KR101126266B1

KR101126266B1 - 식물의 개화시기를 조절하는 방법

Info

Publication number: KR101126266B1
Application number: KR1020080110485A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 이연희; 김둘이; 이정숙; 서석철; 이인숙
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2012-06-27
Also published as: KR20100051354A

Abstract

본 발명은 식물 개화시기를 조절하는 전사조절인자들 및 그들의 유전자 그리고 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼 (Oryza sativa)로부터 유래한 새로운 bZIP형 전사조절인자, 그의 N-말단 결손 bZIP형 전사조절인자 및 그들의 아미노산 서열, 상기 전사조절인자 유전자 OREB2, 상기 N-말단 결손 유전자 OREB2-D71 및 그들의 염기서열, 이 유전자들을 포함하는 식물 발현 벡터들, 이로 형질전환된 식물 유전자 운반체, 이들을 각종 유용 작물의 개화시기를 조절하는 데 사용하는 용도, 이를 이용하여 제작한 개화가 지연되는 형질전환 식물 그리고 상기 N-말단 전사조절인자를 이용하여 식물의 개화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 전사조절인자들은 생장 분화를 조절하는 기능을 가지므로 각종 유용한 작물의 생산성을 증대하는 데 널리 사용될 수 있다.

개화시기 조절, bZIP형 전사조절인자, N-말단 결손, 전사조절인자 유전자 OREB2, N-말단 결손 유전자 OREB2-D71, 식물의 개화 지연

Description

식물의 개화시기를 조절하는 방법 {Method for controlling flowering time of plant by using N-terminus-deleted mutant of bZIP transcription factor}

본 발명은 식물 개화시기를 조절하는 전사조절인자들 및 그들의 유전자 그리고 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벼 (Oryza sativa)로부터 유래한 새로운 bZIP형 전사조절인자, 그의 N-말단 결손 bZIP형 전사조절인자 및 그들의 아미노산 서열, 상기 전사조절인자 유전자 OREB2, 상기 N-말단 결손 유전자 OREB2-D71 및 그들의 염기서열, 이 유전자들을 포함하는 식물 발현 벡터들, 이로 형질전환된 식물 유전자 운반체, 이들을 각종 유용 작물의 개화시기를 조절하는 데 사용하는 용도, 이를 이용하여 제작한 개화가 지연되는 형질전환 식물 그리고 상기 N-말단 전사조절인자를 이용하여 식물의 개화를 지연시키는 방법에 관한 것이다.

bZIP형 전사조절인자는 미생물, 동물 및 식물에서 광범위하게 존재하는 전사조절 단백질이다. 일반적으로 bZIP형 전사조절인자는 DNA 결합 염기성 도메인 (DNA binding basic domain)과 류신 지퍼 (leucine zipper) 영역을 포함하는 구조적 특 징을 가지는 데, 이 때 류신 지퍼 영역은 bZIP 단백질 간의 상호작용을 가능하게 한다.

자코비 (Jacoby) 등은 애기장대로부터 bZIP형 전사조절인자 75종을 확인하고 유전자 염기서열과 보존된 구조영역을 중심으로 하여 10개의 소그룹 (subgroup)으로 분류하였다 (bZIP transcription factors in Arabidopsis; Trends in Plant Science, 2002, 7(3): 106-111). 식물에서 일부 bZIP형 전사조절인자가 환경스트레스, 병원균 및 빛에 반응해서 생장 및 분화를 조절하는 것으로 보고되어 있지만, 아직 대다수 bZIP형 전사조절인자에 대한 생리학적 기능은 규명되지 않은 상황이다.

상기 bZIP형 전사조절인자들 중에서, 앱시스산 반응인자 결합단백질 (ABRE binding factor; ABF)은 앱시스산 반응인자 (ABRE)에 결합하고 호르몬 ABA에 의해 유도되어 유전자 전사를 조절하는 작용을 하고 bZIP형 전사인자 그룹 1A (group 1A)로 분류된다. 특히 상기 ABF 계열의 bZIP형 전사조절인자들 중 ABF2 (AREB1), ABF3 및 ABF4 (AREB2)는 염 및 한발 스트레스에 의해서도 유전자의 발현이 유도되는 특징을 보인다. 따라서 상기 전사조절인자를 과발현 시키는 경우 환경 스트레스에 대한 저항성이 크게 증가하는 것으로 보고되어 식물의 스트레스 반응을 유도하는 주요한 전사조절인자로 알려져 있다 (Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. 2004, Plant Biotechnology Journal, 459-466; 대한민국 특허 (김수영) 10-0327298, 2002년 2월 22일).

그러나 구조적으로는 이 그룹 A에 속하더라도 그 기능은 전혀 다른 것으로 알려진 bZIP형 전사인자도 일부에서 보고되고 있다. 구체적으로 애기장대 ABI5 전사조절인자 (AtbZIP39)는 발아 후 유식물 생장을 조절하는 주요인자로 알려져 있으며, FD 전사조절인자 (AtbZIP14)는 애기장대의 개화를 촉진하는 조절 단백질로 보고되어 왔다 (A postgermination developmental arrest checkpoint is mediated by abscisic acid and requires the ABI5 transcription factor in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2001, 98: 4782-4787; FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science, 2005, 12: 309(5737):1052-6). 또한 최근에는 벼의 게놈 데이터베이스 (genomic database)를 기반으로 하여 14종의 그룹 A에 속하는 bZIP형 전사조절인자가 탐색된 바 있었다 (Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice. Plant Physiol., 2008, 146(2):333-50). 그러나 전사조절인자 Trab1과 OsABI5의 분자생물학적 특성이 일부 규명되었을 뿐, 그 생물학적 기능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다 (A bZIP factor, TRAB1, interacts with VP1 and mediates abscisic acid-induced transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1999, 96: 15348-15353; A bZIP transcription factor, OsABI5, is involved in rice fertility and stress tolerance. Plant Mol Biol., 2008, 66(6):675-83). 이외에도 bZIP 전사조절인자는 호모다이머 (homodimer) 또는 헤테로다이머 (heterodimer)를 형성하거나 다른 종류의 전사인자 단백질들과 상호 작용하여 다양한 생리반응을 유도할 수 있는 것으로 알려져서 주목받고 있다. 이러한 기능은 세포내 bZIP형 전사조절인자의 활성을 인위적으로 조절하는 경우 식물의 표현형 변이를 다양하게 창출할 수 있는 가능성을 제시해준다.

이에 본 발명자들은 식물의 생장 및 분화를 조절하는 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 벼 (Oryza sativa)로부터 새로운 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2를 분리하고 이 전사조절 단백질의 전사활성 도메인을 분석한 다음, 그의 N-말단 결손 전사조절인자 OREB2-D71 및 그의 유전자를 이용하여 식물 발현 벡터, 식물 유전자 운반체 및 형질전환 식물체를 제작하고 이로 형질전환된 식물체에서 개화시기가 지연되며 AP1, FT, CO 또는 GI 유전자 등을 포함한 개화 촉진 유전자의 발현이 억제되는 것을 관찰하여 생장 분화를 조절할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 식물의 생장 및 분화를 조절할 수 있는 새로운 전사조절인자들 및 그들의 유전자를 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 개화시기 조절에 관여하는 새로운 bZIP형 전사조절인자 유전자를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 상기 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 전사활성 도메인을 포함하는 상기 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71를 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 개화시기 조절에 관여하는 bZIP형 전사조절인자 단백질을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 72 내지 98번째 아미노산 서열을 포함하는 bZIP형 전사조절인자 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 상기 bZIP형 전사조절인자 단백질의 전사활성 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71 (수탁번호: KACC 95092P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAHA-OREB2-D71를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 식물을 형질전환시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터를 이용하여, 상기 OREB2 유전자 또는 상기 OREB2-D71 유전자를 과발현시키는 과정으로 형질전환 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 식물 개화시기 조절에 관여하는 bZIP형 전사조절인자 유전자를 제공한다.

상기 bZIP형 전사조절인자 유전자는 벼 (Oryza sativa)로부터 유래하고, 호르몬 ABA를 처리한 벼의 종자와 배아 (embryo)에서 발현되며 호르몬, 염 및 시토키닌 등에 의해 발현이 유도되는 특징을 가진다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산서열을 포함하는 bZIP형 전사조절인자 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산서열 전체를 포함하는 상기 전사조절인자 유전자 OREB2 (Oryza sativa ABRE binding factor) 및 상기 유전자 OREB2의 서열번호 5로 표시되는 N-말단이 결손되어 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 전사활성 도메인을 포함하는 상기 전사조절인자 유전자 OREB2-D71 (Oryza sativa ABRE binding factor deletion 71)를 제공한다.

상기 전사조절인자 단백질은 벼 (Oryza sativa)로부터 유래하고 N-말단 아미노산 잔기에 전사활성을 포함하고 ABRE 에 결합하여 전사를 활성화하는 기능을 가진다.

본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열의 일부 또는 전체를 포함하는 상기 전사조절인자 단백질을 제공하고, 또한, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열 중에서 상기 일부에는 72 내지 98번째 아미노산 서열을 포함하는 상기 전사조절인자 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에는 전사조절인자 OREB2 단백질 및 OREB2-D71 단백질이 포함되고, 여기서 상기 전사조절인자 OREB2-D71 단백질은 OREB2 단백질의 N-말단에서 71개 아미노산이 결손되어 있으나 전사활성을 유지하는 돌연변이 단백질이다.

또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 상기 bZIP형 전사조절인자 단백질의 전사활성 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 bZIP형 전사조절인자 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71를 제공한다.

상기 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71는 2008년 9월 23일자로 농업생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KACC 95092P).

또한, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAHA-OREB2-D71를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 식물을 형질전환시킨 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 식물은 애기장대를 포함한 쌍자엽 식물과 그의 종자를 포함하는 것이 바람직하며, 이에 한정되지 않고 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 중에서 선택되는 쌍자엽 식물을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절인자 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터를 이 용하여 식물 형질전환용 운반체를 제작하고 이로 식물체를 형질전환시키는 과정으로 식물체의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 OREB2 유전자 또는/및 상기 OREB2-D71 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체 내에서 상기 전사조절인자 유전자를 과발현시키는 과정으로 형질전환 식물체의 개화시기를 조절할 수 있다. 상기 개화시기 조절에는 식물체의 개화시기를 지연시키는 것을 포함하며, 여기에는 식물 개화를 촉진시키는, AP1, FT, CO 또는 GI 유전자를 포함하는 유전자의 발현을 억제하여 개화시기를 지연시키는 것도 포함된다 . 또한, 상기 개화시기 조절이외에도, 호르몬 ABA, 시토키닌 및 염을 포함한 다양한 환경 스트레스에 대한 저항성을 키우거나 다양한 생장 및 분화 과정을 조절하는 데도 상기 과정이 사용될 수 있다

상기에서 식물 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 모든 방법을 의미한다. 이 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없으며, 식물 종의 형질전환은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 모든 식물 종에 대해 일반적으로 적용된다. 모든 형질전환 방법이 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있으며, 여기에는 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 벼 (Oryza sativa)로부터 유래한 새로운 bZIP형 전사조절인자, 그의 N-말단 결손 돌연변이 전사조절인자 및 그들의 아미노산 서열, 상기 전사조절인자 유전자 OREB2, 상기 돌연변이 전사조절인자 유전자 OREB2-D71 및 그들의 염기서열, 이 유전자들을 포함하는 식물 발현 벡터들, 이로 형질전환된 식물 유전자 운반체, 이를 이용하여 제작한 개화가 지연되는 식물 형질전환체, 이들을 각종 유용 작물의 개화시기를 조절하는 데 사용하는 용도 그리고 상기 돌연변이 전사조절인자를 이용하여 식물의 개화를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 전사조절인자들 및 그들의 유전자는 ABA, 시토키닌, 염 및 환경 등을 포함한 다양한 스트레스에 반응을 유도하고 생장 분화를 조절하는 기능을 가지므로, 각종 유용한 작물의 생산성을 증대하는 데 널리 사용될 수 있다. 실제로 상기 유전자 및 단백질 또는 활성이 변화된 N-말단 결손 유전자 및 단백질의 세포내 수준을 조절하는 유전공학적 방법 (GM 작물 등)을 통해, 영양생장기 연장 및 개 화시기를 지연시킨 다양한 식물들을 개발하여 산업화할 수 있는 가능성을 제시해준다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2의 분리 및 그의 염기서열 결정

본 발명에서는 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2 를 분리하기 위하여 역전사효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 다음과 같이 실시하였다. 먼저 벼의 성숙종자를 100 uM ABA 용액에 48시간 배양한 후 RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 주형으로 올리고 (dT)₂₀와 역전사효소 (Superscript III, Invitrogen)를 사용하여 단일 cDNA 사슬을 합성하였다. NSF DNA 칩 분석 결과에서 ABA에 의해 유전자 발현이 증가하는 것으로 탐색된 유전자 (Os09g28310)의 Genbank 염기서열에 기초하여 하기 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 한 쌍의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머(정방향 프라이머 OREB2-1 및 역방향 프라이머 OREB2-2)를 제작하였다.

상기 단일 cDNA 사슬을 주형으로 상기 프라이머들과 Taq 폴리머라제 (Pyrobest, Takara)를 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 증폭된 cDNA 절편을 클로닝 벡터 pGEM-T vector (Promega)에 클로닝하여 OREB2로 명명하고 전체 염기서열을 분석하였다.

그 결과 상기에서 증폭된 OREB2 유전자는 서열번호 1의 아미노산서열을 가지는 1,131bp로 구성되고, 이로부터 서열번호 2의 염기서열을 가지는 376개 아미노산으로 구성되며 분자량 39.9 kD를 가지는 폴리펩티드가 인코딩되는 것을 확인하였다. 또한 상기 OREB2 유전자의 계통수를 분석한 결과, 이 유전자는 bZIP형 전사조절인자의 그룹A계열 단백질로서 애기장대의 전사조절인자 AREB1/ABF2, AREB2/ABF4, ABI5 및 벼의 전사조절인자 TRAB1과 유사성이 높은 것을 알 수 있었다 (도 1 참조). 구체적으로, 상기 OREB2 단백질은 C-말단 부위에 전형적인 BRLZ 영역을 포함하고 잘 보존된 4개의 특징적인 구조 영역을 가지며 특징적 구조 영역 안에는 CKII와 CaMK 인산화 모티프가 포함되어 있는 것으로 분석되었다 (도 2 참조).

실시예 2. OREB2 유전자의 발현 양상 분석

본 발명에서는 bZIP형 전사조절인자의 OREB2 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여, 성숙종자, 캘루스 그리고 암조건 또는 명조건에서 2주간 키운 벼 유묘의 잎과 뿌리에서 RNA를 각각 분리하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA를 주형으로 올리고 (dT)₂₀와 역전사효소 (Superscript III, Invitrogen)를 사용하여 단일 cDNA 사슬을 합성하였다. OREB2 유전자에 대한 서열번호 8 및 서열번호 9의 한 쌍의 프라이머 (정방향 프라이머 OREB2-3 및 역방형 프라이머 OREB2-4)와 단일 cDNA 사슬을 주형으로 Taq 폴리머라제 (Solgent)를 사용하여 PCR을 25 싸이클 반응 으로 수행하여 DNA를 증폭하고 1% 아가로즈 젤 전기영동으로 분리하여 발현 정도를 비교하였다.

그 결과 OREB2 유전자의 발현이 종자에 국한되지 않고 대부분의 조직에서 발현되고 있는 것을 확인하였다 (도 3, A 참조). 또한 호르몬에 의한 OREB2 유전자 조절을 규명하기 위해 벼 유묘의 잎 절편에 1 μM GA, 50 μM BA, 1 μM IAA, 1mM ACC 또는 100 μM ABA를 각각 24시간 처리 후 RNA를 분리하여 상기 RT-PCR 방법으로 유전자 발현을 조사하였다. 상기 OREB2 유전자는 ABA와 ACC , 시토키닌 처리에 의해 유전자 발현이 증가한 반면, GA와 옥신은 OREB2 유전자 발현에 영향을 주지 않았다 (도 3, B 참조). 또한 처리한 ABA와 키네틴 (kinetin) 농도와 비례하여 OREB2 유전자 발현이 증가하는 것으로 조사되어 (도 3, C 및 D 참조) OREB2의 기능이 ABA 및 시토키닌의 작용과 연관된 것을 확인하였다.

실시예 3. OREB2 단백질의 세포내 핵 분포 조사

본 발명에서는 bZIP형 전사조절인자인 OREB2 단백질의 세포 내 핵 분포를 다음과 같이 조사하였다. OREB2 단백질은 C-말단에 BRLZ 영역을 포함하고 있으며 NLS 모티브가 존재하므로 세포내에서 핵에 위치할 것으로 추정되었다. 이를 확인하기 위하여 OREB2-D72 단백질의 종료 코돈을 제거한 전체 ORF를 제한효소 BglII 부위를 포함하는 서열번호 10 및 서열번호 11의 하기 한 쌍의 프라이머 (정방향 프라이머 OREB2GF-1 및 역방향 프라이머 OREB2GF-3)를 사용하여 PCR 증폭하였다.

상기 증폭된 DNA 단편을 형광단백질을 포함하는 클로닝 벡터 pMD1-GFP의 제 한효소 Bam HI 위치에 연결하여 OREB2-D72의 C-말단에서 형광단백질이 올바른 프레임 (in frame)으로 삽입된 재조합 발현 벡터를 제조하였다 (도 5 참조). 또한 상기 발현 벡터를 금 입자 표면에 입힌 후 유전자 총 (particle delivery system; PDS2000, BioRad)을 이용하여 양파 표피세포에 도입하였다. 도입 2일 후 형광 현미경을 이용하여 세포내 형광단백질의 분포를 관찰한 결과, OREB2-D72가 핵에 분포하는 단백질인 것을 확인하였다 (도 6 참조). 상기 결과로부터 OREB2 단백질이 세포내 핵에서 전사활성을 조절하는 전사조절인자로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. OREB2 단백질의 전사활성능 및 전사조절 도메인 분석

본 발명에서는 OREB2 단백질이 DNA 결합영역을 포함하고 세포의 핵에 위치하여 전사조절인자로 작용할 가능성이 높다고 판단하여, OREB2 단백질의 전사활성능 및 전사조절 도메인을 다음과 같이 분석하였다. 먼저 GAL4DNA 결합 도메인 (BD)의 하류에 OREB2 단백질이 연결된 융합단백질을 인코딩하는 플라스미드를 다음과 같이 제작하였다. 먼저 OREB2 유전자의 전체 ORF와 N-말단 71 아미노산 (OREB2D71), 98 아미노산 (OREB2D98), 112 아미노산 (OREB2D112) 및 137 아미노산 (OREB2D137)이 각각 결손된 영역을 증폭하기 위하여 5-말단과 3-말단에 각각 EcoR I과 Xho I 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 6 또는 서열 11 내지 14의 하기 프라이머들 (정방향 프라이머 OREB2-1, OREB2-5, OREB2-6, OREB2-7 및 역방향 프라이머OREB2-2)을 제조하였다. 실시예 1에서 분리한 cDNA를 주형으로 각 한 쌍의 프라이머와 Taq 폴리머라제 (Pyrobest, Takara)를 사용하여 DNA 절편을 증폭하고 클로닝 벡터 pGEM-T (Promega)에 클로닝하여 전체 염기서열을 확인하였다. 또한, 클로닝 벡터 pBDGAL4 (Stratagene)의 해당 제한효소 부위에 OREB2 DNA 단편들이 각각 삽입된 플라스미드를 제작하였다. 두 개의 리포터 유전자들 (HIS3, β-galactosidase)를 갖고 있는 효모균주 YRG2 (Stratagene)에 제작한 플라스미드를 도입하였고, ONPG (O-nitrophenyl β-D-galactopyranosidase)를 기질로 하여 리포터인 베타갈락토시다아제 효소 활성을 분석하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, OREB2가 GAL4DNA 결합부위에 붙어서 리포터 유전자의 발현을 증가시키고 전사촉진 활성 기능이 있는 것을 분명하게 확인하였다. 또한 N-말단 결실 돌연변이 시리즈의 전사촉진 활성을 비교하였을 때, N-말단 71개 아미노산이 결실되면 전사활성이 유지되지만 72 내지 98개 아미노산이 결실되면 전사촉진 활성이 완전히 사라지는 것을 알 수 있었다. 따라서 상기 OREB2 단백질의 72번에서 99번 사이의 27개 아미노산이 전사촉진 활성 도메인이라는 것을 규명할 수 있었다.

실시예 5. 앱시스산 반응인자를 이용한 OREB2 단백질의 전사활성능 조사

본 발명에서는 OREB2 단백질이 ABRE 모티브와 결합하여 전사활성을 촉진하는 기능이 가지는지 여부를 다음과 같이 조사하였다. 먼저 실시예 4에서 PCR 증폭하여 클로닝 벡터 pGMT-Easy에 도입한 OREB2 유전자와 N-말단 결손 시리즈를 제한효소 EcoRI과 Xho I으로 절단하여 얻은 DNA 단편을 효모발현 벡터인 pYX243의 EcoRI과 XhoI 제한효소 부위에 삽입하였다. 밀에서 분리한 Em1a 모티브 (GGACACGTGGCG)를 3X로 포함하는 프로모터의 하류에 리포터 유전자 (β-galactosidase)가 연결된 플 라스미드를 게놈 내에 삽입된 효모균주 (Choi et al., 2000)에 상기 제작한 재조합 발현 벡터 pYX243/OREB2를 도입하여 얻은 효모형질전환체를 Glu/CM-Leu-Ura 배지에서 배양하였다. Gal/Raf/CM-Leu-Ura 배지 조건하 에서 OREB2 N-말단 결손 단백질들의 발현을 각각 유도시킨 후 ONPG (O-nitrophenyl β-D-galactopyranosidase)를 기질로 하여 리포터인 베타갈락토시다아제 효소활성을 분석하였다. 그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, OREB2 단백질이 ABRE 모티브에 결합하여 전사활성을 촉진하는 활성이 있으며, GAL4 시스템과 마찬가지로 N-말단 도메인이 중심역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 돌연변이 전사조절인자 OREB2-D71의 식물 과발현 벡터 제작

본 발명에서는 상기 전사조절인자가 N-말단 돌연변이된 OREB2-D71 단백질을 식물에서 과발현하는 재조합 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 35S 프로모터의 하류에 OREB2-D71이 삽입된 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 N-말단 결손 부위를 서열번호 7 및 서열번호 15의 하기 프라이머 (정방향 프라이머 OREB2-8 및 역방향 프라이머 OREB2-2)를 이용하여 PCR로 증폭하고, 에피토프인 cMyc 과 HA를 포함하는 발현 벡터 pCMV-Myc/HA (Clonetech)를 이용하여 융합된 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 각각 제작하였다 (도 7, A 참조).

또한 에피토프 영역을 포함하는 융합 DNA를 Xba I 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 7, 서열번호 16 및 서열번호 17의 하기 프라이머 (Myc5, Myc3 및 HA5)를 이용하여 PCR로 증폭한 후 하이그로마이신 저항성을 가지는 발현 벡터 pCAMBIA1300 유래의 식물발현 벡터의 35S 프로모터와 Nos 터미네이터 사이의 Xba I 제한효소 부위에 삽입된 발현 벡터를 제작하였다 (도 7, B 참조). 그 다음 식물 형질전환을 위하여 제작한 벡터를 아그로박테리움 (GV3101)에 도입하고 하이그로마이신과 카나마이신 배지에서 배양하였다.

실시예 7. OREB2 과발현에 따른 애기장대 형질전환체의 개화지연 효과 조사

본 발명에서는 OREB2 과발현에 따른 애기장대 형질전환체의 개화지연 효과를 다음과 같이 조사하였다. 상기 실시예 6에서 제작한 아그로박테리움 GV3101/HAOREB2 또는 MycOREB2을 각각 애기장대 (Col 0)식물체에 화기접종 한 후 생성된 종자를 하이그로마이신 (15㎍/ℓ)이 포함된 배지에서 형질전환체 (HA 또는 Myc으로 표기)를 선발하고 온실에서 생육하였다. 그 결과 도 9에서 나타난 바와 같이, 애기장대 T2 형질전환체에서 RT-PCR 분석을 통해서 도입한 OREB2-D71 유전자가 발현되고 있는 것을 확인하였다. 또한 애기장대 형질전환체를 장일 조건에서 키웠을 때 영양생장기 생장속도는 비형질전환체에 비해 차이가 없었으나 (도 9, A 참조), 공통적으로 개화가 현저히 지연되는 특징을 보였으며 (도 9, C 참조), Myc 8 계통의 경우 12주후에도 잎과 꽃눈이 분화하는 분열능이 지속되는 것을 알 수 있었다 (도 9, D 참조). 이처럼 개화가 지연되는 표현형과 연관된 유전자 발현을 규명하기 위하여, 데이터베이스에서 애기장대의 개화를 조절하는 것으로 알려진 유전자군을 탐색하고, 각 유전자의 염기서열에 맞는 서열번호 18 내지 서열번호 26의 하기 한 쌍의 프라이머들 (AtFT-F, AtFT-R, AtCO-F, AtCO-R, AtGI-F, AtGI-R, AtFLC- F, AtFLC-R)을 제작하여 RT-PCR 방법으로 유전자 발현을 조사하였다.

그 결과 비형질전환체 (Col 0)와 비교하여 애기장대 형질전환체에서 개화를 촉진하는 것으로 알려진 유전자군 (AP1, FT, CO, GI)의 발현이 억제된 반면, 개화를 억제하는 유전자 (FLC) 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 10 참조). 따라서 OREB2-D71 유전자의 과발현은 식물의 영양생장기를 연장하고 개화를 지연시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

[서열목록]

서열번호 1

MLTDRWGGRREAMEFGNGGSSSSERRAAAEGATLARQGSVYSLTFDEFQSALAGGGGGGGGGSGFGKDFGSMNMDELLRS

IWTAEESQAMASASGSAAGVGVAVGAPPTSLQRQGSLTLPRTLSAKTVDEVWRNLVRDEPPPVGAADGGDMPPQRQSTLG

EMTLEEFLVRAGVVRENPPAAPPPVPPPMPPRPVPVVPKTTAFLGNFPGANDAGAAALGFAPLGMGDPALGNGLMPRAVP

VGLPGAAVAMQTAVNQFDSGDKGNSDLSSPTEPMPYSFEGLVRGRRNGGGVEKVVERRQRRMIKNRESAARSRARKQAYT

LELEAEVQKLKEMNKELERKQADIMEMQKNEVEEMIKDPFGRRKRLCLRRTLTGPW

서열번호 2

ATGCTGACGGATAGGTGGGGAGGGAGGAGGGAGGCGATGGAGTTCGGGAACGGCGGGTCCTCCTCGTCGGA GCGCAGGGC

GGCGGCGGAGGGGGCGACGCTGGCGAGACAGGGTTCGGTGTATTCGCTGACGTTCGACGAGTTCCAGAGCGCGCTCGCTG

GTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGTGGAAGCGGGTTCGGGAAGGACTTCGGCTCCATGAACATGGACGAGCTGCTCCGGAGC

ATCTGGACCGCGGAGGAGAGCCAGGCCATGGCCTCCGCCTCTGGCTCCGCCGCGGGGGTGGGCGTGGCCGTGGGGGCGCC

GCCGACGTCGCTGCAGCGCCAGGGCTCGCTCACCCTGCCCCGCACGCTCAGCGCCAAGACGGTGGACGAGGTATGGCGCA

ACCTTGTGCGCGACGAGCCACCGCCGGTGGGGGCGGCGGATGGCGGCGATATGCCACCCCAGCGGCAGTCGACCCTCGGG

GAGATGACCCTGGAGGAGTTCTTGGTCAGAGCCGGCGTGGTCCGAGAAAATCCACCCGCTGCGCCGCCCCCCGTTCCCCC

GCCAATGCCGCCGCGGCCAGTCCCGGTGGTCCCCAAGACCACTGCCTTCTTGGGAAACTTCCCCGGTGCCAACGATGCCG

GCGCGGCGGCGCTGGGCTTTGCGCCGCTCGGCATGGGGGATCCAGCCTTGGGCAATGGCCTGATGCCCAGGGCAGTGCCA

GTGGGCTTGCCTGGCGCCGCCGTCGCTATGCAAACAGCGGTGAACCAGTTTGATTCTGGCGATAAGGGGAACAGCGACCT

GTCATCGCCGACGGAGCCAATGCCTTATTCCTTCGAAGGGTTGGTGAGGGGGAGAAGGAACGGTGGCGGAG TAGAGAAAG

TGGTGGAGAGGAGGCAGAGGAGGATGATCAAGAACAGGGAGTCCGCGGCGAGATCCCGCGCGCGCAAGCAGGCTTACACA

TTGGAATTGGAAGCTGAAGTTCAGAAACTCAAGGAGATGAACAAGGAATTGGAGAGGAAACAGGCAGATATCATGGAAAT

GCAGAAAAATGAGGTAGAAGAAATGATAAAGGATCCATTTGGAAGAAGGAAGAGACTTTGCTTGCGAAGAACACTGACTG

GTCCCTGGTGA

서열번호 3

LELEAEVQKLKEMNKELERKQADIMEMQKNEVEEMIKDPFGRRKRLCLRRTLTGPW

서열번호 4

MNMDELLRSIWTAEESQAMASASGSAAGVGVAVGAPPTSLQRQGSLTLPRTLSAKTVDEVWRNLVRDEPPPVGAADGGDM

PPQRQSTLGEMTLEEFLVRAGVVRENPPAAPPPVPPPMPPRPVPVVPKTTAFLGNFPGANDAGAAALGFAPLGMGDPALG

NGLMPRAVPVGLPGAAVAMQTAVNQFDSGDKGNSDLSSPTEPMPYSFEGLVRGRRNGGGVEKVVERRQRRMIKNRESAAR

SRARKQAYTLELEAEVQKLKEMNKELERKQADIMEMQKNEVEEMIKDPFGRRKRLCLRRTLTGPW

서열번호 5

ATGAACATGGACGAGCTGCTCCGGAGCATCTGGACCGCGGAGGAGAGCCAGGCCATGGCCTCCGCCTCTGGCTCCGCCGC

G

서열번호 6

5'-ggaattcatgctgacggataggtgggg-3'

서열번호 7

5‘-ctcgagttaccagggacctgtcaatgttct-3’

서열번호 8

5‘-gaattcagcgacctgtcatcgccg-3’

서열번호 9

5‘-gcaagcaaagtctcttccttcttc-3’

서열번호 10

5‘-tctagatctatgaacatggacgagctgc-3’

서열번호 11

5‘-agatctccagggacctgtcaa-3’

서열번호 12

5‘-gaattcggggtgggcgtggcc-3’

서열번호 13

5'-gaattccgccagggctcgctca-3'

서열번호 14

5'-gaattcgacgagccaccgccggt-3'

서열번호 15

5‘-gaattcgagggtcgatgaacatggacg-3’

서열번호 16

5‘-tctagaaccatggcatcaatgcagaag-3’

서열번호 17

5‘-tctagagctcgcggccgcggtacctcgagagat-3’

서열번호 18

5‘-tctagaaccatgtacccatacgatgtt-3’

서열번호 19

5'-caggttcaaaacaagccaag-3'

서열번호 20

5'-caccgttcgttactcgtatca-3'

서열번호 21

5'-aggtgataaggatgccaag-3'

서열번호 22

5'-cagggtcaggttgttgctc-3'

서열번호 23

5'-aaccatcttctgtggggac-3'

서열번호 24

5'-agaaccctgcgagtctatc-3'

서열번호 25

5'-ccccatatgggaagaaaaaaacta-3'

서열번호 26

5'-cccggatccctaattaagtagtggga-3'

도 1은 본 발명의 전사조절인자 OREB2 유전자의 전체 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 OREB2 단백질의 구조적 특징을 모식적으로 나타낸 것이다. AD: 전사촉진 활성 영역; BRLZ: 염기성 류신 지퍼 영역; Prich: 프롤린 과밀영역; 및 CPM: 인산화모듈.

도 3은 본 발명의 OREB2 유전자가 호르몬 ABA, 염 및 시토키닌에 의해 발현 유도되는 양상을 역전사효소-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)으로 분석하여 나타낸 것이다.

도 4는 벼와 애기장대의 데이터베이스로부터 얻은 A그룹 bZIP형 전사조절인자들의 계통학적 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 OREB2 단백질, OREB2-D71 단백질 및 N-말단 71개 이상 아미노산이 결손된 돌연변이들에서 전사 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 N-말단 결손 OREB2 단백질들의 앱시스산 반응인자가 삽입된 효모에서의 전사 활성을 비교하여 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명에서 C-말단 smGFP 가 결합된 OREB2-D71 단백질을 모식적으로 나타내고 양파 표피세포 핵에서 발현 양상을 형광현미경으로 관찰한 것이다.

도 8은 본 발명의 OREB2-D71 단백질의 N-말단에 에피토프 (HA 또는 Myc)를 삽입하여 (A) 35S 프로모터의 하류에 연결시킨 식물 형질전환용 발현 벡터 (B)의 제작 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 9은 본 발명의 OREB2-D71 유전자가 고발현되는 애기장대 형질전환체 (HA1, Myc7및 Myc8)에서 개화가 지연되는 양상을 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명의 애기장대 형질전환체에서 개화 관련 유전자의 발현 양상을 조사한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. GI: GIGANTEA; CO: CONSTANS; FT: 개화 부위 T (flowering locus T); FLC: 개화 부위 C; AP1: APETALA1.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for controlling flowering time of plant by using N-terminus-deleted mutant of bZIP transcription factor <130> PA080075 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 1 Met Leu Thr Asp Arg Trp Gly Gly Arg Arg Glu Ala Met Glu Phe Gly 1 5 10 15 Asn Gly Gly Ser Ser Ser Ser Glu Arg Arg Ala Ala Ala Glu Gly Ala 20 25 30 Thr Leu Ala Arg Gln Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe 35 40 45 Gln Ser Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Phe Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser 65 70 75 80 Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser Gln Ala Met Ala Ser Ala Ser Gly Ser 85 90 95 Ala Ala Gly Val Gly Val Ala Val Gly Ala Pro Pro Thr Ser Leu Gln 100 105 110 Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Ala Lys Thr Val 115 120 125 Asp Glu Val Trp Arg Asn Leu Val Arg Asp Glu Pro Pro Pro Val Gly 130 135 140 Ala Ala Asp Gly Gly Asp Met Pro Pro Gln Arg Gln Ser Thr Leu Gly 145 150 155 160 Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu 165 170 175 Asn Pro Pro Ala Ala Pro Pro Pro Val Pro Pro Pro Met Pro Pro Arg 180 185 190 Pro Val Pro Val Val Pro Lys Thr Thr Ala Phe Leu Gly Asn Phe Pro 195 200 205 Gly Ala Asn Asp Ala Gly Ala Ala Ala Leu Gly Phe Ala Pro Leu Gly 210 215 220 Met Gly Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Leu Met Pro Arg Ala Val Pro 225 230 235 240 Val Gly Leu Pro Gly Ala Ala Val Ala Met Gln Thr Ala Val Asn Gln 245 250 255 Phe Asp Ser Gly Asp Lys Gly Asn Ser Asp Leu Ser Ser Pro Thr Glu 260 265 270 Pro Met Pro Tyr Ser Phe Glu Gly Leu Val Arg Gly Arg Arg Asn Gly 275 280 285 Gly Gly Val Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys 290 295 300 Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr 305 310 315 320 Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Gln Lys Leu Lys Glu Met Asn Lys Glu 325 330 335 Leu Glu Arg Lys Gln Ala Asp Ile Met Glu Met Gln Lys Asn Glu Val 340 345 350 Glu Glu Met Ile Lys Asp Pro Phe Gly Arg Arg Lys Arg Leu Cys Leu 355 360 365 Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp 370 375 <210> 2 <211> 1131 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atgctgacgg ataggtgggg agggaggagg gaggcgatgg agttcgggaa cggcgggtcc 60 tcctcgtcgg agcgcagggc ggcggcggag ggggcgacgc tggcgagaca gggttcggtg 120 tattcgctga cgttcgacga gttccagagc gcgctcgctg gtggcggcgg cggcggcggt 180 ggtggaagcg ggttcgggaa ggacttcggc tccatgaaca tggacgagct gctccggagc 240 atctggaccg cggaggagag ccaggccatg gcctccgcct ctggctccgc cgcgggggtg 300 ggcgtggccg tgggggcgcc gccgacgtcg ctgcagcgcc agggctcgct caccctgccc 360 cgcacgctca gcgccaagac ggtggacgag gtatggcgca accttgtgcg cgacgagcca 420 ccgccggtgg gggcggcgga tggcggcgat atgccacccc agcggcagtc gaccctcggg 480 gagatgaccc tggaggagtt cttggtcaga gccggcgtgg tccgagaaaa tccacccgct 540 gcgccgcccc ccgttccccc gccaatgccg ccgcggccag tcccggtggt ccccaagacc 600 actgccttct tgggaaactt ccccggtgcc aacgatgccg gcgcggcggc gctgggcttt 660 gcgccgctcg gcatggggga tccagccttg ggcaatggcc tgatgcccag ggcagtgcca 720 gtgggcttgc ctggcgccgc cgtcgctatg caaacagcgg tgaaccagtt tgattctggc 780 gataagggga acagcgacct gtcatcgccg acggagccaa tgccttattc cttcgaaggg 840 ttggtgaggg ggagaaggaa cggtggcgga gtagagaaag tggtggagag gaggcagagg 900 aggatgatca agaacaggga gtccgcggcg agatcccgcg cgcgcaagca ggcttacaca 960 ttggaattgg aagctgaagt tcagaaactc aaggagatga acaaggaatt ggagaggaaa 1020 caggcagata tcatggaaat gcagaaaaat gaggtagaag aaatgataaa ggatccattt 1080 ggaagaagga agagactttg cttgcgaaga acactgactg gtccctggtg a 1131 <210> 3 <211> 376 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 3 Met Leu Thr Asp Arg Trp Gly Gly Arg Arg Glu Ala Met Glu Phe Gly 1 5 10 15 Asn Gly Gly Ser Ser Ser Ser Glu Arg Arg Ala Ala Ala Glu Gly Ala 20 25 30 Thr Leu Ala Arg Gln Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe 35 40 45 Gln Ser Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Phe Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser 65 70 75 80 Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser Gln Ala Met Ala Ser Ala Ser Gly Ser 85 90 95 Ala Ala Gly Val Gly Val Ala Val Gly Ala Pro Pro Thr Ser Leu Gln 100 105 110 Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Ala Lys Thr Val 115 120 125 Asp Glu Val Trp Arg Asn Leu Val Arg Asp Glu Pro Pro Pro Val Gly 130 135 140 Ala Ala Asp Gly Gly Asp Met Pro Pro Gln Arg Gln Ser Thr Leu Gly 145 150 155 160 Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu 165 170 175 Asn Pro Pro Ala Ala Pro Pro Pro Val Pro Pro Pro Met Pro Pro Arg 180 185 190 Pro Val Pro Val Val Pro Lys Thr Thr Ala Phe Leu Gly Asn Phe Pro 195 200 205 Gly Ala Asn Asp Ala Gly Ala Ala Ala Leu Gly Phe Ala Pro Leu Gly 210 215 220 Met Gly Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Leu Met Pro Arg Ala Val Pro 225 230 235 240 Val Gly Leu Pro Gly Ala Ala Val Ala Met Gln Thr Ala Val Asn Gln 245 250 255 Phe Asp Ser Gly Asp Lys Gly Asn Ser Asp Leu Ser Ser Pro Thr Glu 260 265 270 Pro Met Pro Tyr Ser Phe Glu Gly Leu Val Arg Gly Arg Arg Asn Gly 275 280 285 Gly Gly Val Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys 290 295 300 Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr 305 310 315 320 Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Gln Lys Leu Lys Glu Met Asn Lys Glu 325 330 335 Leu Glu Arg Lys Gln Ala Asp Ile Met Glu Met Gln Lys Asn Glu Val 340 345 350 Glu Glu Met Ile Lys Asp Pro Phe Gly Arg Arg Lys Arg Leu Cys Leu 355 360 365 Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp 370 375 <210> 4 <211> 305 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4 Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser 1 5 10 15 Gln Ala Met Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ala Gly Val Gly Val Ala 20 25 30 Val Gly Ala Pro Pro Thr Ser Leu Gln Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu 35 40 45 Pro Arg Thr Leu Ser Ala Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Asn Leu 50 55 60 Val Arg Asp Glu Pro Pro Pro Val Gly Ala Ala Asp Gly Gly Asp Met 65 70 75 80 Pro Pro Gln Arg Gln Ser Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe 85 90 95 Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asn Pro Pro Ala Ala Pro Pro 100 105 110 Pro Val Pro Pro Pro Met Pro Pro Arg Pro Val Pro Val Val Pro Lys 115 120 125 Thr Thr Ala Phe Leu Gly Asn Phe Pro Gly Ala Asn Asp Ala Gly Ala 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Phe Ala Pro Leu Gly Met Gly Asp Pro Ala Leu Gly 145 150 155 160 Asn Gly Leu Met Pro Arg Ala Val Pro Val Gly Leu Pro Gly Ala Ala 165 170 175 Val Ala Met Gln Thr Ala Val Asn Gln Phe Asp Ser Gly Asp Lys Gly 180 185 190 Asn Ser Asp Leu Ser Ser Pro Thr Glu Pro Met Pro Tyr Ser Phe Glu 195 200 205 Gly Leu Val Arg Gly Arg Arg Asn Gly Gly Gly Val Glu Lys Val Val 210 215 220 Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg 225 230 235 240 Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val 245 250 255 Gln Lys Leu Lys Glu Met Asn Lys Glu Leu Glu Arg Lys Gln Ala Asp 260 265 270 Ile Met Glu Met Gln Lys Asn Glu Val Glu Glu Met Ile Lys Asp Pro 275 280 285 Phe Gly Arg Arg Lys Arg Leu Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro 290 295 300 Trp 305 <210> 5 <211> 81 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 atgaacatgg acgagctgct ccggagcatc tggaccgcgg aggagagcca ggccatggcc 60 tccgcctctg gctccgccgc g 81 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 ggaattcatg ctgacggata ggtgggg 27 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 ctcgagttac cagggacctg tcaatgttct 30 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 8 gaattcagcg acctgtcatc gccg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 9 gcaagcaaag tctcttcctt cttc 24 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 tctagatcta tgaacatgga cgagctgc 28 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 11 agatctccag ggacctgtca a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 gaattcgggg tgggcgtggc c 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 gaattccgcc agggctcgct ca 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 14 gaattcgacg agccaccgcc ggt 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 15 gaattcgagg gtcgatgaac atggacg 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 tctagaacca tggcatcaat gcagaag 27 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 17 tctagagctc gcggccgcgg tacctcgaga gat 33 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 18 tctagaacca tgtacccata cgatgtt 27 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 19 caggttcaaa acaagccaag 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 20 caccgttcgt tactcgtatc a 21 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 21 aggtgataag gatgccaag 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 22 cagggtcagg ttgttgctc 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 23 aaccatcttc tgtggggac 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 24 agaaccctgc gagtctatc 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 25 ccccatatgg gaagaaaaaa acta 24 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 26 cccggatccc taattaagta gtggga 26

Claims

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서열번호 2의 염기서열로 이루어지고 벼 (Oryza sativa)로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 전사활성 도메인을 포함하며 식물의 개화시기 조절에 관여하는 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71.
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제 5항의 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71 (수탁번호: KACC 95092P).
삭제
제 11항의 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71로 식물을 형질전환시킨 형질전환 식물체.
삭제
제 11항의 bZIP형 전사조절인자 유전자 OREB2-D71을 포함하는 식물 발현 벡터 pCAMBIAMyc-OREB2-D71를 이용하여, 제 5항의 OREB2-D71 유전자를 과발현시키는 과정으로 형질전환 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.
삭제