KR101206324B1 - 균근성 버섯 균사체의 생산 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 고체 매질, 및 고체 매질 상에 형성된 균사체를 접종원으로 이용한 수목의 균근감염 묘목의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경석을 포함하는 고체 매질에서 균근성 버섯의 균사체를 배양하여 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법, 상기 방법에 사용하기 위한 고체 매질, 및 상기 고체 매질 상에 형성된 균사체를 접종원으로 이용하여 무균상태가 아닌, 용기, 시설, 묘포장 등에서 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법에 관한 것이다.

균근성 버섯, 송이버섯, 능이버섯, 균사체, 경석, 맥반석, 식용유, 계면활성제, 시설, 묘포장, 수목, 균근감염 묘목

Description

균근성 버섯 균사체의 생산 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 고체 매질, 및 고체 매질 상에 형성된 균사체를 접종원으로 이용한 수목의 균근감염 묘목의 생산 방법{Methods for producing hyphae of Mycorrhizal mushrooms and solid mediums for the methods, and methods for producing mycorrhiza-infected seedlings of woody plants using the hyphae formed on the solid medium as inoculum sources}

본 발명은 균근성 버섯 균사체의 생산 및 생산된 균사체를 이용한 균근감염 묘목의 생산에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 균근성 버섯 균사체의 생산 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 고체 매질, 및 상기 고체 매질 상에 형성된 균사체를 접종원으로 이용하여 무균상태가 아닌, 용기, 시설, 묘포장 등에서 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법에 관한 것이다.

송이버섯, 능이버섯, 덩이버섯, 알버섯 등으로 대표되는 균근성 버섯은, 인공재배로 안정적인 생산이 가능한 팽이버섯, 느타리버섯, 표고버섯 등과 같은 부생성 버섯과는 달리, 인공재배가 어렵다. 균근성 버섯에 대해서는 포자, 배양균사, 균근을 이용한 인공재배 실험이 수행되어 왔으나, 혼시메지버섯[Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo] 을 제외한 다른 버섯에 대하여는 현재까지 유효한 생산수단이 확립되어 있지 않은 실정이다. 일반적으로 버섯의 인공재배는 순수 배양한 균사체로부터 제조한 종균을 원목 혹은 영양배지 등에 접종 배양하여 자실체를 생산하는 것을 목표로 하는 경우가 대부분이다. 그러나 송이버섯으로 대표되는 대부분의 균근성 버섯류들은 부생성 버섯류들과는 달리 그들이 가지고 있는 셀룰로스와 전분 등의 이용능률이 현저히 낮은 생리학적 특성이 있으므로 부생성 버섯을 위한 인공재배 기술의 응용이 곤란한 실정이다. 또한, 송이버섯과 같은 균근성 버섯들은 생리적 특성상 생장속도가 느리기 때문에 균사체만을 대량으로 생산하는 데에 어려움이 따르고, 특히 실외에서의 기주식물인 묘목에서의 균근합성에는 고도의 기술이 요하게 된다. 그 이유는 비멸균 상태인 실외의 토양 내에는 균근성 버섯의 생육을 저해하는 많은 미생물과 버섯 균사를 먹이로 하는 토양 동물들이 서식하고 있기 때문이다. 그러므로 토양 미생물에 저항성이 있을 뿐만 아니라 토양 소동물로부터 피해를 입지 않는 접종 균사체를 생산할 수 있는가가 인공재배 성공을 위해 무엇보다 중요한 요소가 된다.

우리나라에서는, 균근성 버섯 중 유일하게 송이버섯에 관한 연구가 비교적 많이 수행되어 왔으며, 송이버섯 균사체의 액체배지를 이용한 배양방법이 개발되어 있다. 한국공개특허 제2007-0099362호(2007. 10. 9. 공개)에는 마사토, 펄라이트, 버미큘라이트, 톱밥 및 부엽토 중에서 1종 이상을 혼합한 후, 보리나 보릿가루, 옥수수 가루, 쌀겨를 단독 또는 혼합하여 추가로 더 포함하는 고체 매질에 송이 균사체를 배양하여 송이 균사체를 대량으로 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이들의 배양 균사체가 멸균되지 않은 야외의 토양 내에서 생존능력을 가질지는 의문이다. 게다가, 비록 펄라이트와 버미큘라이트가 다공질이기는 하나, 고온에서 인공적으로 만들어진 것이기 때문에 내부에는 균의 성장에 필요한 미량요소 등과 같은 영양분이 전혀 없는 상태이다. 특히, 펄라이트는 충분히 물에 담그더라도 물이 완전히 침투하지 못하며, 내부에는 늘 공기가 남아 있으므로, 물에서는 위로 뜨는 특징이 있다. 그러므로 균의 배양에 필요한 영양원인 배지의 흡착면에서의 기능이 떨어지므로 균사의 장기적인 배양에서 능률이 떨어질 수밖에 없다. 또한, 버미큘라이트는 부서지기 쉬워 균사체가 성장하더라도 매질의 형태가 부서지기 쉽고 더불어 균사체가 끊어지는 등 균의 생장에 악영향을 미칠 수 있다. 따라서, 기존의 배양 매질 및 방법의 단점을 보완하고 보다 효율적으로 균근성 버섯의 균사체를 생산할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요청되어 왔다.

한편, 경석(輕石, Pumice)은 화산쇄설물의 일종으로 괴상(塊狀)으로 다공질의 것 중 담색(淡色)인 것을 가리킨다. 주로 유문암-안산암질의 마그마가 분출할 때 지하 심층부로부터 상승하여 압력이 감소함에 따라 마그마에 용해되었던 물과 같은 휘발성분이 발포하여 다공질로 된 것이다. 경석의 색은 전체적으로는 백색, 회색, 황색 등의 담색이며, 무색-흑색의 광물결정을 함유한 것이 있다. 일반적인 용도로서는 잘게 부수어 작은 절편으로 가공한 것이 발뒤꿈치의 각질을 문질러 제거하는데 사용한다. 또한, 다공질이기 때문에 보수성(保水性)이 좋아 원예용토로서 사용된다. 그러나, 지금까지 경석을 균근성 버섯의 균사체를 배양하기 위한 매질로 사용한 예는 전혀 없었다.

균근성 버섯의 재배방법으로는, 주로 수목류인 기주식물과의 균근공생이라는 생태적 기능을 이용한 균근합성 실험을 모태로 한 균근묘의 생육 시 간혹 자실체가 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 균근성 버섯의 인공재배는 균근묘의 양묘와 야외의 이식에 의한 자실체 생산을 주된 목표로 하고 있다. 대표적인 균근성 버섯인 송이버섯과 어깨를 나란히 하는 덩이버섯류(Tuber spp.)는 균근묘 창출과 과수원과 같은 감각의 버섯포장 조성이 오래 전부터 유럽의 여러 나라에서는 이루어지고 있다. 또한, 균근묘 창출을 위한 접종용 균사체의 배양에 대한 연구는 오래 전부터 수행되어 왔으나, 대부분이 무균 상태에서 수행된 것으로 자연 상태의 실외 실험에 대한 연구는 미비한 상태이다. 한국등록특허 제390,048호(2003.06.21 등록)는 소나무 유묘와 송이균주의 균사체를 공동 배양하여 송이균만이 감염된 소나무 감염묘를 형성하는 방법에 관한 것으로, PDB 배지에서 액체배양한 송이균주 균사체를 분쇄하여 얻은 균사체 분쇄물을 살균된 배양용기 바닥에 접종하는 단계; 펄라이트와 스페그넘 피트모스를 섞어 제조한 혼합상토를 상기 송이균주 균사체 분쇄물 위에 붓는 단계; K-배지를 상기 혼합상토 위에 분주하는 단계; 소나무 무균 발아묘를 상기 혼합상토와 K-배지를 포함한 감염배지 위에 치상하고 배양용기의 뚜껑을 닫는 단계; 상기 단계에 의하여 제조된 소나무 유묘와 송이균 배양체를 공동 배양하는 단계로 구성되는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 무균상태가 아닌 자연상태에서 그리고 발아묘가 아닌 산지식재가 가능한 묘목에의 균근합성에 대한 보고는 지금까지 전무한 실정이다.

본 발명자들은 균근성 버섯의 인공재배를 위하여 균사체를 보다 신속하게 대량으로 생산할 수 있는 기술을 개발하기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 다공질의 천연석인 경석을 포함하는 고체 매질에서 균근성 버섯의 균사체를 배양함으로써 상기 목적을 성공적으로 달성할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 본 발명자들은 상기 방법에 의해 고체 매질 상에 형성된 균사체를 접종원으로 이용하여 자연상태에서 수목의 균근감염 묘목을 창출 및 대량 생산하는데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 제1목적은 균근성 버섯의 균사체를 배양하여 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제2목적은 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법에 사용하기 위한 고체 매질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제3목적은 상기 고체 매질 상에 형성된 균근성 버섯의 균사체를 접종원으로 이용하여 자연상태에서 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 직경 0.1 내지 10 cm의 경석을 포함하는 고체 매질에 균근성 버섯의 균사체를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 고체 매질은 직경 0.1 내지 10 cm의 맥반석을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 고분자 탄소원으로서 쌀, 밀, 보리, 전분, 옥수수 를 단독 또는 혼합하여 추가로 포함할 수 있다. 또한, 식용유 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 고체 매질은 경석을 통기성 주머니 안에 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 제2면은 직경 0.1 내지 10 cm의 경석을 포함하는 것을 특징으로 하는, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법에 사용하기 위한 고체 매질에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은

1) 상기 방법에 따라 고체 매질 상에 형성된 균근성 버섯의 균사체를 접종원으로 하여 묘목의 뿌리에 균근성 버섯의 균사체를 접종하고;

2) 균사체가 접종된 묘목을 식재하는:

단계를 포함하는, 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 비무균 상태(non-aseptic condition)에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 용기, 시설, 묘포장 등에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 식재된 묘목에 살충제, 살균제 및 식물생장촉진제를 각각 1000배-200배액으로 1-4주 간격으로 관주하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명에 따르면, 균근성 버섯의 공생체인 수목의 뿌리에서의 균근균 합성과 균환(시로, shiro) 형성을 위한 접종원으로 사용하기 위한 균사체를 대량으로 신속하게 생산할 수 있다. 더불어, 다공질의 간극에까지 버섯균의 균사체가 침투하여 야외의 접종원으로 사용하더라도 토양 미생물 및 토양 동물의 피해를 받지 않 을 뿐만 아니라, 천연석 내에는 다수의 미네랄 성분이 함유되어 있어 간극 내로 침투한 균사체가 장기간 생존할 수 있다. 나아가, 무균상태가 아닌 자연상태, 즉 야외에서도 균근감염 묘목을 생산할 수 있게 되어, 지금까지 불가능한 것으로 여겨졌던 송이버섯, 능이버섯 등으로 대표되는 균근성 버섯의 인공재배에 크게 기여할 것으로 기대된다.

또한, 본 발명에 따라 생산된 균근감염 묘목은 산불이나 홍수 등에 의해 교란을 받은 임지 및 임도와 도로 사면의 녹화용으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 식물체의 생존이 거의 불가능한 사막의 녹화식재용으로 이용되어 산림녹화에도 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 균근감염묘를 자유자재로 생산할 수 있어 수목 및 균근성 버섯의 생리 및 생태학적 연구자료로 사용될 수도 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 균근성 버섯 균사체의 생산 방법 및 매질

본 발명에 따른 균근성 버섯 균사체의 접종원 생산 방법은 균근성 버섯의 균사체를 다공질의 천연석인 경석을 포함하는 고체 매질에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, '균근성 버섯'은 기주인 수목과의 공생관계를 형성하는 균근성 버섯을 포괄하는 것으로서, 본 발명의 매질 및 방법으로 배양 및 생산이 가능한 한 그 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들면, 송이버섯[Tricholoma matsutake (S. Ito et Imai) Sing.], 송이버섯아제비[T. bakamatsutake Hongo], 능이버섯[Sarcodon aspratus (Berk.) S. Ito], 덩이버섯류[Tuber spp.], 알버섯[Rhizopogen rubescens (Tul.) Tul.], 큰비단그물버섯[Sullus grevillei (Klotzsch) Sing.], 황소비단그물버섯[S. bovines (L.: Fr.) O. Kuntze], 그물버섯[Boletus edulis Bull. Ex Fr.], 혼시매지버섯[Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo], 벗꽃버섯류[Hygrophorus spp.], 시매지버섯류[Lyophyllum spp.], 송이버섯류[Tricholoma spp.], 오오이쪼버섯류[Leucopaxillus spp.], 광대버섯류[Amanita spp.], 그물버섯류[Boletus spp.], 비단그물버섯류[Sullus spp.], 껄꺼리그물버섯류[Leccinum spp.], 무당버섯류[Russula spp.], 젖버섯류[Lactarius spp.], 꾀꼬리버섯류[Cantharellus spp.], 싸리버섯류[Ramaria spp.], 곰보버섯[Morchella esculenta (L.: Fr.) Pers. ver. Esculenta], 모래밭버섯[Pisolithus tinctorius Cokr & Couch], 어리알버섯류[Scleroderma spp.] 및 곰보버섯류[Morchella spp.]을 포함하며, 대표적으로는, 송이버섯 또는 능이버섯일 수 있다.

본 발명의 균근성 버섯 균사체 배양용 고체 매질은 직경 0.1 내지 10 cm의 경석을 포함하는 것을 특징으로 한다. 경석은 천연석 그대로나(예: 난석) 천연석에 무기염 등의 양분을 흡수시킨 것(예: 골드난석)을 사용할 수 있으며, 이들을 혼합하여 사용할 수도 있다. 직경 0.1 cm 미만의 경석을 사용하는 경우에는 지렁이와 같은 토양동물에 의한 섭식피해에 노출되기 쉬운 문제점이 있을 수 있고, 직경 10 cm 초과의 경석을 사용하는 경우에는 기본적으로 큰 문제점은 없으나 고체 매질의 멸균 등에 다소 불편이 따를 수 있다.

본 발명에 따른 매질은 경석 이외에도, 맥반석을 추가로 포함할 수 있으며, 이로써 한층 더 우수한 효과를 거둘 수 있다. 맥반석은 화강섬록반암에 속하는 것으로, 석영과 장석이 섞여 있으며 주성분은 무수규산, 산화알루미늄이다. 여과제, 소염제 등으로 쓰여 약석이라 불리며, 원적외선을 방출하여 찜질방, 식기, 의료기 등에 이용되고 있다. 맥반석 또한 다량의 미네랄을 함유하고 있어 균근성 버섯의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라, 미생물 정화능력을 갖는 특징이 있으므로 경석과 같이 혼합하여 배양한 송이 접종원을 야외에 접종할 경우 토양 미생물에 대한 높은 저항성을 나타낼 수 있다. 특히 송이버섯과 같은 균근성 버섯은 균사에서 유기산을 분비하여 암석을 용해하는 성질이 있으므로, 맥반석에 함유된 다량의 미네랄을 효과적이고 지속적으로 이용하여 균사의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 접종원의 생존기간을 월등히 증가시킬수 있다.

본 발명의 구체적인 예에서는, 직경 0.1 내지 10 cm의 난석, 직경 0.1 내지 10 cm의 골드난석 및 직경 0.1 내지 10 cm의 맥반석을 배합하여 사용함으로써 보다 우수한 효과를 얻을 수 있다. 이때 난석, 골드난석 및 맥반석을 2~5 : 2~5 : 1, 특히 3 : 3 : 1의 부피비로 배합하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서는 고체 매질, 즉 경석, 또는 경석 및 맥반석을, 사용 전에, 탄소원과 질소원을 함유하는 액체배지(예: 증류수에 건조효모와 글루코스를 함유하는 액체배지) 중에서 멸균(예를 들어 121 ℃에서 60분간)하는 것이 바람직하다.

본 발명의 고체 매질은 고분자 탄소원으로서 쌀, 밀, 보리, 전분, 옥수수를 단독 또는 혼합하여 추가로 포함할 수 있다. 보리, 옥수수 등을 첨가한 경우에도 양호한 효과를 얻을 수 있으나, 쌀을 첨가한 경우 보다 우수한 효과를 얻을 수 있다. 고분자 탄소원은 경석 100 부피부(part by volume)에 대하여 10 내지 25 부피부로 사용할 수 있다. 구체적으로, 난석, 골드난석, 맥반석 및 쌀을 3 : 3 : 1 : 1의 부피비로 사용할 수 있다.

본 발명의 고체 매질은 식용유 및/또는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 식용유는 올리브기름, 참기름, 들기름, 콩기름, 낙화생 기름 등의 식물성 기름과 경유, 어유 등의 동물성 기름을 사용할 수 있으며, 특히 올리브기름, 참기름, 들기름 등의 식물성 기름을 사용할 수 있다. 계면활성제는 폴리에틸렌글리콜화 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트, 특히 트윈(Tween) 20 혹은 트윈 80을 사용할 수 있다. 식용유 및 계면활성제는 각각 경석 100 부피부에 대하여 1 내지 5 부피부로 사용할수 있다. 식용유 및 계면활성제를 첨가함으로써 균사체를 크게 증량시킬 수 있게 된다.

본 발명에서는, 경석을 통기성 주머니 내에 포함시킴으로써 보다 효율적이고 편리하게 균사체를 배양할 수 있다. 사용 가능한 통기성 주머니에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들어 삼베, 모시, 부직포로 만들어진 주머니, 특히 삼베 주머니를 사용할 수 있다. 이와 같이 통기성 주머니를 사용할 경우, 접종원을 정량적으로 대량 생산할 수 있으며, 야외에서 균근균 접종실험시 접종원의 정량화가 가능하다는 장점이 있다. 또한, 소나무 묘목이나 산림의 소나무 뿌리에 접종원 을 직접 부착할 수 있으므로 원하는 뿌리 부분에 접종가능하며, 예를 들어, 스테이플러(stapler) 등으로 직접 원하는 뿌리에 고정하여 접종할 수 있다. 또한 야외 접종시 균사체가 파괴되지 않으며, 경석 매질이 하나의 큰 균사체 덩어리로 존재하고 접종시 균사의 끊어짐 및 접종원의 부서짐이 없기 때문에 접종 후 균사의 초기생장이 빠르고 토양동물의 섭식피해를 피할 수 있다. 더욱이 균사의 뭉치 내에는 균사가 성장하면서 분비하는 항균성 성분들이 농축되어 있어 접종시 토양미생물에 대한 저항성을 증가시킨다.

본 발명에서 고체 매질의 접종원으로 사용하는 균사체는 자연산 송이버섯으로부터 순수 분리한 것이다. 순수 분리 균주의 배양을 위하여, 증류수 1 리터당 건조효모 5 g 또는 효모추출물 2 g, 글루코스 20 g, 한천 20 g을 배합하여 고체배지를 제조하고, 고체배지가 들어있는 샤레에 순수 버섯균을 접종하고, 20-25 ℃, 특히 24-25 ℃에서 4-5 주간 배양한다. 배양한 균사체를 메스를 이용하여 잘게 자른 고체배지 조각을 멸균수가 들어있는 비이커에 넣은 후, 호모지나이저(homogenizer)로 분쇄하여 본 발명에 따른 매질의 접종원으로 사용한다. 또한, 증류수 1 리터당 건조효모 5 g 또는 효모추출물 2 g, 글루코스 20 g, 한천 20 g을 배합하여 제조한 고체배지에서 1차 배양한 균사체를 1차 배양용 배지에서 한천을 뺀 액체배지에서 전 배양하는 것도 가능하다.

분쇄 균사체의 접종량에 따라 배양속도가 다르며, 접종량이 증가할수록 신속배양에 효과적이다.

본 발명에 따른 매질 내에서의 배양온도는 20-25 ℃, 특히 24-25 ℃가 바람 직하고, 배양기간은 매질 및 접종 균사량에 따라 다르지만, 대략 1 내지 3 개월, 예를 들어 2개월이면 매질 전체에 균사가 만연된다.

2. 고체 매질 상에 형성된 균사체를 이용한 균근감염 묘목의 생산

나아가 본 발명에서는, 상기한 바와 같은 방법에 따라 고체 매질 상에 형성된 균근성 버섯의 균사체를 접종원으로 하여 묘목의 뿌리에 균근성 버섯의 균사체를 접종하고, 균사체가 접종된 묘목을 식재함으로써, 수목의 균근감염 묘목을 생산한다. 본 발명에서, 수목은 균근성 버섯과 공생관계를 형성하는 기주식물로서, 대표적으로 송이버섯의 경우 소나무가 이에 해당한다. 본 발명에서는, 10년생 이하, 예를 들어 5년생 이하, 예를 들어 6개월 이상 3년생 이하, 예를 들어 1년생의 묘목을 사용할 수 있다. 또한, 식재된 묘목에 살충제, 살균제 및 식물생장촉진제를 각각 1000-200배액으로 1-4주 간격으로 관주하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 무균상태가 아닌, 용기, 시설 또는 묘포장에서 균근감염 묘목을 생산할 수 있게 된다. 균사체 접종원을 접종하여 식재한 후 약 3개월이면 묘목의 뿌리에서 균근의 형성이 확인된다. 묘목에 감염된 균근을 동정(identify)하기 위하여, 감염묘의 균근으로부터 DNA를 추출한 후 균근성 버섯의 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 등에 의해 증폭하여 묘목에 감염된 균근의 DNA가 접종된 균근성 버섯의 것과 일치함을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 접종용 송이버섯 균사체의 고체배지에서의 배양

자연산 송이버섯으로부터 균사체를 순수 분리하였다. 증류수 1리터당 건조효모 5 g 또는 효모추출물 2 g, 글루코스 20 g 및 한천 20 g을 배합하여 고체배지를 제조하였다. 고체배지가 들어있는 샤레에 순수 송이버섯균을 접종하였다. 24-25 ℃에서 4-5 주간 배양한 균사체를 메스를 이용하여 잘게 자른 고체배지 조각을 멸균수가 들어있는 비이커에 넣은 후, 호모지나이저로 분쇄하여 다공질의 천연석 매질의 접종원으로 사용하였다.

[실시예 2] 송이버섯균의 다공질 천연석 매질 내에서의 균사체 배양

직경 3 cm의 경석을 증류수 1리터당 건조효모 5 g, 글루코스 20 g이 들어있는 액체 배지가 들어있는 용기에 넣고 121 ℃에서 60 분간 멸균하였다. 그후 용기내의 액체 배지를 따라낸 후 경석을 멸균된 샤레에 옮긴 후 실시예 1에 의해서 제조된 균사체를 접종하여 배양하였다. 배양조건은 실시예 1과 같았다.

도 1a는 경석에서 성장한 송이버섯 균사체를 보여주는 사진이다. 도 1b는 송이 균사체가 만연된 경석(상부)과 경석의 횡단절편의 내부 간극에 침입한 송이균사체(하부 좌측)와 이의 확대(하부 우측) 사진이다. 이들 도면에 나타난 바와 같 이, 경석의 표면은 물론 내부 간극에까지 송이버섯 균사체가 만연되어, 송이버섯 균사체의 성장이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] 경석이 들어있는 주머니 내에서의 송이버섯 균사체의 배양

난석, 골드난석, 맥반석 및 쌀을 각각 3: 3: 1: 1의 부피비로 섞은 다음 천연섬유인 삼베로 만든 주머니(5 cm×5 cm)에 가득 넣고 봉한 후, 실시예 2의 액체배지가 들어있는 용기에 넣어 같은 방법으로 멸균하였다. 멸균 후 각각의 주머니 내에 실시예 1에 의해 제조된 접종용 균사체를 이용하여 송이버섯균을 접종하고 24-25 ℃에서 2 개월간 배양하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 주머니의 표면은 물론 매질 내부에도 송이버섯 균사체가 만연되어 있음을 확인하였다.

[실시예 4] 식용유 또는 계면활성제를 함유하는 경석 매질에서의 송이버섯 균사체의 배양

실시예 2에서, 경석에 각각 0.01~0.05 부피의 올리브유 및 트윈 20을 가하여 송이버섯 균사체를 배양하였다. 그 결과를 도 3(좌측: 트윈 20 첨가 시, 우측: 올리브유 첨가 시)에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 식용유나 계면활성제를 첨가한 경우 균사체 및 균사속이 보다 풍부하게 자라 배양 균사체가 크게 증량되었음을 확인할 수 있었다.

[실시예 5] 경석 송이균사체 접종원을 이용한 자연상태에서의 소나무 송이균 감염묘의 창출

1년생 소나무를 이용하여 그 뿌리를 반으로 절단하였다. 용기 내에 실시예 3에 따라 얻어진 고체 매질 상에 형성된 송이버섯 균사체의 접종원을 올려놓은 후 그 위에 소나무의 뿌리를 놓고 흙으로 덮어 소나무를 식재하였다. 식재 후 1-2주 간격으로 살충제(스미치온, 하아파케미칼, 이스라엘), 살균제(베노밀, 에스엠비티(주)) 및 식물성장촉진제(멀티피드, (주)동방아그로)를 각각 1000~200배액으로 하여 충분히 분주하였다. 도 4에 송이버섯 균사체 접종원과 같이 식재한 후 3개월 경과시 묘목 상태를 나타내었고, 도 5에 소나무 뿌리에 형성된 송이 균근을 나타내었으며, 도 6 및 7은 송이 균근의 현미경 사진이다.

[실시예 6] 송이균 감염묘에 형성된 균근으로부터 송이균의 검출

실시예 4에서 식재 후 3개월이 경과한 소나무 묘목의 뿌리에서 균근을 확인하고 균근의 근단을 채취하여 DNA를 추출하여 송이버섯 특이적 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 송이균을 검출하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 1a는 다공질의 천연석 매질인 경석에 만연된 송이버섯 균사체를 보여주는 사진이고;

도 1b는 송이 균사체가 만연된 경석(상부)과 경석의 횡단절편의 내부 간극에 침입한 송이 균사체(하부 좌측) 및 이의 확대(하부 우측) 사진이며;

도 2는 다공질의 천연석 매질인 경석이 들어있는 삼베 주머니에 만연된 송이버섯 균사체를 보여주는 사진이고;

도 3은 각각 식용유와 계면활성제가 든 경석 매질에서 자란 송이버섯균의 균사체 뭉치 및 균사속을 보여주는 사진(좌측: 계면활성제, 우측: 식용유)이며;

도 4는 다공질의 천연석 매질인 경석에 만연된 송이버섯 균사체 접종원과 같이 식재한 후 3개월 경과 시 소나무 묘목을 보여주는 사진이고;

도 5는 소나무 뿌리에 형성된 송이균근을 보여주는 사진이며;

도 6은 송이균근의 형태를 보여주는 현미경 사진이고;

도 7은 송이균근의 횡단절근에 의한 현미경 사진이며;

도 8은 송이버섯 특이적 프라이머를 이용한 PCR에 의해 형성된 균근으로부터 송이균을 검출한 결과를 보여주는 전기영동사진이다.

Claims (10)

1. 통기성 주머니 안에 포함된 직경 0.1 내지 10 cm의 경석을 포함하는 고체 매질에 균근성 버섯의 균사체를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 고체 매질이 직경 0.1 내지 10 cm의 맥반석을 추가로 포함하는 것인, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 고체 매질이 쌀, 밀, 보리, 전분, 옥수수를 단독 또는 혼합하여 추가로 포함하는 것인, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 고체 매질이 식용유 또는 계면활성제를 추가로 포함하는 것인, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 균근성 버섯은 송이버섯[Tricholoma matsutake (S. Ito et Imai) Sing.], 송이버섯아제비[T. bakamatsutake Hongo], 능이버섯[Sarcodon aspratus (Berk.) S. Ito], 덩이버섯류[Tuber spp.], 알버섯[Rhizopogen rubescens (Tul.) Tul.], 큰비단그물버섯[Sullus grevillei (Klotzsch) Sing.], 황소비단그물버섯[S. bovines (L.: Fr.) O. Kuntze], 그물버섯[Boletus edulis Bull. Ex Fr.], 혼시매지버섯[Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo], 벗꽃버섯류[Hygrophorus spp.], 시매지버섯류[Lyophyllum spp.], 송이버섯류[Tricholoma spp.], 오오이쪼버섯류[Leucopaxillus spp.], 광대버섯류[Amanita spp.], 그물버섯류[Boletus spp.], 비단그물버섯류[Sullus spp.], 껄꺼리그물버섯류[Leccinum spp.], 무당버섯류[Russula spp.], 젖버섯류[Lactarius spp.], 꾀꼬리버섯류[Cantharellus spp.], 싸리버섯류[Ramaria spp.], 곰보버섯[Morchella esculenta (L.: Fr.) Pers. ver. Esculenta], 모래밭버섯[Pisolithus tinctorius Cokr & Couch], 어리알버섯류[Scleroderma spp.] 및 곰보버섯류[Morchella spp.]로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 것인, 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법.
7. 직경 0.1 내지 10 cm의 경석을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제4항 및 제6항에서 선택된 어느 한 항에 따른 균근성 버섯의 균사체를 생산하는 방법에 사용하기 위한 고체 매질.
8. 1) 제1항 내지 제4항 및 제6항에서 선택된 어느 한 항에 따른 방법에 따라 얻어진 고체 매질 상에 형성된 균근성 버섯의 균사체를 접종원으로 하여 묘목의 뿌리에 균근성 버섯의 균사체를 접종하고

   2) 균사체가 접종된 묘목을 식재하는:

   단계를 포함하는, 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 비무균 상태에서 수행되는, 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 식재된 묘목에 살충제, 살균제 및 식물생장촉진제를 각각 1000-200배액으로 1-4주 간격으로 관주하는 단계를 추가로 포함하는, 수목의 균근감염 묘목을 생산하는 방법.

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