KR20230034175A

KR20230034175A - Tpp-pcl-tpp 나노입자를 포함하는 면역활성증진 조성물

Info

Publication number: KR20230034175A
Application number: KR1020220110054A
Authority: KR
Inventors: 이주영; 강한창; 석진경
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2023-03-09

Abstract

본 발명은 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP 나노입자 (TPCL-NP)의 면역활성능에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TPCL-NP를 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물 및 항암제 병용 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 선천성 면역의 활성화 및 후천성 면역반응을 효과적으로 유도하여 면역증진 및 개선에 유용하게 사용될 수 있으며, 더 불어 항암 면역능을 유도하므로 항암 요법의 효과를 증진시킬 수 있다.

Description

TPP-PCL-TPP 나노입자를 포함하는 면역활성증진 조성물{COMPOSITION FOR ENHANCING IMMUNE ACTIVITY COMPRISING TPP-PCL-TPP NANOPARTICLES}

본 발명은 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP 나노입자 (TPCL-NP)의 면역활성능에 관한 기술로, 보다 상세하게는 TPP-PCL-TPP 나노입자를 포함하는 면역보조제 조성물 및 항암제 병용 약학 조성물을 제공한다.

생체는 병원미생물 또는 그 생성물, 음식물, 화학물질, 약, 꽃가루 등의 외래물질이나 자신의 이상세포, 노폐조직 등을 면역반응을 통해 제거함으로써 항상성을 유지한다. 하지만, 면역기능이 정상적이지 않을 경우, 감염, 알레르기, 자가면역질환, 악성 종양 등의 반응이 나타날 수 있다.

면역은 세포와 세포가 만들어내는 물질이 담당하며, 면역을 담당하는 세포에는 과립구(granulocyte), 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), 수지상세포(dendritic cell), 림프구(lymphocyte) 등이 있다. 대식세포는 외부 물질이 침입했을 때 가장 먼저 반응하며, 활성화되면 체내에 침입한 병원 미생물이나 암 세포에 대하여 탐식능(phagocytosis)을 나타내거나 직접적인 살상기능 즉, 항미생물 활성(antimicrobial activity) 및 항종양 활성(antitumor activity)을 나타낸다. 수지상세포는 침입한 이물질의 정보를 T 세포에 알리는 강력한 항원제시능을 가진 세포로, 온몸 조식에 널리 분포되어 있다. 이러한 과정에서 염증성 사이토카인을 분비한다.

한편, 백신은 항원에 대한 면역반응을 생성하도록 하기 위해 사용되는 의약품으로서, 최근 개발되고 있는 백신들은 주로 재조합 단백질(recombinant protein)을 항원으로 사용하고 있다. 재조합 단백질은 사균 백신이나 약독화 생백신에 비하여 부작용이 적고 안전하지만 면역원성이 낮으므로 감염 방어에 충분한 면역력을 생성하기 위해 백신용 면역보조제(vaccine adjuvant)를 함께 사용하고 있다.

트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)은 미토콘드리아 막을 통과하여 미토콘드리아 내로 들어갈 수 있는 대표적인 물질로, 비타민, 코엔자임(coenzyme) Q10과 같은 다양한 화학물질과 화학적으로 결합하여 미토콘드리아 표적약물전달체로 개발되고 있다. 하지만, 이의 면역활성능에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

대한민국 등록특허 제10-1173042호 (2012년08월13일 공고)

본 발명의 목적은 우수한 면역활성능을 가진 면역보조제 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제 치료 효과를 증진시키는 항암제 병용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP)를 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물을 제공한다.

본 발명은 항암제; 및 하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP);를 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP)를 포함하는 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50이다.

본 발명에 따른 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP 나노입자 (TPCL-NP)는 TPP와 달리 수지상세포의 면역 활성화를 유도하는 바, 선천성 면역의 활성화 및 후천성 면역반응을 효과적으로 유도하여 면역증진 및 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 TPP-PCL-TPP 나노입자에 항암제를 봉입시킬 수 있어 항암제 투여시 병용하면, 항암제의 효과와 더불어 항암면역능을 유도하므로 항암 요법의 효과를 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리페닐포스포늄(TPP)과 TPP-PCL-TPP 나노입자(TPCL-NP) 처리에 따른 IL-1β의 생성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 트리페닐포스포늄(TPP)과 TPP-PCL-TPP 나노입자(TPCL-NP) 처리에 따른 NLRP3 인플라마좀의 활성화 정도를 IL-1β의 생성과 caspase-1 생성으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리페닐포스포늄(TPP)과 TPP-PCL-TPP 나노입자(TPCL-NP) 처리에 따른 NLRP3 인플라마좀의 활성화 정도를 pyroptosis 생성으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 TPP-PCL-TPP 나노입자(TPCL-NP) 처리에 따른 암조직의 부피 및 무게의 변화를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자들은 생체적합성과 생분해성 갖는다고 알려진 소수성 고분자인 폴리(입실론-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone), PCL)의 양 말단에 미토콘드리아 표적기인 TPP를 화학적으로 결합시켜 아령모양의 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자 및 이의 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 상기 나노입자가 면역활성능을 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP)를 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.

본 명세서에서, 미토콘드리아 표적약물전달체인 트리페닐포스포늄 (triphenylphosphonium; TPP)이 생분해성 소수성 고분자인 폴리(입실론-카프로락톤) [poly(ε-caprolactone; PCL)의 양 말단에 공유결합한 TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자가 자기조립을 통해 형성된 나노입자를 "TPCL-NP"로 명명한다.

본 명세서에서, "자기조립(self-assembly)"이란, 각각의 성분들이 자발적으로 구성요소 간의 상호작용에 의해 일정한 나노 구조를 이루는 것으로, 그 방법은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법 모두를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "면역보조제(adjuvant)"란, 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다.

상기 조성물은 수지상세포의 면역 활성을 유도할 수 있다.

상기 조성물은 암 질환 치료용 또는 면역질환 치료용일 수 있다.

구체적으로, 상기 암 질환은 간암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 위암, 대장암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 면역질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식, 혈관염, 사구체신염, 전신성 홍반루푸스 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.

상기 약학 조성물에 있어서, 상기 항암제는 면역항암제, 세포독성항암제 및 표적항암제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 명세서에서, "면역항암제"는 암세포가 인체의 면역체계를 회피하지 못하도록 하거나 면역세포가 암세포를 더 잘 인식하여 공격하는 약물로, 바람직하게는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4를 표적하는 면역체크포인트억제제를 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 면역항암제는 이필리무맙(ipilimumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "세포독성항암제"는 정상세포에 비해 빠른 속도로 무분별하게 분열하는 암세포를 공격하여 항암효과를 나타내는 약물로, DNA에 직접 결합하여 그 구조를 손상시키는 알킬화제(alkylating agents), DNA 대사 과정을 억제하는 대사길항제(antimetabolites), DNA 회전효소를 억제하는 DNA 회전효소 억제제(topoisomerase inhibitors), 염색체 분리과정을 억제하는 미세소관 저해제(microtubule-targeting agents) 등을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 세포독성항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 에노시타빈(enocitabine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "표적항암제"는 정상세포와 차이가 나는 암세포의 특정 부분을 표적으로 하여 암세포만을 선택적으로 공격하는 약물로, 세포 표면에 작용하는 단클론항체(monoclonal antibody) 계열 약물과 세포 내부에 작용하는 소분자 화합물(small molecule compound) 계열 약물을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 표적항암제는 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 리툭시맙(rituximab), 브렌툭시맙(brentuximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 이매티닙(imatinib), 아파티닙(afatinib), 세리티닙(ceritinib), 토파시티닙(tofacitinib), 소라페닙(sorafenib), 파조파닙(pazopanib) 및 템시롤리무스(temsirolimus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암 질환은 간암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 위암, 대장암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 면역보조제 조성물 또는 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 나노입자의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등으로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 상세하게는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 주사제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 상기 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 항산화제를 더 첨가할 수 있다. 상기 항산화제로는 티아민(thiamin, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 나이아신(niacin, 비타민 B3), 판토펜산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6) 및 코발라민(cobalamin, 비타민 B12) 등의 비타민 B군의 화합물과 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 면역보조제 조성물 또는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물은 암 질환 또는 면역질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

상기 조성물은 암 질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> TPP-PCL-TPP (TPCL) 고분자의 합성

TPCL 고분자는 기존의 방법과 동일하게 합성하였다.

상세하게는, 폴리(입실론-카프로락톤) (PCL)의 양 말단에 있는 수산화기(OH)와 미토콘드리아 표적기인 TPP를 포함하는 4-카르복시부틸트리페닐포스포늄 브로마이드(4-Carboxybutyltriphenylphosphonium bromide; carboxybutyl TPP·Br)의 카르복실기(COOH)를 화학적으로 결합시켜 얻었다. 예로, 분자량 1250 달톤 또는 2000 달톤인 폴리카플로락톤디올(PCL-diol) 0.2g을 2mL의 클로로포름(chloroform)에 녹이고, PCL-diol의 수산화기 몰 수의 3배에 해당하는 carboxybutyl TPP·Br, 4-(디메틸아미노)피리딘[4-(dimethylamino)pyridine; DMAP], 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC]를 따로 미량의 트리에틸아민(triethylamine, TEA)과 함께 8mL의 클로로포름에 녹였다. carboxybutyl TPP·Br를 포함하는 용액을 2시간 동안 교반해 카르복실기를 활성화시키고, 이 용액에 미리 준비된 PCL-diol 용액을 첨가하여 추가적으로 48시간 더 교반시켰다. 분자량 1.25kDa인 PCL(PCL_1.25kDa)을 포함하는 고분자 반응용액은 에테르(ether)에 침전시키고, 분자량 2kDa인 PCL(PCL_2kDa)을 포함하는 고분자 반응용액은 노르말 헥산(n-hexane)에 침전시켰다. 침전된 물질을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 같은 부피의 정제수를 첨가하여 투석을 통해 고분자를 정제하였고, 얻어진 고분자용액을 동결건조하여 TPP-PCL_1.25kDa-TPP(TPCL1) 고분자와 TPP-PCL_2kDa-TPP(TPCL2) 고분자를 얻었다.

<실시예 2> TPCL 나노입자 (TPCL-NP) 제조

얇은 막 수화(Thin-film hydration) 방법으로 유리 바이알에 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium; TPP)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-TPP (TPP-PCL-TPP; TPCL) 고분자를 2 mg/ml (2 mg)이 되도록 메탄올에 녹였다. 증발기를 이용하여 30℃에서 메탄올을 휘발시켜 박막을 만들었다. 1 mg/ml 이 되도록 증류수를 첨가하고 탐침소니케이터를 이용하여 나노입자를 만들었다. (3분 pulse on/3초 pulse off, 총 3분, amp 20%)

형성된 TPCL-NP의 크기와 제타전위는 제타사이저 기계를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1과 같다.

TPCL-NP의 입자크기 및 제타전위
입자크기 (nm)	다분산도	제타전위 (mV)
42.7±11.9	0.203	70.8

<실시예 3> TPCL-NP의 면역활성능 확인

미토콘드리아 표적물질인 TPP와 TPCL-NP가 면역세포를 활성화시키는지를 IL-1β의 생성 정도로써 확인하였다.

마우스 골수유래 수지상세포에 LPS 100 ng/ml을 4시간 동안 노출시킨 후, TPP 및 TPCL-NP를 각각 5, 10, 25 및 50 μg/ml로 처리하고 1시간 후에 세포 밖으로 분비된 IL-1β의 양을 확인하였다. 양성대조군으로는 ATP (5 mM)를 처리하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, TPP는 IL-1β의 분비를 유도하지 않았지만, TPCL-NP는 농도의존적으로 IL-1β의 분비를 증가시켰다. 동일한 미토콘드리아 표적물질이라도 TPP는 수지상세포의 활성화를 유도하지 않았으나, TPCL-NP는 수지상세포의 활성화를 유도함을 확인하였다.

NLRP3 인플라마좀의 활성화는 면역세포 활성화의 중요한 기전이다. 따라서 TPCL-NP가 NLRP3 인플라마좀의 활성에 영향을 미치는지 확인하였다. 마우스 골수유래 수지상세포에 LPS 100 ng/ml을 4시간 동안 노출시킨 후, TPP 및 TPCL-NP를 각각 5, 10, 25 및 50 μg/ml로 처리하고 1 시간 후에 세포내의 pro-IL-1β, pro-caspase-1 와 배지로 분비된 IL-1β와 caspase-1 의 발현정도를 확인하였다. 양성대조군으로는 ATP (5 mM)를 처리하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, TPCL-NP는 세포내 pro-IL-1β, pro-caspase-1 단백질 감소 및 IL-1β, caspase-1의 세포외분비를 증가시켰지만 TPP는 세포내 pro-IL-1β, pro-caspase-1 단백질 변화 및 IL-1β, caspase-1의 세포외분비를 유도하지 않았다. TPCL-NP는 수지상세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성화를 유도하였고, 동일한 미토콘드리아 표적물질이라도 TPP는 NLRP3 인플라마좀 활성화를 유도하지 않음을 확인하였다. TPCL-NP에 의한 면역세포 활성능은 양성대조군인 ATP와 TPCL-NP 25 μg/ml에서 유사한 정도였다.

Pyroptosis는 면역세포 활성화의 또 다른 지표로써, NLRP3 인플라마좀의 활성화에 의해 유도된다. 따라서 TPCL-NP에 의한 pyroptosis 유도를 확인하기 위해, pyroptotic pathway의 주요 구성 요소인 Cleaved Gasdermin D의 발현을 확인하였다. 마우스 골수유래 수지상세포에 LPS 100 ng/ml을 4시간 동안 노출시킨 후, TPP 및 TPCL-NP를 각각 5, 10, 25 및 50 μg/ml로 처리하고 1시간 후에 세포내의 Cleaved Gasdermin D를 측정하였다. 양성대조군으로는 ATP (5 mM)를 처리하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, TPCL-NP 50 μg/ml 처리시 Cleaved Gasdermin D의 발현을 증가시켰지만 TPP는 Cleaved Gasdermin D의 발현을 유도하지 않았다.

이를 통해, 미토콘드리아표적 나노입자인 TPCL-NP는 수지상세포의 면역활성화를 유도하였으며, 이를 통하여 면역시스템 활성화에 기여할 것으로 예상된다.

<실시예 4> TPCL-NP의 항암효능 확인

TPCL-NP를 처리한 수지상세포와 항암제를 병용투여했을 때 항암제 효능을 증진시킬 수 있는지 확인하기 위해서 동종이식 마우스 동물모델을 사용하였다. 7주령 C57BL/6 마우스에 B16/F10 (murine melanoma cell line, 마우스 흑색종 세포주)를 5 x 10⁵ cells/mouse로 하여 오른쪽 등 측면에 피하 주사하였다. 암덩어리의 높이, 폭, 길이를 일주일에 2번씩 측정하여, 공식 V = 4/3π (높이/2*폭/2*길이/2)를 적용하여 부피를 계산하였다.

마우스의 골수세포를 채취하여 수지상세포로 분화시키고, 세포 활성화를 위하여 LPS (100 ng/ml) 또는 TPCL-NP (10 μg/ml)을 처리하였다. 항원으로 ovalbumin (200 μg/ml)를 1시간 처리하였다. 종양을 피하 주사한 마우스의 왼쪽 측면에 이들 수지상세포 (1 x 10⁶ cells/mouse)를 종양투여 day 7. day 14, day 21에 3번 피하 주사하였다. 수지상세포 투여한 날에 항암제인 anti-PD-L1 항체 (30 μg/mouse)(Bioxcell, BE0101 InvivoMAb anti-mouse PD-L1(B7-H1)) 또는 대조군으로 IgG를 복강 주사하였다. 처리군은 다음과 같다: (1) 수지상세포를 투여하지 않은 군(no DCs), (2) 수지상세포와 IgG 투여군, (3) LPS 4시간 처리한 수지상세포와 IgG 투여군, (4) LPS 4시간 처리 후 TPCL-NP 1시간 처리한 수지상세포와 IgG 투여군, (5) LPS 4시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군, (6) LPS 4시간 처리 후 TPCL-NP 1시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군. Day 22에 마우스의 암 조직을 분리하여 무게를 측정하였다.

도 4A에 나타난 바와 같이, 다른 투여군에서 암조직의 부피가 시간에 따라 증가한 반면, 투여군(6) LPS 4시간 처리 후 TPCL-NP 1시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군에서는 암조직 부피 증가가 감소했다. 특히, TPCL-NP가 없는 투여군(5) LPS 4시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군에서는 암부피 증가의 억제가 나타나지 않은 반면, TPCL-NP를 처리한 투여군(6) LPS 4시간 처리 후 TPCL-NP 1시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군에서는 암부피 증가 억제가 관찰되었다.

또한, 도 4B에 나타난 바와 같이, TPCL-NP를 처리하지 않은 (5) LPS 4시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군에 비하여 TPCL-NP를 처리한 (6) LPS 4시간 처리 후 TPCL-NP 1시간 처리한 수지상세포와 anti-PD-L1 투여군에서 암조직 무게가 현저히 감소하였다.

이를 통해, TPCL-NP을 수지상세포에 처리하여 수지상세포가 면역활성화되면 항암제의 효능을 증폭시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, TPCL-NP는 항암제와 병용투여시 항암요법의 효과를 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP)를 포함하는 면역보조제(adjuvant) 조성물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
수지상세포의 면역 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 면역보조제 조성 물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
암 질환 치료용 또는 면역 질환 치료용인 것을 특징으로 하는, 면역보조제 조성물.
항암제; 및
하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP);를 포함 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.
제 4 항에 있어서,
상기 항암제는,
면역항암제, 세포독성항암제 및 표적항암제로 이루어진 군에서 선택되는 어 느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 면역항암제는,
PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4를 표적하는 면역체크포인트억제제인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 면역항암제는 이필리무맙(ipilimumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab) 및 더발루맙(Durvalumab)으로 이루어진 군에서 선택 되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 세포독성항암제는,
젬시타빈, 카페시타빈, 시타라빈, 데시타빈, 에노시타빈, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신 및 미톡산트론으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 표적항암제는,
세툭시맙, 트라스투주맙, 이브리투모맙, 리툭시맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 이매티닙, 아파티닙, 세리티닙, 토파시티닙, 소라페닙, 파조파닙 및 템시롤리무스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 암 질환은,
간암, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 위암, 대장암, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암, 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 고분자가 자기조립된 나노입자(TPCL-NP)를 포함하는 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물:
<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 3 내지 50임.