KR101136480B1 - 신규한 클루이베라 인터미디아 ｄｓ-ｅｂｎ-ｇｂｉ 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 - Google Patents

신규한 클루이베라 인터미디아 ｄｓ-ｅｂｎ-ｇｂｉ 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 클루이베라 인터미디아(Kluyvera intermedia) DS-EBN-GBI 균주와 그 균주의 배양방법 및 이를 포함하는 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 작물에 병해를 유발하는 병원성 곰팡이의 생육을 저해시키는 항진균성 물질을 직접 생산하는 기능을 갖는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주와 그 균주의 배양방법 및 그 균주를 포함하는, 식물의 병해 예방 효과가 향상된 미생물 제제에 관한 것이다.

Description

신규한 클루이베라 인터미디아 ＤＳ-ＥＢＮ-ＧＢＩ 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제{NOVEL KLUYVERA INTERMEDIA DS-EBN-GBI AND MICROBIAL AGENT COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규한 클루이베라 인터미디아(Kluyvera intermedia) DS-EBN-GBI 균주와 그 균주의 배양방법 및 이를 포함하는 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 작물에 병해를 유발하는 병원성 곰팡이의 생육을 저해시키는 항진균성 물질을 직접 생산하는 기능을 갖는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주와 그 균주의 배양방법 및 그 균주를 포함하는, 식물의 병해 예방 효과가 향상된 미생물 제제에 관한 것이다.
일반적으로 비옥한 토양에는 농업적으로 이용할 수 있는 기능을 갖는 많은 유효미생물들이 서식하고 있으며 그중에서도 특성이 우수한 균주를 식물 생육 촉진성 세균(Plant Growth Promoting Bacteria, PGPB)이라 하여 따로 추출 및 배양한 다음 작물의 성장촉진제나 비료로 이용하고 있다. PGPB 균주로 선별되는 미생물로는 옥신이나 지베렐린과 같이 작물생육을 촉진시킬 수 있는 물질을 생성하는 것과 각종 작물에 병을 유발하는 병원성 미생물의 생육을 억제시키거나 혹은 항생물질을 분비하여 병원균을 사멸시킬 수 있는 기능을 갖는 길항 미생물들이 주로 이용되고 있다. 이러한 유효미생물은 일반적으로 식물의 생장에 필요한 각종 효소, 생리활성물질, 아미노산, 핵산 등을 분비하여 식물의 뿌리에 직접 또는 간접으로 흡수되어 다수확에 기여함과 동시에 수확물의 맛, 향기, 색깔, 저장성 증대 등 품질향상과 영양분 함량에도 크게 공헌하고 있는 것으로 잘 알려져 있다.
식물의 성장을 증진하는 능력을 가진 PGPR 세균은 대부분 Pseudomonas 속으로 알려졌지만 Anthrobacter 속, Alcaligenes 속, Serratia 속, Rhizobium 속, Agrobacterium 속 및 Bacillus 속 등도 보고된 바 있다.
상기의 PGBR 세균들은 식물 호르몬 분비에 의한 식물 성장촉진 및 신속한 군체형성(colonization)에 의하여 식물 뿌리 부근에 응집되어 식물병의 침입을 막는데, 이는 siderophore를 생성하여 병원균이 이용할 철분을 흡착함으로써 병원균의 생육을 저해하는 것으로 알려졌다. 미생물이 생성하는 siderophore는 간접적으로는 착합된 철을 해리시켜 식물체의 철 양분에 기여하기도 하며 직접적으로는 철과 결합한 siderophore를 그대로 흡수하여 철 양분에 기여하기도 한다. 특히 식물 근권에서 철의 이용도에 따라 미생물의 생육과 발달이 영향을 받기 때문에 미생물이 생성하는 siderophore는 토양병원성 미생물이나 식물 생장 촉진에 중요한 생물학적 방제제로 사용되어왔다.
베타-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase)는 1959년 리즈 등에 의해 처음으로 보고된 효소로서, 곰팡이, 효모, 세균 등 많은 미생물에서 발견되며, 해조류, 콩, 발아 중의 곡류, 곰팡이 및 효모 등의 세포벽에 존재하는 베타-1,3-글루칸의 베타-1,3-글루코사이드 결합을 선택적으로 분해하는 효소로서 알려져 있다.
지금까지, 베타-1,3-글루카나아제는 바이러스(Chlorella Virus PBCV-1, Virology, 276, 27-36, 2000), 고세균(Pyrococcus furiosus, J. Biol. Chem., 272, 31258-31264, 1997), 곰팡이(Trichoderma harzianum, J. Bacteriol., 157, 6937-6945, 1995) 및 다양한 종류의 박테리아(Risoctonia solani, Phytophtaora infestans, Bacillus circulans, Biochim. Biophys. Acta., 73, 267-275, 1963; Oerskovia xantineolytica, J. Bacteriol., 158, 4751-4757, 1996; Thermotoga neapolitana, Biochem. Biophys. Res. Commun., 194, 1359-1364, 1993; Rothothermus marinus, Eur. J. Biochem., 224, 923-930, 1994) 등과, 해양 무척추동물 등에서 분리 및 정제되어 효소적 특성이 밝혀졌으나, 그 외 다른 미생물에서 상기 효소가 정제되거나 유전자 염기서열이 밝혀진 예는 아직까지 보고된 바가 없다.
따라서, 작물 유래의 병원성 곰팡이의 생장을 저해시킬 수 있는 항진균성 물질을 직접 생산하는 미생물을 토양 또는 작물에 직접 접종하여 병해를 예방함으로써, 작물의 생산성 향상과 함께 경제적, 환경적인 이득이 될 수 있도록 하기 위한 신규 미생물의 제공이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 항진균성 물질을 직접 생산하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항진균성 물질을 직접 생산하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주가 포함되어 식물의 생산성을 높일 수 있는 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항진균성 물질을 직접 생산하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 항진균성 물질을 직접 생산하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주를 제공함으로써 달성된다.
또한, 본 발명은 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하는 분리시료 채취단계, 채취된 토양을 증류수에 희석하여 배지에 접종한 후 세균을 배양하는 배양단계, 배양된 각각의 세균을 분리하여 한천이 첨가된 배지에서 생장시키는 생장단계; 생장된 세균을 단일 콜로니상으로 분리하는 제1분리단계 및 상기 제1분리단계에서 분리된 단일 콜로니상의 세균을 다시 배지에 접종한 뒤 단일 콜로니상으로 분리하는 제2분리단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 배양방법에 따른 상기 배지는 한천이 첨가된 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지가 바람직하며, 상기 배양단계는 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하여, 한천이 첨가된 루리아-베르타니 배지가 들어있는 패트리디쉬에 접종한 후, 완전 밀봉하여 1일간 배양하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 제1분리단계 및 제2분리단계는 루리아-베르타니 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후, 면전을 이용하여 밀봉한 뒤, 1일간 배양하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 바람직한 특징에 따르면 상기 배양단계는 루리아-베르타니 배지가 들어있는 미생물 배양기에서 6.2～6.3 사이의 pH 범위에서 배양액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
상기 배양방법을 통해 배양된 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI는 유기비료 첨가제로도 사용될 수 있는데, 통상의 비료 조성물에 본 발명의 방법에 의해 배양된, 항진균성 물질을 직접 생산하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 첨가하여 식물의 생산성을 높일 수 있는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 클루이베라 인터미디아 균주 DS-EBN-GBI는 병원성 곰팡이의 생장을 저해시킬 수 있는 항진균성 물질들인 베타-1,3-글루카나아제 및 siderophore를 직접 생산하는 것을 확인하였으며, 또한 발명에 따른 신규한 클루이베라 인터미디아 균주 DS-EBN-GBI를 포함하는 미생물 제제를 토마토의 초기 생장 촉진 효과 및 오이 병해충 발병 억제 효과의 확인을 위하여 해당 작물에 처리한 결과 효과가 뛰어난 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 미생물 제제는 성장 촉진 및 병해의 예방을 통하여 작물의 생산성 향상과 함께 경제적, 환경적인 이득이 가져올 수 있다.
도 1은 본 발명에 의해 배양된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI을 나타낸 위상차 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 시간에 따른 생육 곡선의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 시간에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 초기 pH에 따른 생육 곡선의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 초기 pH에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 미생물 배양기에서 pH를 조절하여 배양한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선이다.
도 7은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 16s rDNA의 염기서열이다.
도 8은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 균주 기탁증이다.
도 9는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 베타-1,3-글루카나아제 생성능을 나타낸 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-BL6의 siderophore을 나타낸 결과이다.
도 11은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 씨앗에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 후 측정한 초기 줄기 생장의 결과이다.
도 12는 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 씨앗에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 후 토마토 모종의 건조된 무게를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 13a 및 도 13b는 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 모종에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 뒤, 포트 실험이 완료된 사진이다.
도 14a 및 도 14b는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 배양액이 병원성 곰팡이의 생장을 억제하는 것을 나타낸 사진이다.
도 15은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 이용하여 친환경농산물안전성센터에서 진행한 포장시험에서 3주간 처리한 후 병해의 방제 효과를 나타낸 사진이다.
본 발명에 따른 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주의 배양방법은 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하는 분리시료 채취단계; 채취된 토양을 증류수에 희석하여 배지에 접종한 후 세균을 배양하는 배양단계; 배양된 각각의 세균을 분리하여 한천이 첨가된 배지에서 생장시키는 생장단계; 생장된 세균을 단일 콜로니상으로 분리하는 제1분리단계; 및 상기 제1분리단계에서 분리된 단일 콜로니상의 세균을 다시 배지에 접종한 뒤 단일 콜로니상으로 분리하는 제2분리단계를 포함한다.
본 발명의 배양방법에 따른 상기 배지는 한천이 첨가된 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지가 바람직하며, 상기 배양단계는 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하여, 한천이 첨가된 루리아-베르타니 배지가 들어있는 패트리디쉬에 접종한 후, 완전 밀봉하여 1일간 배양하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 제1분리단계 및 제2분리단계는 루리아-베르타니 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후, 면전을 이용하여 밀봉한 뒤, 1일간 배양하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이하에서는, 본 발명에 따른 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 분리, 동정, 생육, 염기서열 분석, 항진균성 물질 생성능 및 식물 생장 촉진 효과 등을 실시예를 들어 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 분리, 동정 및 생육 특성
1) 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 분리
본 발명의 균주는 강원도 평창군의 계방산 내부에 야생식물의 근권으로부터 토양을 채취하여 토양 미생물 분리의 시료로 사용하였다.
채취한 시료를 증류수에 연속 희석하여 한천이 들어있는 루리아-베르타니 배지가 들어있는 페트리디쉬에 스프레딩(spreading)을 하여 접종한 후, 완전 밀봉하여 1일간 배양하는 단계를 갖는다. 이후, 생장이 가장 우수한 미생물을 1차로 분리하여 한천이 첨가된 루리아-베르타니 배지에서 스트리킹(streaking)을 하여 단일 콜로니들로 분리하는 제1분리단계를 거친 후, 순수 분리된 단일 콜로니들을 다시 루리아-베르타니 액체 배지에 접종한 뒤 생장속도가 가장 빠른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주를 동일한 배지로부터 분리하는 제2분리단계를 갖는다.
DS-EBN-GBI을 분리하는 과정을 더욱 상세하게 설명하면 아래와 같다.
강원도 평창군의 계방산 내부에 야생식물의 근권(식물의 뿌리를 포함하는 약 1g의 토양)으로부터 일정량의 토양을 채취한 뒤, 99㎖의 멸균된 증류수가 들어있는 플라스크에 넣고 30분간 교반한 액체를 연속 희석하여, 한천이 첨가된 루리아-베르타니 배지가 포함된 페트리디쉬에 100㎕씩 접종하고 삼각유리막대를 이용하여 도말한 뒤, 배양하였다. 배양과정에서 일정 시간 이후 미생물의 콜로니가 나타나면, 이를 백금이를 사용하여 다시 한천이 첨가된 루리아-베르타니 배지가 들어있는 페트리디쉬에 획선 접종하여 순수한 단일 콜로니를 분리하였다.
상기 단일 콜로니의 분리과정을 반복하여 배지에 나타나는 콜로니 가운데, 가장 빠른 시간에 콜로니를 형성하는 단일균주 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 순수 분리하였다. 도 1은 본 발명에 의해 배양된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI을 나타낸 위상차 현미경 사진이다.
2) 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 생육 특성과 생리적 생화학적 특성
상기 순수 분리된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선을 조사하기 위하여, 먼저 루리아-베르타니 액체 배지(pH 6.8)가 들어있는 플라스크에 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 접종하고, 30℃에서 배양하면서 600㎚에서 3일간 OD(Optical Density) 값을 측정하였다. 그 결과, 생육의 최적 pH는 6.2～6.3, 최적 온도는 30℃임을 알 수 있었다. 그리고, 8시간에 걸쳐 대수 증식기가 형성되었으며, 최대 생육은 도 2에 나타낸 것처럼 32시간이 경과된 후에 나타났다. 도 2는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 시간에 따른 생육 곡선의 변화를 나타낸 그래프이다. 단, 도 2에서 ‘■’는 플라스크를 교반 배양한 조건이고, ‘▲’는 플라스크를 정치 배양한 조건이다.
도 3은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 시간에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다. 단, 도 3에서 ‘■’는 플라스크를 교반 배양한 조건이고, ‘▲’는 플라스크를 정치 배양한 조건이다. 정치 배양한 조건과 교반 배양한 조건에 대한 배양액의 pH 변화를 비교한 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이 배양 12~14시간까지는 두 실험군 모두 pH가 감소하다가 교반 배양 조건에서는 pH가 다시 상승하는 경향을 나타냈으며, 이 시간부터 미생물의 대수 증식기가 유지되는 것을 알 수 있다. 그러나 정치 배양 조건에서는 pH가 점점 감소하는 경향을 나타냈으며, 배양액의 성장도 또한 증가하지 않는 것으로 보아, 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육에 있어서 대수 증식기에서의 pH 조절이 생육에 지대한 영향을 미치리라 사료된다.
상기 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선을 보다 정확하게 확인하기 위하여, 배양액의 초기 pH를 6.8, 7.2, 7.6, 8.0으로 각각 보정하고 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 접종하여 1일간 OD와 pH 변화를 측정하였다. 도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양 초기 pH에 따른 생육곡선과 pH 변화를 나타낸 그래프로서, 도에서 표시되는 ‘●’는 배양액의 초기 pH를 6.8, ‘▲’는 배양액의 초기 pH를 7.2, ‘■’는 배양액의 초기 pH를 7.6, ‘◆’는 배양액의 초기 pH가 8.0으로 조절한 조건을 표시한다. 도 4 및 도 5에 나타낸 것과 같이 배양액의 초기 pH를 보정한 경우에도 DS-EBN-GBI의 생육은 배양 초기 8시간 이후부터 증가하며, 배양액의 pH는 대수증식기 이후(접종 후 8시간) 점점 증가하는 경향을 나타내었다. 이 과정을 통해 DS-EBN-GBI의 생육에 있어서 pH가 중요한 요인이라는 것을 알 수 있었다.
상기 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선을 확인하기 위하여, 루리아-베르타니 액체 배지(pH 6.8)가 들어있는 미생물 배양기에 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 접종하고, 온도는 30℃, pH를 6.2～6.3으로 보정할 수 있도록 하기 위하여 보정액을 첨가하면서 1일간 OD 값을 측정하였다. 그 결과, 도 6에서 나타낸 것처럼, 플라스크에서 확인한 대수 증식기 시간(8시간)이 미생물 배양기에서 4시간으로 확인되었으며, 배양 초기 pH 조절을 통해 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양이 촉진되었음을 알 수 있었다. 도 6은 본 발명에 따른 미생물 배양기에서 pH를 조절하여 배양한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선이다.
상기 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생리적 및 생화학적 특성을 확인한 결과를 아래 표 1에 나타내었다. 표 1에 표기한 + 및 - 는 현미경 또는 배양액으로부터 육안으로 관찰한 결과이다(단, 표 1에 나타낸 + 는 표기된 탄소원/질소원을 이용하여 성장이 가능한 것을 나타낸 것이고, -는 표기된 탄소원/질소원을 이용하지 못해 성장이 불가능한 것을 나타낸 것이다.).
탄소원, 질소원 이용반응의 표
구분 특성 구분 특성
균주의 모양 단간균 균주 크기 (㎛) 0.5~0.7*0.7~1.5
편모 o 포자 x
그람염색 음성
호기적 대사 +++ 혐기적 대사 +
전분 가수분해력 x 4℃에서의 생장력 x
7% 염화나트륨 액 성장 x
Catalase o Lactase o
Oxidase x Arginine dihydrolase x
Lysine decarboxylase x
Indole production x Gelatinase x
탄소원이용반응
Glucose + Citrate +++
Acetate +++ Malonate +
L-Arabinose + DL-mannitol +
Cellulobiose + D-sorbitol +
Glycerol + Rhamnose +
Maltose + Sucrose +
D-Mannose + Glucoside +
D-xylose +
질소원이용반응
Urea - Inositol -
Yeast extract +++ Peptone +++
Ammonium sulphate + Ammonium phosphate +
실시예 2 : 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 염기서열 분석
클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 염기서열 분석은 16s rDNA 염기서열 시퀀스 분석법으로 분석하였으며, 분석은 강원대학교 산학협력단 부설 친환경 농산물 안전성 센터에서 실시하였다. 샘플의 상태는 gDNA/cell 스톡(stock) 상태로 의뢰하였으며, 의뢰 내역으로는 Extracion-gDNA, PCR 증폭에 의한 PCR 산물(product)을 10번의 시퀀싱(Sequencing) 반응을 통해 분석하였으며, 분석에 사용한 프라이머(primer)는 유니버셜 프리(Universial free)로 구분되는 다음과 같은 시퀀스(sequence)를 가진다.
fD1 : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3',
rP2 : 5'-ACGGCTACCTTGTTACGAC-3'
클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 16s rDNA 염기서열 분석 결과를 도 7에 기재하였으며, 계통학적 결과는 쥬크-캔터(Jukes-Cantor) 모델을 적용한 네이버-조이닝(Neighbour-joining) 방법에 따라 작성한 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2는 본 발명에 따른 DS-EBN-GBI의 계통학적 동정결과를 나타낸 것으로 DS-EBN-GBI의 16s rDNA 서열을 NCBI를 통해 분석한 결과로서 표시된 균주가 DS-EBN-GBI의 동정 결과를 나타내고 있다. 즉, DS-EBN-GBI는 염기서열의 상동성을 조사한 결과 클루이베라 인터미디아로 분류되었으며, 이에 본 발명의 발명자들은 신규한 클루이베라 인터미디아 균주를 "클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI" 로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 2010년 10월 12일자로 기탁번호 KCTC 11783BP를 부여받았다. 도 8은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 균주 기탁증이다.
DS-EBN-GBI의 계통학적 동정결과
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 15 18 19
1. 10-M-19- Full ( GBI )
100 98 93 72 20 25 70 71 72 72 71 75 75 74 72 71 74 75 67
2. Kluyvera intermedia
(DQ223868)		 100 92 72 19 24 70 71 72 72 71 75 74 74 72 71 74 74 66
3. E. persicinus
LMG2691(AJ001190)		 100 73 16 21 74 72 73 76 76 76 75 75 76 75 75 72 64
4. Rhodobacter capsulatus
ATCC 11166 		100 22 26 72 71 72 73 72 74 74 76 74 73 74 73 65
5. Aspergillus flavus
(EF592150)		 100 87 14 15 16 15 14 18 18 15 16 15 19 20 34
6. Aspergillus oryzae
(GU385811)		 100 19 20 21 20 20 23 24 23 21 20 24 25 40
7. Lactococcus lactis
KLDS 4.0319		 100 82 81 85 85 82 81 81 83 83 81 79 69
8. L. fermentum JS
 100 88 84 85 84 83 84 83 84 82 81 70
9. L. parabuchneri
(AF275311)		 100 84 84 87 87 86 85 84 86 83 73
10. B. anthracis (EU723830) 100 92 90 88 89 91 92 89 85 74
11. B. cereus (EU723819)
 100 95 90 91 92 93 90 87 75
12. B. thruingenesis
(EU697392)		 100 92 93 91 91 91 90 79
13. B. amyloliquefaciens
(AB300815)		 100 99 96 95 96 91 79
14. B. velezensis
(AB244428)		 100 96 96 95 90 78
15. B. lichenofermis
(AB039328)		 100 98 93 89 76
16. B. subitilis (M-2010)
 100 92 88 75
15. B. pumilus (EU19191)
 100 92 79
18. B. niabensis (FJ784929) 100 82
19. B. niacini (FJ772024)
 100
실시예 3 : 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 식물 생장촉진 유도물질 생성능 조사
1) 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 베타-1,3- 글루카나아제 생성능 확인
상기 실시예 1을 통해 순수 분리된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 루리아 앤 베르타니 배지에서 배양하여 베타-1,3-글루카나아제의 생성능을 조사하였다. 이때, 조건은 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 배양액의 상등액 0.25㎖를 회수한 뒤, 0.2% 라미나린(laminarin) 용액 0.5㎖를 혼합하여, 40℃의 중탕기에서 120분간 반응시킨 뒤, 디엔에스(Dinitrosalysilic acid, DNS) 방법을 이용하여 글루코오스 농도를 측정하여 정량하였으며, 베타-1,3-글루카나아제 생성능의 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에 표시되는 ‘◆’는 DS-EBN-GBI를 표시하며, ‘■’는 비교미생물인 DS-EBN-GBL을 표시한 것이다. 도 9에 나타낸 것과 같이, DS-EBN-GBI균주의 베타-1,3-글루카나아제 활성은 배양 8시간 후, GBI 균주에서 최대 67.9 μM glucose/min/㎎ protein으로 나타났으며 대조군은 같은 시간에 최대 18.9 μM glucose/min/㎎ protein으로 나타났다. 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 생육 곡선에서 나타낸 결과와 같이 대수증식기가 진행되는 배양 8시간 이후에 가장 높은 베타-1,3-글루카나아제 활성을 나타냈으며 이를 통해 DS-EBN-GBI 균주의 항진균성의 초기 효과는 베다-1,3-글루카나아제에 의한 효과가 주된 요인이라고 할 수 있다.
2) 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 siderophore 생성능 확인
상기 실시예 1을 통해 순수 분리된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 루리아 앤 베르타니 배지에서 배양하여 siderophore의 생성능을 조사하였다.
클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양액을 원심분리하여 회수한 상등액 10㎖에 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 추출과정을 진행하였다. 추출한 용액을 원심분리한 뒤, 상층의 에틸아세테이트 5㎖와 하스웨이(Hathway) 반응용액 5㎖를 20분간 반응시킨 후, 700㎚의 파장에서 측정한 흡광도 값을 디하이드록시 벤조산(dihydroxy benzoic acid)를 이용하여 정량하였다. 도 10은 본 발명에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-BL6의 siderophore를 나타낸 결과이다. 도 10에서 '◆’는 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI를 표시하며, ‘■’및 ‘▲’는 비교미생물인 DS-EBN-GBL과 DS-EBN-GBA을 표시한 것이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI는 최대 94.5 μM/㎖의 siderophore를 생성하였으며, 그 외의 비교미생물이 생산한 siderophore(36.13 μM/㎖, 27.41 μM/㎖)보다 높은 수치를 나타내었다. 특히 siderophore 생성능은 배양 시간이 지날수록 생성능이 유지되는 것을 알 수 있는데, 이는 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI가 나타내는 항진균성 효과가 지속적으로 유지될 수 있음을 나타낸다.
상기 실시예 3을 통하여, 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI는 베타-1,3-글루카나아제와 siderophore 모두를 직접 생산한다는 사실을 확인하였다.
실시예 4 : 클루이베라 인터미디아 DS - EBN - GBI 의 식물 생장 촉진 효과 확인
1) 미생물 배양액의 제조
상기 실시예 1의 1)에 제시된 조건으로 진탕 배양된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양액을 원심분리하여 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주의 농도를 1×1010 cells/㎖ 수준으로 농축하고, 균주가 살아있는 상태를 유지하면서 식물 생장촉진용 배양액을 제조하였다.
2) 포트에서의 토마토의 초기 생장 촉진 효과 확인
토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 씨앗을 발아시킨 뒤, 발아상태가 양호한 토마토 모종을 플라스틱 포트(pot)에 심고, 상기 실시예 4의 1)의 방법으로 제조된 배양액으로 처리하여, 비오디 인큐베이터(BOD incubator)에서 15일간 육종하였다. 육종 결과는 도 11, 도 12, 도 13a 및 도 13b에 나타내었다.
도 11은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 모종에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 후 측정한 초기 줄기의 생장 결과로서, 여기서 대조군으로는 물을 사용하였으며, GBI(A)는 식물생장촉진용 배양액 균주의 농도를 1×104 cells/㎖ 수준으로 희석한 것이며, GBI(B)는 식물생장촉진용 배양액 균주의 농도를 1×106 cells/㎖ 수준으로 희석한 조건이다. 도 11에 나타낸 것과 같이, 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 처리군 중 GBI(A)는 대조군에 비해 28.6%의 줄기 신장을 나타냈으며, GBI(B)는 18.9%의 줄기 신장을 나타내었다.
도 12는 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 모종에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 후 토마토 모종의 건조된 무게를 측정하여 나타낸 결과로서, 여기서 대조군으로는 물을 사용하였으며, GBI(A)는 식물생장촉진용 배양액 균주의 농도를 1×104 cells/㎖ 수준으로 희석한 것이며, GBI(B)는 식물생장촉진용 배양액 균주의 농도를 1×106 cells/㎖ 수준으로 희석한 조건이다. 도 12에 나타낸 것과 같이, GBI(A) 조건은 대조군에 비해 건조중량을 144% 향상시켰으며, GBI(B)처리군은 55.2%의 건조중량 상승 효과를 나타내었다.
미생물의 종류와 그 활성도에 따라 작물생육 촉진효과를 나타내는 정도가 다른데, 상기 실시예의 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI는 배양액의 농도가 1×104 cells/㎖ 일 때, 가장 우수한 식물생장 촉진효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.
도 13a 및 도 13b는 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)의 모종에 본 발명에 따른 배양액을 처리한 뒤, 포트 실험이 완료된 사진이다. 도 13a 및 도 13b에서 보는 바와 같이, GBI(A)와 GBI(B) 조건 모두 대조군에 비해 토마토 모종의 크기 및 모종의 잎 발달 정도가 우수함을 육안으로 확인하였다.
3) 대치배양을 이용한 항진균성 효과 확인
작물 병원성 곰팡이인 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici와 Fusarium oxysporum f. sp. nevium을 대상으로 항진균성 효과를 확인하였다. 상기의 병원성 곰팡이를 PDA 배지의 한쪽에 접종하고, 상기 실시예 4의 1)의 방법으로 제조된 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 배양액을 획선 접종한 뒤, 5일간 배양하여 병원성 곰팡이의 생장 저해 정도를 관찰하였다. 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 병원성 곰팡이의 생장 저해 정도는 도 14a 및 도 14b에 나타내었는데, 도 14a는 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici에 무접종군과 GBI 접종군(I균주)을 나타낸 결과이며, 도 14b는 Fusarium oxysporum f. sp. nevium에 무접종군과 GBI 접종균(I균주)를 나타낸 결과이다. 생장 저해 정도는 병원성 곰팡이와 항진균성 효과를 나타내는 미생물 사이에 형성되는 투명환의 크기에 따라 결정되는데, 도 14a 및 도 14b에 나타나는 것과 같이 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI 균주가 생성시킨 투명환은 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici과 Fusarium oxysporum f. sp. nevium의 두 병원성 곰팡이 모두에서 대조군에 비해 큰 투명환을 형성하였다.
4) 포장시험에서의 오이 병해충 발병 억제 효과 확인
재배 중인 오이(백다다기)에 발생한 노균병을 제어하기 위해, 상기 실시예 4의 1)의 방법으로 제조된 배양액으로 주 1회, 3주간 처리하여, 노균병의 발병 억제 정도를 확인하였다. 노균병 발병 억제 정도는 도 15에 나타내었는데, 도 15은 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양액을 100배 희석하여 처리한 사진이다. 도 15에서 보는 바와 같이, 대조군의 오이 잎사귀는 노균병에 의해 잎이 갈변하였으며 병반이 다량 생성된 반면, 처리군의 오이 잎사귀는 갈변이 없고, 병반의 생성 정도도 대조군에 비해 낮은 편이다. 즉, 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 살포에 의해 노균병의 발생 정도를 억제하였으며, 병반에 의한 갈변 현상도 예방하는 효과를 나타내었다.
아래의 표 3은 오이 노균병에 대한 인터미디아 DS-EBN-GBI의 약제방제 효과를 나타낸다.
오이 노균병에 대한 약제방제 효과

시험약제		 발병도 유의차
(DMRT)		 방제가
(%)
I 반복 II 반복 III 반복 평균
무처리군 54.2 55.0 56.7 55.3 b -
GBI 균주 39.2 40.8 40.0 40.0 a 27.6
총 3회의 반복시험을 통해서 평균을 도출하고, 발병도 대비 시험약제의 방제가를 결정하였는데, 표 3에 나타낸 것과 같이 GBI 처리군은 40.0의 발병도를 나타내었으며, 무처리군 대비 노균병에 대한 방제가는 27.6%로 측정되었다.
표 4는 오이 노균병에 대한 약제 정도를 나타낸다. 표 4에 나타낸 것과 같이 시험작물인 오이에 대해 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI의 배양액의 기준량 또는 배량을 살포하더라도 작물에 직접적인 약해를 일으키지 않음을 알 수 있다.
오이 노균병에 대한 약제 정도
시험약제
 시험작물
 약해정도 (0-5) 비고
기준량 배량
GBI 균주 오이 (백다다기) - - 약해 없음
한국생명공학연구원 KCTC11783 20101012
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Claims (6)

  1. 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 16s rDNA를 가지는 것을 특징으로 하는 토양에서 분리한 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI(KCTC 11783BP) 균주.
  2. 제 1항의 균주에 있어서,
    상기 균주는 베타-1,3-글루카나아제 및 siderophore 생성능을 갖는 것을 특징으로 하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI(KCTC 11783BP) 균주.
  3. 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하는 분리시료채취단계;
    채취된 토양을 증류수에 희석하여 배지에 접종한 후 세균을 배양하는 배양단계;
    배양된 각각의 세균을 분리하여 한천이 첨가된 배지에서 생장시키는 생장단계;
    생장된 세균을 단일 콜로니상으로 분리하는 제1분리단계;
    상기 제1분리단계에서 분리된 단일 콜로니상의 세균을 다시 배지에 접종한 뒤 단일 콜로니상으로 분리하는 제2분리단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규한 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI(KCTC 11783BP) 균주의 배양방법.
  4. 제 3항의 배양방법에 있어서,
    상기 배양단계는 야생 식물의 근권 내 토양을 채취하여, 루리아-베르타니 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후, 면전을 이용하여 밀봉한 뒤, 1일간 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  5. 제 3항의 배양방법에 있어서,
    상기 배양단계는 루리아-베르타니 배지가 들어있는 미생물 배양기에서 6.2～6.3 사이의 pH 범위에서 배양액을 제조하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  6. 제 1항 또는 2항에 따른 클루이베라 인터미디아 DS-EBN-GBI(KCTC 11783BP) 균주를 포함하는 미생물 제제.
KR1020100105852A 2010-10-28 2010-10-28 신규한 클루이베라 인터미디아 ｄｓ-ｅｂｎ-ｇｂｉ 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 KR101136480B1 (ko)

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