KR101221296B1 - 혈액 응고 측정 장치 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 혈액 응고 측정 장치 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 혈액 응고 측정 장치는 볼록한 나노 패턴으로 표면을 극대화한 구조체와 삼중 전극 시스템을 구비하여 기존의 일반 기판을 사용한 측정 장치 또는 이중 전극 시스템을 구비한 측정 장치와 비교할 때, 기판 표면의 혈액 응고 현상 감지 정도가 매우 현저한 특징을 갖는다.

Description

혈액 응고 측정 장치 및 그의 제조방법{Blood Coagulation Measuring Device and Method of Synthesizing the Same}

본 발명은 혈액 응고 측정 장치 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

심부정맥 혈전증이나 폐색전증, 인공판막이식 또는 심방세동 등 혈전에 의해 혈류의 흐름이 비정상적인 경우 항응고 치료를 받게 되는데 이러한 환자들은 복용하는 항응고제의 양을 지속적으로 조절 관리하여야 출혈이나 색전증이 일어나지 않는다. 이때 체내에서 혈액응고 과정이 정상적으로 유지되고 있는지 확인하기 위해 혈액응고 검사를 필수적으로 시행한다(1).

혈액응고 검사는, 수술 받는 환자의 출혈 감수성의 측정 및 혈액 응고를 예방하기 위한 항응고제 치료 환자의 모니터링 등 다양한 목적으로 실시할 수 있다. 다수의 응고 시험이 현재 사용되고 있으며, 이들 중 하나가 프로트롬빈 시간(PT) 시험이다. PT 시험은, PT 시험을 받는 혈액 샘플에 첨가된 트롬보플라스틴에 의한 외인성 응고 경로의 활성화에 의존한다. 외인성 응고 경로의 활성화는, 피브리노겐이 피브린으로 전환되는 것을 촉매하는 단백질분해 효소인 트롬빈의 생성을 유도한다.

트롬보플라스틴(TF)은 인자 VIIa와 함께 복합체를 형성하는 막 결합된 당단백질로서 인자 VIIa/TF 복합체는 혈액 응고 과정을 개시한다. 일단 형성되면, 인자 VIIa/TF 복합체는 응고 캐스케이드의 외인성 및 내인성 경로에 수반되는 일련의 특이 효소를 활성화시키고, 이는 궁극적으로 트롬빈의 형성, 피브린, 혈소판 활성화 및 마지막으로 응혈 형성을 유도한다.

통상적인 PT 시험은 환자의 혈액 응고 시스템의 기능장애 또는 결핍을 진단하기 위해 시험관내 환경 및 제어된 조건하에 상술된 일련의 효소적 반응을 이용한다. 응혈 형성이 발생하는 데 걸리는 시간은 프로트롬빈 시간 또는 PT 값으로 언급된다.

일반적으로 혈액응고 검사의 원리는 빛의 투과성을 이용하여 측정하는데, 액체인 환자의 혈장을 특정 검사시약과 혼합하면 혈장이 응고되어 빛의 투과력이 떨어지게 되므로 이 시점을 역학적으로 측정하게 된다(2). 그러나 기존 병원의 혈액응고 검사는 중앙검사실에 있는 대형 검사장비로 시행하므로 시간이 오래 걸리고, 반드시 병원에 내원해야하며 많은 양의 혈액이 필요하는 등의 불편 사항이 있었다.

특히, 종래의 측정 장치로는 의료 전문가에 의해서만 혈액 응고에 대한 분석이 가능하기 때문에, 대부분의 일반인들은 사용할 수가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈액 응고 시간을 보다 정확하면서도 간편하게 측정할 수 있는 장치의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과 극대화된 표면적을 갖는 기판과 삼전극 시스템을 구비한 전기화학적 측정 장치를 개발해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 혈액 응고 측정 장치 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 혈액 응고 측정 장치를 이용한 혈액 응고 시간 측정방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 볼록한(convex) 나노패턴이 형성된 수지 기판 및 (b) 상기 수지 기판 위에 위치하는 세 개의 전극을 포함하는 혈액 응고 측정 장치를 제공한다.

본 발명자들은 혈액 응고 시간을 보다 정확하면서도 간편하게 측정할 수 있는 장치의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과 극대화된 표면적을 갖는 기판과 삼전극 시스템을 구비한 전기화학적 측정 장치를 개발해냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 혈액 응고 측정 장치에서 사용되는 수지 기판(a)은 볼록한 나노패턴이 표면에 형성되어 그 표면적이 극대화된 것을 특징으로 한다.

나노패턴의 크기 및 모양은 균일 또는 불균일할 수 있으며, 미세한 엠보싱 구조를 형성하여 기판체 상부의 표면적을 극대화 할 수 있는 것이라면 그 모양 및 크기에 제한없이 사용될 수 있다. 상기 볼록한 나노패턴의 직경은 1 nm 내지 500 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 900 nm, 보다 바람직하게는 50 내지 300 nm일 수 있다. 나노 패턴의 직경이 지나치게 큰 경우 기판체 상부의 표면적을 극대화효과가 줄어들게 되므로 바람직하지 않다. 상기 나노패턴은 수 ㎛의 엠보싱 구조를 갖는 그레이 바운더리구조 또한 가질 수 있으며, 이 경우 나노패턴이 이중으로 형성되어 표면적 극대화 효과가 더욱 가중된다. 이 경우, 하기에서 상세하게 설명할 전극의 나노패턴과 함께 결합한다면 삼중 엠보싱 구조를 형성하게 되므로 기판 상부의 표면적 극대화 효과가 가장 드라마틱하게 나타나는 장점이 있다.

본 발명의 나노패턴 수지 기판의 재료로서 사용할 수 있는 수지는 전기 전도성이 없는 수지라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 흐름성, 성형성 및 전기적 특성이 우수한 수지를 사용하는 것이 바람직하며, 예컨대 염화비닐 수지, 비닐 아세테이트 수지, 메타크릴 수지, 불소 수지, 폴리우레탄 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리아마이드 수지, 폴리아세탈 수지, 폴리프로필렌 수지, 에폭시 수지, AS(Acrylonitrile styrene) 수지, ABS(Acrylonitrile-butadiene-styrene) 수지, HIPS(High impact polystyrene) 수지, SB(Styrene-butadiene) 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지 및 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 수지 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 혈액 응고 측정 장치에서 사용되는 세 개의 전극(b)은 상기 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판 위에 위치하며, 이는 기판의 표면에서 일어나는 혈액의 응고 현상을 전기화학적으로 측정하고자 하는 것이다. 상기 세 개의 전극(b)는 구체적으로 각각 작동전극(working electrode), 상대전극(counter electrode) 및 기준전극(reference electrode)로 구성될 수 있으며, 상기 기준전극은 작동전극에서 일어나는 모든 현상을 측정할 수 있다.

상기 세 개의 전극을 구성하는 물질로는 전류를 통과시킬 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 예컨대 철, 알루미늄, 니켈, 티타늄, 금, 은, 구리, 백금 등의 금속 또는 전도성 수지를 사용하는 것이 바람직하며 다만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직한 일 구현예에서, 상기 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판 위에 위치한 상기 세 개의 전극 또한 볼록한 나노 패턴을 가질 수 있으며, 이 경우 볼록한 나노패턴이 2중으로 형성되어 표면적 확장 효과가 극대화 될 수 있다. 상기 수지 기판이 수 ㎛의 엠보싱 구조를 갖는 그레이 바운더리 구조를 갖는 경우에는 3중 엠보싱 구조의 형성으로 기판 상부의 표면적이 극대화되어 혈액 응고 현상을 가장 정확하게 감지할 수 있는 장점이 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 수지 기판이 수 ㎛의 엠보싱 구조를 갖는 그레이 바운더리 구조를 가지며, 상기 수지 기판에 형성된 나노 패턴의 직경은 50 내지 900 nm이고, 상기 전극의 볼록한 나노 패턴의 직경은 0.1 내지 50 nm일 수 있다.

상기 전극은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 상기 기판의 표면위에 형성시킬 수 있으며, 바람직하게는 전자빔 증착, 진공 증착, 열증착, 스퍼터링, 저압 화학기상법, 졸-겔 합성법, 전기 도금 또는 무전해 도금법이고, 보다 바람직하게는 통상의 물리적 증착(physical evaporation) 방법으로서 열증착법(thermal evaporation), 스핀코팅(spin coating), 진공 증착 또는 스퍼터링(sputtering) 법을 이용하고, 가장 바람직하게는 진공 증착 또는 스퍼터링 법이다.

상기 진공 증착 또는 스퍼터링 법을 사용하는 경우 수지 기판위에 코팅되는 금속 입자의 크기를 손쉽게 조절할 수 있으며, 그 결과 상기 세 개의 전극 또한 나노 패턴을 가지도록 할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 상기 3개의 전극은 전도성 수지를 이용하여 형성시킨 ‘전극 연결부위’와 연결될 수 있으며, 이와 같은 전극 연결부위를 전도성 수지를 이용하여 형성시키는 이유는 스퍼터 등으로 제작한 전극을 집게로 연결하기는 어렵기 때문이다. 상기와 같이 전도성 수지로 형성된 전극 연결부위는 그 부분에 집게를 설치하여 전원에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “전도성 수지”란 전자기기의 패키징이나 어셈블리 분야 등 납땜으로는 접합할 수 없는 세라믹이나 플라스틱, 카본 등의 소재, 또는 납땜으로 접합할 경우 물성저하가 일어나는 현상을 피하기 위해 사용되는 전도성 접착제를 포함하는 저항이 거의 없는 수지를 의미하며 수지에 전도성을 부여하기 위한 재료를 배합한 것이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 전도성을 부여하는 재료로는 니켈, 구리, 카본 블랙, 복합재료, 합금, 은과 같은 전도성 필러가 가장 대표적이며, 귀금속 박막을 표면에 형성시킨 구상 입도의 필러를 사용할 수도 있다. 매트릭스로서는 열경화성 수지로서 에폭시 수지, 페놀수지, 실리콘수지, 폴리이미드수지 등을 사용할 수 있으며, 폴리에틸렌 수지, 폴리스티렌 수지와 같은 열가소성 수지를 사용할 수도 있다. 열가소성 수지를 사용할 경우에는 보수가 용이한 장점이 있다. 현재 실용적인 전도성 수지 재료로서는 전도성 접착제(ECA: 등방성 접착제), 이방전도성 필름(ACF: Anisotropic Conductive Film) 및 이방전도성 페이스트(ACP: Anisotropic Conductive Paste)가 있으며, 모두 유기고분자화합물을 매트릭스로 하여 전도성 미립자를 분산시킨 것이다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 전도성 수지로는 나일론 수지, 전도성 에폭시 수지, 전도성 실리콘 수지 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 전도성 에폭시 수지를 사용한다. 상기 전도성 에폭시는 수지폴리파라반산이나 비스말레이미드 수지와 혼용하거나 마이크로캡슐화 함으로써 작업성과 안정성을 개선할 수도 있다. 또한 상기 전도성 에폭시는 에폭시수지 중에 적어도 70%의 은분을 포함하며, 10-4 Ωcm의 전도성을 나타내는 것을 사용할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 혈액 응고 측정 장치는 상기 세 개의 전극(b)의 상부에 위치하는 (c) 건조된 PT 시약(dried prothrombin time reagent)을 추가적으로 포함한다. 이 경우, 장치에 미리 PT 시약을 건조시켜 놓음으로써 실제 혈액 응고 시간을 측정할 때 따로 전혈 또는 혈장에 PT 시약을 혼합할 필요가 없으므로 편리하고, 또한 적용되는 PT 시약의 양을 일정하게 유지할 수 있으므로 더욱 정확하게 PT 측정이 가능한 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “PT 시약”이란 외인성 응고 경로를 활성화시키는 트롬보플라스틴을 포함하는 액상의 제제를 의미하며, 트롬보플라스틴 제제의 액상 민감도는 국제 민감도 지수(ISI)를 사용하여 등급화된다. ISI 값은 주어진 트롬보플라스틴 로트로 수득한 프로트롬빈 시간 값에 대해 표준 참조 트롬보플라스틴 로트로 수득한 프로트롬빈 시간 값을 로그 눈금으로 플롯팅하여 수득할 수 있다. 주어진 트롬보플라스틴 로트의 ISI 값은 표준 참조 트롬보플라스틴 로트의 ISI를 곱하여 수득한 직선의 기울기이다. 보다 민감성의 트롬보플라스틴은 대략 1.0의 보다 낮은 ISI 값을 갖고, 덜 민감성의 트롬보플라스틴은 통상적으로 대략 2.0 내지 3.0의 보다 높은 ISI 값을 갖는다. PT 시험에 사용하기 위해서는 ISI가 대략 1.0인 고도의 민감성 PT 시약이 가장 유리하고 적합한 것으로 간주되는데, 이는 1.0의 ISI에서 국제 정상화 비율(INR)을 단순하고 정확하게 계산할 수 있기 때문이다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 INR의 사용이 민감도의 차이에 기인하는 트롬보플라스틴 편차를 상쇄할 수 있음을 인지할 것이다. INR은 다음과 같이 계산할 수 있다.

INR = (혈액샘플의 PT/평균 규정 PT)^ISI

상기 식에서 평균 규정 PT(MNPT)는 20명 이상의 정상 샘플 공여자로부터 수득 한 혈액 샘플의 평균 프로트롬빈 시간을 의미한다.

본 발명의 혈액 응고 측정 장치에 사용되는 PT 시약은 천연 또는 재조합 공급원으로부터의 PT, 천연 또는 합성 인지질, 칼슘 및 완충제 조성물을 사용하는 당업계에서 알려진 통상적인 방법에 의해 제조한 PT 시약을 사용할 수도 있고, 본원에서 전체가 참조로서 인용되는 미국 특허 제5,314,695호에 개시된 방법에 의해 제조된 것을 사용할 수도 있으며 또는 시중에서 판매되는 국제 표준 PT 시약을 상업적으로 구입하여 사용할 수도 있다.

바람직한 다른 구현예에서, 본 발명의 혈액 응고 측정 장치는 천공이 형성된 마스크(mask)를 추가적으로 포함하며, 상기 천공 형성 마스크는 상기 세 개의 전극(b)과 상기 건조된 PT 시약(c)의 사이에 위치하는 것을 특징으로 한다. 상기 마스크를 위치시키는 이유는 전기 화학적 반응이 동일한 면적에서만 일어날 수 있도록 하여, 측정시 재현성을 좋게 해준다. 상기 마스크 천공의 크기는 세 개의 전극을 모두 노출시킬 수 있는 정도의 크기이면 되고 그 크기 및 모양에 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 상기 마스크는 전기가 통하지 않고 접착성이 좋은 소수성의 물질을 사용하는 것이 바람직하며, 폴리머 테이프(캡톤 테이프)를 사용하여 혈소판 제거 혈장 또는 전혈이 반응 면적 이외의 부분으로 빠져나가지 않도록 하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 금속 기판을 양극산화시켜 금속 산화 피막을 형성하는 단계; (b) 상기 금속 산화 피막이 형성된 금속 기판으로부터 상기 금속 산화 피막을 제거하여 표면에 오목한 나노 형상이 형성된 금속 기판을 수득하는 단계; (c) 상기 오목한 나노 형상이 형성된 금속 기판에 수지를 도포하는 단계; (d) 상기 금속 기판을 제거하여 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판의 상부에 세 개의 전극을 형성시키는 단계를 포함하는 혈액 응고 측정 장치의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 혈액 응고 측정 장치의 제조방법은 상술한 혈액 응고 측정 장치를 제작하는 과정에 관한 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

혈액 응고 측정 장치를 제공하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과같다.

(a) 금속 산화 피막의 형성

본 발명의 방법에 따르면, 금속 기판을 양극 산화시켜 금속 산화 피막을 형성시킨다.

본 명세서에서 용어 “양극산화”는 전기분해 원리를 이용하여 금속 표면에 나노 다공성 산화막을 형성시키는 과정을 말하며, 예를 들면 전해질 용액에서 양극으로 금속 기판을 연결하고 음극으로 백금(Pt)전극을 연결하여 적정한 전압을 가하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 금속 기판은 전기 분해에 의해 금속 표면이 산화될 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 알루미늄, 아연, 철, 니켈, 티타늄, 주석, 납, 금, 은, 구리 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 양극산화는 당업계에 공지된 다양한 전해질 용액의 존재 하에서 실시될 수 있다.

(b) 오목한 형상이 형성된 금속 기판의 수득

상기에서 형성된 나노 다공성 금속 산화막의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시되며, 바람직하게는 수지를 도포하여 금속 산화 피막과 결합한 수지와 금속 기판과의 표면에너지 차이로 금속 산화피막과 결합된 수지를 분리하는 함으로써 실시될 수 있다. 상기에서 사용될 수 있는 수지의 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 수지의 흐름성 및 성형성이 우수한 것을 사용하는 것이 미세한 산화피막의 제거를 위하여 바람직하다.

상술한 바와 같이 금속 산화 피막을 제거하면, 표면에 오목한 형상이 형성된 금속 기판을 수득할 수 있다.

(c) 수지의 도포

상기와 같이 금속산화피막을 제거하고, 오목한 형상이 형성된 금속 기판에 수지를 도포하여 볼록한 나노패턴을 나타내는 수지 기판을 제조할 수 있다.

본 단계에서 사용할 수 있는 수지의 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 수지의 흐름성 및 성형성이 우수한 것을 사용하는 것이 미세한 나노패턴의 형성을 위해 바람직하며, 또한 전기적 특성이 우수한 수지를 사용하는 것이 바람직하다.

(d) 볼록한 면들의 미세패턴이 형성된 수지 기판의 수득

상기 수지 도포 후 금속 기판을 제거한다. 금속 기판의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 산화피막(나노튜브)을 제거한 금속 나노 패턴 위에 도포하여 굳어진 수지와 금속의 표면에너지 차이로 금속 기판을 제거할 수 있다. 본 발명의 방법에서 금속 기판을 제거하면, 상기 기판의 오목한 형상이 형성된 면에 도포된 수지 기판은 볼록한 면들의 미세패턴이 형성된다. 이렇게 볼록한 면들의 미세패턴을 형성함으로써 표면적을 극대화 시킬 수 있다.

(e) 수지 기판에 세 개의 금속 전극의 형성

금속 전극은 작동전극(working electrode), 상대전극(counter electrode) 및 기준전극(reference electrode)으로 구성될 수 있으며, 금속 전극을 형성하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 실시할 수 있으며, 바람직하게는 전자빔 증착, 진공 증착, 열증착, 스퍼터링, 저압 화학기상법, 졸-겔 합성법, 전기 도금 또는 무전해 도금법이고, 보다 바람직하게는 통상의 물리적 증착(physical evaporation) 방법으로서 열증착법(thermal evaporation), 스핀코팅(spin coating), 진공 증착 또는 스퍼터링(sputtering) 법을 이용하고, 가장 바람직하게는 진공 증착 또는 스퍼터링법이다.

바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈액 응고 측정 장치 제조 방법은 상기 단계(e) 이후에 (f) 상기 형성된 세 개의 전극 위에 PT 시약을 올려 건조시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 혈액 응고 측정 장치 제조 방법은 상기 방법은 상기 단계(e) 및 단계(f) 사이에 천공이 형성된 마스크(mask)를 상기 세 개의 전극 상부에 위치시키는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 (f) 단계는 상기 마스크의 천공면적 안에 상기 PT 시약을 올려 건조시키는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 혈액 응고 측정 장치위에 전혈시료 또는 혈장시료를 적용하는 단계; 및 (b) 상기 기판의 전압을 측정하는 단계를 포함하고, 전압값의 변동(fluctuation)이 시작되는 시점을 프로트롬빈 시간으로 결정하는 프로트롬빈 시간(prothrombin time) 측정 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “변동(fluctuation)”이란 일정하게 유지되던 값이 ± 5 % 이상 상하로 요동치는 것을 뜻하며, 이는 피의 굳어진 부분이 전류의 흐름에 따라 전극에 가까워졌다 멀어졌다를 반복하면서 전류의 흐름을 방해함에 따라 발생하는 현상에 의해 나타나는 그래프의 변화를 말한다. 상기 전압값의 변동은 본 명세서에 포함된 도면에서 명확하게 확인 할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 혈액 응고 측정 장치 및 그 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 혈액 응고 측정 장치는 볼록한 나노 패턴으로 표면을 극대화한 수지 기판과 삼중 전극 시스템을 구비하여 기존의 일반 기판을 사용한 측정 장치 또는 이중 전극 시스템을 구비한 측정 장치와 비교할 때, 기판 표면의 혈액 응고 현상 감지 정도가 매우 현저한 특징을 갖는다.

도 1은 실시예에서 제조한 나노 패턴화된 수지 기판체 및 삼전극 시스템을 구비한 혈액 응고 장치를 보여주는 사진이다.
도 2는 실시예에서 사용한 티타늄 양극산화법을 보여주는 모식도이다. 티타늄 금속 및 백금은 각각 양극 및 음극에 연결하며 전해질로는 0.25 wt% 불화암모늄 에틸렌글리콜을 사용하였다.
도 3은 실시예에서 양극산화법으로 제조한 티타늄 나노 튜브를 에폭시를 이용하여 티타늄 금속에서 분리시키는 것을 보여주는 모식도이다.
도 4는 실시예를 따라 양극산화법를 이용하여 제조된 나노 패턴화된 티타늄 기판체를 통해 나노 패턴화된 에폭시 기판체를 제조하는 방법을 보여준다.
도 5는 실시예에서 제조한 패턴화된 에폭시 기판체의 표면을 보여주는 원자현미경(Atomic Force Microscope, AFM) 사진이다. 금 입자를 코팅하지 않아 2중 엠보싱 구조를 보여주고 있다. 높이 40 nm 및 직경 100 nm의 패턴을 확인 할 수 있다.
도 6은 실시예에 따라 제조된 금입자가 코팅된 나노 패턴화된 티타늄 기판체 표면을 보여주는 전계방사형 주사전자현미경(FE-SEM) 사진이다.
도 7은 실시예를 따라 제조된 금입자가 코팅된 나노 패턴화된 티타늄 기판체의 3중 엠보싱 구조를 보여주는 모식도이다. 나노 패턴 에폭시의 2중 엠보싱구조와 금 입자를 코팅시켜서 전극을 형성 했을 때의 3중 엠보싱 구조를 보여준다.
도 8은 실시예를 따라 제조한 나노 패턴 에폭시 기판체의 전극형성 단면을 보여주는 모식도이다. 엠보싱구조의 형태와 전극을 형성하는 금 입자 부분, 전도성 에폭시 및 구리테이프를 포함하여 전극을 형성하는 단면을 보여준다.
도 9는 본 발명에 따라 작동전극 부분에서 반응이 일어나는 모습을 그림으로 표현한 그림이다. A부분은 혈장이 굳어지는 부분을 모사한 것이며, 전극에서 혈장이 굳어지는 시점은 그래프의 변화가 떨어진다. 그 이유는 2전극 시스템에서는 작동전극 부분과 상대전극 부분의 데이터를 조합하여 나오기 때문에 정확한 전극에서의 반응을 찾기는 어렵다. 하지만 3전극 시스템에서는 작동전극에서 일어나는 모든 반응을 측정함으로써 혈장이 굳어지는 모습을 정확하게 관찰 가능하다.
도 10은 2중 전극 시스템을 이용하여 혈소판 제거 혈장의 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT)을 측정한 결과 그래프이다. 점선부분은 종래 응고센서 전극(흑연전극)이다. 도 10에서 점선 그래프 중 180초에서 가장 높은 전압값을 가지는 그래프부터 각각 PT 시약 2, 1 및 3 ㎕를, 그리고 실선 그래프 중 가장 빨리 전압값을 변화를 보여주는 그래프로부터 PT 시약 1, 2 및 3 ㎕를 처리하였다.
도 11은 2중 전극 시스템을 이용하여 전혈의 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT)을 측정한 결과 그래프이다. 점선부분은 종래 응고센서 전극(흑연전극)이다. 또한, 도 11에서 점선 그래프 중 180초에서 가장 높은 전압값을 가지는 그래프부터 각각 PT 시약 5, 3 및 1 ㎕를, 그리고 실선 그래프 중 가장 빨리 전압값을 변화를 보여주는 그래프로부터 PT 시약 3, 5 및 1 ㎕를 처리하였다.
도 12는 3전극 시스템을 구비한 본 발명의 나노 패턴화된 수지 기판체를 이용하여 혈액 응고 측정을 실시하는 것을 보여주는 그래프로서 정전류 1 mA를 인가하여 저항값의 변화를 측정하였다. 혈장이 굳어지면서 그래프의 변화가 심하게 일어나는 것을 확인할 수 있다. 그래프의 변동(fluctuation)이 시작되는 부분, 즉 점선으로 표시한 부분이 프로트롬빈 시간이다.
도 13은 본 발명에서 시약 또는 standard calibration plasma를 측정한 결과의 그래프이다. 시약이 굳어지지 않는 부분을 그래프로 보여주고 있다.
도 14는 본 발명에 따라 PT 측정 결과를 비교한 그래프이다. 시약을 섞지 않고 reagent 또는 calibration plasma를 따로 측정한 결과의 비교 그래프이다. Reagent를 건조시켜 PT 측정을 한 결과와 많은 차이가 있는 모습이 관찰 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

혈액 응고 측정용 기판의 제조

1. 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판의 제조

아세톤(99.5%, 삼천)으로 타티늄 금속 기판(전극, 두께: 0.25 mm, 순도: 99.6%, 직경: 15 mm, goodfellow)을 초음파 세척기(POWER SONIC 505, 화신테크)에서 15분 동안 1차 세척한 다음, 3차 증류수(Human Power I+ Pure Water System, 휴먼파워, RO 0 ㎲/Cm, UP 18.3 ㏁ㆍCm)로 세정하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 티타늄 기판 및 반대전극(백금선, 두께: 0.2 mm, 순도: 99.9%, GOODS TOKEN)을 전해질(0.25 wt% 불화암모늄 에틸렌글리콜) 내에 설치하고, 반응이 원활히 진행되도록 전해질을 저어주면서, 2전극 시스템(Source Meter, Model 2400, Keithley)을 이용하여 40V 전압을 인가하여 실온에서 5시간 동안 양극산화 반응을 실시하였다. 이어, 세척수로 티타늄을 세척하여 자기 정렬된 티타늄 나노 튜브를 수득하였다.

상기 양극산화로 제조된 티타늄 나노 튜브의 상부에 에폭시(호마이카, 동일랩메이트, 에폭시:경화제=10:1)를 붓고 상기 에폭시가 응고 된 다음, 응고된 에폭시를 떼어냄으로써 산화물을 제거하였다.

상기와 같이 산화막을 제거하여 오목한(concave) 모양으로 나노 패턴된 티타늄 기판체 상부에 중량비 10 : 1로 혼합한 에폭시 및 경화제를 도포하였다. 이어, 티타늄 기판체와 에폭시 기판체를 분리하여 볼록한(convex) 모양으로 나노 패턴화된 에폭시 수지 기판체를 수득하였다.

2. 이중 전극 시스템 혈액 응고 측정용 기판의 제조

상기 1에서 제조한 나노 패턴 에폭시 위에 전도성 에폭시(DOTITE electroconductives, type D-500, 동일랩메이트)로 구리 테이프와 연결시킬 부분을 형성하였다. 이어, 금 입자 진공증착장비(sputter 및evaporator, Vacuum Device Inc, Vacuum Device Ion Coater System, Magnetron Sputter, MSP-1S)를 이용하여 40 mA의 전류를 가하면서, 상기 연결 부분에 목적하는 전극 모양으로 금(Au, 순도: 99.99%, 동일랩메이트)을 코팅하였다. 40 mA의 전류를 가한 이유는 10nm 크기의 금입자를 형성할 수 있어, 코팅되는 금의 크기를 조절하기 위해서이다. 이어, 전극이 생성된 나노 패턴 에폭시 기판체 상부의 전도성 에폭시 부분을 구리 테이프로 연결시켜, 나노 패턴된 에폭시 기판체에 두 개의 전극을 형성된 이중 전극 시스템 혈액 응고 측정용 기판을 제조하였다.

3. 삼중 전극 시스템 혈액응고 측정용 기판의 제조

상기 1에서 제조한 나노 패턴 에폭시 위에 마스크를 올려 전도성 에폭시(DOTITE electroconductives, type D-500)로 기준전극(reference electrode)을 형성하였다. 전도성 에폭시를 도포하고 마스크 윗부분에 올라온 전도성 에폭시를 제거하여 높이가 같은 전극을 형성하였다.

이어, 백금 입자 진공증착장비(sputter 및 evaporator, Vacuum Device Inc, Vacuum Device Ion Coater System, Magnetron Sputter, MSP-1S)를 이용하여 40 mA의 전류를 가하면서, 상기 연결 부분에 목적하는 전극 모양으로 백금(Pt, 순도:99.99%)을 코팅하여 작동전극(working electrode) 및 상대전극(counter electrode)를 제조하였다. 40 mA의 전류를 가한 이유는 10nm 크기의 백금입자를 형성할 수 있어, 코팅되는 백금의 크기를 조절하기 위해서이다.

이어, 전극이 생성된 나노 패턴 에폭시 수지 기판체 상부의 전극 3부분 모두를 전도성 에폭시로 전극을 연결하는 부분을 형성하였다. 전도성 에폭시로 연결부분을 만드는 이유는, 입자 진공증착장비로 제작한 전극을 집게로 연결하기는 어렵기 때문에 저항값이 거의 없는 전도성 에폭시로 집게 연결부분을 제작하기 위해서이다.

시약을 동일한 면적안에 건조시키기 위해서 직경 8mm의 천공이 형성된 마스크(폴리머 테이프)를 제작하고, 나노 패턴 에폭시 기판체 위에 마스크를 형성시켰다. 그 다음, 직경 8mm의 마스크 천공 면적 내에 PT 시약(Hemosil^TM PT-Fibrinogen HS, Instrumentation Laboratory, U.S.A) 10㎕를 넣고 건조기(sanpla dry keeper, Sanplatec Corpolation)를 사용하여 습도 17%를 유지하여 3시간 이상 건조시켜 삼중 전극 및 건조된 PT용액을 포함하는 혈액 응고 측정용 기판을 제조하였다.

전기화학적 검출을 이용한 혈액 응고 시간 측정

1. 이중 전극 시스템 기판을 이용한 혈액 응고 시간 측정

상기에서 제조한 이중 전극이 형성된 나노 패턴 에폭시 기판체 상부의 패턴화된 부분에 프로트롬빈 시간(prothormbin time) 시약(Hemosil^TM PT-Fibrinogen HS, Instrumentation Laboratory, U.S.A)이 포함된 혈소판 제거 혈장(platelet poor plasma, PPP) 또는 전혈(whole blood, WB)을 떨어뜨렸다. PT 시약은 혈소판 제거 혈장(PPP)의 PT를 측정하는 경우 PPP 20 ㎕ 당 1-3 ㎕ 그리고 전혈(WB)의 PT 측정하는 경우 WB 20 ㎕ 당 1-5 ㎕의 양으로 첨가하였다. 정전류 공급 장비(POTENTIOSTAT GALVANOSTAT AUTOLAB)를 이용하여 인가되는 정전류 0.01 mA를 공급하고, GPES(General Purpose Electrochemical System) 버전 4.9 프로그램을 이용하여 검출되는 전압값 변화를 통해 혈소판 제거 혈장 또는 전혈이 굳어지는 현상을 관찰하고 그 결과를 각각 도 10 및 도 11에 나타내었다.

정전류를 흘려주면 처음에는 전압값이 일정하다가 표면에서 PPP 또는 WB가 응고되는 경우 전류의 흐름에 방해가 되므로 표면의 저항값이 증가하게 되고, 이렇게 증가된 저항값을 장비가 인식하면서 정전류를 보정하여 전압값이 증가하게 된다.

도 10 및 도 11을 보면, 2 전극 시스템을 구비한 상기 혈액 응고 측정용 기판을 사용한 경우에는 일정 시간 후 그래프가 변화하였으나, 종래 응고센서 기판(흑연전극)에서는 그래프가 변하는 모습을 관찰 할 수 없었다. 이는 본 발명의 혈액 응고 측정용 기판의 경우 볼록한 나노 패턴이 형성된 에폭시 수지 기판 위에 다시 볼록한 나노 패턴을 가진 전극을 형성시켜 나노 패턴으로 표면이 극대화되어 표면에서 일어나는 아주 미세한 변화를 감지해 낼 수 있었기 때문이다. 그러나 종래 응고센서 기판(흑연전극)의 경우는 혈액이 응고되는 변화를 전혀 감지해 내지 못했다.

다만, 도 10 및 도 11에서 볼 수 있듯이 이중 전극 시스템의 경우도 그래프가 일정 시점에서 한번 변화한 후로는 일정한 값을 보여 거의 변화를 감지해내지 못하였다.

2. 삼중 전극 시스템 기판을 이용한 혈액 응고 시간 측정

상기에서 제조한 삼중 전극이 형성된 나노 패턴 에폭시 기판체 상부에 위치한 패턴화된 부분의 PT 시약이 건조된 곳에 혈장(standard calibration plasma, Instrumentation Laboratory, U.S.A)을 떨어뜨렸다. 정전류 공급 장비(POTENTIOSTAT GALVANOSTAT AUTOLAB)를 이용하여 인가되는 정전류 1 mA를 공급하고, GPES(General Purpose Electrochemical System) 버전 4.9 프로그램을 이용하여 검출되는 전압값 변화를 통해 혈장이 굳어지는 현상을 관찰하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서 확인할 수 있듯이, 처음에 정전류 1 mA를 흘려주었을 때에는 전류가 흐르다가, 혈장이 응고되면서 전류의 흐름을 방해하게 되면, 혈장이 굳어진 부분(A)이 전극에 형성되면서 저항값이 올라가게 된다. 하지만 굳어진 혈장(A)이 다시 전극에서 떨어지면서 저항값은 낮아지게 된다. 실험 결과 이와 같은 부분이 계속 반복되면서 그래프의 변화가 심하게 일어났다. 그래프의 변화가 심하게 일어나는 부분을 측정하면서 혈장이 굳어지는 부분을 측정 가능하였다. 반면에, 시약 또는 혈장만 가지고 PT 측정을 측정하였을 경우에는 그래프의 변화가 일어나지 않았다(도 13).

이중 전극 시스템을 사용한 경우에는 그래프가 일정 시점에서 한번 변화한 후로는 거의 변화가 없었던 반면(도 10 및 도 11), 삼중 전극 시스템을 사용하자 그래프의 변화가 매우 심하게 일어났다(도 12). 이는 이중 전극 시스템과 달리 기판에서 일어나는 모든 반응을 정확하게 읽어냈기 때문이다. 이렇게 정확하게 표면의 반응을 읽을 수 있는 것은 표면적을 극대화한 나노 패턴 수지 기판과 삼중 전극 시스템이 결합하였기 때문이다. 본 발명의 나노 패턴 수지 기판의 경우 기존의 다른 기판과 달리 나노 패턴으로 인해 표면적이 매우 넓지만, 엄밀하게는 평평한 면이 아니기 때문에, 작동전극과 기준전극에서 일어나는 부분을 그래프로 보여주는 기존의 단순한 이중 전극 시스템으로는 표면에서 일어나는 세밀한 응고 현상을 정확히 감지하기기 어렵다. 반면 삼중 전극 시스템은 작동전극(working electrode)에서 일어나는 모든 것을 기준전극(refenrence electroder)이 측정하기 때문에 울퉁불퉁한 표면 상태의 미세한 변화를 측정하는 데 매우 적합하다. 결국 이렇게 정확한 그래프를 얻는 것이 가능한 것은 볼록한 나노 패턴으로 표면을 극대화한 구조체와 삼중 전극 시스템의 조합이 빚어낸 상승효과이다.

참고문헌

1. Kovacs M, Cruickshank M, Wells PS. et al. Randomized assessment of a warfarin nomogram for initial oral anticoagulation after venous thromboembolic disease. Haemostasis., 28:628(1999).

2. Rossi E, Mondonico P, Lombardi A, Preda L. Method for the determination of functional (clottable) fibrinogen by the new family of ACL coagulometers. Thromb . Res. 52:453-468(1988).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. (a) 볼록한(convex) 나노패턴이 형성된 수지 기판 및 (b) 상기 수지 기판 위에 위치하는 세 개의 전극을 포함하는 혈액 응고 측정 장치에서, 상기 전극 또한 볼록한 나노 패턴을 가지며 그 결과 볼록한 나노패턴이 2중으로 형성되는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 혈액 응고 측정 장치는 상기 세 개의 전극(b)의 상부에 위치하는 (c) 건조된 PT 시약(dried prothrombin time reagent)을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 혈액 응고 측정 장치는 천공이 형성된 마스크(mask)를 추가적으로 포함하며, 상기 천공 형성 마스크는 상기 세 개의 전극(b)과 상기 건조된 PT 시약(c)의 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 수지는 염화비닐 수지, 비닐 아세테이트 수지, 메타크릴 수지, 불소 수지, 폴리우레탄 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리아마이드 수지, 폴리아세탈 수지, 폴리프로필렌 수지, 에폭시 수지, AS(Acrylonitrile styrene) 수지, ABS(Acrylonitrile-butadiene-styrene) 수지, HIPS(High impact polystyrene) 수지, SB(Styrene-butadiene) 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지 및 폴리트리메틸렌테레프탈레이트 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 수지 기판에 형성된 나노 패턴의 직경은 50 내지 900 nm이며, 상기 전극의 볼록한 나노 패턴의 직경은 0.1 내지 50 nm인 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 전극은 금, 은, 구리, 백금 또는 전도성 수지인 것을 특징으로 하는 혈액 응고 측정 장치.
   
8. 다음의 단계를 포함하는 혈액 응고 측정 장치의 제조방법:
   (a) 금속 기판을 양극산화시켜 금속 산화 피막을 형성하는 단계;
   (b) 상기 금속 산화 피막이 형성된 금속 기판으로부터 상기 금속 산화 피막을 제거하여 표면에 오목한 나노 형상이 형성된 금속 기판을 수득하는 단계;
   (c) 상기 오목한 나노 형상이 형성된 금속 기판에 수지를 도포하는 단계;
   (d) 상기 금속 기판을 제거하여 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판을 수득하는 단계; 및
   (e) 상기 볼록한 나노 패턴이 형성된 수지 기판의 상부에 볼록한 나노 패턴을 가지는 세 개의 전극을 형성시키는 단계.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계(e) 이후에 (f) 상기 형성된 볼록한 나노 패턴을 가지는 세 개의 전극 위에 PT 시약을 올려 건조시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계(e) 및 단계(f) 사이에 천공이 형성된 마스크(mask)를 상기 세 개의 전극 상부에 위치시키는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 (f) 단계는 상기 마스크의 천공면적 안에 상기 PT 시약을 올려 건조시키는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 다음의 단계를 포함하는 프로트롬빈 시간(prothrombin time) 측정 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 혈액 응고 측정 장치위에 전혈시료 또는 혈장시료를 적용하는 단계; 및
    (b) 상기 기판의 전압을 측정하는 단계, 전압값의 변동(fluctuation)이 시작되는 시점을 프로트롬빈 시간으로 결정한다.

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