KR101158908B1 - 아스피린 불내성 천식의 위험성과 연관된 ｃｅｐ68 유전자 변이체 - Google Patents

아스피린 불내성 천식의 위험성과 연관된 ｃｅｐ68 유전자 변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스피린 불내성 천식의 위험성과 CEP68 유전자 다형성의 연관성 분석에 관한 것이다. 본 발명은 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한, 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자; 및 CEP68 해플로타입을 제공한다. 또한, 본 발명은 단일염기변이를 갖는 CEP68 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다. 본 발명은 CEP68 유전자 다형성을 분석함으로써 아스피린 불내성과 연관된 천식의 진단 및 예측이 가능함을 제시하며, 이는 장차 신약개발, 질병진단 및 치료분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아스피린 불내성 천식의 위험성과 연관된 ＣＥＰ68 유전자 변이체{CEP68 gene variants associated with risk of aspirin-intolerant asthma}
본 발명은 아스피린 불내성 천식의 위험성과 연관된 ＣＥＰ68 유전자 변이체에 관한 것이다.
아스피린(아세틸살리실산)은 항염증 치료뿐만 아니라 통증 및 발열을 완화하는 진통제로 사용되어 왔다. 천식의 약 20%가 아스피린 및 다른 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAIDs)에 민감성이 있다. 아스피린-불내성 천식(AIA)은 아스피린 또는 다른 NSAIDs 투여 후 급성 기관지 경련을 동반한 특이한 임상 징후로서 1922년에 처음 발표되었다. AIA는 아스피린 과민성, 기관지 천식 및 비용종증(nasal polyposis)을 동반하는 만성 비이관염의 증후군을 특징으로 한다. 상부 기도(respiratory tract )로부터 하부 기도까지의 AIA의 진행은 상부 및 하부 기도 내의 강한 호산구성 침윤과 함께 지속적 천식 징후를 동반한다. 일반적으로 AIA는 약 30세에서 시작되고 여성에게서 보다 빈번히 발생한다. 치료제로서는, 류코트리엔(leukotriene) 수용체 길항제가 AIA의 장기간 관리를 위한 일차 약물로 잘 알려져 있다.
최근 연구에서, 아스피린 과민성은 LTC4, LTD4, 및 LTE4와 같은 염증유발성 시스테인 류코트리엔(CysLTs)의 과생산과 관련되어 있을 가능성이 있다는 보고가 있었다. CysLTs는 류코트리엔 합성경로 또는 5-리폭시지나제(lipoxygenase) 경로를 통하여 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다. 아스피린은 아라키돈산을 프로스타글란딘으로 변환시키는 사이클로옥시지나제 경로를 차단하고, 결국 아라키돈산 대사물을 5-리폭시지나제 경로로 바꾼다. 따라서, CysLT 수용체 및 아라키돈산 캐스케이드 관련 효소/단백질은 천식에서 아스피린 불내성의 주 표적으로 간주되어 왔다. 유전학적 연구에서는, 시스테인 류코트리엔 수용체 2, 트롬복산 A2 수용체, 및 프로스타글란딘 E3 수용체 아형 2의 다형성(polymorphism)이 AIA와 연관되어 있음이 확인되었다. 류코트리엔 C4 합성효소 (LTC4S) 및 아라키도네이트 5-리폭시지나제 (ALOX5) 의 유전적 다형성은 집단 및 다형성 유전자좌에 따라 AIA와 양성적으로 또는 음성적으로 연관되어 있다. 아라키도네이트(arachidonate) 경로에서의 유전자뿐만 아니라, 면역반응 및 염증 경로에서의 TNF, HLA-DPB1, TBX21, ACE, IL-10/TGF 및 NLRP3 유전자의 유전적 변이도 천식에서 아스피린 과민성과 연관되어 있다. 이러한 결과들은 이전에 생각했던 것보다 다른 경로의 유전자들의 유전적 변이가 천식에서의 아스피린 과민성의 발생과 더욱 관련될 수 있음을 제시해준다.
최근에, 전체 유전체 연관성 분석(GWAS; Genome-wide association studies)은 사람 질환 및 약물 치료에 대한 임상적 반응과 연관된, 유전체 전체에서의 유전적 변이를 예측하기 위한 기술로서 부각되었다. 최근, 천식 관련 GWAS는 PDE4D 및 IL1RL1과 같은 몇 개 민감성 유전자를 발견하였다. AIA의 경우, 최근 대부분의 유전학적 연관성 분석은 후보 유전자 접근방법을 통하여 수행되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 AIA의 전체적 병인을 보다 이해하기 위하여 전체 유전체 연관성 분석 및 천식의 아스피린 불내성의 추가연구를 수행하였다.
최근, CEP68(Centrosomal protein 68 kDa, CRTAC1이라고도 함)는 연골세포에서 발현되고 중심체 응집에 작용하는 것으로 보고되었다. CEP68은 두 상이한 전사체로 폐와 뇌에서 발현되며, 세포외 기질 분자로도 기능한다. 또한, 흡연이 천식의 요인이라는 가정하에, CEP68이 주변 흡연에 노출된 후 다르게 발현된다는 보고가 있었다. 그러나, CEP68의 기능을 아직 잘 이해하지 못하고 있었다. 이에 본 발명자들은 CEP68이 천식에서 아스피린 불내성과 연관되어 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아스피린 불내성 천식과 연관된 유전자 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 변이체를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위해서, 본 발명은 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한, 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 제공한다.
본 발명자들은 CEP68 유전자가 천식에서 아스피린 불내성 발생의 양성 위험성 인자임을 확인하였다. 본 발명자들은 오류-양성 SNP 수를 줄이고 통계적 검증력을 가지기 위해서 2단계의 전 유전체 분석 및 추가 연구를 이용하였다. 본 발명에서 로지스틱 및 회귀 분석은 CEP68 유전자의 변이체와 AIA의 유의성있는 연관성을 산출하였고, 상기 유전자의 nonsynonymous SNP rs7572857이 가장 낮은 P값을 가진 것으로 나타났다. 또한, AIA 피검자에서 해플로타입 CEP68_ht4(T-G-A-A-A-C-G)가 ATA 대조군에 비해 보다 빈번하였고, AIA와 유의성있는 연관성을 나타냈다. 특히, rs7572857에서 유래된 4번째 위치의 “A”는 해플로타입 CEP68_ht4에서만 확인되었다. 따라서, 이들 결과는 CEP68의 유전자 변이체가 AIA의 발병가능성에 중요한 역할을 할 수 있음을 강하게 제시한다.
일 구체예에서, 상기 단일염기변이는 rs7572857 G>A임을 특징으로 한다. 상기 단일염기변이는 글리신을 세린으로 치환한다.
본 발명에서, CEP68의 다형성이 아스피린 유발에 의한 FEV1 감소에 미치는 효과를 조사한 결과, rs7572857 G>A 변이체의 동형접합 AA가 다른 변이체 보다 AIA 환자의 FEV1 감소의 현저한 증가를 보였으며, 이는 글리신으로부터 세린으로의 변화가 아스피린 유발에 의한 FEV1을 더 크게 감소하는 데 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. 구체적으로, CEP68 유전자의 엑손 2에서 Gly74Ser 치환은 단백질 구조의 극성에 영향을 미칠 수 있고(도 3), 그럼으로써 AIA에서 염증유발성 시스테인 류코트리엔의 생산에 중요한 역할을 하는 ALOX5와 같은 다른 분자들과의 상호작용을 조절하거나, CEP68 단백질 자체의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 추가 기능 부위 예측에 의하면, 74Gly 및 74Gly 부근을 포함한 아미노산이 일부 kinase의 표적이 될 수 있음을 발견하였다 (도 3). 특히, SH 도메인은 몇몇 조절자(regulator)의 특이한 서열이기 때문에, 글리신으로부터 세린으로의 변화는 다른 조절자와의 관계에서 중요한 역할을 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단일염기변이는 rs2302647 C>T임을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 단일염기변이는 rs2252867 A>G임을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 단일염기변이는 rs2723087 T>A임을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 단일염기변이는 rs6741255 T>C임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은
아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 해플로타입으로서,
CEP68 유전자의 염기변이가 유전자의 번역개시점을 기준으로 -13405번째 염기가 T, -299번째 염기가 G, +79번째 염기가 A, +220번째 염기가 A, +1704번째 염기가 A, +10327번째 염기가 C, +12718번째 염기가 G임을 특징으로 하는 CEP68 해플로타입을 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은
서열번호 1 및 2; 서열번호 4 및 5; 서열번호 10 및 11; 서열번호 13 및 14; 및 서열번호 16 및 17로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 아스피린 불내성 천식 진단 키트를 제공한다.
상기 아스피린 불내성 진단 키트는
서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은
단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 방법은
i) 피험자로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
ii) CEP68 유전자의 SNP를 지노타이핑하는 단계를 포함할 수 있다.
참고로, 본 발명에서 사용된 용어의 약어는 아래와 같다.
AIA: Aspirin-intolerant asthma
AIA-I: Intermediate AIA
ATA: Aspirin-tolerant asthma
GWAS: Genome-wide association studies
SNP: Single nucleotide polymorphism
LD: Linkage disequilibrium
FEV1: Forced expiratory volume in 1 second
NSAID: Non-steroidal anti-inflammatory drug
CysLT: Cysteinyl leukotriene
LTC4S: Leukotriene C4 synthase
ALOX5: Arachidonate 5-lipoxygenase
OAC: Oral aspirin challenge
SAS: Statistical Analysis System
본 발명은 CEP68 유전자 다형성을 분석함으로써 아스피린 불내성과 연관된 천식의 진단 및 예측이 가능함을 제시하며, 이는 장차 신약개발, 질병진단 및 치료분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CEP68의 유전자 지도, 해플로타입 및 LD 플롯을 도시한 것이다. A. CEP68의 유전자 지도 및 그것의 표적 SNPs; B. CEP68의 해플로타입, 플로타입의 연관성 빈도가 > 0.05인 경우 표 3에 나타냄; C. CEP68의 LD 플롯.
도 2는 CEP68의 rs7572857G>A이 아스피린 유발에 의한 FEV1 감소에 미치는 효과를 도시한 것이다. 수직 분포는 CEP68 유전자에서 nonsynonymous SNP (rs7572857G>A)의 각 유전자형에서 아스피린 유발에 의한 FEV1의 %감소의 평균 SE 값을 나타낸다. 희귀 대립유전자의 동형접합자는 FEV1감소의 현저한 증가를 보였다.
도 3은 74Gly과 74Ser의 나선형 휠 투영(Helical Wheel Projection) 및 물성, 그리고 모티프 검색을 나타낸 것이다. Gly74Ser의 나선형 휠 투영은 Expert Protein Analysis System (ExPASy)에 의해 제시된 것이다. 74Gly (A) 에서 74Ser (B)으로의 변화는 가까운 극성 아미노산과의 상호작용 때문에 극성의 증가를 나타냈다. 글리신과 세린의 고체 표면 에너지 및 수증기/H20 분배 정도를 비교하였다. C. 기능적 부위를 위한 74Gly를 포함하는 모티프 및 74Gly에 근접한 모티프를 예측 프로그램(http://elm.eu.org/index.html)을 사용하여 확인하였다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 피검자의 선정
본 발명에서는 피검자를 순천향대학교, 중앙대학교, 충남대학교, 충북대학교 및 서울대학교에서 모집하였다. 모든 피검자들은 한국인이었다. 모든 환자들은 의사가 진단하였고, 세계천식관리지침(Global Initiative for Asthma guideline)에 제시된 천식의 정의를 충족하였다. 모든 환자들은 사전 12 개월 동안 호흡장애 및 천명의 병력과 함께 하기 중 하나의 증상을 보였다: (1) 단기작용 기관지 확장제의 흡입 후 FEV1 15% 이상의 증가 또는 12% 이상의 증가, (2) 10 mg/mL 미만의 PC20 메타콜린, 및 (3) 2주간의 흡입 스테로이드 및 장기작용 기관지 확장제의 처리 후 FEV1 20% 이상의 증가. 피부단자검사(skin prick test)를 위하여 24 일반 흡입 알레르겐을 사용하였다. 전체 IgE를 CAP 시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)으로 측정하였다. 아토피는 직경 3mm 이상의 두드러기 반응으로 정의된다. 천식 환자들은 경구 아스피린 투여(oral aspirin challenge; OAC) 6주 이전에 천식 악화 및 기도 감염을 경험하지 않았다. OAC는 이전 방법과 약간 다른 방법을 사용하여 증가된 양의 아스피린으로 수행하였다. FEV1의 변화는 마지막 아스피린 투여 후 5시간 동안 이어졌다. 아스피린 유도성 기관지 경련은 FEV1 %의 감소로 나타난 바와 같이 [(투여 전 FEV1 - 투여 후 FEV1) / 투여 전 FEV1]으로 계산할 수 있다. OAC 반응은 하기 3 그룹으로 분류할 수 있다: 20% 이상의 FEV1 감소, 또는 비안(naso-ocular) 또는 피부 반응을 동반하여 15% 내지 19%의 FEV1 감소를 나타내는 피검자들은 AIA 그룹에 속하고; 15% 내지 19%의 FEV1 감소, 또는 단지 비안 또는 피부 반응을 나타내는 피검자들은 중간 AIA(AIA-I) 그룹에 속하고; 비안 또는 피부 반응 없이 15% 미만의 FEV1 감소를 나타내는 피검자들은 ATA 그룹에 속한다.
모든 시료는 동의하에 제공되었고, 프로토콜은 각 병원의 임상시험 심사위원회( Institutional Review Board)로부터 승인을 획득하였다.
AIA, AIA-I, 및 ATA 그룹의 임상적 특징 및 비교를 표 1에 요약하였다.
Figure 112010020606751-pat00001
먼저, -15% 내지 68%의 아스피린 유도성 FEV1 감소가 확인되었다. 전 유전체 연구 및 추가연구 모두에서 AIA 및 AIA-I 환자들에서 아스피린 유발에 의한 FEV1 % 감소는 ATA 대조군의 환자들에 비해서 현저히 증가하였는데 (P < 0.0001), 이는 본 연구가 유전자 다형성과 천식에서의 아스피린 과민성 간의 연관성을 반영할 수 있음을 나타낸다. 2단계의 피검자들에서, AIA 환자들에서 예측된 FEV1 % 값 및 PC20 메타콜린은 ATA 대조군의 환자들보다 현저히 낮았지만, 총 IgE 수준은 대조군보다 더 높았다 (P < 0.01). 또한, 아스피린-불내성 천식에서 BMI의 현저한 감소가 관찰되었다. 뿐만 아니라, AIA의 첫 번째 의료검사의 평균나이는 ATA 그룹 보다 현저히 낮았다.
실시예 2: 전체 유전체 SNP 지노타입핑
80명의 AIA 환자 및 100명의 ATA 환자로부터 채취한 약 750 ng의 유전체 DNA를 사용하여 각 샘플을 Illumina's Human-1 Genotyping BeadChip (Illumina, San Diego, USA)에서 지노타이핑하였다. 지노타이핑은 Illumina's assay 매뉴얼에 따라 수행되었으며, 상기 피검자의 DNA 샘플에서 총 109,365 SNPs 유전자형을 테스트하였다. 간단히 설명하면, 각 샘플은 전체 게놈 증폭 단계, 절편화 단계, 침전 단계 및 적절한 혼성화 버퍼에서 재혼탁 단계를 거쳤다. 변성된 샘플을 준비된 Human-1 Genotyping BeadChip에서 48℃ 16시간 동안 혼성화하였다. 그 다음, 단일 염기 연장 반응을 위해 처리한 비드칩을 염색하고 Illumina Bead Array Reader에서 영상화하였다. 형광강도를 SNP 지노타입으로 변화시키기 위해서, 각 샘플에서 얻은 표준화된 비드 강도 데이터를 Beadstudio 3.0® software (Illumina)에 로딩하였다. 모든 SNP에 대한 지노타입 calling을 위한 SNP 클러스터를 Beadstudio 3.0® 소프트웨어를 이용하여 조사하였다. genotype quality threshold 통과 후 각 샘플의 전체 call rate는 98.0% 이상이었으며, 4,515 SNPs (109,365 SNPs의 4.1%)는 정확한 유전자형 결과를 제공하지 못하였다. 나머지 104,850 SNPs의 추가 품질관리 분석(나머지 104,850 SNPs)에서 5,108 단형성 SNPs 및 2,758 X 염색체 SNPs를 추가로 누락시켰고, 평균 99.9%의 평균 call rate를 가진 최종 나머지 96,984 SNPs (88.7%)를 분석을 위해 선택하였다.
각 SNPs의 종합 통계분석 및 연관성 테스트는 소프트웨어 HelixTree®를 이용하여 계산하였다. 공동우성 모델에서 ORs, 95% CI, 및 P 값과 SNP의 대립유전자 연관성의 결과로서, 가장 유의성있는 연관성을 나타낸 유전자 영역 내의 11개 SNPs를 2단계 추가연구를 위해 스크린하였다(표 2).
Figure 112010020606751-pat00002
천식 또는 아스피린 불내성과의 연관성에 대한 11개의 후보 유전자의 문헌을 조사한 결과, CIITA 및 DAF 유전자가 염증 및/또는 천식과 관련되어 있다는 일부 보고가 있었다. 또한, DCBLD2가 천식과 연관된 EGF 신호전달의 신규 티로신 인산화 표적으로 확인되었다.
실시예 3: 11개 후보 유전자의 SNP 지노타이핑
가장 유의성있는 연관성에 기반한 추가연구를 위하여, 아스피린 불내성 위험성에 대해 가장 낮은 P 값 (P < 0.0001)을 가진 유전자 내 11개의 SNP를 선별하였다. 이 연구를 위하여, 11개 후보유전자 내의 총 150개의 비-단형성 태깅(non-monomorphic tagging)-SNP (SBF1 유전자의 8개 SNPs; DCBLD2의 12개 SNPs; WDR21A의 15개 SNPs; FILIP1 유전자의 34개 SNPs; PDZK3 유전자의 2개 SNPs; LRRC43 유전자의 15개 SNPs; CIITA 유전자의 18개 SNPs; DAF 유전자의 5개 SNPs; ENPP5 유전자의 5개 SNPs; CEP68 유전자의 7개 SNPs; C6 유전자의 27개 SNPs)를 AIA-I을 포함한 총 163명의 AIA 환자들의 시료 및 429명의 ATA 대조군을 이용하여 지노타이핑하였다. 상기 SNPs를 BeadExpress® (Illumina, San Diego, USA)를 이용하여 스캐닝하였다.
초기 진단 연령, 성, 흡연 상태, 아토피, 및 BMI에 대해서 조절된 다변수 로지스틱 분석을 사용하여 천식에서 유전자형과 아스피린 불내성 간의 case/control 연관성을 분석하였다.
실시예 4: 통계학적 분석
전체 게놈 분석을 위하여, AIA 환자와 ATA 대조군 간의 유전자형 분포의 연관성을 HelixTree® 소프트웨어 (Golden Helix, Montana, USA)를 이용한 로지스틱 회귀분석으로 계산하였다.
CEP68 다형성의 연관성 분석을 위해서, 본 발명자들은 모든 쌍의 이대립인자 유전자좌 간에 Lewontin's D' (|D'|) 및 LD coefficient r 2 를 조사하였다. CEP68의 LD를 결정하기 위해 HapMap에서 Haploview v4.1 소프트웨어를 다운로드하였다.
먼저 헤플로타입을 PHASH 소프트웨어를 사용하여 평가한 다음, 통계분석시스템(SAS; Statistical Analysis System) 프로그램을 이용한 로지스틱 분석에 의해 계산하였다. 결실된 유전자형을 보유한 피검자들은 개별 SNPs 및 헤플로타입 분석에서 누락시켰다. SAS을 이용한 다변수로서, 초기 진단 연령, 성, 흡연 상태, 아토피 및 체지방지수(BMI)에 대해서 조절된 로지스틱 분석으로 AIA과 ATA 간의 유전자형의 분포를 비교하였다. 일반 대립유전자(C)를 희귀 대립유전자(R)의 이형접합자 및 동형접합자에 대한 대상 유전자로 사용하였다. 유의성있는 연관은 P 값 < 0.05로 나타내었다.
결과:
아스피린 불내성 천식의 위험성과 가장 유의성있는 연관성을 나타낸 CEP68 유전자의 SNP rs7572857
분석 결과, 실시예 3의 11개 후보유전전자 중 CEP68 유전자의 다형성이 ATA 대조군에 비해서 공동우성 모델의 AIA와 가장 유의성있는 연관성을 보였다 (표 3, P = 6.0×10-5 - 4.0×10-5). 나아가, 글리신을 세린으로 치환한 CEP68 유전자의 nonsynonymous SNP (rs7572857G>A)는 유전자의 7개 SNPs 중 가장 낮은 P 값을 나타냈다 (OR = 2.63; 95% CI = 1.64-4.21; 공동우성 모델에서 P = 6.0×10-5). 또한, rs7572857G>A은 우성 모델에서는 통계학적으로 유의성이 있었지만 (P = 0.0005), 열성 모델에서는 유의성이 없었다 (데이터 나타내지 않음). CEP68 유전자 외에 10개의 후보 유전자의 다형성에서는 유의성있는 연관성이 발견되지 않았다 (표 1 참조).
CEP68 유전자의 SNP들 간의 쌍별 비교(Pair-wise comparison)는 밀접한 연관불균형(Linkage Disequilibrium; LD)을 나타냈다 (도 1 참조). 헤플로타입을 PHASE 소프트웨어를 이용하여 유추한 후, 해플로타입과 아스피린 불내성 간의 연관성에 대한 로지스틱 분석 결과, AIA에 대한 해플로타입 CEP68 _ ht4 (T-G-A-A-A-C-G)가 ATA 보다 더 빈번하였고, 공동우성 모델 (OR = 2.63; 95% CI = 1.64-4.21; P = 6.0×10-5, 표 3 참조) 및 우성 모델 (OR = 2.49; 95% CI = 1.49-4.15; P = 0.0005) 모두에서 AIA와 유의성있게 연관되어 있었다.
Figure 112010020606751-pat00003
CEP68 유전자의 상기 7개의 SNP를 확인하기 위하여 Illumina GoldenGate Assay에 이용된 프라이머 및 프로브 서열은 아래와 같다.
CEP68 유전자의 SNPs 확인을 위한 프라이머 및 프로브 서열
CEP60의 SNPs 프라이머/프로브 서열 서열
번호
rs2302647C>T 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACGGGGAACATCAGTGCGTCCAA 1
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTGGGGAACATCAGTGCGTCCAG 2
프로브 　 GCAAAATGAACGAATGTACGATGGTTTGCCGCCAATAGAGGCGTCTGCCTATAGTGAGTC 3
rs2252867A>G 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACGCCCCACCAGCAGAAACCCAA 4
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTGCCCCACCAGCAGAAACCCAG 5
프로브 　 AGGGTCAACACAGGTCCAACATTCGTATCATTTAGTGGCGCGAGTCTGCCTATAGTGAGTC 6
rs12611491A>G 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACATGTCCAGCTCCCGCTCCCT 7
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTATGTCCAGCTCCCGCTCCCC 8
프로브 　 CAGCTCCCTCTCCCATAGACCGGGTCATGGCTCTACGGTAGTCTGCCTATAGTGAGTC 9
rs7572857G>A 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACCTGGTGGGCTCTAGAGGGGCT 10
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTCTGGTGGGCTCTAGAGGGGCC 11
프로브 　 CCAGGGTCAGTCCCAATCGAACGTCCAGGGTCCTATGCTAGTCTGCCTATAGTGAGTC 12
rs2723087T>A 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACGCTCTGTCATGCTGAAGCTGGAAA 13
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTGCTCTGTCATGCTGAAGCTGGAAT 14
프로브 　 CAGTCCCTTACCTCTGAGAAGAATCGCCCCTTGTGAGTAGCAGGTCTGCCTATAGTGAGTC 15
rs6741255T>C 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACGCCCTGGGCACTGGCTTTCT 16
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTGCCCTGGGCACTGGCTTTCC 17
프로브 　 CAGCTTCCCAGTGTCTGGGTCCCTGGAACCAACGACCTGTGTCTGCCTATAGTGAGTC 18
rs10496123G>A 프라이머 정방향 ACTTCGTCAGTAACGGACAGCATCTGAACCTTGGCATGTCA 19
역방향 GAGTCGAGGTCATATCGTAGCATCTGAACCTTGGCATGTCG 20
프로브 　 TTTATTTAAGCCTTATGCCCAAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCGTCTGCCTATAGTGAGTC 21
아스피린 유발에 의한 FEV 1 의 감소에 대한 CEP68 유전자의 SNP rs7572857 의 효과
회귀분석 결과, CEP68 유전자의 유전자형은 아스피린 유발에 의한 FEV1 감소와도 유의성있게 연관되어 있었다. 4개의 SNPs rs2302647, rs2252867, rs2723087, 및 rs6741255는 동형접합성 일반 대립유전자에 비해서 동형접합성 희귀 대립유전자에서 약 2배 이상 증가된 FEV1 감소와 유사한 분포 패턴을 보였다 (표 5 참조). 그러나, rs7572857G>A의 경우, nonsynonymous 뉴클레오티드 치환이 희귀 대립유전자의 동형접합자에서 약 4배 증가의 상이한 분포를 보였으며(도 2 참조), 이는 rs7572857이 다른 변이체 보다 아스피린 유발에 의한 더 높은 FEV1 감소에 보다 강력한 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
Figure 112010020606751-pat00004
실시예 5: 아스피린 불내성 천식 진단 키트 및 정보제공방법
본 발명에서는 상기 표 5의 FEV1 감소 효과가 우수한 SNPs rs7572857G>A, rs2302647 C>T, rs2252867 A>G, rs2723087 T>A, 및 rs6741255 T>C의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 아스피린 불내성 천식 진단 키트를 제조하였다.
즉, 서열번호 1 및 2; 서열번호 4 및 5; 서열번호 10 및 11; 서열번호 13 및 14; 및 서열번호 16 및 17로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 및 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 포함하는 아스피린 불내성 천식 진단 키트를 제조하였다.
아스피린 불내성 천식이 의심되는 환자(피검자)의 혈액으로부터 DNA를 추출한 후, 상기 CEP68 유전자의 SNPs의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 지노타이핑함으로써, 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다.
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
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  8. 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 해플로타입으로서,
    CEP68 유전자의 염기변이가 유전자의 번역개시점을 기준으로 -13405번째 염기가 T, -299번째 염기가 G, +79번째 염기가 A, +220번째 염기가 A, +1704번째 염기가 A, +10327번째 염기가 C, +12718번째 염기가 G임을 특징으로 하는 CEP68 해플로타입.
  9. 서열번호 1 및 2; 서열번호 4 및 5; 서열번호 10 및 11; 서열번호 13 및 14; 및 서열번호 16 및 17로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 아스피린 불내성 천식 진단 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는, 아스피린 불내성 천식 진단 키트.
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  13. 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법에 있어서,
    상기 단일염기변이는 rs7572857 G>A임을 특징으로 하는, 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법에 있어서,
    상기 단일염기변이는 rs2302647 C>T임을 특징으로 하는, 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법에 있어서,
    상기 단일염기변이는 rs2252867 A>G임을 특징으로 하는, 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법.
  16. 단일염기변이를 갖는 CEP68(Centrosomal protein 68 kDa) 유전자를 사용하여 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법에 있어서,
    상기 단일염기변이는 rs6741255 T>C임을 특징으로 하는, 아스피린 불내성 천식의 진단 또는 예측을 위한 정보제공방법.
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