KR101173042B1

KR101173042B1 - 재조합 사이토카인 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 하는종양 예방 또는 치료용 백신 보조제

Info

Publication number: KR101173042B1
Application number: KR1020090026051A
Authority: KR
Inventors: 박영규; 이상록; 신부안
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2012-08-13
Also published as: KR20100107790A

Abstract

본 발명은 재조합 사이토카인 융합 단백질에 관한 것으로 보다 구체적으로는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 기능과 인터 로이킨 18(IL18) 유전자의 기능을 동시에 갖는 재조합 사이토카인(cytokine) 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 백신 보조제는 미세 암세포에 대항하는 치료학적 효과뿐만 아니라 예방학적인 효과를 동시에 해결 할 수 있을 것으로 기대된다.

사이토카인, 대식세포 콜로리 자극인자, 인터 로이킨 18, 종양, 백신 보조제

Description

재조합 사이토카인 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 하는 종양 예방 또는 치료용 백신 보조제{Cytokine fusion protein and vaccine Vaccine adjuvant composition containing same for treating cancer}

본 발명은 재조합 사이토카인 융합 단백질에 관한 것으로 보다 구체적으로는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 기능과 인터 로이킨 18(IL18) 유전자의 기능을 동시에 갖는 재조합 사이토카인(cytokine) 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신에 관한 것이다.

백신 보조제란 백신과 함께 투여할 경우(coadministration) 백신 항원에 의해 유도되는 항원 특이적 면역 반응(Ag-specific immune response)을 향상(enhance), 지속(prolong) 또는 촉진(accelerate)시킬 수 있는 물질을 칭한다. 현재까지 사람에게 사용할 수 있도록 승인된 백신 보조제에는 'alum(알루미늄 포스페이트(aluminium phosphate) 및 알루미늄 히드록시드(aluminium hydroxide))' 및 '스쿠알렌 에멀젼(squalene emulsion)' 등이 있다. 백신 보조제는 다음 5가지의 조건 중 1가지 이상을 충족해야만 한다: 1) 항원제공세포(antigen presenting cell) 표면의 공동자극 분자(co-stimulatory molecule) 발현 조절, 항원 특이적 T 림프구 반응 유도 혹은 사이토카인(cytokine) 분비 조절과 같은 면역조절(immunomodulation), 2) 항원 제공(presentation), 3) CD8 + T 림프구 반응, 4) 표적(targeting), 5) 항원 축적능(depot generation).

또한, 이상적인 백신 보조제는 1) 안전해야하고, 2) 체내에서 생분해되어야하며, 3) 항원 단독으로 투여했을 경우보다 높은 방어면역 혹은 치료면역능을 보여야하고, 4) 화학적 혹은 생물학적으로 확인된 물질이어야 하며, 5) 항원 보다 낮은 농도에서 작용하는 것이 좋고, 6) 상업적 혹은 임상적으로 쉽게 적용할 수 있도록 반감기가 길어야한다.

현재 백신 보조제로 사용되고 있거나 사용이 고려되고 있는 것으로는 1) 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 미네랄염(mineral salt), 2) 계면활성 물질, 3) 세균 유래 물질, 4) 사이토카인 혹은 호르몬, 6) 다가음이온(polyanion), 7) 폴리아크릴(polyacryl), 8) 담체(carrier), 9) 바이러스를 이용한 생 벡터(living vector), 10) 미네랄 오일(mineral oil)이나 리포좀(liposome)과 같은 운반제(vehicle) 등이 있다. 이 중에서 현재 활발한 연구가 진행되고 있으며 크게 주목받고 있는 단백질 유래 백신 보조제로는 Vibrio cholerae에서 유래한 콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 대장균 유래의 이열성 독소(heat-labile toxin, LT)가 있다.

상기 사이토카인 혹은 호르몬은 자가종양백신 또는 동종종양백신에 현재 상업적으로 활용되어지고 있다. 특히 GVAX와 같은 제품은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)를 발현시켜 세포백신(cell based vaccine)의 효능을 증강시키고자 하였다. 그러나 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)만을 사용하게 되면 예방학적인 기능 만을 강조한 것으로 암 적출 수술 후에 남아 있을 수 있는 미세 암세포에 대한 대항 하는 능력이 많이 떨어지는 것으로 보고되고 있다.

이들 백신 보조제는 점막 부위(mucosal area) 및 혈청(serum) 중에서 항원 특이적 항체(antigen-specific antibody) 생산을 유도하며, 항원제공세포(antigen presenting cell; APC) 표면의 B7-2 발현을 유도하여 CD4+ 세포의 공동자극 신호(co-stimulatory signaling)를 촉진하는 기전에 의한다는 보고가 있다. 그러나 이들은 장독성(enterotoxicity)이 높은 외독소이므로 독성(toxicity)은 줄이고 보조제적 특성(adjuvaticity)은 높이는 안전하고, 효율적인 백신 보조제의 개발이 강력하게 요망되고 있다.

본 발명의 목적은 상기 문제점을 개선하고자 미세암세포에 대항하는 치료학적 효과뿐만 아니라 예방학적인 효과를 동시에 해결 할 수 있는 방안으로 재조합 사이토카인(cytokine) 융합 단백질을 제공하고자 한다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명은 신호서열(signal peptide)을 포함하고 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 인터 로이킨 18(IL18)단편이 5′에서 3′ 방향으로 EcoRI 제한효소에서 융합되어 재조합 융합 사이토카인 단백질을 만드는 것이 특징이다.

본 발명은 상기 재조합 융합 사이토카인 단백질은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF) 및 인터 로이킨 18(IL18)의 두 가지 사이토카인이 가지고 있는 고유의 특성을 모두 가지고 있는 것이 특징이다.

본 발명은 상기 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 17개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal peptide)을 이용하여 세포 밖으로 분비가 쉬운 것이 특징이다.

본 발명은 상기 재조합 융합 사이토카인 단백질을 유효성분으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제로 자가종양백신(tumor cell based vaccine)의 반응을 증폭시켜 주는 것이 특징이다.

이하 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 신호서열(signal peptide)을 포함하고 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 인터 로이킨 18(IL18)단편이 5′에서 3′ 방향으로 EcoRI 제한효소에서 융합되어 있는 재조합 융합 사이토카인 단백질을 제공한다.

상기 재조합 융합 사이토카인 단백질을 제조하기 위하여 먼저, 융합 사이토카인 GMIL18 발현 플라스미드를 제작하기 위하여 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 17개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal peptide)을 함유하고 있는 서열번호 2의 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편을 클로닝하였다.

다음 단계로 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 로이킨 18(IL18)단편을 클로닝 한 후, 상기 클로닝 된 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 인터 로이킨 18(IL18)단편을 EcoRI 제한효소(EcoRI site)의 단편으로 서로 연결하여 재조합 융합 사이토카인 DNA을 클로닝하였다.

상기 클로닝된 재조합 융합 사이토카인 DNA를 단백질 발현용 벡터에 클로닝하여 단백질 발현을 유도하였다. 본 발명에서는 상기 재조합 융합 사이토카인 단백질을 GMIL18로 명명하였으며 이는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 도 1을 참조한다.

상기 본 발명에 따른 재조합 융합 사이토카인 단백질인 GMIL18의 기능을 분석하였다. 구체적인 예로 상기 융합 사이토카인 GMIL18이 NSF-60의 세포의 증식을 시킬 수 있는지에 대한 검증한 결과 대조군인 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF) 단백질과 거의 유사하게 세포의 증식을 도와주는 것으로 확인됨으로써 융합 사이토카인 GMIL18은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 능력을 갖고 있는 것을 확인하였다. 또한, 감마 인터페론(interferon gamma)의 분비를 확인 한 결과 융합 사이토카인 GMIL18 역시 감마 인터페론(interferon gamma)의 분비를 촉진하는 것으로 인터 로이킨 18(IL18)의 능력을 갖고 있는 것을 확인하였다. 도 3를 참조한다.

구체적인 예로 상기 본 발명에 따른 재조합 융합 사이토카인 단백질인 GMIL18의 세포 밖으로 많은 양의 단백질을 분비하는 단백질 분비능을 확인하였다. 아데노바이러스(adenovirus)에 클로닝된 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF), GL18 및 융합 사이토카인 GMIL18을 대장암 세포 line에 접종하여 배양 후, 배양 배지를 이용하여 웨스튼 블롯(western blot)을 실시한 결과 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)와 융합 사이토카인 GMIL18 단백질은 발현양도 많을 뿐만 아니라 세포 밖으로 많은 양의 단백질을 분비하는 단백질 분비능이 우수한 것을 확인할 수 있었으나, 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 신호서열(signal peptide)에 인터 로이킨 18(IL18)을 융합한 GL18(GMCSF signal peptide + mature form IL18)은 배양 배지에 서 단백질이 분비되지 않고 세포 분획에서만 단백질이 분비되는 것을 확인하였다. 도 4을 참조한다.

상기 본 발명에 따른 재조합 융합 사이토카인 단백질인 GMIL18의 여러 휴면 세포주에서의 단백질 분비능을 확인하였다. 구체적인 예로 융합 사이토카인 GMIL18 유전자가 대장암, 전립선암 및 위암 세포주에 전달이 매우 잘 될 뿐만 아니라 대장암, 전립선암 및 위암 세포주에서 높은 농도로 융합 사이토카인 GMIL18 단백질이 세포 밖으로 잘 분비되는 것을 확인하였다. 이는 대장암, 전립선암, 위암으로부터 선택되는 1종 이상의 종양을 치료 또는 예방에 항암효과를 제공한다. 도 5를 참조한다.

본 발명은 상기 재조합 사이토카인 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제를 제공한다.

구체적인 예로 상기 본 발명에 따른 융합 사이토카인 GMIL18의 항암 효과를 실험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 확인하였다. CT26 마우스 대장암 세포주에 대조군에는 pCDNA 4 벡터만을 감염하였고, 실험군에는 pCDNA 4 벡터와 융합 사이토카인 GMIL18을 발현하는 플라스미드를 클로닝한 재조합 플라스미드를 감염시켜 마우스의 대퇴부에 피하 주사하여 종양의 발생 정도와 종양의 성장을 관찰하였다. 그 결과 융합 사이토카인 GMIL18 처리군이 비교군에 비하여 종양의 크기 및 IVIS image에서 낮은 루시퍼라이제(luciferase) 활성도를 보이는 것을 확인하였으며, 이는 항암 효과가 탁월하다는 것을 보여주는 결과이다. 도 6를 참조한다.

뿐만 아니라 혼합 배양한 수지상 세포에서 CD11c가 매우 낮게 감소되었고 T 세포 공동자극 마커(co-stimulator maker)인 CD86 과 수지상 세포 교체 마커(migration maker)인 CCR7 표지인자의 수치는 증가하는 것을 확인하였다. 이는 T 세포의 유도 후 림프노드로의 이동이 잘 이루어져 항암효과를 더욱 증가시키는 것을 확인한 것이다. 도 7을 참조한다.

본 발명은 상기 융합 사이토카인 GMIL18을 유효성분으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제가 자가종양백신(tumor cell based vaccine)의 반응을 증폭시키는 것을 특징으로 한다.

구체적인 예로 상기 융합 사이토카인 GMIL18을 함유하는 자가종양백신의 항암 효과를 검정하였다. 융합 사이토카인 GMIL18은 종양의 크기와 f-luc의 수치에서 도 예방뿐만 아니라 치료에도 종양의 성장 속도가 감소하였으며 비장 조직에서는 매우 작은 종양 결절과 비교적 깨끗한 비장을 확인하였다. 도 9 및 10을 참조한다.

본 발명에 따른 재조합 사이토카인(cytokine) 융합 단백질은 자가이식 항암 백신뿐만 아니라 DNA 백신(DNA vaccine), 아데노바이러스를 이용한 백신(adenovirus based vaccine) 등 여러 분야의 항암면역치료 영역에서 활용 될 수 있을 것으로 기대 된다.

본 발명에 따른 백신 보조제는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 기능과 인터 로이킨 18(IL18) 유전자의 기능을 동시에 갖는 기능이 향상된 재조합 사이토카인(cytokine) 융합 단백질을 제공함으로써 미세 암세포에 대항하는 치료학적 효과뿐만 아니라 예방학적인 효과를 동시에 해결 할 수 있을 것으로 기대 된다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[실시예 1] 융합 사이토카인 GMIL18 클로닝 및 융합 단백질의 제조

융합 사이토카인 GMIL18 발현 플라스미드를 제작하기 위하여 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 17개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal peptide)을 함유하고 있는 서열번호 2의 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편을 클로닝하였다.

먼저, GMCSF(kpn1)-Forward(서열번호 4) 5`- CCGGGGTACCATGGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTC-3` 프라이머와 GMCSF(EcoR1)-Revers (서열번호 5) 5`- CCGGGAATTCTTTTTGGCCTGGTTTTTTGC-3`프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 62℃에서 30초, 72℃에서 40초를 35 회 반복하여 증폭된 PCR 생산물을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편을 확인하였다. GMCSF PCR 생산물을 정제하기 위해 3M 아세트산나트륨(Sodium acetate)을 GMCSF PCR 생산물의 1/10 부피로 넣어주고 100% 에탄올을 3배의 부피로 넣어준 후 30분간 -20℃에 보관한 후, 13,000 RPM으로 원심분리하여 생성된 PCR 펠릿과 함께 침전된 불순물(salt)을 70% 에탄올을 이용하여 제거하였다. 상기 GMCSF PCR 생산물 펠릿을 건조시킨 후 3차 증류수로 녹여 Kpn1과 EcoR1 제한효소를 처리하고 37℃ 배양기에서 3시간 반응시킨 후, 제한효소로 절제된 GMCSF PCR 생산물을 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. 상기 전기영동된 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후 DNA 밴드를 UV 램프하에서 절제하여 절제된 아가로스 겔을 QAIGEN gel elution kit를 이용하여 Kpn1과 EcoR1 제한효소가 처리된 정제된 순수한 GMCSF PCR 산물(서열번호 2)을 수득하였다.

또한 서열번호 3의 인터 로이킨 18(IL18) 단편을 클로닝 하기 위하여 IL-18(EcoR1) Forward 프라이머(서열번호 6) 5'-CCCGAATTCAACTTTGGCCGACTTCACTG-3`와 IL18(Xba1) Revers 프라이머(서열번호 7) 5'-CCCTCTAGACTAACTTTGATGTAAGTTAG-3`를 이용하여 94℃에서 1분, 62℃에서 30초, 72℃에서 45초를 35회 반복하여 증폭된 PCR 생산물을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 증폭된 로이킨 18(IL18) 단편을 확인하였다. PCR 생산물을 정제하기 위해 3M 아세트산나트륨(Sodium acetate)을 IL18 PCR 생산물의 1/10 부피를 넣어주고 100% 에탄올을 3배의 부피로 넣어준 후 30분간 -20℃에 보관한 후 13000 RPM으로 생성된 IL18 PCR 펠릿과 함께 침전된 불순물(salt)을 70% 에탄올을 이용하여 제거하였다. 상기 IL18 PCR 생산물 펠릿을 건조시킨 후 3차 증류수로 녹여 Xba1과 EcoR1 제한효소를 처리하고 37℃ 배양기에서 3시간 반응시킨 후, 제한 효소로 절제된 IL18 PCR 생산물을 1.2% 아가로스 겔 상에 서 전기영동하였다. 상기 전기영동된 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후 DNA 밴드를 UV 램프하에서 절제하여 절제된 아가로스 겔을 QAIGEN gel elution kit를 이용하여 Xba1과 EcoR1 제한효소가 처리된 정제된 순수한 IL18 PCR 산물(서열번호 3)을 수득하였다.

상기 수득된 GMCSF PCR 산물과 IL18 PCR 산물을 pCMV 벡터에 클로닝하기 위하여 우선 pCMV 벡터를 Kpn1 과 Xba1 제한 효소로 이중 절단을 하여 전기영동과 겔 분리를 시행하여 Kpn1 과 Xba1 제한 효소가 처리된 정제된 순수한 pCMV 벡터를 수득하였다. 상기 수득된 pCMV 벡터와 IL18 단편, GMCSF 단편을 한 튜브에 넣고 T4 DNA 라이게이즈 5 unit 첨가하여 4℃ 저온 챔버에서 12시간 반응 후 결합시켰다. 상기 반응 후 결합된 DNA(pCMV-GMIL18)은 E. Coli 내로 형질전환 시킨 후 카나마이신 50ug/ml이 포함된 LB 고체배지에서 형질전환된 E. Coli를 선별하여 카나마이신 50ug/ml이 포함된 액체배지에서 배양하여 pCMV-GMIL18(서열번호 1)을 추출하였다.

상기 추출된 pCMV-GMIL18은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF) 유전자의 17개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal peptide)을 함유하고 있는 서열번호 2를 이용하여 인터 로이킨 18(IL18)를 세포 밖으로 분출 할 수 있게 클로닝된 것이다.

상기 클로닝 된 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 가지는 인터 로이킨 18(IL18)단편 EcoRI 제한효소(EcoRI site)로 서로 연결하여 재조합 융합 사이토카인 DNA를 단백질 발현용 벡터에 클로닝하여 단백질 발현을 유도하였다.

상기 유도된 단백질로부터 분리된 재조합 융합 사이토카인 단백질을 GMIL18로 명명하였다.

[ 실시예 2] 융합 사이토카인 GMIL18 의 웨스턴 블롯 및 기능 분석

대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 고유의 능력을 확인하기 위하여 NSF-60의 세포의 증식을 시킬 수 있는지를 확인하였다.

NSF-60 세포는 GMCSF 의존적 세포로서 세포의 배양액 내에 GMCSF의 함량에 따라 증식 속도의 차이가 형성된다. NSF-60 세포를 96 웰 플레이트에 1X10⁴ 세포씩 각 웰에 50ul씩 분주 하고 GMIL18이 포함된 배양액(RPMI1640)을 NSF-60이 존재하는 웰에 첨가하여 24 시간 후 XTT 어세이 키트를 이용하여 37℃ 세포배양기 내에서 4시간 반응시켰다. 세포의 성장 속도를 확인하기 위해 ELISA Reader 기를 이용하여 450nm 파장으로 세포의 증식을 확인하였다.

도 3에서 확인한 바, NSF-60의 세포의 증식을 시킬 수 있는지에 대한 검증한 결과 대조군인 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF) 단백질을 직접 처리한 군과 비교하여 거의 같은 결과의 세포의 증식을 도와주는 것으로 확인됨으로써 융합 사이토카인 GMIL18은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 능력을 갖고 있는 것을 확인하였다.

그리고 또 다른 사이토카인인 인터 로이킨 18(IL18)의 고유의 능력을 확인하기 위하여 Balb/c 마우스들의 비장을 적출 하여 이를 다시 1차 배양을 하기 위해 비장을 비장림프구(splenocyte)로 만든 후 감마인터페론(interferon gamma)의 분비 를 ELISA를 통하여 확인하였다. 그 결과 융합 사이토카인 GMIL18이 감마인터페론(interferon gamma)의 분비를 촉진 시킨 것을 확인하였다. 결국 융합 사이토카인 GMIL18은 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 기능과 인터 로이킨 18(IL18)의 기능을 동시에 갖고 있다는 것을 확인 할 수 있었다.

융합 사이토카인 GMIL18의 대장암 세포에서의 단백질 분비능력 확인하였다. 각각의 대장암 세포를 6 웰 플레이트에서 5X10⁵ 세포씩 배양한 후 500 MOI 씩의 ad-GMIL18(adenovirus-GMIL18)를 배지 위에 첨가해 주었다. 약 12시간 후 배양액을 수거 하여 15% SDS page gel 상에 30ul 씩 로딩 하였다. 전기 영동된 SDS page gel은 Bio-RAD membrane transfer 장비를 이용하여 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전달시켰다. 상기 단백질이 전달된 멤브레인은 TBST buffer에 5% skin milk로 만든 blocking solution에 넣어 약 2시간 동안 흔들면서 blocking 하고 TBST buffer로 약 15분간씩 3번의 워싱을 수행 한 후 GMCSF 1차 항체를 1:1,000 비율로 희석된 TBST buffer 하에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 15분간 3번 반복 워싱을 수행하고 2차 항체를 1:2,000 비율로 희석하여 1시간동안 처리하고 다시 15분간씩 3번의 워싱을 하였다. 단백질 분석을 위해 ECL solution을 멤브레인에 떨어뜨려 발색 한 후 chemiluminescence system 장비인 Las-3000(fujifilm) 하에서 1분30초간 노출 시켜 단백질 밴드를 확인하였다.

도 4의 결과에서 확인한 바, 아데노바이러스(adenovirus)에 클로닝된 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF), GL18 및 융합 사이토카인 GMIL18을 대장암 세포 line 에 접종하여 배양 후, 배양 배지를 이용하여 웨스튼 블롯(western blot)을 실시한 결과 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)와 융합 사이토카인 GMIL18 단백질은 발현양도 많을 뿐만 아니라 세포 밖으로 많은 양의 단백질을 분비하는 단백질 분비능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)의 신호서열(signal peptide)에 인터 로이킨 18(IL18)을 융합한 GL18(GMCSF signal peptide + mature form IL18)은 배양 배지에서 단백질이 분비되지 않고 세포 분획에서만 단백질이 분비되는 것을 확인하였다.

[ 실시예 3] 융합 사이토카인 GMIL18 의 여러 휴면 세포주에서의 단백질 분비능의 확인

대장암, 전립선암 및 위암 세포에서 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector)를 이용하여 유전자 전달을 확인하였다.

대장암(DLD1, HCT8, HCT15, SW620,HT29, SW480), 전립선암(DU145) 및 위암(SUN68) 세포를 6 well plate에 각각 1X10⁵ 세포씩 분주한 후, 배양액은 최소한으로 하기 위해 각 well 당 1ml씩 첨가해 주고 adenovirus을 각 세포에 500 MOI가 되게끔 세포위에 첨가해 준다. 이때 사용한 아데노바이러스는 형광발현유전자(enhanced green fluorescent protein, EGFP)가 발현하는 ad-EGFP와 GMIL18이 발현하는 ad-GMIL18 아데노바이러스를 감염한 후, 24시간 지난 후에 IF 현미경을 통하여 EGFP 발현 및 세포 배양액의 일부를 채취하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 실시하여 세포 밖으로 분비되는 GMIL18 발현량을 확인하였다.

도 5의 결과에서 확인한 바, 융합 사이토카인 GMIL18 유전자의 전달이 매우 잘 되고 있다. 대장암, 전립선암 및 위암 세포주에서 높은 농도로 융합 사이토카인 GMIL18 단백질이 세포 밖으로 잘 분비되는 것을 확인하였다.

[ 실시예 4] 융합 사이토카인 GMIL18 의 항암 효과 검정

CT26 마우스 대장암 세포주(5X10⁴)에 대조군은 pCDNA 4 벡터만을 이용하여 감염시켰고, 실험군은 pCDNA 4 벡터와 융합 사이토카인 GMIL18을 발현하는 플라스미드를 클로닝한 재조합 플라스미드를 이용하여 감염시켰다. 상기 대조군과 실험군의 마우스의 대퇴부에 피하 주사하여 종양의 발생 정도와 종양의 성장을 2일, 10일 및 13일 결과를 비교 분석하였으며, 감염 24시간 후, 배양 배지를 이용하여 ELISA 분석하여 GMIL18의 생성 농도를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 확인한 바, 융합 사이토카인 GMIL18의 실험군이 대조군에 비하여 종양의 크기 및 IVIS image에서도 낮은 루시퍼라이제(luciferase) 활성도를 보이는 것을 확인하였으며, 이는 항암 효과가 탁월하다는 것을 보여주는 결과이다.

[ 실시예 5] 융합 사이토카인 GMIL18 의 실험관 내( in vitro ) 항암 효과 검정

먼저 성숙된 수지상 세포(maturation of Dendritic cell)에 마우스 CT26 종양세포 내 융합 사이토카인 GMIL18이 감염된 세포를 혼합 배양하여 실험관 내(in vitro) 항암효과를 확인하였다. 성숙된 수지상 세포와 마우스 CT26 종양세포 내 융합 사이토카인 GMIL18이 감염된 세포의 혼합 배양 비율은 2 : 1의 비율로 혼합하여 배양하고 이틀 후, 형광세포분석기((Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS) 로 수지상 세포의 표면에 표지된 인자들을 분석하였다.

CD11c은 수지상 세포에서 성숙된 수지상 세포로 가는 지표로서 CD11c는 수지상 세포의 성숙을 저해하는 표지인자이므로 성숙 된 수지상 세포에 있어서 CD11c의 수가 감소하게 된다.

그 결과 도 7에서 확인한 바, 본 연구결과에 따라 혼합 배양한 수지상 세포에서 CD11c가 매우 낮게 감소되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 T 세포 공동자극 마커(co-stimulator maker)인 CD86 과 수지상 세포 이동 마커(migration maker)인 CCR7 표지인자의 수치는 증가하는 것을 확인하였다. 이는 T 세포의 유도 후 림프노드로의 이동이 잘 이루어져 항암효과를 더욱 증가시키는 것을 확인한 것이다.

[ 실시예 6] 융합 사이토카인 GMIL18 의 생체 내( in vivo ) 항암 효과 검정

마우스 CT26 종양세포 내 융합 사이토카인 GMIL18이 감염된 세포에 의해 생체 내(in vivo) 에서 마우스에 종양을 형성 시킨 후 종양 주변에 준비된 세포를 피하 주사하고 2일 후에 마우스를 희생시켜 종양 부위의 조직을 파라핀 블락(paraffin block)을 만들어 이를 이뮤노스테이닝(immunostain)을 하여 CD4+, CD8+를 관찰하여 융합 사이토카인 GMIL18에 의해 T-Cell 들이 종양 주위로 침투하는 지에 대한 조사하였다.

그 결과 도 8에서 확인한 바, 융합 사이토카인 GMIL18에 의해 CD4+ 와 CD8+의 종양 내에 침투가 증가되는 것을 확인하였다.

[ 실시예 7] 융합 사이토카인 GMIL18 을 함유하는 자가종양백신의 항암 효과 검정

융합 사이토카인 GMIL18을 함유하는 자가종양백신을 예방적 방법과 치료학적 인 방법으로 처리하였을 때 항암효과를 확인하였다.

먼저, 상기 예방적 방법은 자가종양백신(autologous tumor vaccine)을 제작 준비하여 종양의 전이가 되기 전에 면역법(immunization)을 실시하고, 종양의 전이가 된 후에 종양 크기와 IVIS imaging를 이용하여 일주일에 두 번 간격으로 추적 조사하여 대조구와 비교하였다.

상기 치료학적인 방법은 자가종양백신(autologous tumor vaccine)을 종양의 전이가 된 후부터 면역법(immunization)을 실시하였다. 상기 면역법(immunization)은 마우스의 좌. 우 대퇴부에 번갈아 가면서 피하 밑으로 주입하는 방식을 사용하였고 종양 백신에 사용 되는 세포의 수는 약 2X10⁶ cells을 사용하였다.

상기 예방접종 스케줄(vaccination schedule)에 따라 종양의 전이 전 한 번의 예방접종과 종양의 전이 후 4번의 예방접종을 한 후 예방적 또는 치료적인 방법에 따른 백신의 효과를 검증하였다.

그 결과 도 9에서 확인한 바, 종양의 크기와 f-luc의 수치에서 융합 사이토카인 GMIL18을 처리한 그룹에서 종양의 성장 속도가 효과적으로 줄어들고 있음을 확인하였으며 대조군과 실험군을 비교해 보면 예방적 모델이 치료적인 모델에 비해 더욱 효과적인 것을 확인하였다.

[ 실시예 8] 미세 암전이 마우스 모델에서 융합 사이토카인 GMIL18 을 함유하는 자가종양백신의 항암 효과 검정

미세 암전이 마우스의 복강을 직접 개복하여 마우스의 비장에 1X10⁴ CT26 세포를 반 절개한 비장에 직접 HBSS 100ul와 같이 주입하였다. 개복 후 1X10⁴ CT26 세포를 주입한 비장 부위는 겸자로 분리하여 남아있는 비장부위에 침범하지 못하게 하였다. 상기 CT26 세포가 주입된 부위의 비장은 혈관을 고정 클립으로 고정하고 절제해서 제거하였고 그 후 바로 개복된 복강을 봉합하였다. 마취제는 갈로란(galloran)을 사용하여 흡입 마취와 케타민과 럼푼을 같이 사용하였다.

상기 실시예 7와 동일하게 종양의 전이 후 4번의 예방접종을 한 후 약 17일째 대조구의 마우스들의 IVIS imaging이 매우 높은 수준으로 확인되는 시점을 기준으로 마우스를 희생시킨 후 전체 비장을 모두 확인하였다.

그 결과 도 10에서 확인한 바, 미세 암전이 마우스에서 CT26 세포를 주입한 비장에서 매우 빠른 속도로 종양이 성장하였으며, 또한 종양 성장 시간도 매우 짧은 시간이 소요되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 대조구 그룹에서는 복강에 복수가 있었으며 종양 결절이 매우 크고 많은 수의 결절이 형성된 것을 확인하였다. 그러나 융합 사이토카인 GMIL18을 처리한 그룹에서는 비장 조직에서 매우 작은 종양 결절이 확인되었고, 비장이 비교적 깨끗한 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에 따른 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 인터 로이킨 18(IL18)단편으로 재조합된 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질 서열을 나타낸 것이고,

(A: GMIL18 재조합 융합 사이토카인, B: GMCSF 단편 , C: IL18 단편)

도 2는 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 클로닝을 위한 모식도이고,

도 3은 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 웨스턴 블롯(Western blot) 및 기능분석 결과를 보여주는 것이고,

도 4는 사람의 대장암(human colon cancer cells)에서의 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 세포 밖으로의 분비능을 확인한 결과이고,

도 5는 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 대장암, 전립선암, 위암 세포로의 단백질의 분비능을 확인한 결과이고,

도 6은 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 항암효과를 루시퍼라이제(luciferase)의 활성도로 확인한 결과이고,

도 7은 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 항암효과를 실험관 내(in vitro) 확인 결과이고,

도 8은 암세포 조직에서의 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 T Cell 분화 유도를 확인 결과이고,

도 9는 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질을 발현하는 자가이식 항암백신의 예방 및 치료에 따른 결과를 보여주는 것이고,

도 10은 미세 암전이 마우스 모델에서 본 발명에 따른 GMIL18 재조합 융합 사이토카인 단백질의 자가종양백신의 효과를 보여주는 결과이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Cytokine fusion protein and vaccine Vaccine adjuvant composition containing same for treating cancer <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> GMIL18 fusion protein <400> 1 Met Trp Leu Glx Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 Thr Asp Glu Phe Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile 130 135 140 Arg Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val 145 150 155 160 Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr 165 170 175 Arg Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala 180 185 190 Val Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys 195 200 205 Asn Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp 210 215 220 Asp Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His 225 230 235 240 Asn Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala 245 250 255 Cys Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp 260 265 270 Glu Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln 275 280 285 Ser <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> GMCSF protein fragment <400> 2 Met Trp Leu Glx Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His 20 25 30 Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val 35 40 45 Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys 50 55 60 Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser 85 90 95 Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr 100 105 110 Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu 115 120 125 Thr Asp 130 <210> 3 <211> 157 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> IL18 protein fragment <400> 3 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSF forward primer <400> 4 ccggggtacc atggcaccca cccgctcacc catcactgtc 40 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSF reverse primer <400> 5 ccgggaattc tttttggcct ggttttttgc 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL18 forward primer <400> 6 cccgaattca actttggccg acttcactg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL18 reverse primer <400> 7 ccctctagac taactttgat gtaagttag 29

Claims

서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 대식세포 콜로리 자극인자(GMCSF)단편과 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 인터 로이킨 18(IL18)단편이 5′에서 3′ 방향으로 융합되어 있는 재조합 융합 사이토카인 단백질.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,

상기 재조합 융합 사이토카인 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 사이토카인 단백질.
제 1항에 따른 재조합 사이토카인 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 종 양의 치료 또는 예방용 백신 보조제.
제 5항에 있어서,

상기 종양은 대장암, 전립선암, 위암으로부터 선택되는 1종 이상의 종양인 것을 특징으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제.
제 5항 또는 6항에 있어서,

상기 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제는 자가종양백신(tumor cell based vaccine), DNA 백신(DNA vaccine), 아데노바이러스를 이용한 백신(adenovirus based vaccine)로부터 선택되는 하나 이상의 백신의 반응을 증폭시켜 특징으로 하는 종양의 치료 또는 예방용 백신 보조제.