KR101082138B1

KR101082138B1 - 아스피린 과민성 천식 진단용 ｉｌ17ｒａ 유전자 다형성 마커

Info

Publication number: KR101082138B1
Application number: KR1020100029429A
Authority: KR
Inventors: 박춘식; 신형두
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-11-09
Also published as: KR20110109630A

Abstract

본 발명은 IL17RA 유전자 다형성을 이용하는 아스피린 과민성 천식 진단용 마커, 아스피린 과민성 천식 진단용 일배체형 마커, 진단 키트 및 이를 이용한 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 아스피린 과민성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며, 천식의 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아스피린 과민성 천식 진단용 ＩＬ17ＲＡ 유전자 다형성 마커{IL17RA GENE POLYMORPHISMS MARKER FOR DIAGNOSING ASPIRIN INTOLERANT ASTHMA}

본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 마커, 아스피린 과민성 천식 진단용 일배체형 마커, 진단 키트 및 이를 이용한 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

아스피린-과민성 천식(Aspirin-intolerant asthma :AIA)이란 아스피린 또는 다른 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAIDs)의 섭취 후에 천식환자들에게서 기관지수축이 발생하는 것이다. 이러한 증후군은 ‘아스피린 삼징후’, 즉 아스피린 과민성, 기관지 천식, 및 비강 용종증(nasal polyposis)를 동반하는 만성 과형성성 호산성의 부비동염(sinusitis)를 특징으로 한다. 다른 천식환자들처럼, AIA를 가진 환자의 기도는 뚜렷한 호산성을 가지는 지속적인 염증, 상피의 파열, 사이토킨 과잉 생산, 및 염증 분자의 상향조절의 징후를 보인다.

사이토킨은 천식의 병인에서 중요한 신호 분자이다. 그러나, AIA 표현형에 대한 다른 염증 매개자 및 분자들의 유전적인 민감성을 조사하는 연구는 드물었다. 인터루킨 17A 수용체인 IL17RA는 인터루킨 17A에 낮은 친화력으로 바인딩하는 타입 I 막 당단백질이다. IL-17A에 의한 p38유사 분열로 활성화된 단백질 키나아제의 활성화는 산화질소 합성효소 및 COX-2 유전자의 상향조절(upregulation) 결과를 낳는다. IL-17RA와 IL-17RB의 활성화는 천식에서 염증 및 리모델링 과정을 담당하는 유전자의 발현을 조절하는 JNK, p38 MAPK, 및 핵 인자 (NF)-KB를 유도한다.

IL-17RA와 B의 생물학적 효과를 고려하면, IL-17RA의 유전적 변이는 천식과 그것의 하부표현형(subphenotypes)의 발생에 있어 역할을 할 수 있다. 그러나, IL-17RA에 있는 다형성과 천식환자들에게 있는 아스피린 과민성 사이의 잠재적인 연관성에 대한 분석은 없었다. 그래서, 본 발명자들은 IL17RA 유전자의 유전적 다형성을 조사하고, 천식환자들에서 아스피린 과민성에 대한 잠재적인 후보자들로서 이 좌위를 평가하였다. SNPs를 한국인 군집에서 분석하였고, 통계학적 분석을 수행하여 천식 및 아스피린 과민성에 대한 유전적 효과를 조사하였다.

본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 다형성 마커, 일배체형 마커 및 진단 키트 및 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 73번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 73번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식(Aspirin Intolerant Asthma : AIA) 진단용 인터루킨 17 수용체 A(Interleukin 17 receptor A: 이하 IL17RA) 유전자 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 79번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 79번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3을 갖는 IL17RA 게놈 유전자 내에서 선택되며, 번역 시작점(서열번호 3의 134번째 염기)으로부터 -50번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 -50번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 다형성 마커 및 상기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 73번째 염기가 G; 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 79번째 염기가 G; 서열번호 3을 갖는 IL17RA 게놈 유전자 내에서 선택되며, 서열번호 3의 84번째 염기가 T; 서열번호 3의 1959 번째 염기가 C; 서열번호 3의 5507 번째 염기가 G; 서열번호 3의 9952 번째 염기가 A; 서열번호 3 의 14546번째 염기가 C;및 서열번호 3의 14965 번째 염기가 T인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 일배체형(haplotype) 마커 및 상기 일배체형 마커를 검출할 수 있는 프로브나 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및 3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계;를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기와 같이 IL17RA 유전자의 -1075 A>G, -947 A>G 및 -50 C>T 다형성 마커 및 일배체형 마커는 천식환자들에게 있어서 아스피린 과민성과 밀접한 관련이 있으므로, 이를 측정함으로써 아스피린 과민성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며, 아스피린 과민성 천식의 예방 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 염색체 22q11.1에 위치한 IL17RA 유전자의 다형성 부위를 나타낸 염색체 지도이다.
도 2는 제 1 실험군 피검자들의 일배체형을 나타낸 것이다.
도 3은 제 2 실험군 피검자들의 일배체형을 나타낸 것이다.
도 4는 총 실험군 피검자들의 일배체형을 나타낸 것이다.
도 5는 제 1 실험군 피검자들의 IL17RA 다형성 사이의 연관 불평형 계수(LDs)를 나타낸 것이다.
도 6은 제 2 실험군 피검자들의 IL17RA 다형성 사이의 연관 불평형 계수(LDs)를 나타낸 것이다.
도 7은 총 실험군 피검자들의 IL17RA 다형성 사이의 연관 불평형 계수(LDs)를 나타낸 것이다.
도 8은 천식환자에서 IL17RA의 -1075 A>G, -947 A>G 및 -50 C>T 다형성과 아스피린 시험 투여에 의해 유도된 FEV2(%) 감소와의 연관성을 나타낸 것이다. P값은 공변수로서 연령(연속 값), 성별(남성=0, 여성=1), 흡연 상태(비흡연자=0, 과거 흡연자=1, 흡연자=2) 및 아토피 상태(비아토비=0, 아토피=1)를 제어하는 선형 회귀 분석을 사용하여 얻었다.
도 9는 PCR 프라이머의 다이아그램을 나타낸 것이다.
도 10은 IL17RA 과 PGK 1 의 용융 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 천식 환자의 hPBMCs에서 -1075 A>G, -947 A>G 및 -50 C>T 유전자형에 따른 IL17RA 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 12는 단핵구 사이의 CD14+ 관문을 나타낸 것이다.
도 13 내지 도 15는 3가지 SNPs를 가지는 천식 환자에서 나온 단핵구 사이의 IL17RA 발현 수준을 비교한 것이다.
도 16은 AIA와 ATA 환자에서 아스피린 농도에 따른 단핵구에서 IL17RA 발현 변화를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 다형성 마커를 제공한다. IL17RA 유전자의 다형성 마커가 될 수 있는 SNPs는 -1075A>G(서열번호 1의 73번째 염기가 A 또는 G), -947A>G(서열번호 2의 79번째 염기가 A 또는 G), -50C>T(서열번호 3의 84번째 염기가 C 또는 T), +1826C>T(서열번호 3의 1959 번째 염기가 C 또는 T), +5374G>A(서열번호 3의 5507 번째 염기가 G 또는 A), +9819A>G(서열번호 3의 9952 번째 염기가 A 또는 G), +14413C>T(서열번호 3 의 14546 번째 염기가 C 또는 T), +14832T>C(서열번호 3의 14965 번째 염기가 T 또는 C), +16795C>T(서열번호 4의 16928 번째 염기가 C 또는 T), +16896G>T(서열번호 3의 17029 번째 염기가 G 또는 T), +19827G>C(서열번호 3의 19960 번째 염기가 G 또는 C), +20480T>C(서열번호 3의 20613 번째 염기가 T 또는 C), +21699A>G(서열번호 3의 21832 번째 염기가 A 또는 G), +23316G>A(서열번호 3의 23449 번째 염기가 G 또는 A), +25108A>G(서열번호 3의 25241 번째 염기가 A 또는 G)다.

상기와 같이 동정된 IL17RA 15개의 SNP[-1075A>G, -947A>G, -50C>T, +1826C>T, +5374G>A, +9819A>G, +14413C>T, +14832T>C, +16795C>T, +16896G>T, +19827G>C, +20480T>C, +21699A>G, +23316G>A, +25108A>G]와 천식환자들 중에 아스피린 과민성과의 연관성을 비교 분석한 결과 -1075A>G, -947A>G, -50C>T가 밀접한 연관성을 보였다.

또한, 본 발명은 상기 다형성 마커 중 어느 하나 이상을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 일배체형 마커를 제공한다. 상기 IL17RA 일배체형 마커는 서열번호 1의 73번째 염기(번역시작점으로부터 -1075번째)가 G, 서열번호 2의 79번째 염기(번역시작점으로부터 -947번째)가 G, 서열번호 3의 84번째 염기(번역시작점으로부터 -50번째)가 T, 서열번호 3의 1959 번째 염기(번역시작점으로부터 +1826번째)가 C, 서열번호 3의 5507 번째 염기(번역시작점으로부터 +5374번째)가 G, 서열번호 3의 9952 번째 염기(번역시작점으로부터 +9819번째)가 A, 서열번호 3 의 14546 번째 염기(번역시작점으로부터 +14413번째)가 C, 서열번호 3의 14965 번째 염기(번역시작점으로부터 +14832번째)가 T 인 것이다. 상기 번역시작점은 서열번호 3의 134번째 염기이다.

본 발명에서는 IL17RA 다형성들의 유전자형 분석 및 일배체형 재구성을 통하여 일배체형을 분류한 후 이에 대한 분석을 수행하였고, 그 결과 BL1_ht1 만이 천식환자들 중에 아스피린 과민성과 유의적으로 연관되어 있음을 관찰하였다(표 4참조).

또한, 본 발명은 상기 일배체형 마커를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 IL17RA 유전자의 -1075A>G, -947A>G 및 -50C>T 다형성 부위 중 어느 하나 이상을 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 다형성 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 일배체형 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트를 제공한다.

상기 프로브 또는 프라이머쌍은 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및 3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

단계 2에 있어서, 다형성 부위를 검출하는 방법은, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화 분석, 대립 유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR) 분석, 다이나믹 대립유전자 혼성화(dynamic allele-specific hybridization, HASH) 분석, PCR 연장 분석 및 TaqMan 프로브 PCR 분석방법 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법들은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 피검자 선정

본 발명에서 피검자는 한국에 있는 4개 대학 병원으로 이루어진 천식 유전체 연구 센터로부터 모집하였고, 모든 피검자는 한국인이었다. 모든 환자는 의사에게 진단받은 환자였고, 세계천식기구(GINA) 가이드라인에 설정된 천식의 기준을 충족시켰다. 모든 환자는 지난 12개월 동안 호흡곤란과 헐떡임의 병력이 있었고, 15% 이상의 1초간 노력성 호기량(FEV1) 또는 단기-활성의 기관지확장제를 200ml 더 흡입하여 12% 이상 증가하거나; 10 mg/ml 미만의 PC20 메타콜린; 또는 스테로이드와 장기-활성 기관지확장제를 흡입을 2주 동안 처리했을 때 20% 이상의 FEV1 증가를 더 가졌다. 24가지 일반 흡입 알러젠(예를 들면, 먼지, 고양이털, 개털, 바퀴벌레, 풀, 나무, 두드러기 쑥 꽃가루와 같은)(Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)에 대해 피부 테스트를 수행하였다. 총 IgE는 CAP시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)에 의해 측정되었다. 아토피는 피부 테스트로부터 하나 이상의 양성 반응 (>3mm 직경)으로 정의하였다. 천식 환자들은 경구 아스피린 도전(OAC)를 진행한 6 주 이내에 질병의 발작 및 호흡기 감염을 경험하지 못했다. 경구 유발 검사는 종래의 방법을 약간 변형한 방법을 사용하여 아스피린의 함량을 증가(10-450mg Astrix; 호주, 멜버른, 메인 약품사(Mayne Pharma Ltd.))시키면서 수행하였다.

FEV1 변화가 아스피린을 최종 투여한 후 5시간 동안 지속되었다. 아스피린으로 유도된 기관지경련(bronchospasms)은 [투여 전 FEV1]-[투여 후 FEV1]/[투여 전 FEV1]으로 계산하였다. OAC 반응에 의해, FEV1에서 15% 이상 감소하거나 피부 반응이 나타나면 아스피린 과민성 천식(AIA)이고, 눈코사이(naso-ocular)나 피부 반응이 일어나지 않고 FEV1에서 15% 이하의 감소를 보이면 아스피린-내성 천식(ATA)으로 분류하였다.

제 1 실험군과 제 2실험군을 포함하여 1146명의 천식 환자들이 포함되었다. 피검자들의 임상학적 특징들을 표 1에 요약하였다. ATA 와 AIA 그룹 사이에는 평균 연령, 성별 분포, 흡연 유발 및 BMI에서 현저한 차이가 있었다. 제 2 실험군에서만 ATA 와 AIA 그룹 사이에 DVC, FEV1, 및 log[PC20]이 큰 차이가 있었다. 아스피린을 시험투여한 후 5시간 동안 FEV1에서 최대 감소를 FEV1에서 아스피린에 의해 유도된 감소에 대한 값으로 사용하였다. FEV1에서 아스피린 유도된 감소는 -15% 내지 82% 의 범위였다.

<실시예 2> 사람 염색체 22q11.1 내에 존재하는 IL17RA 유전자의 서열 분석 및 SNP 동정

본 발명자들은 한국인 피검자들 DNA 샘플에서 SNPs(single nucleotide polymorphism)를 발견하기 뒤해 프로모터 영역을 포함하는 전장 IL17RA 유전자를 서열분석하였다. 증폭 및 서열분석을 위해 GenBank 서열(NC_000022.10)에 기초하여 프라이머 세트를 제작하여 PCR하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 IL17RA 유전자 내에서 총 15개의 SNPs를 발견하였다.

<실시예 3> 유전자형 분석

제1 실험군으로 5% 소수 대립 유전자 빈도 및 LDs 값을 고려하여 IL17RA 유전자의 15개 다형성을 선택하였고, 선택된 다형성은 143AIA 피검자와 411 ATA 피검자에서 유전자형을 분석하였다. 제 2 실험군으로, 추가적인 피검자(72 AIA 및 512 ATA)가 포함되었고, 제 1 실험 결과에서 근거한 IL17RA SNPs 4개가 유전자형을 분석하였다. 선택된 SNP는 TaqMan^TM assay를 사용하여 제노타이핑하였고, 프라이머 익스프레스(Applied Biosytem)를 사용하여 PCR 프라이머와 MGB TaqMan 프로브를 디자인하였다. 한 개의 대립 유전자 프로브는 FAM으로 표지하였고, 나머지는 VIC 으로 표지하였다. 사용한 프라이머 및 프로브 정보는 하기 표 2에 표시하였다. 900nM의 프라이머 농도와 200nM의 MGB-프로브 농도로 UNG(Applied Biosytem) 없이 TaqMan Universal Master 믹스에서 PCR을 하였다. 게노믹 DNA 20ng을 사용하여 총 반응 부피를 5㎕로 384-웰 포맷으로 반응을 수행하였다. 플레이트를 써멀 사이클러(PE 9700, Applied Biosytem)에 넣고, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 가열한 다음 95 에서 15초, 60 에서 1분으로 하여 40 사이클을 수행하였다. TaqMan assay 플레이트는 프리즘 7900 HT 기구(Applied Biosytem)로 이동시켜서 각각의 웰의 형광도(fluirescence intensity)를 기록하였다. 각각의 플레이트로부터 나온 형광 데이터 파일을 자동화된 소프트웨어(SDS 2.1)로 분석하였다.

좌위		검정 id 또는 프로브 서열	서열번호
-1075 A>G		C____337394_1_
-947 A>G		C____337392_20
-50 C>T		C___7620898_1_
+1826C>T		C___2666419_20
+5374 G>A		C__29337634_10
+9819A>G		C__30466953_10
+14413C>T		C___2666426_10
+14832T>C		C__30268888_10
+16795C>T		C___2666431_10
+16896G>T		C__34282187_10
+19827G>C		C_____12689_10
+20480T>C		C___2666438_1_
+21699A>G		C__15872337_10
+23316G>A		C__16172121_10
+25108 >G	정방향	CCCAGCCATGAAGGAACTTA	4
	역방향	TCCCAGTGTGCTGGGATTAC	5
	VIC	CCGAGGACACATTAAACGA	6
	FAM	GAGGACACGTTAAACGAAC	7

<실시예 4> 통계적 분석

본 발명자들은 이대립유전자 좌위, 르원틴 D(Lewontin's D')(|D'|) 및 r²의 모든 쌍 사이에 연관 불평형에 대해 폭넓게 사용된 측정법을 이용하였다. 개체들의 일배체형을 스테판(Stephens)에 의해 개발된 PHASE 알고리즘(ver.2.0)을 사용하여 추론하였다. 유전자형 및 일배체형 분포를 연령(연속값), 성별(남성=0, 여성=1), 아토피 상태(비-아토피=0, 아토피=1), 및 흡연 상태(비흡연자=0, 금연자=1, 흡연자=2) 및 신체 비만지수(BMI)을 공변량으로 하여 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 분석하였다. 유전자형 및 일배체형 사이에서 아스피린 투여에 따른 FEV1 감소율 변화도 로지스틱 회귀 모델을 사용해 검사하였다. 이 데이터를 SAS 버전 9.1(SAS Inc., Cary, NC) 및 SPSS 버전 10.0(SPSS Inc., Chicago, IL) 소프트웨어 패키지를 사용하여 관리, 분석하였다.

<실시예 5> 유전자 다형성 빈도 분석

본 발명의 피검자들에서 IL17RA 15개 SNP와 AIA 연관성 연구를 위해 유전자형을 분석하였다. 한국인 집단에서 15 SNPs의 열성 대립유전자 빈도 (MAFs)가 표 3에 나타나 있다. 전체 피검자 중에 IL17RA 유전자 다형성의 빈도를 표 3에 나타내었다. 모든 좌위의 분포는 하디-바인베르크 평형(P>0.01)에 있었다.

<실시예 6> 아스피린 내성 천식(ATA)과 아스피린 과민성 천식(AIA) 사이의 아스피린의 유도에 대한 IL17RA 다형성의 연관성 회귀 분석

제 1 실험군에서, IL17RA 유전자의 15개 다형성이 143AIA 피검자 및 411ATA 피검자를 포함한 554명의 천식환자들에서 아스피린 과민성의 위험의 연관성을 다중 로지스틱 회귀 분석 모델을 사용하여 분석하였다(표 4). 분석 결과, 3개의 SNPs 와 1개의 일배체형(프로모터에 있는 -1075A>G, -947A>G, 5'UTR에 있는 -50C>T 및 블록 1 에 있는 일배체형-1)이 아스피린 과민성의 위험과 관련이 있었다.

희귀 대립유전자 빈도는 ATA 보다 AIA에서 현저하게 낮았다(p<0.0005). 다중 테스트로 보정한 후에도 통계학적인 현저함은 유지되었다(p<0.01). 두 개의 일배체형(BL 1-ht5 와 BL2-ht1)은 아스피린 과민성에 대한 낮은 위험과 관련이 있었고 인트론 1에 있는 3개의 SNP(+1826C>T, +5374G>A, +9819A>G)는 아스피린 과민성에 대한 고 위험과 관련이 있었지만 다중 테스트로 보정한 후에는 이러한 관련성이 유지되지 않았다.

15 개의 SNPs 사이에서, -1075A>G, -947A>G 및 -50C>T를 포함하는 3개의 SNPs 를 AIA(n=72) 및 ATA(n=484)를 포함한 2차 유효성 실험군(n=551)에서 분석하였다. 유전적 효과의 동일한 디렉션(direction)이 관찰되었다. 비록 제 1 실험 집단에서 보다 효과의 정도가 감소하긴 하였지만(less OR=0.60-0.57 vs. 0.68), 모든 환자들에게 이 3개의 SNPs가 현저한 연관성이 있는 것으로 분석되었다.

아스피린 내성 천식(ATA)과 아스피린 과민성 천식(AIA) 사이의 아스피린의 유도에 대한 IL17RA 유전자에서의 SNP의 연관성 회귀 분석 결과는 표 4에 나타내었다.

<실시예 7> 천식환자의 CD14 포지티브 단핵구에서 IL17RA 단백질 발현의 측정

단핵 세포(PBMC)를 밀도 구배(Histopaque 1077)를 사용하여 천식 환자의 헤파린 처리된 정맥혈로부터 정제하였다. 마우스 PE-결합된(conjugated) 모노클로날 항-인간 IL17R mAb(R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 FITC-결합된 마우스 항-인간 CD14(BD Biosciences) 를 5 ×10⁵　PBMC 와 함께 배양하였고, 이후 PBS로 두번 세척하였다. 염색된 세포를 플로우 사이토미터(flow cytometer)(FACScan; Becton-Dickinson, Mountain View, CA)로 분석하였다. 아이소타입-매치된(isotype-matched) 대조군으로, PE-결합된 마우스 IgG1(R&D Systems) 및 FITC-결합된 마우스 IgG2a 카파(kappa)(BD Biosciences)를 각 실험된 항체와 동일 농도로 사용하였다.

플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 얻은 IL17RA 발현 결과를 도 12 내지 도 15에 나타내었다. CD14+ 단핵구에서의 발현은 세 그룹 사이에 현저한 차이가 있었다(공동 우성 P=0.004). -1075A>G, -947A>G, -50C>T 에서 AAC 동형접합을 가지는 천식 환자로부터 나온 CD14(+) 단핵구가 다른 그룹을 가진 것보다 현저하게 발현이 더 높았다 (Mean±.E.= 24.83±7.20, 우성 P=0.017, 도 14). 거의 모든 CD14 포지티브 단핵구가 그들의 표면에서 IL17RA 단백질을 발현하였고, CD14 단핵구에서의 IL17RA 의 포지티브 비율은 비슷하였다. 이 결과는 프로모터 또는 5'-UTR 지역에 있는 SNP가 수용체 단백질을 발현시키는 부분(fraction)이 아니라, IL17RA 유전자의 단백질 발현의 양에 영향을 준다는 것을 의미한다.

<실시예 8> RNA 추출 및 IL17RA 유전자의 실시간(Real-time) PCR

보정된 구아디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름(guanidium thiocyanate-phenol-chloroform) 추출법으로 호중성 백혈구의 총 RNA를 분리하였다. 3 ㎍의 전체 RNA로부터 RNA와 역전사된 cDNA를 정량하였다. DNase I(10,000　U/mL; Stratagene, La Jolla, CA)-처리된 RNA를 0.5 mM dNTP, 2.5 mM MgCl₂, 5　mM DTT, 1　㎕의 랜덤 헥사머(random hexamer)(50　㎍/㎕) 및 슈퍼스크립트(SuperScript) II RT(200　unit/㎕; Life Technologies, Grand Island, NY)와 함께 42℃에서 50분간 배양하여 역전사시켰고, 70℃에서 15분 동안 가열-불활성화하였다. IL17RA 유전자의 cDNA 절편은 엑손(exon) 1 내지 엑손 4를 포함했다. cDNA는 인간 PGK1(phosphoglycerate kinase1), 및 IL17RA 유전자용 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 시험관으로 실시간 PCR을 사용하여 분취(aliquote)되었다(각각 191　bp, 317　bp 절편, 도 9). 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다:

PGK1 정방향: 5'-CCTGGGCGGAGCTAAAGTTG-3'(서열번호: 8);

PGK1 역방향: 5'-AGACCTAATGTCCAAAGCTGAGA-3'(서열번호: 9);

IL17RA 정방향: 5'-CTGCGACTCCTGGACCAC-3'(서열번호: 10);

IL17RA 역방향: 5'-CTGTCCAAACTGAGGCATCA-3'(서열번호: 11)

실시간 PCR은 StepOne^TMReal-Time PCR System(Applied Biosystems, CA)으로 수행하였다. 상기 반응은 10　㎕ 마스터 믹스(master mix)(iQ SYBR Green Supermix; Bio-Rad, Hercules, CA), 200ng/㎕ cDNA 주형(template) 및 각각의 1㎕ IL17RA 유전자 프라이머 쌍으로 구성된 20㎕ PCR 혼합물로 준비하였다. 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 90℃에서 15초, 58℃에서 32초 및 72℃에서 32초를 40 사이클 수행하면서 증폭시켰다. 모든 생산물의 변성(melting) 곡선을 60℃에서 0.3℃만큼 증가하는 각 15초 사이클을 85 사이클 수행하는 증폭 후에 즉시 획득하였다. IL17RA 또는 내인성 참조 유전자(endogenous reference gene)의 역치 사이클(Ct)은 고정된 역치를 지나는 PCR 생산물의 형광발광에서 절편의 사이클 횟수로 정의하였다. 2^-△△Ct법을 사용하여, 상기 데이터는 유전자 발현의 차이 변화(fold-change)로 표현하였고, 내인성 참조 유전자(PGK1)로 정상화(normalizeed)시켰으며, 대조군과 대비하였다(IL17RA의 -1075AA, -947 AA 및-50CC 유전자형). 다른 샘플에서, 2^-△△ ^Ct 의 측정은 대조군에 비해서 유전자 발현에 있어서 접힘(fold)이 변화했다는 것을 가리킨다. 각각의 환자에서 IL17RA mRNA 발현의 접힘(fold) 차이도 2^-△△ ^Ct 법을 사용하여 계산하였다.

PBMC에 의한 IL17RA mRNA 발현에서의 이러한 다형성의 유전적 효과를 조사하기 위해, -1075A>G, -947A>G, -50C>T 를 가지는 피검자들로부터 나온 hPBMC에서의 IL17RA mRNA 수준을 측정하여 실시간 PCR을 사용하였다. IL17RA mRNA 수준의 정량화는 PGK1 강도로 보정한 후에 IL17RA 실시간 PCR 산물의 강도를 측정하였다. PBMC에서 IL17RA mRNA의 발현 수준은 -1075AG, -947AG, -50CT(n=10) 이형접합을 가지는 것과 -1075GG, -947GG, -50TT(n=8) 동형접합을 가지는 것에 비해 -1075AA, -947AA, -50CC(n=10) 동형접합을 가지는 공동 우성 모델에서 현저하였다(p=0.039, 도 11). PBMC에서 IL17RA mRNA의 발현 수준은 -1075AG, -947AG, -50CT(n=10) 이형접합을 가지는 것과 -1075GG, -947GG, -50TT(n=8) 동형접합을 가지는 것에 비해 -1075AA, -947AA, -50CC(n=10) 동형접합을 가지는 우성 모델에서 매우 현저하였다(p=0.010, 도 11).

<실시예 9> AIA 환자와 ATA 환자에서 IL17RA 단백질 발현의 플로우 사이토메트리 분석

전체 혈액의 8ml를 RPMI1640과 1:1로 희석하고, 25mM HEPES, L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100㎍/㎕ 스트렙토마이신(더모)를 보충한 후, 60mm 클린 디쉬에 희석 혈액의 4ml 분취액을 추가시켰다. ASA(Acetylsalicylic acid; Sigma Chemicla Co; St. Louis, MO) 를 최종 농도 0 또는 0.2mM 이 되도록 첨가시켰다. 플레이트를 24시간동안 5% CO2로 37℃에서 배양했다. 24시간 후에 배양한 세포를 수집하여 10분 동안 1450g 에서 원심분리하였다. 상층액을 -20℃에서 저장하였다. 펠렛은 2ml PBS에서 분산시키고 단핵구랑 중성구를 퍼콜 구배(Percoll gradient)(Sigma Chemicla Co; St. Louis, MO)를 이용하여 정제하였다. 실험은 6 AIA 와 12 ATA 각각의 혈액으로 수행하였다.

형광 염색과 플로우 사이토메트릭 분석(도 16)을 사용하여 AIA(n=6)과 ATA(n=12)에 대한 단핵구, 중성구의 표면에서 IL17RA 단백질 발현 수준을 측정하였다. AIA 와 ATA 그룹에서 ASA에 의한 IL17RA 단백질 발현 수준이 현저하게 변화하지 않았다(P>0.05, 도 16). 이 두 그룹 사이에서 IL17RA 의 후유도(postchallenge) 수준을 비교해보면, 중성구에서는 아니지만, 단핵구에서는 ATA 환자들에서보다 AIA 환자들에서 지속적으로 더 높았다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 73번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 73번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식(Aspirin Intolerant Asthma : AIA) 진단용 인터루킨 17 수용체 A(Interleukin 17 receptor A: 이하 IL17RA) 유전자 다형성 마커.
서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 79번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 79번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 다형성 마커.
서열번호 3을 갖는 IL17RA 게놈 유전자 내에서 선택되며, 번역 시작점(서열번호 3의 134번째 염기)으로부터 -50번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 -50번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 다형성 마커.
서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 73번째 염기가 G; 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 선택되며, 상기 서열에서 79번째 염기가 G; 서열번호 3을 갖는 IL17RA 게놈 유전자 내에서 선택되며, 서열번호 3의 84번째 염기가 T; 서열번호 3의 1959 번째 염기가 C, 서열번호 3의 5507 번째 염기가 G, 서열번호 3의 9952 번째 염기가 A, 서열번호 3 의 14546번째 염기가 C 및 서열번호 3의 14965 번째 염기가 T인 아스피린 과민성 천식 진단용 IL17RA 유전자 일배체형(haplotype) 마커.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 다형성 마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트.
제 4항의 일배체형 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 상기 일배체형 마커를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단 키트.
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 및
3) 단계 2)의 검출 결과와 정상인의 다형성 부위 검출결과를 비교하는 단계;를 포함하는 아스피린 과민성 천식을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.