KR101209850B1 - 이소티아졸론 화합물이 함유된 조성물의 유전독성 억제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이소티아졸론 화합물의 유전독성 억제방법으로서, 생물체에 돌연변이를 유발시킬 수 있는 유전독성 원인물질을 물리적 방법으로 변형시켜 이소티아졸론 화합물을 함유하는 조성물의 유전독성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 보다, 상세하게는 이소티아졸론에 사이클로덱스트린 및 용매를 가온하면서 교반시키고, 상기 이소티아졸론을 포함하는 혼합물을 냉각하는 단계를 거침으로서 이소티아졸론 화합물의 유전독성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
이소티아졸론, 안정화제, 사이클로덱스트린, 유전독성, 복귀돌연변이.
Description
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 이소티아졸론 화합물이 함유된 조성물의 유전독성 억제방법 및 상기 방법으로 제조된 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 이소티아졸론 용액의 사용 또는 환경노출 기간 동안 발생할 수 있는 생물체에 대한 유전독성 발현을 방지하기 위하여 이소티아졸론 용액에 사이클로덱스트린을 이용하여 변이원성 물질의 입체구조를 변화시키는 방법으로 이소티아졸론 화합물의 살균력은 유지하면서 유전독성을 억제한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
3-이소티아졸론은 개인위생용품 방부제로부터 공업용 수처리제 까지 산업분야 전반적으로 미생물에 의한 제품의 부패 및 공정 상의 문제를 방지하는데 사용되는 산업용 살균제이다. 지금까지 상용화된 대부분의 3-이소티아졸론 제품은 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 과 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 4,5-디클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 실질적인 혼합물상태로 존재하고 있다. 이 제품에 함유된 기술이 발달하고 화학물질의 환경과 생물에 대한 영향 평가의 기술이 발달 함에 따라 생물체의 유전과정에서 돌연변이를 유발시킬수 있는 유전독성이 화학물질의 독성 및 안전성 평가에 중요한 판단 기준이 되었다. 수용액에서 이 제품들은 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 의 화학적 불안정성을 극복하기 위해 금속질산염을 안정화제로 사용하고 있으며 이 안정화제에 대한 기술은 미국특허 US 3,807,795에 기술되어 있다.
또 안정화제 없는 무수물 상태에서 이소티아졸온 조성물에 대한 기술은 KR 96-3924에 상세하게 기술되어 있으며 미국특허 US 5,670,529 및 대한민국 특허공개공보 제 1997-0000034호에는 3-이소티아졸론 및 금속질산의 배합물에 Cu2 + 염을 ppm수준으로 첨가하여 화학적 안정성을 유지 하기도 한다. 한편 화학적으로 불안정한 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온이 생성되지 않는 제조방법으로 화학적 안정성을 유지하려는 기술은 대한민국 특허출원번호 1991-0007541호에서 제시되었는데, 이는 불순물인 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온을 제거하는데 한계가 있으며, 미국특허등록번호 제5466818호에서는 컬럼을 사용하여 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온을 분리할수 있다고 기술되어 있다. 상기의 기술들에서 제시된 방법은 불순물로 함유되는 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 잔류농도는 줄일 수 있으나 선택성에서 효과적이지 못하며 상용화 시킬 수 없었다. 또한, 대한민국 특허공개공보 제2001-0103525호는 이소티아졸론에 사이클로덱스트린을 첨가하여 이소티아졸론 화합물의 살균력은 유지하면서 침전물의 형성을 감소 또는 방지할 수 있는 방법 및 그 조성물에 관한 것으로, 이소티아졸론 혼합물의 유전독성을 억제하는 제조방법은 밝힌 바 없다. 대한민국 등록특허 제0383098호의 이소티아졸론 침전 방지를 안정화 방법인데, 이는 사이클로덱스트린 첨가에 의한 점도증가와 물의 활동도 감소로 침전형성을 방지하는 방법으로 이소티아졸론 및 사이클로덱스트린의 혼합형태는 가역적인 형태로 이루어진 제조방법에 관한 것이다.
지금까지 상용화된 대부분의 3-이소티아졸론 제품은 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 과 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 4,5-디클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온의 실질적인 혼합물 상태로 존재하고 있다. 화학물질의 환경과 생물에 대한 영향 평가의 기술이 발달 함에 따라 생물체의 유전과정에서 돌연변이를 유발시킬 수 있는 유전독성이 화학물질의 독성 및 안전성 평가에 중요한 판단 기준이 되었다. 그래서 지금까지 이소티아졸론 조성물은 유전독성 유발물질로 알려지고 있다.
유전독성을 확인하기 위한 복귀돌연변이시험은 하나 또는 몇 개의 DNA염기쌍의 치환, 첨가 그리고 결실을 포함하는 점돌연변이를 검색하기 위해 아미노산 요구성 균주인 살모넬라균과 대장균을 이용한다. 점돌연변이(point mutation)는 유전적 질병의 원인이 되며, 암유전자와 체세포의 암억제 유전자에 존재하는 점돌연변이는 암 형성에 관여하고 있다는 많은 증거가 있다.
복귀돌연변이시험은 주로 유전독성적인 활성 또는 점돌연변이를 유발하는 활성에 대한 초기검색에 사용되어 진다.
상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명의 목적은 이소티아졸린 및 사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물을 교반하면서 가열하고, 추후 혼합물을 냉각함으로서 사이클로덱스트린이 이소티아졸린을 선택적으로 포접함으로써 돌연변이원으로 작용하여 유전독성을 발현하지 못하도록 억제시킨 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 혼합하고; 상기 혼합물을 50 내지 100℃의 온도로 가온하고; 상기 가온된 혼합물을 1 내지 3 시간 동안 교반하고; 및 상기 교반된 혼합물을 영하 10 내지 0℃로 냉각하는 단계를 포함하는 이소티아졸론 화합물의 유전독성 억제방법으로서, 상기 이소티아졸론 화합물은 하기 화학식 1로 표기되는 것인 이소티아졸론 화합물을 함유하는 조성물에서의 이소티아졸론 화합물의 유전독성 억제방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 수소원자, 할로겐원자, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 고리화된 아릴기이고,
R3는 수소원자, C1 내지 C18의 알킬기, C2 내지 C18의 알케닐기, C2 내지 C18의 알키닐기, 3 내지 8각 고리를 갖는 C3 내지 C12의 시클로알킬기, C10 내지 C24의 아랄킬기, 또는 C10 내지 C24의 아릴기이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 이소티아졸론 화합물의 유전독성을 제거하기 위하여 안정화제 및 용매를 포함하는 이소티아졸론 용액의 조성물을 연구하던 중 유전독성의 원인물질이 할로겐화된 이소티아졸론 분해산물임을 알 수 있었고, 여러 종류의 할로겐화된 이소티아졸론의 분해물이 생성되기 전단계에서 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온을 사이클로덱스트린류로 입체구조복합체를 형성시키는 경우, 제조된 상기 용액이 미생물에 돌연변이를 유발하는 물질의 방출이 억제되어 조성물의 유전독성이 방지됨을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 이소티아졸론 화합물을 함유하는 조성물의 유전독성 억제방법은 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 혼합하여 가열하면서 교반하는 단계 및, 냉각하는 단계를 포함하는 유전독성 억제용 이소티아졸론 용액의 제조방법으로서, 상기 이소티아졸론 화합물은 하기 화학식 1로 표기되는 것인 이소티아졸론 화합물이다. 보다 상세하게는 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 혼합하고; 상기 혼합물을 50 내지 100℃의 온도로 가온하고; 상기 온도로 가온된 혼합물을 1 내지 3 시간동안 교반하며; 및 상기 교반된 혼합물을 영하 10 내지 0℃로 냉각하는 단계를 포함하는 이소티아졸론 화합물의 유전독성을 억제하는 방법에 대한 것이다. 상기 교반시간이 1 시간 이하인 경우는 사이클로덱스트린의 이소티아졸론 화합물의 포접 효율이 떨어지며, 3시간 이상인 경우는 경제적으로 효율적이지 못하다.
바람직하기로는 상기 화학식 1로 표기되는 이소티아졸론 화합물은 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 4,5-디클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 5-클로로-2-n-옥틸-4-이소티아졸린-3-온, 4,5-디클로로-2-n-옥틸-4-이소티아졸린-3-온, 벤조이소티아졸린-3-온, 5-클로로-2-메틸-3-이소티아졸론, 2-메틸-3-이소티아조론, 2-옥틸-3-이소티아졸론, 4,5-디클로로-2-시클로헥실-3-이소티아졸론 및 4,5-디클로로-2-옥틸-3-이소티아졸론으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 혼합물일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이소티아졸론 화합물이 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온, 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 및 벤조이소티아졸론의 혼합물일 수 있다. 상기 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린-3-온 및 2-메틸-4-이소티아졸린-3-온은 살균력을 상승시키는 효과가 있으나 유전독성을 나타낸다. 반면, 벤조이소티아졸론은 유전독성의 유발이 없는 물질로 살균력의 상승효과를 나타낸다. 따라서, 상기와 같이 이소티아졸론 화합물류를 혼합하여 사용함으로써 유전독성의 발현정도를 낮추고 살균력의 상승효과를 나타낼 수 있다. 이 경우, 유전독성은 사이클로덱스트린의 혼합과 가온 및 냉각처리에 의하여 이소티아졸론을 포접함으로서 억제시킬 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 이소티아졸론 화합물은 전체 이소티아졸론 용액 조성 물에 대하여 0.5 내지 50중량% 로 포함될 수 있다. 0.5중량% 이하인 경우는 이소티아졸론의 효과를 발휘하지 아니하므로 상용화 하기에 경제적으로 불리하며, 50중량% 이상인 경우는 최종 조성물의 안정성에 불리한 영향을 미칠 수 있다.
또한 본 발명에 사용되는 사이클로덱스트린은 글루코스가 환상으로 결합된 구조를 갖는 화합물로 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린 및 감마-사이클로덱스트린의 3가지 종류가 있으며, 이들 3종류의 사이클로덱스트린은 단독으로 사용하거나 2종류 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 베타-사이클로덱스트린을 단독으로 사용할 수 있다.
상기 사이클로덱스트린류의 첨가량은 전체 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 0.01 내지 50 중량%를 사용하는 것이 좋으며, 바람직하기로는 상기 사이클로덱스트린의 사용량이 0.5 내지 10 중량%인 것이 좋다. 0.01 중량% 이하인 경우는 유전독성 제거효능을 발휘하지 못할 수 있고, 50 중량% 이상인 경우는 조성물 점도가 증가하여 사용상 불편할 수 있다.
본 발명에 사용되는 용매는 상기 이소티아졸론 화합물 및 사이클로덱스트린을 효과적으로 분산시킬 수 있는 용매라면 통상적인 용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 용매가 물, 황산, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 1,5-펜탄디올, 2,4-펜탄디올, 벤질알콜 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혼합물인 것이 좋으며, 더욱 바람직하기로는 상기 용매가 물인 것이 좋다.
이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매는 통상적으로 상온상에서 교반하여 혼합물을 얻는 방법이 사용되는 것과 달리, 본 발명에서는 교반단계 전 상기 혼합물에 50 내지 100℃로 가온하는 전단계를 거친다. 상기 혼합물에 상기의 온도로 가온하는 경우, 사이클로덱스트린이 이소티아졸린 화합물을 포접하기 위한 복합체를 형성할 수 있게 된다. 50℃이하로 가온하는 경우는 사이클로덱스트린의 클로로이소티아졸린 복합체 형성시 필요한 에너지 상태에 이르지 못하게 되므로, 사이크로덱스트린이 이소티아졸린 화합물에 대하여 입체구조적 포집을 이루지 못하고 표면에 흡착되는 것에 그칠 수 있으므로, 유전독성이 억제되지 못할 염려가 있고, 100℃ 이상으로 가온하는 경우는 포접 과정상 클로로이소티아졸린의 활성성분 파괴가 발생되어 조성물이 불안정하게 될 수 있다.
상기의 가온된 이소티아졸린 화합물 함유 조성물은 1 내지 3 시간동안 교반하는 단계를 거친다. 상기 교반시 교반력에 의한 운동에너지는 온도를 높이는 경우 열에너지에 의한 이소티아졸린류의 유효성분 파괴를 최소화 할 수 있고, 사이클로덱스트린에 물리적으로 전단력을 제공하여 효율적으로 입체구조를 형성하도록 도움을 주므로 이소티아졸린 화합물의 유전독성이 억제될 수 있다. 본 단계에서의 이소티아졸린 화합물 함유 조성물은 물리적 힘을 가하기 위하여 고속교반기를 분당 2000rpm 내지 20000rpm 으로 교반시킨다. 상기 교반속도가 2000rpm 이하인 경우는 에너지가 불충분하여 이소티아졸린 화합물의 일부가 포접이 안 될 수 있으며, 20000rpm 이상인 경우는 기기 및 운전상 경제적으로 불리할 수 있다. 상기 가온조건을 유지하면서 교반하는 단계를 거치는 경우, 이소티아졸론과 사이클로덱스트린은 입체적 복합체를 형성하지만, 상기 입체적 복합체는 형성과 해리가 모두 용이한 물리적인 여기된 상태로 이를 사용하는 경우는 가역적으로 재용출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 혼합물은 상기의 교반단계를 거친 후, 영하 10 ℃내지 0℃로 5시간 내지 10시간 동안 서서히 점진적으로 냉각시키는 단계가 수행된다. 상기로 가온상태에서 교반시 입체적으로 포접된 사이클로덱스트린-이소티아졸론 화합물의 구조가 열역학적 가장 안정화된 복합체로 형성되는 과정이 필요하다. 이는 점차적인 미약한 발열 과정에 의하여 진행되며, 그 결과 이소티아졸론과 사이클로덱스트린의 입체 구조적으로 가장 안정한 형태로 화학 결합을 하게 된다. 이 과정이 충분치 못하면 포접된 이소티아졸론의 재용출이 발생될 우려가 있으며, 이로 인해 이소티아졸론 화합물의 유전독성이 유발될 수 있다. 점차적으로 냉각하는 단계를 거치는 경우, 상기 냉각온도가 영하 10℃ 이하인 경우는 조성물의 운동에너지 부족으로 복합체가 형성되기 전 각각의 사이클로덱스트린 및 이소티아졸론 화합물 자체가 동결될 수 있으며, 0℃ 이상인 경우는 사이클로덱스트린-이소티아졸론 화합물 복합체의 포접 효과가 줄어들 수 있다. 이러한 냉각단계에서 이소티아졸론과 사이클로덱스트린 사이에 많은 수소결합이 형성되어 열역학적으로 최적의 안정화된 복합체의 형태를 이루어, 비가역적 결합이 형성된다.
상기 가온 및 교반, 냉각단계를 거치는 동안 하기 화학식 2로 대표되는 사이클로덱스트린은 이소티아졸론 화합물을 선택적으로 포접하여 입체적 구조상 복합체를 형성하게 되며, 그 결과 형성된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물은 동일 미생물 농도에서 처리시 유전독성 발현이 억제되는 효과를 제공하게 된다.
[화학식 2]베타사이클로덱스트린류
이와 같은 가온, 교반 및 냉각은 상기 온도 범위에서 1회 이상 반복할 수 있다.
본 발명의 조성물 제조방법에는 상기 조성물에 안정화제를 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 사이클로덱스트린 포접과 무관하게 통상적으로 안정화제로 사용되는 물질들이 적용될 수 있다. 바람직하게는 상기 안정화제로 질산염 또는 황산을 사용하는 것이 좋으며, 황산을 안정화제로 사용할 경우는 제조되는 이소티아졸론 용액이 높은 농도의 이소티아졸론 화합물을 함유할 수 있고, 금속염을 함유하는 것을 근본적으로 차단할 수 있어서 더욱 좋다.
질산염 또는 황산을 안정화제로 사용할 경우 황산의 사용량은 상기 이소티아졸론 화합물에 대하여 0.01 내지 10 중량%의 황산을 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 상기 이소티아졸론 화합물 1 중량부에 대하여 0.1 내지 5 중량%가 좋다. 0.01 중량% 이하로 함유되는 경우는 안정제의 역할을 할 수 없고, 5 중량% 이상인 경우는 산도 문제로 제품 사용에 제약이 따른다
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린, 용매 및 임의적으로 안정화제를 포함하는 것인 유전독성이 억제된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 조성물의 유전독성 억제 효능은 이소티아졸론 화합물 함유 혼합물은 본 발명의 제조방법에 따라 가온된 상태에서 교반하고, 그 후 냉각시키는 단계를 거침에 의하여 사이클로덱스트린이 이소티아졸론을 포접함으로서 제공되어 진다. 상기와 같은 본 발명에 따른 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 유효량을 미생물에 의해 오염되었거나, 오염되기 쉬운 분야에 적용시 우수한 항균력을 나타내고, 환경 중 유전독성의 우려가 없다는 장점을 가지고 있다.
즉 상기 이소티아졸론 조성물은 살균제, 위생제, 청정제, 탈취제, 액체 및 가루비누, 오일 및 그리이스 제거제, 음식처리용 화학제품, 일용화학제품, 석유제조시, 종이처리시, 제지공장 슬라임 방지제, 석유산물, 접착제, 섬유, 안료슬러리, 라텍스, 가죽 및 피혁처리, 석유연료, 장소, 호재, 고무, 제당, 담배, 수영장, 화 장품, 화장실용품, 풀, 플라스틱, 카드보오드, 의약품, 화학적화장치, 가정세탁물, 디젤연료첨가제, 왁스, 코오크, 윤활제, 건축용품, 콘크리이트 배합제 또는 광택제에 투입되거나 또는 상기 형태로 제조될 수 있으며, 박테리아 및/또는 곰팡이 및/또는 조류에 의한 오염 가능성이 있거나 오염된 영역 및 기타 바람직하지 않은 미생물이 성장할 수 있는 환경과 접촉하는 유기물 및 수분이 있는 영역 어디에나 사용이 가능하다.
하기 실시예를 들어 본 발명은 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 제한되는 의도는 아니다.
실시예
1:
이소티아졸론
용액의 제조
3-이소티아졸론의 유전독성 억제 효과를 실험을 하기 위하여 물을 용매로 사용하고, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온이 3 : 1의 비율로 혼합된 혼합물의 1.5 중량% 용액을 비이커에 취하여 온도계를 장착하고 고체상분말 베타-사이클로덱스트린 2 중량% 투입한 후, 온도를 80℃로 유지 시키며 고속 교반기로 분당 5000 rpm으로 30분간 고속 교반하였다. 이 용액을 0℃ 이하로 급속 냉각하여 1시간 정치시킨 후 상온에서 보관한다.
실시예
2:
이소티아졸론
용액의 제조
3-이소티아졸론의 유전독성 억제 효과 실험을 하기 위하여 물을 용매로 사용하고, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온이 0.1 : 100 의 비율로 혼합된 혼합물 50 중량% 용액을 비이커에 취하여 온도계를 장착하 고, 고체상 분말 베타-사이클로덱스트린 0.2중량% 투입한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 실험 하였다.
실시예
3:
이소티아졸론
화합물 함유 혼합물의 제조
3-이소티아졸론의 유전독성 억제 효과를 실험을 하기 위하여 물을 용매로 사용하고, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온 및 벤즈이소티아졸론(BIT) 이 0.1 : 100: 100 의 비율로 혼합된 혼합물 10 중량% 용액을 비이커에 취하여 온도계를 장착하고, 고체상분말 베타-사이클로덱스트린 0.04 중량% 투입한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실험 하였다.
비교예
1:
이소티아졸론
용액의 제조
실시예1에서 조성물과 동일한 조건에서 사이클로덱스트린 포접후의 유전독성 억제효과를 비교 하기 위하여 물을 용매로 사용하고,, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온이 3 : 1의 비율로 혼합된 혼합물 1.5 중량% 용액을 비이커에 취하여 온도계를 장착하고 온도를 80℃로 유지시키며, 고속 교반기로 분당 5000 rpm으로 30분간 고속 교반하였다. 이 용액을 0℃ 이하로 급속 냉동하여 1시간 정치 시킨후 상온에서 보관한다. 이 용액을 유전독성 측정용 농도로 희석하여 하기 절차에 따라 비교 표준물질과 함께 독성 발현을 관찰하고 평가 하였다. 그 결과를 표 2 에 나타내었다.
비교예
2:
이소티아졸론
용액의 제조
실시예 2 에서 조성물과 동일한 조건에서 사이클로덱스트린 포접후의 유전독성 억제효과를 비교 하기 위하여 물을 용매로 사용하고, 5-클로로-2-메틸-4-이소 티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온이 0.1 : 100 의 비율로 혼합된 혼합물 50 중량% 용액을 비이커에 취한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 조건으로 실험하였다.
비교예
3:
이소티아졸론
용액의 제조
실시예 3 에서 조성물과 동일한 조건에서 사이클로덱스트린 포접후의 유전독성 억제효과를 비교 하기 위하여 물을 용매로 사용하고, 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온과 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온 및 벤즈이소티아졸론(BIT) 이 0.1 : 100: 100 의 비율로 혼합된 혼합물 10 중량% 용액을 비이커에 취한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 실험 하였다.
실험예
1:
이소티아졸론
용액의
살모넬라균에서의
유전독성
억제활성
1-1:
시험균의
전처리
본 실험에서는 히스티딘 요구성 살모넬라 티피무리움 TA98, TA100, TA1535, 및 TA1537 균주(구입처:Molecular Toxicology, Inc., USA)를 각각 배양액 15㎖에 무균조작으로 접종하고, 진탕배양기를 이용하여 하룻동안 전배양하였다. 전배양 종료 후 각 균주현탁액의 흡광도를 UV 스펙트로포토미터(측정파장 660nm, V-550, Jasco, Japan)로 측정하여 1 x 109 세포수/㎖ 이상의 균수가 확인된 것을 이하 시험에 사용하였다.
또한, 시험에 사용될 Top agar는 염화나트륨 0.5% 와 박토아가(Bacto Agar, Lot No:4149282, BD, USA) 0.6% 용액에 0.5 mmol/LL-Histidine (Lot No. : 126H1093, Sigma, USA)-0.5 mmol/L D-biotine(Lot No.:068H137425, amresco, USA)용액을 용량비 10:1로 혼합하여 준비하였다.
1-2: 시험시료의 제조
먼저 4차 증류수에 영양 액체배지 No.2(Lot No.: 298714, Oxoid, UK)를 2.5%가 되도록 용해하였다. 그 후, 삼각플라스크에 박토아가(Bacto Agar, Lot No:4149282, BD, USA) 15g 과 800㎖ 의 3차 증류수를 넣고 고압증기 멸균하였다. 멸균 후, 사전에 멸균하여 준비한 virus buffer salt(10X) 100㎖와 20% 글루코오스 100㎖를 첨가하여, 각각의 페트리디쉬에 분주하여 굳혔다.
1-3: 대사
활성화계
시험방법
실험예 1-2에서 준비된 시료 100㎕ 에 S9 mix 500㎕를 이미 건열멸균된 시험관(13 X 100㎜)에 넣고, 균현탁액 100㎕를 첨가하여 37 ℃ 진탕배양기에서 20분간 선회배양한 다음, 45℃에 보관된 top agar(연한천 용액) 2㎖를 첨가하여 잘 혼합한 후, Vogel-Bonner 최소 글루코오스 한천평판배지 위에 중층하였다. Top agar가 고정된 후 페트리디쉬를 뒤집어서 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 경과 후 복귀변이콜로니수를 콜로니카운터(ProtoCOL, SYNBIOSIS,UK)로 자동계측하였다. 상기 방법으로 얻어진 복귀변이 콜로니수는 실측치로 기록하였으며, 각 용량군당 평균과 표준편차를 구하여 하기 표 1에 나타냈다.
1-4:
대사활성계
비적용의 경우
상기 1-3에서 S9 mix 500㎕ 대신 0.1 mol/인산완충액(pH 7.4) 500㎕를 이용하는 것을 제외하고 실험예 1-3와 같은 방법으로 복귀변이 콜로니수를 측정하여 하 기 표 1에 나타냈다. 음성대조군으로는 시험물질의 부형제로 사용한 주사용수인 Lot No.:AAW5AL, Choongwae Pharma Corp. 를 사용하였으며, 양성대조군으로는 하기 5가지의 물질을 이용하여 상기의 실험을 행하였으며, 복귀변이 콜로니수를 측정하여 하기 표 1에 나타냈다.
2-NF: s-Nitrofluorene(Lot No.: DA09213BA, Aldrich, USA)
SA: Sodium azide(Lot No.:121Koo47, Sigma, USA)
2-AA: 2-Aminoanthracene (Lot No.: 106F06681, Sigma, USA)
9-AA: 9-Aminoacridine (Lot No.: 106F06681, Sigma, USA)
4-NQO: 4-nitroquinoline 1-oxide (Lot No.:101K2191, Sigma, USA)
실험예
2:
이소티아졸론
용액의
대장균에서의
유전독성
억제활성
Escherichia coli WP2uvrA(pKM101) 균주를 시험균주로 이용하고, top agar 제조시 0.5mmol/LL-Histidine-0.5mmol/L D-biotine 용액 대신 0.5mmol/L L-Tryptophan 을 이용한 것을 제외하고는 실험예 1과 동일한 방법으로 실험하여 복귀변이콜로니수 측정하여 하기 표 1에 나타냈다.
시험균주 | 용량 ㎍/plate |
실시예 | 콜로니수 | 비교예 | 콜로니수 | ||
대사활성계 | 비활성계 | 대사활성계 | 비활성계 | ||||
살모넬라 티피무리움 TA98 | 0 | 1 | 19 | 22 | 1 | 19 | 22 |
2 | 22 | 21 | 2 | 22 | 21 | ||
3 | 21 | 21 | 3 | 21 | 21 | ||
살모넬라 티피무리움 TA100 | 0 | 1 | 116 | 110 | 1 | 116 | 110 |
2 | 110 | 114 | 2 | 110 | 114 | ||
3 | 104 | 111 | 3 | 104 | 111 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1535 | 0 | 1 | 19 | 20 | 1 | 19 | 20 |
2 | 18 | 19 | 2 | 18 | 19 | ||
3 | 19 | 18 | 3 | 19 | 18 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1537 | 0 | 1 | 9 | 9 | 1 | 9 | 9 |
2 | 9 | 9 | 2 | 9 | 9 | ||
3 | 9 | 9 | 3 | 9 | 9 | ||
대장균 WP2urvA(pKM101) | 0 | 1 | 120 | 110 | 1 | 120 | 110 |
2 | 115 | 102 | 2 | 115 | 102 | ||
3 | 118 | 106 | 3 | 118 | 106 | ||
시험균주 | 용량 ㎍/plate |
실시예 | 콜로니수 | 비교예 | 콜로니수 | ||
대사활성계 | 비활성계 | 대사활성계 | 비활성계 | ||||
살모넬라 티피무리움 TA98 | 312 | 1 | 23 | 22 | 1 | 48 | 60 |
2 | 20 | 21 | 2 | 52 | 80 | ||
3 | 21 | 21 | 3 | 59 | 53 | ||
살모넬라 티피무리움 TA100 | 312 | 1 | 103 | 110 | 1 | 260 | 320 |
2 | 108 | 114 | 2 | 280 | 420 | ||
3 | 105 | 111 | 3 | 321 | 431 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1535 | 312 | 1 | 19 | 20 | 1 | 63 | 75 |
2 | 17 | 19 | 2 | 45 | 50 | ||
3 | 18 | 18 | 3 | 40 | 53 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1537 | 312 | 1 | 10 | 9 | 1 | 36 | 40 |
2 | 8 | 9 | 2 | 25 | 59 | ||
3 | 9 | 9 | 3 | 28 | 23 | ||
대장균 WP2urvA(pKM101) | 312 | 1 | 111 | 110 | 1 | 196 | 320 |
2 | 116 | 102 | 2 | 227 | 260 | ||
3 | 115 | 106 | 3 | 192 | 279 | ||
시험균주 | 용량 ㎍/plate |
실시예 | 콜로니수 | 비교예 | 콜로니수 | ||
대사활성계 | 비활성계 | 대사활성계 | 비활성계 | ||||
살모넬라 티피무리움 TA98 | 625 | 1 | 15 | 22 | 1 | 59 | 72 |
2 | 16 | 21 | 2 | 78 | 83 | ||
3 | 16 | 21 | 3 | 29 | 56 | ||
살모넬라 티피무리움 TA100 | 625 | 1 | 108 | 110 | 1 | 336 | 350 |
2 | 109 | 114 | 2 | 360 | 346 | ||
3 | 110 | 111 | 3 | 420 | 492 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1535 | 625 | 1 | 19 | 20 | 1 | 68 | 65 |
2 | 16 | 19 | 2 | 52 | 63 | ||
3 | 18 | 18 | 3 | 65 | 65 | ||
살모넬라 티피무리움 TA1537 | 625 | 1 | 7 | 9 | 1 | 32 | 38 |
2 | 6 | 9 | 2 | 29 | 52 | ||
3 | 7 | 9 | 3 | 54 | 64 | ||
대장균 WP2urvA(pKM101) | 625 | 1 | 108 | 110 | 1 | 450 | 713 |
2 | 118 | 102 | 2 | 560 | 586 | ||
3 | 113 | 106 | 3 | 484 | 562 |
표 1에 따르면, 사이클로덱스트린을 첨가하지 아니한 비교예의 경우에 비하여, 실시예 1 내지 3의 경우 시험균주의 용량에 관계없이 포함되어 있는 경우 복귀변이콜로니수가 적은 것으로 측정되었다. 이는 사이클로덱스트린을 이소티아졸론 화합물에 혼합하여 가온, 교반 및 냉각단계를 거치는 경우 이소티아졸론-사이클로덱스트린 복합체의 형성으로 인하여 이소티아졸론 화합물의 유전독성이 발현되는 것이 방지됨을 알 수 있다.
실험예
3:
유전독성
억제활성의 판단
상기 실험예 1 및 2에서 측정된 복귀변이콜로니수에 대하여 대사활성계 존재 유무에 관계없이 콜로니수가 음성대조군에 비하여 한 개 이상의 용량에서 명확히 증가하고, 2배 이상이면서 용량의존성을 가지며, 그 작용에 재현성이 인정될 경우 양성으로 판정하였으며, 그 외에는 음성으로 판정하여 하기 표 2에 기재하였다.
대사활성계 | 대사비활성계 | 유전독성 | |
실시예 1 | 음성 | 음성 | 없음 |
실시예 2 | 음성 | 음성 | 없음 |
실시예 3 | 음성 | 음성 | 없음 |
비교예 1 | 양성 | 양성 | 있음 |
비교예 2 | 양성 | 양성 | 있음 |
비교예 3 | 양성 | 양성 | 있음 |
복귀돌연변이 실험 결과에서 실시예 1 내지 3의 모든 시험균주에서 복귀변이 콜로니수는 대사활성계의 적용유무에 관계없이 용량의존적으로 증가되지 않았으며, 음성대조군과 비교하여 2배 이상의 증가를 보이지 않았다. 또한, 시험물질에 의한 균주의 생육저해와 석출도 관찰되지 않았다. 따라서, 실시예 1 내지 3의 경우 시험균주에서 유전독성이 발현되지 않았다고 결론 내릴 수 있다.
그러나 비교예 1 내지 3의 모든 시험균주에서 시험물질에 의한 복귀변이 콜로니수는 용량의존적으로 증가되지 않았으며, 음성대조군과 비교하여 2배 이상의 증가를 보였다. 그러므로 비교예의 모든 경우는 유전독성이 있다고 판단할 수 있다.
그러므로 본 발명의 이소티아졸론 용액의 제조방법은 사이클로덱스트린을 포함하고 교반 시 온도의 상승단계 및 교반작용 후 냉각단계를 거침으로서 이소티아졸론의 유전독성이 억제된다는 사실을 확인할 수 있었다.
본 발명의 이소티아졸론 용액의 유전독성 억제방법은 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 혼합하여 고온의 온도조건에서 가열하면서 교반하는 단계 및 냉각단계를 포함함으로써 이소티아졸론 화합물의 유전독성을 억제하는 장점이 있다.
Claims (11)
- 하기 화학식 1로 표시되는 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 함유하는 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 50 내지 100 ℃의 온도조건으로 가온하고,상기 가온된 조건하에서 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 교반하고,상기 교반물을 영하 10 내지 0 ℃로 냉각하는 것을 포함하는 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법:[화학식 1]상기 화학식 1에서,R1 및 R2는 각각 수소원자, 할로겐원자, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 고리화된 아릴기이고,R3는 수소원자, C1 내지 C18의 알킬기, C2 내지 C18의 알케닐기, C2 내지 C18의 알키닐기, 3 내지 8각 고리를 갖는 C3 내지 C12의 시클로알킬기, C10 내지 C24의 아랄킬기, 또는 C10 내지 C24의 아릴기이다.
- 제1항에 있어서, 상기 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 2000 내지 20000 rpm으로 60 내지 180 분 동안 교반하는 것인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 전체 이소티아졸론 화합물 함유 조성물 중 상기 이소티아졸론 화합물 0.5 내지 50 중량%, 및 사이클로덱스트린 0.5 내지 10 중량%를 포함하는 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 이소티아졸론 화합물은 5-클로로-2-메틸-3-이소티아졸론, 2-메틸-3-이소티아졸론, 2-옥틸-3-이소티아졸론, 4,5-디클로로-2-시클로헥실-3-이소티아졸론 및 4,5-디클로로-2-옥틸-3-이소티아졸론으로 구성된 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 이소티아졸론 화합물은 5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸론-3-온, 2-메틸-4-이소티아졸론-3-온 및 벤조이소티아졸론을 중량비 0.01:1:1 내지 0.5:1:1 로 함유하는 혼합물인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 및 감마-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 가열, 교반 및 냉각단계를 1회 이상 반복하는 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 용매는 물, 황산, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 1,5-펜탄디올, 2,4-펜탄디올, 벤질 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 질산염 또는 황산을 상기 이소티아졸론 화합물에 대하여 0.01 내지 5 중량부로 더욱 포함하는 것인 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물의 제조 방법.
- 하기 화학식 1로 표시되는 이소티아졸론 화합물, 사이클로덱스트린 및 용매를 함유하는 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 50 내지 100 ℃의 온도조건으로 가온하고,상기 가온된 조건하에서 이소티아졸론 화합물 함유 조성물을 교반하고,상기 교반물을 영하 10 내지 0 ℃로 냉각하는 것을 포함하는 이소티아졸론 화합물의 유전독성 억제방법으로 제조된 조성물로,이소티아졸론 화합물 0.5 내지 50 중량%, 사이클로덱스트론 0.5 내지 10 중량% 및 잔량의 용매를 포함하는 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물.[화학식 1]상기 화학식 1에서,R1 및 R2는 각각 수소원자, 할로겐원자, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 고리화된 아릴기이고,R3는 수소원자, C1 내지 C18의 알킬기, C2 내지 C18의 알케닐기, C2 내지 C18의 알키닐기, 3 내지 8각 고리를 갖는 C3 내지 C12의 시클로알킬기, C10 내지 C24의 아랄킬기, 또는 C10 내지 C24의 아릴기이다.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 안정화제를 더욱 포함하는 유전독성이 감소된 이소티아졸론 화합물 함유 조성물.
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KR100383098B1 (ko) | 2000-05-10 | 2003-05-12 | 에스케이케미칼주식회사 | 이소티아졸론 용액의 침전형성 방지방법 및 그 조성물 |
-
2005
- 2005-11-09 KR KR1020050107222A patent/KR101209850B1/ko active IP Right Grant
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