전이 제안된다: 디프테리아 독소 수용체에의 약물- 또는 리포좀-콘쥬게이션된 담체 단백질 (예를 들어 CRM197)의 B 도메인의 특이적 결합에 이어 담체 단백질/약물 복합체는 엔도사이토시스된다. 담체 단백질에서의 배좌에 있어서의 pH 변경에 의해 유도되는 변화로 인하여 담체 단백질/약물 복합체의 T 도메인이 엔도좀의 막 내로 삽입되고, 이어서 그 후 (약물 복합체를 포함하는) A 도메인이 사이토졸 내로 이동된다. 그 후 약물 및 담체 단백질 (절단되 거나 여전히 콘쥬게이션됨)은 뇌-혈관 장벽을 가로질러 수송된다. 엔도좀의 일부가 리소좀으로 될 가능성이 있기 때문에 이러한 작용 기전은 리소좀으로 치료제를 전달하는 수단으로 또한 유용하다. 이러한 경우에 있어서 효소 (예를 들어 리소좀 저장 질환에 걸린 환자에 있어서 결핍되어 있는 효소)를 포함하는 콘쥬게이트가 특히 흥미롭다.
Figure 112009008266218-pct00035
Figure 112005044121898-pct00036
Figure 112005044121898-pct00037
Figure 112005044121898-pct00038
Figure 112005044121898-pct00039
Figure 112005044121898-pct00040
Figure 112005044121898-pct00041
Figure 112005044121898-pct00042
Figure 112005044121898-pct00043
Figure 112005044121898-pct00044
Figure 112005044121898-pct00045
Figure 112005044121898-pct00046
Figure 112005044121898-pct00047
Figure 112005044121898-pct00048
Figure 112005044121898-pct00049
Figure 112005044121898-pct00050
Figure 112005044121898-pct00051
Figure 112005044121898-pct00052
Figure 112005044121898-pct00053
Figure 112005044121898-pct00054
Figure 112005044121898-pct00055
Figure 112005044121898-pct00056
Figure 112005044121898-pct00057
Figure 112005044121898-pct00058
Figure 112005044121898-pct00059
Figure 112005044121898-pct00060
Figure 112005044121898-pct00061
Figure 112005044121898-pct00062
Figure 112005044121898-pct00063
Figure 112005044121898-pct00064
Figure 112005044121898-pct00065
Figure 112005044121898-pct00066
Figure 112005044121898-pct00067
Figure 112005044121898-pct00068
Figure 112005044121898-pct00069
Figure 112005044121898-pct00070
Figure 112005044121898-pct00071
Figure 112005044121898-pct00072
Figure 112005044121898-pct00073
Figure 112005044121898-pct00074
Figure 112005044121898-pct00075
Figure 112005044121898-pct00076
Figure 112005044121898-pct00077
Figure 112005044121898-pct00078
Figure 112005044121898-pct00079
Figure 112005044121898-pct00080
Figure 112005044121898-pct00081
Figure 112005044121898-pct00082
Figure 112005044121898-pct00083
Figure 112005044121898-pct00084
Figure 112005044121898-pct00085
Figure 112005044121898-pct00086
Figure 112005044121898-pct00087
Figure 112005044121898-pct00088
Figure 112005044121898-pct00089
[표 1]
"리포폴리사카리드-민감성 (LPSS)" 유전자, 그들의 서열 번호, LPS 효과 (↑(up), ↓(down), 차별 발현 (dif+ 또는 dif-)), 그들의 기탁 번호 (RefSeq), 유전자 표기 및 명칭 (또는 유전자 이름).
Figure 112005044121898-pct00090
[표 2]
LPSS 유전자의 LPS 반응 (평균 일반적으로 스케일화된 강도 수치 +/- 표준편차)
Figure 112005044121898-pct00091
Figure 112005044121898-pct00092
Figure 112005044121898-pct00093
Figure 112005044121898-pct00094
Figure 112005044121898-pct00095
Figure 112005044121898-pct00096
Figure 112005044121898-pct00097
Figure 112005044121898-pct00098
Figure 112005044121898-pct00099
Figure 112005044121898-pct00100
Figure 112005044121898-pct00101
Figure 112005044121898-pct00102
Figure 112005044121898-pct00103
Figure 112005044121898-pct00104
Figure 112005044121898-pct00105
Figure 112005044121898-pct00106
Figure 112005044121898-pct00107
Figure 112005044121898-pct00108
Figure 112005044121898-pct00109
SEQUENCE LISTING <110> Rijksuniversiteit Leiden <120> Differentially expressed nucleic acids in the blood-brain barrier <130> P206561PCT <140> P206561PCT <141> 2004-02-10 <150> EP 03075390.9 <151> 2003-02-10 <150> US 60/446,270 <151> 2003-02-11 <150> US 60/491,522 <151> 2003-08-01 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Pro Ala Ala Glu Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys 20 25 30 Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys 35 40 45 Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr 50 55 60 Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile 65 70 75 80 Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe 85 90 95 Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu 100 105 110 Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly 115 120 125 Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu 130 135 140 Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr 145 150 155 160 Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu 165 170 175 Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp 180 185 190 Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala 195 200 205 Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu 210 215 220 Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr 225 230 235 240 Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp 245 250 255 His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val 260 265 270 Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu 275 280 285 Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr 290 295 300 Gln Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr 305 310 315 320 Val Leu Lys Val Leu Glu Ile Leu Gly Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu 325 330 335 Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln 340 345 350 Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu Gln Glu Ile Val Glu Gly Met 355 360 365 Lys Gln Lys Met Trp Ser Ile Glu Asn Ile Ala Phe Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Gly Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys 385 390 395 400 Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp 405 410 415 Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu 420 425 430 His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly 435 440 445 Asp Leu Glu Glu Tyr Gly Gln Asp Leu Leu His Thr Val Phe Lys Asn 450 455 460 Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala 465 470 475 480 Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His 485 490 <210> 2 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405 <210> 3 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405 <210> 4 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405 <210> 5 <211> 948 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Ile Lys Thr Leu Asn Leu Val Leu Gly Leu Lys Arg Ala Leu 1 5 10 15 Glu Phe Pro Glu Val Phe Met Met Glu Val Lys Asp Pro Asn Met Lys 20 25 30 Gly Ala Met Leu Thr Asn Thr Gly Lys Tyr Ala Ile Pro Thr Ile Asp 35 40 45 Ala Glu Ala Tyr Ala Ile Gly Lys Lys Glu Lys Pro Pro Phe Leu Pro 50 55 60 Glu Glu Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Pro Ile Pro Asp Glu 65 70 75 80 Leu Leu Cys Leu Ile Cys Lys Asp Ile Met Thr Asp Ala Val Val Ile 85 90 95 Pro Cys Cys Gly Asn Ser Tyr Cys Asp Glu Cys Ile Arg Thr Ala Leu 100 105 110 Leu Glu Ser Asp Glu His Thr Cys Pro Thr Cys His Gln Asn Asp Val 115 120 125 Ser Pro Asp Ala Leu Ile Ala Asn Lys Phe Leu Arg Gln Ala Val Asn 130 135 140 Asn Phe Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Thr Lys Arg Leu Arg Lys Gln Leu 145 150 155 160 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Pro Leu Ile Gln Arg 165 170 175 Asn Leu Gln Pro Leu Met Arg Ser Pro Ile Ser Arg Gln Gln Asp Pro 180 185 190 Leu Met Ile Pro Val Thr Ser Ser Ser Thr His Pro Ala Pro Ser Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Thr Ser Asn Gln Ser Ser Leu Ala Pro Pro Val Ser Gly 210 215 220 Asn Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro Val Pro Asp Ile Thr Ala Thr Val 225 230 235 240 Ser Ile Ser Val His Ser Glu Lys Ser Asp Gly Pro Phe Arg Asp Ser 245 250 255 Asp Asn Lys Ile Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ser Glu His Ser Lys 260 265 270 Gly Thr Ser Ser Ile Ala Ile Thr Ala Leu Met Glu Glu Lys Gly Tyr 275 280 285 Gln Val Pro Val Leu Gly Thr Pro Ser Leu Leu Gly Gln Ser Leu Leu 290 295 300 His Gly Gln Leu Ile Pro Thr Thr Gly Pro Val Arg Ile Asn Thr Ala 305 310 315 320 Arg Pro Gly Gly Gly Arg Pro Gly Trp Glu His Ser Asn Lys Leu Gly 325 330 335 Tyr Leu Val Ser Pro Pro Gln Gln Ile Arg Arg Gly Glu Arg Ser Cys 340 345 350 Tyr Arg Ser Ile Asn Arg Gly Arg His His Ser Glu Arg Ser Gln Arg 355 360 365 Thr Gln Gly Pro Ser Leu Pro Ala Thr Pro Val Phe Val Pro Val Pro 370 375 380 Pro Pro Pro Leu Tyr Pro Pro Pro Pro His Thr Leu Pro Leu Pro Pro 385 390 395 400 Gly Val Pro Pro Pro Gln Phe Ser Pro Gln Phe Pro Pro Gly Gln Pro 405 410 415 Pro Pro Ala Gly Tyr Ser Val Pro Pro Pro Gly Phe Pro Pro Ala Pro 420 425 430 Ala Asn Leu Ser Thr Pro Trp Val Ser Ser Gly Val Gln Thr Ala His 435 440 445 Ser Asn Thr Ile Pro Thr Thr Gln Ala Pro Pro Leu Ser Arg Glu Glu 450 455 460 Phe Tyr Arg Glu Gln Arg Arg Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Ser 465 470 475 480 Lys Leu Asp Glu Phe Thr Asn Asp Phe Ala Lys Glu Leu Met Glu Tyr 485 490 495 Lys Lys Ile Gln Lys Glu Arg Arg Arg Ser Phe Ser Arg Ser Lys Ser 500 505 510 Pro Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Ser Arg Ser Ser Tyr Thr Tyr Ser Lys 515 520 525 Ser Arg Ser Gly Ser Thr Arg Ser Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Phe Ser 530 535 540 Arg Ser His Ser Arg Ser Tyr Ser Arg Ser Pro Pro Tyr Pro Arg Arg 545 550 555 560 Gly Arg Gly Lys Ser Arg Asn Tyr Arg Ser Arg Ser Arg Ser His Gly 565 570 575 Tyr His Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Pro Tyr Arg Arg Tyr His Ser 580 585 590 Arg Ser Arg Ser Pro Gln Ala Phe Arg Gly Gln Ser Pro Asn Lys Arg 595 600 605 Asn Val Pro Gln Gly Glu Thr Glu Arg Glu Tyr Phe Asn Arg Tyr Arg 610 615 620 Glu Val Pro Pro Pro Tyr Asp Met Lys Ala Tyr Tyr Gly Arg Ser Val 625 630 635 640 Asp Phe Arg Asp Pro Phe Glu Lys Glu Arg Tyr Arg Glu Trp Glu Arg 645 650 655 Lys Tyr Arg Glu Trp Tyr Glu Lys Tyr Tyr Lys Gly Tyr Ala Ala Gly 660 665 670 Ala Gln Pro Arg Pro Ser Ala Asn Arg Glu Asn Phe Ser Pro Glu Arg 675 680 685 Phe Leu Pro Leu Asn Ile Arg Asn Ser Pro Phe Thr Arg Gly Arg Arg 690 695 700 Glu Asp Tyr Val Gly Gly Gln Ser His Arg Ser Arg Asn Ile Gly Ser 705 710 715 720 Asn Tyr Pro Glu Lys Leu Ser Ala Arg Asp Gly His Asn Gln Lys Asp 725 730 735 Asn Thr Lys Ser Lys Glu Lys Glu Ser Glu Asn Ala Pro Gly Asp Gly 740 745 750 Lys Gly Asn Lys His Lys Lys His Arg Lys Arg Arg Lys Gly Glu Glu 755 760 765 Ser Glu Gly Phe Leu Asn Pro Glu Leu Leu Glu Thr Ser Arg Lys Ser 770 775 780 Arg Glu Pro Thr Gly Val Glu Glu Asn Lys Thr Asp Ser Leu Phe Val 785 790 795 800 Leu Pro Ser Arg Asp Asp Ala Thr Pro Val Arg Asp Glu Pro Met Asp 805 810 815 Ala Glu Ser Ile Thr Phe Lys Ser Val Ser Glu Lys Asp Lys Arg Glu 820 825 830 Arg Asp Lys Pro Lys Ala Lys Gly Asp Lys Thr Lys Arg Lys Asn Asp 835 840 845 Gly Ser Ala Val Ser Lys Lys Glu Asn Ile Val Lys Pro Ala Lys Gly 850 855 860 Pro Gln Glu Lys Val Asp Gly Asp Val Arg Asp Leu Leu Asp Leu Asn 865 870 875 880 Leu Gln Leu Lys Lys Pro Lys Arg Arg Leu Arg Arg Leu Thr Ile Leu 885 890 895 Asn His His Leu Pro Leu Arg Arg Met Lys Lys Ser Leu Glu Pro Pro 900 905 910 Glu Lys Leu Thr Leu Asn Gln Gln Lys Thr Pro Arg Asn Lys Thr Ser 915 920 925 Gln Arg Gly Lys Ser Glu Glu Gly Leu Phe Gln Arg Cys Gln Ile Arg 930 935 940 Lys Ala Asn Asn 945 <210> 6 <211> 556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Pro Gln Ser Asn Asn Lys 325 330 335 Asn Ser Leu Val Ser Pro Ala Gln Glu Pro Ala Pro Leu Gln Thr Ala 340 345 350 Met Glu Pro Gln Thr Thr Val Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys 355 360 365 Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys 370 375 380 Ala Ala Pro Leu Arg Thr Gly Asn Gly Ser Ser Val Pro Glu Gly Arg 385 390 395 400 Ser Ser Arg Asp Arg Thr Ala Pro Ser Ala Gly Met Gln Pro Gln Pro 405 410 415 Ser Leu Cys Ser Ser Ala Met Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys Ile Thr 420 425 430 Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Thr 435 440 445 Lys Ile Cys Asp Pro Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly 450 455 460 Asn Leu Val Glu Gly Met Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe Glu Asn Leu 465 470 475 480 Leu Ser Lys Asn Ser Lys Pro Ile His Thr Thr Ile Leu Asn Pro His 485 490 495 Val His Val Ile Gly Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Leu 500 505 510 Thr Gln Tyr Ile Asp Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser Gln Ser Glu 515 520 525 Glu Thr Arg Val Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu Asn Val His 530 535 540 Tyr His Cys Ser Gly Ala Pro Ala Ala Pro Leu Gln 545 550 555 <210> 7 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Val Gly Arg Gln Ser 305 310 315 320 Ser Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ala Gly Gln 325 330 335 Ala Ala Lys Ser Leu Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Lys 340 345 350 Arg Lys Ser Ser Ser Ser Val His Leu Met Glu Pro Gln Thr Thr Val 355 360 365 Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn 370 375 380 Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile 385 390 395 400 Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu 405 410 415 Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp Pro Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu 420 425 430 Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Met Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe 435 440 445 Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn Ser Lys Pro Ile His Thr Thr Ile Leu 450 455 460 Asn Pro His Val His Val Ile Gly Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr 465 470 475 480 Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser 485 490 495 Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu 500 505 510 Asn Val His Tyr His Cys Ser Gly Ala Pro Ala Ala Pro Leu Gln 515 520 525 <210> 8 <211> 518 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Pro Gln Ser Asn Asn Lys 325 330 335 Asn Ser Leu Val Ser Pro Ala Gln Glu Pro Ala Pro Leu Gln Thr Ala 340 345 350 Met Glu Pro Gln Thr Thr Val Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys 355 360 365 Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys 370 375 380 Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala 385 390 395 400 Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp Pro Gly 405 410 415 Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Met 420 425 430 Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn Ser Lys 435 440 445 Pro Ile His Thr Thr Ile Leu Asn Pro His Val His Val Ile Gly Glu 450 455 460 Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp Gly 465 470 475 480 Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His 485 490 495 Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu Asn Val His Tyr His Cys Ser Gly Ala 500 505 510 Pro Ala Ala Pro Leu Gln 515 <210> 9 <211> 495 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Glu Pro Gln Thr Thr Val 325 330 335 Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn 340 345 350 Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile 355 360 365 Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu 370 375 380 Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp Pro Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu 385 390 395 400 Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Met Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe 405 410 415 Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn Ser Lys Pro Ile His Thr Thr Ile Leu 420 425 430 Asn Pro His Val His Val Ile Gly Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr 435 440 445 Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser 450 455 460 Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu 465 470 475 480 Asn Val His Tyr His Cys Ser Gly Ala Pro Ala Ala Pro Leu Gln 485 490 495 <210> 10 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Pro Gln Ser Asn Asn Lys 325 330 335 Asn Ser Leu Glu Pro Gln Thr Thr Val Val His Asn Ala Thr Asp Gly 340 345 350 Ile Lys Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp 355 360 365 Leu Lys Ala Arg Cys Leu Lys Asp Gly Ala Pro Gly Thr Glu Gln Pro 370 375 380 Pro Leu Gln Ala Cys Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Pro Gln Pro Cys 385 390 395 400 Glu Asn Arg Arg Ser Leu Arg Leu Gln Asn Ser 405 410 <210> 11 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Arg Phe Thr Asp Asp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val 20 25 30 Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys 35 40 45 Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly 85 90 95 Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser His Cys Ile His Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn His Ile His 115 120 125 Gln His Asp Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 145 150 155 160 Ala Ile Glu Val Gln Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly 165 170 175 Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly 180 185 190 Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu 195 200 205 Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Lys Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn 245 250 255 Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val 260 265 270 Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val 275 280 285 Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile 290 295 300 Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu 305 310 315 320 Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Pro Gln Ser Asn Asn Lys 325 330 335 Asn Ser Leu Glu Pro Gln Thr Thr Val Val His Asn Ala Thr Asp Gly 340 345 350 Ile Lys Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp 355 360 365 Leu Lys Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile 370 375 380 Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp 385 390 395 400 Pro Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu 405 410 415 Gly Met Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn 420 425 430 Ser Lys Pro Ile His Thr Thr Ile Leu Asn Pro His Val His Val Ile 435 440 445 Gly Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile 450 455 460 Asp Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val 465 470 475 480 Trp His Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu Asn Val His Tyr His Cys Ser 485 490 495 Gly Ala Pro Ala Ala Pro Leu Gln 500 <210> 12 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Ala Pro Arg Gly Asp Val Thr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Ala Gly Ala Ser Pro Ala Lys Ala Asn Gly Gln Glu Asn Gly 20 25 30 His Val Lys Ser Asn Gly Asp Leu Ser Pro Lys Gly Glu Gly Glu Ser 35 40 45 Pro Pro Val Asn Gly Thr Asp Glu Ala Ala Gly Ala Thr Gly Asp Ala 50 55 60 Ile Glu Pro Ala Pro Pro Ser Gln Gly Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val 65 70 75 80 Pro Pro Lys Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys 85 90 95 Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys Glu Gly 100 105 110 Gly Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Gln Glu Gln 115 120 125 Gly Glu Ile Gly Ala Cys Ser Asp Glu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Lys 130 135 140 Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ser Gln Glu Pro Gln Ala Lys Gly Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ala Gly Pro Gln Ala Thr Glu Pro 165 170 175 Ser Thr Pro Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ser Ala Glu 180 185 190 Gln Asn Glu 195 <210> 13 <211> 1821 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Arg Pro Arg Thr Lys Ala Arg Ser Pro Gly Arg Ala Leu Arg Asn 1 5 10 15 Pro Trp Arg Gly Phe Leu Pro Leu Thr Leu Ala Leu Phe Val Gly Ala 20 25 30 Gly His Ala Gln Arg Asp Pro Val Gly Arg Tyr Glu Pro Ala Gly Gly 35 40 45 Asp Ala Asn Arg Leu Arg Arg Pro Gly Gly Ser Tyr Pro Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Lys Val Tyr Ser Leu Phe Arg Glu Gln Asp Ala Pro Val Ala 65 70 75 80 Gly Leu Gln Pro Val Glu Arg Ala Gln Pro Gly Trp Gly Ser Pro Arg 85 90 95 Arg Pro Thr Glu Ala Glu Ala Arg Arg Pro Ser Arg Ala Gln Gln Ser 100 105 110 Arg Arg Val Gln Pro Pro Ala Gln Thr Arg Arg Ser Thr Pro Leu Gly 115 120 125 Gln Gln Gln Pro Ala Pro Arg Thr Arg Ala Ala Pro Ala Leu Pro Arg 130 135 140 Leu Gly Thr Pro Gln Arg Ser Gly Ala Ala Pro Pro Thr Pro Pro Arg 145 150 155 160 Gly Arg Leu Thr Gly Arg Asn Val Cys Gly Gly Gln Cys Cys Pro Gly 165 170 175 Trp Thr Thr Ala Asn Ser Thr Asn His Cys Ile Lys Pro Val Cys Glu 180 185 190 Pro Pro Cys Gln Asn Arg Gly Ser Cys Ser Arg Pro Gln Leu Cys Val 195 200 205 Cys Arg Ser Gly Phe Arg Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Ile Pro Asp 210 215 220 Glu Glu Phe Asp Pro Gln Asn Ser Arg Leu Ala Pro Arg Arg Trp Ala 225 230 235 240 Glu Arg Ser Pro Asn Leu Arg Arg Ser Ser Ala Ala Gly Glu Gly Thr 245 250 255 Leu Ala Arg Ala Gln Pro Pro Ala Pro Gln Ser Pro Pro Ala Pro Gln 260 265 270 Ser Pro Pro Ala Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gln Thr His Pro Ser 275 280 285 Gln Gln His Val Gly Leu Ser Arg Thr Val Arg Leu His Pro Thr Ala 290 295 300 Thr Ala Ser Ser Gln Leu Ser Ser Asn Ala Leu Pro Pro Gly Pro Gly 305 310 315 320 Leu Glu Gln Arg Asp Gly Thr Gln Gln Ala Val Pro Leu Glu His Pro 325 330 335 Ser Ser Pro Trp Gly Leu Asn Leu Thr Glu Lys Ile Lys Lys Ile Lys 340 345 350 Ile Val Phe Thr Pro Thr Ile Cys Lys Gln Thr Cys Ala Arg Gly His 355 360 365 Cys Ala Asn Ser Cys Glu Arg Gly Asp Thr Thr Thr Leu Tyr Ser Gln 370 375 380 Gly Gly His Gly His Asp Pro Lys Ser Gly Phe Arg Ile Tyr Phe Cys 385 390 395 400 Gln Ile Pro Cys Leu Asn Gly Gly Arg Cys Ile Gly Arg Asp Glu Cys 405 410 415 Trp Cys Pro Ala Asn Ser Thr Gly Lys Phe Cys His Leu Pro Ile Pro 420 425 430 Gln Pro Asp Arg Glu Pro Pro Gly Arg Gly Ser Arg Pro Arg Ala Leu 435 440 445 Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ser Thr Phe Thr Leu Pro Leu Ser Asn 450 455 460 Gln Leu Ala Ser Val Asn Pro Ser Leu Val Lys Val His Ile His His 465 470 475 480 Pro Pro Glu Ala Ser Val Gln Ile His Gln Val Ala Gln Val Arg Gly 485 490 495 Gly Val Glu Glu Ala Leu Val Glu Asn Ser Val Glu Thr Arg Pro Pro 500 505 510 Pro Trp Leu Pro Ala Ser Pro Gly His Ser Leu Trp Asp Ser Asn Asn 515 520 525 Ile Pro Ala Arg Ser Gly Glu Pro Pro Arg Pro Leu Pro Pro Ala Ala 530 535 540 Pro Arg Pro Arg Gly Leu Leu Gly Arg Cys Tyr Leu Asn Thr Val Asn 545 550 555 560 Gly Gln Cys Ala Asn Pro Leu Leu Glu Leu Thr Thr Gln Glu Asp Cys 565 570 575 Cys Gly Ser Val Gly Ala Phe Trp Gly Val Thr Leu Cys Ala Pro Cys 580 585 590 Pro Pro Arg Pro Ala Ser Pro Val Ile Glu Asn Gly Gln Leu Glu Cys 595 600 605 Pro Gln Gly Tyr Lys Arg Leu Asn Leu Thr His Cys Gln Asp Ile Asn 610 615 620 Glu Cys Leu Thr Leu Gly Leu Cys Lys Asp Ala Glu Cys Val Asn Thr 625 630 635 640 Arg Gly Ser Tyr Leu Cys Thr Cys Arg Pro Gly Leu Met Leu Asp Pro 645 650 655 Ser Arg Ser Arg Cys Val Ser Asp Lys Ala Ile Ser Met Leu Gln Gly 660 665 670 Leu Cys Tyr Arg Ser Leu Gly Pro Gly Thr Cys Thr Leu Pro Leu Ala 675 680 685 Gln Arg Ile Thr Lys Gln Ile Cys Cys Cys Ser Arg Val Gly Lys Ala 690 695 700 Trp Gly Ser Glu Cys Glu Lys Cys Pro Leu Pro Gly Thr Glu Ala Phe 705 710 715 720 Arg Glu Ile Cys Pro Ala Gly His Gly Tyr Thr Tyr Ala Ser Ser Asp 725 730 735 Ile Arg Leu Ser Met Arg Lys Ala Glu Glu Glu Glu Leu Ala Arg Pro 740 745 750 Pro Arg Glu Gln Gly Gln Arg Ser Ser Gly Ala Leu Pro Gly Pro Ala 755 760 765 Glu Arg Gln Pro Leu Arg Val Val Thr Asp Thr Trp Leu Glu Ala Gly 770 775 780 Thr Ile Pro Asp Lys Gly Asp Ser Gln Ala Gly Gln Val Thr Thr Ser 785 790 795 800 Val Thr His Ala Pro Ala Trp Val Thr Gly Asn Ala Thr Thr Pro Pro 805 810 815 Met Pro Glu Gln Gly Ile Ala Glu Ile Gln Glu Glu Gln Val Thr Pro 820 825 830 Ser Thr Asp Val Leu Val Thr Leu Ser Thr Pro Gly Ile Asp Arg Cys 835 840 845 Ala Ala Gly Ala Thr Asn Val Cys Gly Pro Gly Thr Cys Val Asn Leu 850 855 860 Pro Asp Gly Tyr Arg Cys Val Cys Ser Pro Gly Tyr Gln Leu His Pro 865 870 875 880 Ser Gln Ala Tyr Cys Thr Asp Asp Asn Glu Cys Leu Arg Asp Pro Cys 885 890 895 Lys Gly Lys Gly Arg Cys Ile Asn Arg Val Gly Ser Tyr Ser Cys Phe 900 905 910 Cys Tyr Pro Gly Tyr Thr Leu Ala Thr Ser Gly Ala Thr Gln Glu Cys 915 920 925 Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu Gln Pro Gly Val Cys Ser Gly Gly Gln 930 935 940 Cys Thr Asn Thr Glu Gly Ser Tyr His Cys Glu Cys Asp Gln Gly Tyr 945 950 955 960 Ile Met Val Arg Lys Gly His Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Arg His 965 970 975 Pro Gly Thr Cys Pro Asp Gly Arg Cys Val Asn Ser Pro Gly Ser Tyr 980 985 990 Thr Cys Leu Ala Cys Glu Glu Gly Tyr Arg Gly Gln Ser Gly Ser Cys 995 1000 1005 Val Asp Val Asn Glu Cys Leu Thr Pro Gly Val Cys Ala His Gly 1010 1015 1020 Lys Cys Thr Asn Leu Glu Gly Ser Phe Arg Cys Ser Cys Glu Gln 1025 1030 1035 Gly Tyr Glu Val Thr Ser Asp Glu Lys Gly Cys Gln Asp Val Asp 1040 1045 1050 Glu Cys Ala Ser Arg Ala Ser Cys Pro Thr Gly Leu Cys Leu Asn 1055 1060 1065 Thr Glu Gly Ser Phe Ala Cys Ser Ala Cys Glu Asn Gly Tyr Trp 1070 1075 1080 Val Asn Glu Asp Gly Thr Ala Cys Glu Asp Leu Asp Glu Cys Ala 1085 1090 1095 Phe Pro Gly Val Cys Pro Ser Gly Val Cys Thr Asn Thr Ala Gly 1100 1105 1110 Ser Phe Ser Cys Lys Asp Cys Asp Gly Gly Tyr Arg Pro Ser Pro 1115 1120 1125 Leu Gly Asp Ser Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Glu Asp Pro Gln 1130 1135 1140 Ser Ser Cys Leu Gly Gly Glu Cys Lys Asn Thr Val Gly Ser Tyr 1145 1150 1155 Gln Cys Leu Cys Pro Gln Gly Phe Gln Leu Ala Asn Gly Thr Val 1160 1165 1170 Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Met Gly Glu Glu His Cys Ala Pro 1175 1180 1185 His Gly Glu Cys Leu Asn Ser His Gly Ser Phe Phe Cys Leu Cys 1190 1195 1200 Ala Pro Gly Phe Val Ser Ala Glu Gly Gly Thr Ser Cys Gln Asp 1205 1210 1215 Val Asp Glu Cys Ala Thr Thr Asp Pro Cys Val Gly Gly His Cys 1220 1225 1230 Val Asn Thr Glu Gly Ser Phe Asn Cys Leu Cys Glu Thr Gly Phe 1235 1240 1245 Gln Pro Ser Pro Glu Ser Gly Glu Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys 1250 1255 1260 Glu Asp Tyr Gly Asp Pro Val Cys Gly Thr Trp Lys Cys Glu Asn 1265 1270 1275 Ser Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Val Leu Gly Cys Gln Pro Gly Phe 1280 1285 1290 His Met Ala Pro Asn Gly Asp Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala 1295 1300 1305 Asn Asp Thr Met Cys Gly Ser His Gly Phe Cys Asp Asn Thr Asp 1310 1315 1320 Gly Ser Phe Arg Cys Leu Cys Asp Gln Gly Phe Glu Ile Ser Pro 1325 1330 1335 Ser Gly Trp Asp Cys Val Asp Val Asn Glu Cys Glu Leu Met Leu 1340 1345 1350 Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Cys Glu Asn Val Glu Gly Ser Phe 1355 1360 1365 Leu Cys Leu Cys Ala Ser Asp Leu Glu Glu Tyr Asp Ala Gln Glu 1370 1375 1380 Gly His Cys Arg Pro Arg Gly Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Glu 1385 1390 1395 Ala Pro Thr Gly Asp His Ala Pro Ala Pro Thr Arg Met Asp Cys 1400 1405 1410 Tyr Ser Gly Gln Lys Gly His Ala Pro Cys Ser Ser Val Leu Gly 1415 1420 1425 Arg Asn Thr Thr Gln Ala Glu Cys Cys Cys Thr Gln Gly Ala Ser 1430 1435 1440 Trp Gly Asp Ala Cys Asp Leu Cys Pro Ser Glu Asp Ser Ala Glu 1445 1450 1455 Phe Ser Glu Ile Cys Pro Ser Gly Lys Gly Tyr Ile Pro Val Glu 1460 1465 1470 Gly Ala Trp Thr Phe Gly Gln Thr Met Tyr Thr Asp Ala Asp Glu 1475 1480 1485 Cys Val Ile Phe Gly Pro Gly Leu Cys Pro Asn Gly Arg Cys Leu 1490 1495 1500 Asn Thr Val Pro Gly Tyr Val Cys Leu Cys Asn Pro Gly Phe His 1505 1510 1515 Tyr Asp Ala Ser His Lys Lys Cys Glu Asp His Asp Glu Cys Gln 1520 1525 1530 Asp Leu Ala Cys Glu Asn Gly Glu Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser 1535 1540 1545 Phe His Cys Phe Cys Ser Pro Pro Leu Thr Leu Asp Leu Ser Gln 1550 1555 1560 Gln Arg Cys Met Asn Ser Thr Ser Ser Thr Glu Asp Leu Pro Asp 1565 1570 1575 His Asp Ile His Met Asp Ile Cys Trp Lys Lys Val Thr Asn Asp 1580 1585 1590 Val Cys Ser Glu Pro Leu Arg Gly His Arg Thr Thr Tyr Thr Glu 1595 1600 1605 Cys Cys Cys Gln Asp Gly Glu Ala Trp Ser Gln Gln Cys Ala Leu 1610 1615 1620 Cys Pro Pro Arg Ser Ser Glu Val Tyr Ala Gln Leu Cys Asn Val 1625 1630 1635 Ala Arg Ile Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gly Val His Phe Arg Pro 1640 1645 1650 Gly Tyr Glu Tyr Gly Pro Gly Pro Asp Asp Leu His Tyr Ser Ile 1655 1660 1665 Tyr Gly Pro Asp Gly Ala Pro Phe Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Glu 1670 1675 1680 Asp Thr Val Pro Glu Pro Ala Phe Pro Asn Thr Ala Gly His Ser 1685 1690 1695 Ala Asp Arg Thr Pro Ile Leu Glu Ser Pro Leu Gln Pro Ser Glu 1700 1705 1710 Leu Gln Pro His Tyr Val Ala Ser His Pro Glu Pro Pro Ala Gly 1715 1720 1725 Phe Glu Gly Leu Gln Ala Glu Glu Cys Gly Ile Leu Asn Gly Cys 1730 1735 1740 Glu Asn Gly Arg Cys Val Arg Val Arg Glu Gly Tyr Thr Cys Asp 1745 1750 1755 Cys Phe Glu Gly Phe Gln Leu Asp Ala Ala His Met Ala Cys Val 1760 1765 1770 Asp Val Asn Glu Cys Asp Asp Leu Asn Gly Pro Ala Val Leu Cys 1775 1780 1785 Val His Gly Tyr Cys Glu Asn Thr Glu Gly Ser Tyr Arg Cys His 1790 1795 1800 Cys Ser Pro Gly Tyr Val Ala Glu Ala Gly Pro Pro His Cys Thr 1805 1810 1815 Ala Lys Glu 1820 <210> 14 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln 1 5 10 15 Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu 20 25 30 Arg Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys 35 40 45 Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His 50 55 60 Leu Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His 65 70 75 80 Val Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Val Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp 100 105 110 Tyr Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr 115 120 125 Asn Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Arg 130 135 140 Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile 145 150 155 160 Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser 165 170 175 Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr 180 185 190 Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg 195 200 205 Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val 210 215 220 Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe 225 230 235 240 Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly 245 250 255 Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly 260 265 270 Arg Phe Ser His Leu 275 <210> 15 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Lys Glu Arg Arg Ala Pro Gln Pro Val Val Ala Arg Cys Lys Leu 1 5 10 15 Val Leu Val Gly Asp Val Gln Cys Gly Lys Thr Ala Met Leu Gln Val 20 25 30 Leu Ala Lys Asp Cys Tyr Pro Glu Thr Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu 35 40 45 Asn Tyr Thr Ala Cys Leu Glu Thr Glu Glu Gln Arg Val Glu Leu Ser 50 55 60 Leu Trp Asp Thr Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Asp Asn Val Arg Pro Leu 65 70 75 80 Cys Tyr Ser Asp Ser Asp Ala Val Leu Leu Cys Phe Asp Ile Ser Arg 85 90 95 Pro Glu Thr Val Asp Ser Ala Leu Lys Lys Trp Arg Thr Glu Ile Leu 100 105 110 Asp Tyr Cys Pro Ser Thr Arg Val Leu Leu Ile Gly Cys Lys Thr Asp 115 120 125 Leu Arg Thr Asp Leu Ser Thr Leu Met Glu Leu Ser His Gln Lys Gln 130 135 140 Ala Pro Ile Ser Tyr Glu Gln Gly Cys Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly 145 150 155 160 Ala Glu Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Ala Phe Thr Ser Glu Lys Ser Ile 165 170 175 His Ser Ile Phe Arg Thr Ala Ser Met Leu Cys Leu Asn Lys Pro Ser 180 185 190 Pro Leu Pro Gln Lys Ser Pro Val Arg Ser Leu Ser Lys Arg Leu Leu 195 200 205 His Leu Pro Ser Arg Ser Glu Leu Ile Ser Ser Thr Phe Lys Lys Glu 210 215 220 Lys Ala Lys Ser Cys Ser Ile Met 225 230 <210> 16 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Pro Glu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Ser Gly Arg Pro Gly Val Thr 1 5 10 15 Thr His Ser Thr Arg Thr Pro Gly Thr Glu Ile Gln Thr Ile Ile Ser 20 25 30 Asn Pro Val Pro Lys Met Glu Glu Ala Lys Ser Gln Ser Leu Glu Glu 35 40 45 Asp Phe Glu Gly Gln Ala Thr His Thr Gly Pro Lys Gly Val Ile Asn 50 55 60 Asp Trp Arg Lys Phe Lys Leu Glu Ser Gln Asp Ser Asp Ser Ile Pro 65 70 75 80 Pro Ser Lys Lys Glu Ile Leu Arg Gln Met Ser Ser Pro Gln Ser Arg 85 90 95 Asn Gly Lys Asp Ser Lys Glu Arg Val Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln 100 105 110 Glu Tyr Glu Leu Ile His Lys Glu Lys Glu Asp Glu Asn Cys Leu Arg 115 120 125 Lys Tyr Arg Arg Gln Cys Met Gln Asp Met His Gln Lys Leu Ser Phe 130 135 140 Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu Leu Glu Thr Gly Lys Gln Phe 145 150 155 160 Leu Glu Thr Ile Glu Lys Glu Leu Lys Ile Thr Thr Ile Val Val His 165 170 175 Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu 180 185 190 Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys 195 200 205 Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro 210 215 220 Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser 225 230 235 240 Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser 245 250 255 Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro Glu Arg Glu Val His Val Leu 260 265 270 Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp Val Glu 275 280 <210> 17 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Ser Ser Pro Gln Ser Arg Asn Gly Lys Asp Ser Lys Glu Arg Val 1 5 10 15 Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln Glu Tyr Glu Leu Ile His Lys Glu Lys 20 25 30 Glu Asp Glu Asn Cys Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Gln Cys Met Gln Asp 35 40 45 Met His Gln Lys Leu Ser Phe Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu 50 55 60 Leu Glu Thr Gly Lys Gln Phe Leu Glu Thr Ile Glu Lys Glu Leu Lys 65 70 75 80 Ile Thr Thr Ile Val Val His Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys 85 90 95 Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile 100 105 110 Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg 115 120 125 Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu 130 135 140 Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe 145 150 155 160 Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro 165 170 175 Glu Arg Glu Val His Val Leu Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp 180 185 190 Val Glu <210> 18 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly 20 25 30 Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys 35 40 45 Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys 50 55 60 Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser 65 70 75 80 Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr 85 90 95 Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu 100 105 110 Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr 115 120 125 Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val 130 135 140 His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp 145 150 155 160 Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val 165 170 175 Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu 180 185 190 Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile 195 200 205 Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu 225 230 235 240 His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu 245 250 255 Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys 260 265 270 Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr 275 280 285 Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser 290 295 300 Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln 305 310 315 320 Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu 325 330 335 Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala 340 345 350 Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys 355 360 365 Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp 370 375 380 Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp 385 390 395 400 Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu 405 410 415 Leu <210> 19 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Arg Val Gly Pro Val Arg Ser Ala Met Ser Gly Ala Ser Gln Pro 1 5 10 15 Arg Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Ala Thr Arg Gly Val Pro Ala Lys 20 25 30 Arg Leu Leu Asp Ala Asp Asp Ala Ala Ala Val Ala Ala Lys Cys Pro 35 40 45 Arg Leu Ser Glu Cys Ser Ser Pro Pro Asp Tyr Leu Ser Pro Pro Gly 50 55 60 Ser Pro Cys Ser Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ile Ala Asp Tyr Leu Leu 85 90 95 Leu Pro Leu Ala Glu Arg Glu His Val Ser Arg Ala Leu Cys Ile His 100 105 110 Thr Gly Arg Glu Leu Arg Cys Lys Val Phe Pro Ile Lys His Tyr Gln 115 120 125 Asp Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Gln Leu Pro Ser His Ser Asn Ile Thr 130 135 140 Gly Ile Val Glu Val Ile Leu Gly Glu Thr Lys Ala Tyr Val Phe Phe 145 150 155 160 Glu Lys Asp Phe Gly Asp Met His Ser Tyr Val Arg Ser Arg Lys Arg 165 170 175 Leu Arg Glu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Phe Lys Gln Ile Val Ser Ala 180 185 190 Val Ala His Cys His Gln Ser Ala Ile Val Leu Gly Asp Leu Lys Leu 195 200 205 Arg Lys Phe Val Phe Ser Thr Glu Glu Arg Thr Gln Leu Arg Leu Glu 210 215 220 Ser Leu Glu Asp Thr His Ile Met Lys Gly Glu Asp Asp Ala Leu Ser 225 230 235 240 Asp Lys His Gly Cys Pro Ala Tyr Val Ser Pro Glu Ile Leu Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Thr Tyr Ser Gly Lys Ala Ala Asp Val Trp Ser Leu Gly Val 260 265 270 Met Leu Tyr Thr Leu Leu Val Gly Arg Tyr Pro Phe His Asp Ser Asp 275 280 285 Pro Ser Ala Leu Phe Ser Lys Ile Arg Arg Gly Gln Phe Cys Ile Pro 290 295 300 Glu His Ile Ser Pro Lys Ala Arg Cys Leu Ile Arg Ser Leu Leu Arg 305 310 315 320 Arg Glu Pro Ser Glu Arg Leu Thr Ala Pro Glu Ile Leu Leu His Pro 325 330 335 Trp Phe Glu Ser Val Leu Glu Pro Gly Tyr Ile Asp Ser Glu Ile Gly 340 345 350 Thr Ser Asp Gln Ile Val Pro Glu Tyr Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ser 355 360 365 Ser Phe Phe Cys 370 <210> 20 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu 20 25 30 Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly 50 55 60 Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu 65 70 75 80 Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val 85 90 95 Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val 100 105 110 His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala 115 120 125 Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser 130 135 140 Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val 145 150 155 160 Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn 165 170 175 Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn 180 185 190 Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu 195 200 205 Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser 210 215 220 Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr 225 230 235 240 Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr 245 250 255 Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln 260 265 270 Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu 275 280 285 Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe 290 295 300 Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val 305 310 315 320 Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly 325 330 335 His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser 340 345 350 <210> 21 <211> 638 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser 1 5 10 15 Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala 20 25 30 Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser 35 40 45 Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe 50 55 60 Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly 65 70 75 80 Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln 85 90 95 Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys 100 105 110 Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 115 120 125 Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp 130 135 140 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 145 150 155 160 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 165 170 175 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 195 200 205 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 210 215 220 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 245 250 255 Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser 275 280 285 Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro 290 295 300 Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe 325 330 335 His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu 340 345 350 Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser 355 360 365 Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser 370 375 380 Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn 385 390 395 400 Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg 405 410 415 Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn 420 425 430 Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val 435 440 445 Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala 450 455 460 Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser 465 470 475 480 Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala 485 490 495 Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser 500 505 510 Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe 515 520 525 Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile 530 535 540 Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu 545 550 555 560 Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala 565 570 575 Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val 580 585 590 Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile 595 600 605 Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser 610 615 620 Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro 625 630 635 <210> 22 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly 20 25 30 Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp 35 40 45 Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu 50 55 60 Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys 85 90 95 Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr 100 105 110 Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg 115 120 125 Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His 130 135 140 Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr 145 150 155 160 Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu 165 170 175 Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr 180 185 190 Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His 195 200 205 <210> 23 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Val Pro Pro Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu 1 5 10 15 Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His 20 25 30 Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala 35 40 45 Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyr Ser 50 55 60 Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe 65 70 75 80 Leu Arg Leu Tyr Tyr Pro Ser Gln Asp Asn Asp Arg Leu Asp Thr Leu 85 90 95 Trp Ile Pro Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Gly Leu Ser Lys Phe Leu Gly 100 105 110 Thr His Trp Leu Met Gly Asn Ile Leu Arg Leu Leu Phe Gly Ser Met 115 120 125 Thr Thr Pro Ala Asn Trp Asn Ser Pro Leu Arg Pro Gly Glu Lys Tyr 130 135 140 Pro Leu Val Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala 165 170 175 Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp 180 185 190 Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr 195 200 205 Leu Lys Gln Glu Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln 210 215 220 Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp 225 230 235 240 His Gly Lys Pro Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu 245 250 255 Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His 260 265 270 Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg 275 280 285 Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp 290 295 300 Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu 305 310 315 320 Tyr Phe Gln Tyr Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser 325 330 335 Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln 340 345 350 Asn Phe Ala Asp Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met 355 360 365 Leu Lys Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser 370 375 380 Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys 385 390 395 400 Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu 405 410 415 Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln 420 425 430 Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn 435 440 <210> 24 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ala Lys Phe Val Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala Asp Cys Ser Asp 1 5 10 15 Ile Leu Arg Leu Ile Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Glu Tyr Met Glu Glu 20 25 30 Gln Val Ile Leu Thr Glu Lys Asp Leu Leu Glu Asp Gly Phe Gly Glu 35 40 45 His Pro Phe Tyr His Cys Leu Val Ala Glu Val Pro Lys Glu His Trp 50 55 60 Thr Pro Glu Gly His Ser Ile Val Gly Phe Ala Met Tyr Tyr Phe Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Pro Trp Ile Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asp Phe Phe Val 85 90 95 Met Ser Asp Tyr Arg Gly Phe Gly Ile Gly Ser Glu Ile Leu Lys Asn 100 105 110 Leu Ser Gln Val Ala Met Arg Cys Arg Cys Ser Ser Met His Phe Leu 115 120 125 Val Ala Glu Trp Asn Glu Pro Ser Ile Asn Phe Tyr Lys Arg Arg Gly 130 135 140 Ala Ser Asp Leu Ser Ser Glu Glu Gly Trp Arg Leu Phe Lys Ile Asp 145 150 155 160 Lys Glu Tyr Leu Leu Lys Met Ala Thr Glu Glu 165 170 <210> 25 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Glu Gly Met Ala Val Phe Gly Phe 1 5 10 15 Val Leu Phe Leu Val Leu Trp Leu Met His Phe Met Ala Ile Ile Tyr 20 25 30 Thr Arg Leu His Leu Asn Lys Lys Ala Thr Asp Lys Gln Pro Tyr Ser 35 40 45 Lys Leu Pro Gly Val Ser Leu Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val Asp Pro 50 55 60 Asn Leu Ile Asn Asn Leu Glu Thr Phe Phe Glu Leu Asp Tyr Pro Lys 65 70 75 80 Tyr Glu Val Leu Leu Cys Val Gln Asp His Asp Asp Pro Ala Ile Asp 85 90 95 Val Cys Lys Lys Leu Leu Gly Lys Tyr Pro Asn Val Asp Ala Arg Leu 100 105 110 Phe Ile Gly Gly Lys Lys Val Gly Ile Asn Pro Lys Ile Asn Asn Leu 115 120 125 Met Pro Gly Tyr Glu Val Ala Lys Tyr Asp Leu Ile Trp Ile Cys Asp 130 135 140 Ser Gly Ile Arg Val Ile Pro Asp Thr Leu Thr Asp Met Val Asn Gln 145 150 155 160 Met Thr Glu Lys Val Gly Leu Val His Gly Leu Pro Tyr Val Ala Asp 165 170 175 Arg Gln Gly Phe Ala Ala Thr Leu Glu Gln Val Tyr Phe Gly Thr Ser 180 185 190 His Pro Arg Tyr Tyr Ile Ser Ala Asn Val Thr Gly Phe Lys Cys Val 195 200 205 Thr Gly Met Ser Cys Leu Met Arg Lys Asp Val Leu Asp Gln Ala Gly 210 215 220 Gly Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Ile Ala Glu Asp Tyr Phe Met Ala 225 230 235 240 Lys Ala Ile Ala Asp Arg Gly Trp Arg Phe Ala Met Ser Thr Gln Val 245 250 255 Ala Met Gln Asn Ser Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Phe Gln Ser Arg 260 265 270 Met Ile Arg Trp Thr Lys Leu Arg Ile Asn Met Leu Pro Ala Thr Ile 275 280 285 Ile Cys Glu Pro Ile Ser Glu Cys Phe Val Ala Ser Leu Ile Ile Gly 290 295 300 Trp Ala Ala His His Val Phe Arg Trp Asp Ile Met Val Phe Phe Met 305 310 315 320 Cys His Cys Leu Ala Trp Phe Ile Phe Asp Tyr Ile Gln Leu Arg Gly 325 330 335 Val Gln Gly Gly Thr Leu Cys Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Val Ala 340 345 350 Trp Phe Ile Arg Glu Ser Met Thr Ile Tyr Ile Phe Leu Ser Ala Leu 355 360 365 Trp Asp Pro Thr Ile Ser Trp Arg Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Arg Cys 370 375 380 Gly Gly Thr Ala Glu Glu Ile Leu Asp Val 385 390 CRM197 (52-Gly) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/224021 1 gaddvvdssk sfvmenfssy hgtkpgyvds iqkgiqkpks gtqgnydddw kefystdnky 61 daagysvdne nplsgkaggv vkvtypgltk vlalkvdnae tikkelglsl teplmeqvgt 121 eefikrfgdg asrvvlslpf aegsssveyi nnweqakals veleinfetr gkrgqdamye 181 ymaqacagnr vrrsvgssls cinldwdvir dktktkiesl kehgpiknkm sespnktvse 241 ekakqyleef hqtalehpel selktvtgtn pvfaganyaa wavnvaqvid setadnlekt 301 taalsilpgi gsvmgiadga vhhnteeiva qsialsslmv aqaiplvgel vdigfaaynf 361 vesiinlfqv vhnsynrpay spghktqpfl hdgyavswnt vedsiirtgf qgesghdiki 421 taentplpia gvllptipgk ldvnkskthi svngrkirmr craidgdvtf crpkspvyvg 481 ngvhanlhva fhrsssekih sneissdsig vlgyqktvdh tkvnsklslf feiks DT (52-Glu) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA24778.1 1 mgaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk 61 ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg 121 teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy 181 eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs 241 eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek 301 ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn 361 fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lhdgyavswn tvedsiirtg fqgesghdik 421 itaentplpi agvllptipg kldvnkskth isvngrkirm rcraidgdvt fcrpkspvyv 481 gngvhanlhv afhrssseki hsneissdsi gvlgyqktvd htkvnsklsl ffeiks DT B-Chain (the receptor binding domain) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/223602 1 msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi 61 dsetadnlek ptaalkavaa lsilpgigsv mgiadgavhh nteeivaqsi alsslmvaqa 121 iplvgelvdi gfaaynfves iinlfqvvhn nynskayrtv dnlhdgyavs wntvedsiir 181 tgfqgesghd ikitaentpl piagvllpti p DT A-Chain (the catalytic (toxic) domain) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1DTP_A 1 gaddvvdssk sfvmenfssy hgtkpgyvds iqkgiqkpks gtqgnydddw kgfystdnky 61 daagysvdne nplsgkaggv vkvtypgltk vlalkvdnae tikkelglsl teplmeqvgt 121 eefikrfgdg asrvvlslpf aegsssveyi nnweqakals veleinfetr gkrgqdamye 181 ymaqacagnr

Claims (40)

  1. 중추신경계(CNS) 장애 또는 미세혈관 장애를 치료, 예방 또는 진단하기 위한 약학 조성물로서, (i) 치료제 또는 진단제 또는 상기 치료제 또는 진단제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체와 (ii) 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 표적화제의 포합제(conjugate)를 포함하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 디프테리아 독소 수용체가 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 표적화제가
    (a) 디프테리아 독소 폴리펩티드 쇄의 비독성 부분;
    (b) 디프테리아 독소 B 쇄; 및
    (c) 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체 CRM197
    로 구성되는 군으로부터 선택되는, 디프테리아 독소 수용체에 대한 리간드 또는 디프테리아 독소 수용체에서의 작용제인 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는
    (a) 항종양성(anti-tumour), 향종양제(antineoplastic) 또는 세포독성 약물,
    (b) 항암 생물 약제학적 약물,
    (c) 항암 또는 항염증성 항체,
    (d) 사이토킨, 신경촉진인자 또는 성장 호르몬,
    (e) 신경촉진 인자,
    (f) 효소,
    (g) 뇌 작용 호르몬 또는 뉴로펩티드,
    (h) 뇌혈관 장벽(BBB)을 통과하지 않는 신경전달물질, 신경전달물질 길항제 또는 작용제,
    (i) 항생제, 항진균제, 구충제 또는 항원충제,
    (j) 폴리펩티드 또는 안티센스 DNA를 코딩하는 발현 벡터, 및
    (k) 안티센스 핵산 또는 펩티드 핵산
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 신경촉진 인자가 신경 성장 인자, 뇌 유래 신경촉진 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-5, 망막 유래의 성장 인자, 모양체 신경촉진 인자, 악티빈(activin), 염기성 섬유아세포 성장 인자, 산성 섬유아세포 성장 인자, 신경교세포주 유래 신경촉진 인자, 뉴블라스틴, 아르테민, 에노빈, 프레세핀, 뉴투린, 결합조직 성장 인자 및 상피 성장 인자로 구성되는 군으로부터 선택되고, 또는
    (b) 뇌-작용 호르몬 또는 뉴로펩티드가 소마토스타틴, 옥시토신, 바소프레신, 구아라닌, VIP, 아드레노코르티코트로픽 호르몬, 콜레시스토키닌, 물질-P, 봄베신, 모틸린, 글리센틴, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드, 펩티드 YY, 뉴로펩티드 Y, 췌장 폴리펩티드, 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 엔도르핀, 엔케팔린, 뉴로텐신, 뉴로메딘 K, 뉴로메딘 L, 칼시토닌 관련 펩티드, 엔도텔린, 심방 나트륨배설촉진 펩티드, 뇌 나트륨배설촉진 펩티드, C-형 나트륨배설촉진 펩티드 및 뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 나노컨테이너 내에서 캡슐화되고, 표적화제가 상기 나노컨테이너에 접합되는 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 나노컨테이너는 나노입자, 리포솜 또는 나노겔이고, 이에 치료제 또는 진단제가 공유 결합되는 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 치료제는
    (a) 항종양성, 향종양제 또는 세포독성 약물,
    (b) 항암 생물 약제학적 약물,
    (c) 항암 또는 항염증성 항체,
    (d) 사이토킨, 신경촉진인자 또는 성장 호르몬,
    (e) 신경촉진 인자,
    (f) 효소,
    (g) 뇌 작용 호르몬 또는 뉴로펩티드,
    (h) 뇌혈관 장벽(BBB)을 통과하지 않는 신경전달물질, 신경전달물질 길항제 또는 작용제,
    (i) 항생제, 항진균제, 구충제 또는 항원충제,
    (j) 폴리펩티드 또는 안티센스 DNA를 코딩하는 발현 벡터, 및
    (k) 안티센스 핵산 또는 펩티드 핵산
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 치료제는
    (a) 항종양성, 향종양제 또는 세포독성 약물,
    (b) 항암 생물 약제학적 약물,
    (c) 항암 또는 항염증성 항체,
    (d) 사이토킨, 신경촉진인자 또는 성장 호르몬,
    (e) 신경촉진 인자,
    (f) 효소,
    (g) 뇌 작용 호르몬 또는 뉴로펩티드,
    (h) 뇌혈관 장벽(BBB)을 통과하지 않는 신경전달물질, 신경전달물질 길항제 또는 작용제,
    (i) 항생제, 항진균제, 구충제 또는 항원충제,
    (j) 폴리펩티드 또는 안티센스 DNA를 코딩하는 발현 벡터, 및
    (k) 안티센스 핵산 또는 펩티드 핵산
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 표적화제가
    (a) 디프테리아 독소 폴리펩티드 쇄의 비독성 부분;
    (b) 디프테리아 독소 B 쇄; 및
    (c) 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체 CRM197
    로 구성되는 군으로부터 선택되는, 디프테리아 독소 수용체에 대한 리간드 또는 디프테리아 독소 수용체에서의 작용제인 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 표적화제가
    (a) 디프테리아 독소 폴리펩티드 쇄의 비독성 부분;
    (b) 디프테리아 독소 B 쇄; 및
    (c) 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체 CRM197
    로 구성되는 군으로부터 선택되는, 디프테리아 독소 수용체에 대한 리간드 또는 디프테리아 독소 수용체에서의 작용제인 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애는
    (a) 뇌혈관질환(CVA), 알쯔하이머병(AD), 혈관-관련 치매, 크로츠펠트-야콥병(CJD), 소해면양뇌증(BSE), 파키슨병(PD), 뇌 외상, 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 헌팅톤 무도병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 장애,
    (b) 우울증, 자폐증, 불안 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD), 신경정신 전신성 홍반성 낭창, 양극성 장애, 정신분열증 및 기타 정신병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 신경정신의학 장애,
    (c) 뇌 종양, 간질, 편두통, 기면증, 불면증, 만성피로증후군, 고산병, 뇌염, 수막염 및 AIDS-관련 치매로 구성되는 군으로부터 선택되는 CNS 장애,
    (d) 혈관 종양, 증식성 유리체망막증, 류마티스 관절염, 크론병, 동맥경화증, 난소 과자극, 건선, 혈관신생 관련의 자궁내막증, 풍선혈관형성술에 후속하는 재협착, 반흔 조직 과생산, 말초 혈관 질병, 고혈압, 염증성 맥관염, 레이노병, 레이노 현상, 동맥류, 동맥 재협착, 혈전성정맥염, 림프관염, 임파부종, 상처 치료 및 조직 수복, 허혈재관류손상, 협심증, 심근경색증, 만성심장질환 및 심부전으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈관신생-관련 장애,
    (e) 노화성 황반 변성,
    (f) 골다공증,
    (g) 아스파르틸글루코스아민뇨증, 콜레스테롤 에스테르 축적증, 월만병, 시스틴증, 다논병, 페브리병, 파버 지방육아종증, 파버병, 푸코시드축적증, I/II형 갈락토시알리도시스, I/II/III형 고셔병, 고셔병, 거대 세포 백질이양증, 크라베병, II 글리코겐 축적증, 폼페병, I/II/III형 GM1-강글리오시도시스, I형 GM2-강글리오시도시스, 테이삭스병, II형 GM2-강글리오시도시스, 샌드호프병, GM2-강글리오시도시스, I/II형 알파-만노축적증, 만노축적증, 이염성 백질이양증, I형 뮤코리피드증, I/II형 시알리도시스, II/III형 뮤코리피드증, 1-세포병, IIIC형 뮤코리피드증, 유사-허얼러 폴리디스트로피, I형 뮤코폴리삭카라이드증, II형 뮤코폴리삭카라이드증, 헌터증후군, IIIA형 뮤코폴리삭카라이드증, 산필리포증후군, IIIB형 뮤코폴리삭카라이드증, IIIC형 뮤코폴리삭카라이드증, IIID형 뮤코폴리삭카라이드증, 뮤코폴리삭카라이드증 IVA형 모르키오증후군, 뮤코폴리삭카라이드증 IVB형 모르키오증후군, VI형 뮤코폴리삭카라이드증, VII형 뮤코폴리삭카라이드증, 슬라이증후군, IX형 뮤코폴리삭카라이드증, 다발성 술파타제 결핍증, 신경 세로이드 리포푸스신증, CLN1 바텐병, A/B형 니이만-픽병, 니이만-픽병, C1형 니이만-픽병, C2형 니이만-픽병, 농축이골증, VII형 쉰들러병, 쉰들러병, 및 정지산 축적증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 리소좀 축적증,
    (h) 패혈성 쇼크, 간선 뇌장애, (당뇨)고혈압, 당뇨 미세혈관병증, 수면병, 휘플병, 뒤시엔느 근위 영양증(DMD) 및 임신중독증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 내피세포 혈관 벽이 뇌혈관 장벽(BBB)의 뇌 혈관의 내피세포를 포함하는 중추 신경계의 미세혈관 장애
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 나노컨테이너 내에서 캡슐화되고, 표적화제가 상기 나노컨테이너에 접합되는 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 치료제는
    (a) 항종양성, 향종양제 또는 세포독성 약물,
    (b) 항암 생물 약제학적 약물,
    (c) 항암 또는 항염증성 항체,
    (d) 사이토킨, 신경촉진인자 또는 성장 호르몬,
    (e) 신경촉진 인자,
    (f) 효소,
    (g) 뇌 작용 호르몬 또는 뉴로펩티드,
    (h) 뇌혈관 장벽(BBB)을 통과하지 않는 신경전달물질, 신경전달물질 길항제 또는 작용제,
    (i) 항생제, 항진균제, 구충제 또는 항원충제,
    (j) 폴리펩티드 또는 안티센스 DNA를 코딩하는 발현 벡터, 및
    (k) 안티센스 핵산 또는 펩티드 핵산
    으로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 나노컨테이너 내에서 캡슐화되고, 표적화제가 상기 나노컨테이너에 접합되는 약학 조성물.
  16. 내피 세포 혈관 장벽 내로, 내피 세포 혈관 장벽을 가로질러 또는 내피 세포 혈관 장벽 내로 및 내피 세포 혈관 장벽을 가로질로 치료제 또는 진단제의 전달을 위한, 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 표적화제로서 기능하는 후보 물질의 능력을 평가하거나 또는 스크리닝하는 방법으로서, 내피 세포 혈관 장벽의 내피 세포 상에서 발현된 상기 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 능력, 내피 세포 혈관 장벽의 세포에 의해 흡수되는 능력 또는 내피 세포 혈관 장벽의 세포를 가로질러 트랜스사이토시스하는 능력에 대하여 상기 물질을 시험하는 단계를 포함하고, 상기 시험 물질이 (a) 상기 세포에 특이적으로 결합하고; 상기 세포 내로 수용체 특이적 흡수(uptake)를 수행하고; 상기 세포를 가로질러 트랜스사이토시스하고; 또는 상기 세포에 특이적으로 결합하고, 상기 세포 내로 수용체 특이적 흡수를 수행하고 그리고 상기 세포를 가로질러 트랜스사이토시스하고, 그리고 (b) 상기 세포 상에 발현하는 상기 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 공지 물질을 사용하는 비교 분석법에서, 상기 공지 물질의 결합, 흡수 및 트랜스사이토시스 중 하나 이상의 양을 감소시키거나, 또는 상기 공지 물질이 독성인 경우, 상기 공지 물질의 독성을 감소시킨다면,
    상기 후보 물질이 상기 표적화제로서의 기능하는 능력을 가진 것으로 결론낼 수 있는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 디프테리아 독소 수용체가
    (a) 뇌혈관 장벽의 내피 세포,
    (b) 뉴런, 아교 세포 및 성상 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 뇌세포,
    (c) 뇌 및 다른 미세혈관 내피 세포,
    (d) 평활근 세포, 염증 세포, NK 세포, 림프절 세포, 골격근 세포, 심장근 세포, 신장 혈관간세포, 각질 세포 또는 기타 피부 세포, 소장 세포, 전관절로부터 유래한 세포, 영양포, 난소 세포, 자궁 세포, 태반 세포 및 방광 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 미세혈관 세포 또는 뇌세포가 아닌 세포, 또는
    (e) 종양 세포
    상에서 구성적으로 발현되는 방법.
  18. 내피 세포 혈관 장벽 내로, 내피 세포 혈관 장벽을 가로질러 또는 내피 세포 혈관 장벽 내로 및 내피 세포 혈관 장벽을 가로질러 치료제 또는 진단제로서 전달되는 후보 물질의 능력을 평가하거나 또는 스크리닝하는 방법으로서, 상기 물질이 표적화제에 접합되는 경우, 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 능력, 내피 세포 혈관 장벽의 세포에 의해 흡수되는 능력, 내피 세포 혈관 장벽의 세포를 가로질러 트랜스사이토시스하는 능력, 또는 디프테리아 독소 수용체에 특이적으로 결합하는 능력, 내피 세포 혈관 장벽의 세포에 의해 흡수되는 능력 및 내피 세포 혈관 장벽의 세포를 가로질러 트랜스사이토시스하는 능력에 대한 상기 물질의 능력을 시험하는 단계를 포함하고, 상기 접합된 시험 물질이 상기 세포에 특이적으로 결합하거나, 상기 세포 내로 수용체 특이적 흡수를 수행하거나, 상기 세포를 가로질로 트랜스사이토시스하거나, 또는 상기 세포에 특이적으로 결합하고, 상기 세포 내로 수용체 특이적 흡수를 수행하고, 상기 세포를 가로질로 트랜스사이토시스한다면, 상기 후보 물질이 내피 세포 혈관 장벽 내로, 내피 세포 혈관 장벽을 가로질러 또는 내피 세포 혈관 장벽 내로 및 내피 세포 혈관 장벽을 가로질러 치료제 또는 진단제를 전달하는 능력을 가진 것으로 결론낼 수 있는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 수용체가
    (a) 뉴런, 아교 세포, 미세아교 세포, 성상 세포, 희소돌기아교세포(oligodendroglial cell), 혈관돌기 세포, 경계 세포(perithelial cell), 상의 세포, 뇌막(meningeal) 세포, 거미막 과립 세포, 거미막, 경질막 세포, 연막 세포 및 맥락총 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 뇌세포,
    (b) 뇌 및 다른 미세혈관 내피 세포,
    (c) 평활근 세포, 염증 세포, NK 세포, 림프절 세포, 골격근 세포, 심장근 세포, 신장 혈관간세포, 각질세포 또는 기타 피부 세포, 소장 세포, 전관절로부터 유래되는 세포, 영양포, 난소 세포, 자궁 세포, 태반 세포 및 방광 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 미세혈관 세포 또는 뇌세포가 아닌 세포, 또는
    (d) 종양 세포
    상에서 구성적으로 발현되는 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
KR1020057014739A 2003-02-10 2004-02-10 염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는핵산 KR101228204B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03075390.9 2003-02-10
EP03075390 2003-02-10
US44627003P 2003-02-11 2003-02-11
US60/446,270 2003-02-11
US49152203P 2003-08-01 2003-08-01
US60/491,522 2003-08-01
PCT/NL2004/000092 WO2004069870A2 (en) 2003-02-10 2004-02-10 Differentially expressed nucleic acids in the blood-brain barrier under inflammatory conditions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050099545A KR20050099545A (ko) 2005-10-13
KR101228204B1 true KR101228204B1 (ko) 2013-01-31

Family

ID=32853964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057014739A KR101228204B1 (ko) 2003-02-10 2004-02-10 염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는핵산

Country Status (9)

Country Link
US (2) US8026209B2 (ko)
EP (1) EP1592709A2 (ko)
JP (1) JP5036302B2 (ko)
KR (1) KR101228204B1 (ko)
AU (1) AU2004208962B2 (ko)
CA (1) CA2515603C (ko)
MX (1) MXPA05008487A (ko)
NZ (1) NZ541760A (ko)
WO (1) WO2004069870A2 (ko)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2335694B1 (en) 2003-09-15 2018-06-13 NanoPharmaceuticals LLC Thyroid hormone analogs and methods of use
US9198887B2 (en) 2003-09-15 2015-12-01 Nanopharmaceuticals Llc Thyroid hormone analogs and methods of use
US8668926B1 (en) 2003-09-15 2014-03-11 Shaker A. Mousa Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations thereof
JPWO2006121199A1 (ja) * 2005-05-11 2008-12-18 日本ケミカルリサーチ株式会社 脂質小胞体組成物
US9220788B2 (en) 2009-06-17 2015-12-29 Nanopharmaceuticals Llc Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations and uses thereof
US10130686B2 (en) 2005-09-15 2018-11-20 Nanopharmaceuticals Llc Method and composition of thyroid hormone analogues and nanoformulations thereof for treating inflammatory disorders
US9498536B2 (en) 2005-09-15 2016-11-22 Nanopharmaceuticals Llc Method and composition of thyroid hormone analogues and nanoformulations thereof for treating anti-inflammatory disorders
US20100209382A1 (en) 2005-09-16 2010-08-19 Ordway Research Institute, Inc. Polyphenol Conjugates as RGD-Binding Compounds and Methods of Use
WO2007138011A1 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating graft rejection and inflammatory conditiions
EP2102357B1 (en) 2006-10-16 2013-11-27 Bayer Intellectual Property GmbH Ltbp2 as a biomarker, therapeutic and diagnostic target
CA2673133C (en) * 2006-12-22 2016-08-30 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Nanoparticle and polymer formulations for thyroid hormone analogs, antagonists, and formulations and uses thereof
EP2125024B1 (en) * 2007-03-23 2013-02-13 TO-BBB Holding B.V. Targeted intracellular delivery of antiviral agents
US9149492B2 (en) * 2008-10-08 2015-10-06 Trustees Of Dartmouth College Method for selectively inhibiting ACAT1 in the treatment of alzheimer's disease
WO2010075332A1 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 Charitable Leadership Foundation Small molecule ligands of the integrin rgd recognition site and methods of use
US9180107B2 (en) * 2009-03-31 2015-11-10 Nanopharmaceuticals Llc Combination treatment of cancer with cetuximab and tetrac
WO2011014704A2 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
PT3626257T (pt) 2010-06-25 2021-11-12 Shire Human Genetic Therapies Métodos e composições de arilsulfatase a para a administração no snc
PT2646470T (pt) * 2010-11-30 2017-05-03 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-recetor da transferrina de baixa afinidade e a sua utilização na transferência de scfv terapêuticos através da barreira hematoencefálica
US8802240B2 (en) 2011-01-06 2014-08-12 Nanopharmaceuticals Llc Uses of formulations of thyroid hormone analogs and nanoparticulate forms thereof to increase chemosensitivity and radiosensitivity in tumor or cancer cells
ES2856091T3 (es) * 2011-09-14 2021-09-27 Univ Northwestern Nanoconjugados capaces de atravesar la barrera hematoencefálica
EP2771028A2 (en) 2011-10-24 2014-09-03 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
CA2853701A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 U.S. Phytotherapy, Inc. Artemisinin and berberine compositions and methods of making
US9358261B2 (en) 2011-10-25 2016-06-07 U.S. Phytotherapy, Inc. Additional artemisinin and berberine compositions and methods of making
US9675582B2 (en) 2011-10-25 2017-06-13 U.S. Phytotherapy, Inc. Alternative ACT with natural botanical active GRAS ingredients for treatment and prevention of the Zika virus
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
AU2013266611B2 (en) * 2012-05-21 2016-08-11 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport
WO2014004424A1 (en) 2012-06-26 2014-01-03 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Method for detecting injury to the brian
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014174834A1 (ja) * 2013-04-25 2014-10-30 国立大学法人山口大学 神経疾患治療剤
US10039808B2 (en) 2014-10-22 2018-08-07 Michael Chez Method of treating or improving neurological function in a human subject
CA3012985A1 (en) 2015-01-27 2016-08-04 Kardiatonos, Inc. Biomarkers of vascular disease
US9925244B1 (en) 2015-02-17 2018-03-27 Michael Chez Treatment of warts in non-immunosuppressed patients
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
CA3026504A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Nanopharmaceuticals, Llc Non-cleavable polymer conjugated with .alpha..nu..beta.3 integrin thyroid antagonists
US11752315B1 (en) 2016-10-07 2023-09-12 Carlos A. Hakim Method of treating normal pressure hydrocephalus
US11351137B2 (en) 2018-04-11 2022-06-07 Nanopharmaceuticals Llc Composition and method for dual targeting in treatment of neuroendocrine tumors
US10328043B1 (en) 2018-04-11 2019-06-25 Nanopharmaceuticals, Llc. Composition and method for dual targeting in treatment of neuroendocrine tumors
US11446084B2 (en) 2019-07-12 2022-09-20 Neuralink Corp. Laser drilling of pia mater
US10961204B1 (en) 2020-04-29 2021-03-30 Nanopharmaceuticals Llc Composition of scalable thyrointegrin antagonists with improved blood brain barrier penetration and retention into brain tumors
US11723888B2 (en) 2021-12-09 2023-08-15 Nanopharmaceuticals Llc Polymer conjugated thyrointegrin antagonists
CN115721733A (zh) * 2022-11-14 2023-03-03 东南大学 一种纳米调节剂的制备方法及其产品和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021769A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
WO1994014696A1 (en) 1992-12-18 1994-07-07 Hoover Universal, Inc. Container with integrally molded closure/tamper indicator

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5665764A (en) * 1995-06-02 1997-09-09 Warner-Lambert Company Tricyclic inhibitors of matrix metalloproteinases
US6207654B1 (en) * 1996-05-03 2001-03-27 Bashir Zikria Capillary membrane stabilization and reduction of inflammation during the course of chemotherapy or antiviral treatment through the use of biodegradable macromolecules and interleukin-2
AU5451598A (en) * 1996-11-22 1998-06-10 Regents Of The University Of California, The Transport of liposomes across the blood-brain barrier
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
DK1234043T3 (da) * 1999-12-02 2004-07-19 Health Prot Agency Konstruktion for afgivelse af terapeutiske midler til neuroceller
US7427598B2 (en) * 2000-05-31 2008-09-23 The United States Of Americas As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Post-natal administration of activity-dependent neurotrophic factor-derived polypeptides for enhancing learning and memory

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021769A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
WO1994014696A1 (en) 1992-12-18 1994-07-07 Hoover Universal, Inc. Container with integrally molded closure/tamper indicator

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050099545A (ko) 2005-10-13
US8613929B2 (en) 2013-12-24
CA2515603A1 (en) 2004-08-19
US8026209B2 (en) 2011-09-27
CA2515603C (en) 2016-06-07
JP2007528698A (ja) 2007-10-18
AU2004208962B2 (en) 2010-07-15
WO2004069870A2 (en) 2004-08-19
US20110274749A1 (en) 2011-11-10
WO2004069870B1 (en) 2005-07-28
US20080213179A1 (en) 2008-09-04
AU2004208962A1 (en) 2004-08-19
EP1592709A2 (en) 2005-11-09
WO2004069870A3 (en) 2004-12-02
MXPA05008487A (es) 2006-03-10
NZ541760A (en) 2008-09-26
JP5036302B2 (ja) 2012-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101228204B1 (ko) 염증성 상태 하에 있는 뇌-혈관 장벽에서 차등 발현되는핵산
CA2450073C (en) Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
JP5081361B2 (ja) Ｅｇ−ｖｅｇｆ核酸及びポリペプチド及び使用方法
EP1945240B1 (en) Compositions comprising receptor-associated protein (rap) variants specific for cr-containing proteins and uses thereof
AU2002322720A1 (en) Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
JP2010503710A5 (ko)
JP2006206587A (ja) 新規なポリペプチド及びそれをコードする核酸
KR20100015786A (ko) 환형의 수용체-연관된 단백질(ｒａｐ) 펩티드
JP2010518007A (ja) 髄鞘形成およびオリゴデンドロサイト分化を促進するためのセマフォリン６ａの使用
CN1788017B (zh) 炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸
JP2015536658A (ja) 標的化イズロン酸−２−スルファターゼ化合物
EP1947116B1 (en) Differentially expressed nucleic acids in the blood-brain barrier under inflammatory conditions
AU2007238587B2 (en) Compositions and methods for suppression of amyloid plaque formation associated with neurodegenerative disorders.
DE69936234T2 (de) Verfahren und Zusammenstzung zur Hemmung des Wachtums von neoplastischen Zellen
JPWO2003030936A1 (ja) 生活習慣病又は拒食症治療薬及びそのスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151104

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161129

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181205

Year of fee payment: 7