KR101116858B1 - 암 및 만성적 바이러스 감염을 치료하기 위한 점액종바이러스의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 점액종 바이러스의 치료학적 용도에 관한 것이다. 점액종 바이러스는 인터페론에 대해 비반응성인 세포를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있으며, 이러한 세포의 존재에 의하여 특징되는 암을 포함하는 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

암 및 만성적 바이러스 감염을 치료하기 위한 점액종 바이러스의 용도{USE OF MYXOMA VIRUS FOR THERAPEUTIC TREATMENT OF CANCER AND CHRONIC VIRAL INFECTION}

본 발명은 점액종 바이러스의 치료학적 용도에 관한 것이다.

다양한 타입의 암 치료에 사용되는 최근 치료법은 암성 세포 (cancerous cell)를 독성화 (poisoning)시키거나 살상시킴으로써 수행되는 경향이 있다. 불행하게도, 암 세포들에 대해 독성을 보이는 치료법들은 전형적으로 건강한 세포에 대해서도 독성을 나타내는 경향이 있다. 또한, 암의 이질적 특성은 여전히 암에 대한 효율적인 치료가 어려운 중요한 이유 중의 하나이다. 화학요법 및 방사선요법 등의 최근의 주된 치료법은 독성 치료법의 좁은 범위내에서 사용되는 경향이 있다. 이러한 형태의 치료법들은 다양한 형태의 암세포 및 이러한 치료법들이 적용되기에는 제한된 범위로 인해 그 적용이 제한된 무딘 기술 (blunt tools)로 간주된다.

최근에 개발된 현대 항암 치료법들은 건강한 세포에 대해서는 낮은 독성을 나타내는 반면 암세포만을 선택적으로 표적하기 위해 시도하고 있으며, 이로 인해 암에 걸리지 않은 건강한 세포들을 남기는데 있어 훨씬 더 적합하다.

종양살상 (Oncolytic) 바이러스 치료법은 종양 세포와 정상 세포 사이의 세포적 차이를 이용하는 (exploit) 것을 목적으로 하는 하나의 시도이다. 이러한 치료법은 항암제로서 복제-가능한 (replication-competent), 종양-선택적 바이러스 벡터를 이용한다. 종양살상 바이러스는 특별히 암 세포를 감염 표적으로 하거나, 건강한 세포에 비해 암 세포에서 효율적으로 복제하기에 훨씬 적합하다. 이러한 복제-가능한, 종양살상 바이러스들은 자연적으로 발생하거나 또는 유전적으로 조작된 것으로서 이질적 암 집단을 표적으로 하는데 있어서 고 선택성 및 강력한 (potent) 수단이 된다. 복제 선택적 종양살상 바이러스가 정상 세포에서는 효율적으로 복제하지 않기 때문에, 특히 방사선 또는 화학요법 등의 기존의 치료법과는 대조적으로 환자에 대한 독성이 낮다.

수많은 연구에서는 자연적으로 발생하거나 유전적으로 변형된 형태의 아데노바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스 1 (herpes simplex virus,“HSV”), 레오바이러스 (Reovirus), 백신 바이러스 (vaccina virus), 소수포구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus,“VSV”) 또는 폴리오바이러스 (poliovirus) 등의 가장 유망한 종양살상 바이러스를 가진 바이러스 세포주에 대한 종양살상 활성을 보고하였다. 항암제로서 최근에 개발중인 변형된 종양살상 바이러스는 HSV, 아데노바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 (“NDV”), 레오바이러스 및 백신 바이러스, 홍역 (measles), VSV 및 폴리오바이러스를 포함한다. 다양한 종양살상 바이러스들은 임상 시험 1 단계 및 2 단계에 있으며 지속적인 효능을 나타내고 있다. 그러나, 바 이러스가 지속적인 복제, 특이성 및 잠재적 살상 활성의 종양살상 목표를 최상으로 만족시킬지에 대해서는 알려져 있지 않다. 종양살상 바이러스 벡터용으로 매우 효율적인 후보로는 짧은 라이프 사이클을 갖고, 빠르게 성숙 비리온 (virion)을 형성하며, 효율적으로 세포로부터 세포로 확산하며, 삽입용으로 준비된 큰 게놈을 가진 것이 될 수 있다. 그뿐 아니라, 초기의 선천적 면역 반응을 억제시키고 Th1 반응의 발생 속도를 늦추는 것이 종양살상 치료법의 효과에 있어서 중요하다는 증거가 제시되고 있다. 종양살상 바이러스를 발생시키는 것으로 간주되는 수많은 바이러스에 대해 정상 집단에서 관찰되는 높은 레벨의 항체 및 T 세포 반응으로 측정한 바와 같이, 인간 바이러스가 면역성이 높다는 사실은 명백하다.

최근의 종양살상 바이러스가 매우 안전하지만, 이는 완벽하게 임상적으로 효율적이어야 하는 단일치료법으로서는 충분하지 않다는 사실을 임상실험에서 밝혔다. 일반적으로 불충분하거나 비효율적인 종양 세포 감염이 관찰되기 때문에, 최근의 경향은 후보 바이러스 (candidate virus)가 치료학적 변이유전자를 발현하도록 상기 바이러스를 유전적으로 조작시킴으로써 바이러스의 효율성을 증가시키는 것이다. 또한, 상기-언급한 종양살상 바이러스의 대부분은 다른 공통의 종양살상 치료법과 조합하여 테스트된다.

아데노바이러스는 손쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며 주지의 관련 바이러스 단백질 기능을 가진다. 또한, 상기 아데노바이러스는 중경증 질병 (fairly mild disease)과 관련되어 있다. ONYX-015 인간 아데노바이러스 (Onyx Pharmaceuticals Inc.)는 임상적 용도로 최적화된 가장 광범위하게 테스트된 종양 살상 바이러스 중의 하나이다. 상기 바이러스는 p53-음성 종양에서 우선적으로 복제하고 두경부암 환자에서의 임상 시험에서 효능성 (potent)을 보이는 것으로 간주되고 있다. 그러나, 연구결과들에서는 ONYX-015가 처리된 환자의 14%에서만 목적하는 임상 반응을 유발함을 보여준다 (Nemunaitis J, Khuri F, Ganly I, Arseneau J, Posner M, Vokes E, Kuhn J, McCarty T, Landers S, Blackburn A, Romel L, Randlev B, Kaye S, Kirn D. J. Clin . Oncol. 2001 Jan 15;19(2):289-98).

국제특허공보 WO96/03997 및 W097/26904에서는 돌연변이 종양살상 HSV가 종양 세포 성장을 억제하며 신경 세포에 대해 특이적임을 기술하고 있다. 또 다른 이점은 HSV가 용이하게 유전적으로 변형될 수 있으며 모든 불필요한 바이러스 복제를 차단하기 위해 약물이 존재한다는 것이다. 그러나, 이러한 바이러스에 노출되고 바이러스에 대한 면역 반응을 획득한 일반 집단이 바이러스의 살상 작용을 약화키는 경향이 있기 때문에, 이러한 공통 인간 병원체는 제한적으로 적용된다. 또한, HSV는 심각한 부작용 또는 잠재적으로 치명적인 질병을 유발할 수 있다.

레오바이러스 타입 Ⅲ는 상대적으로 경증인 질병과 관련이 있으며 이의 바이러스 유전자 기능은 매우 잘 공지되어 있다. 레오바이러스 타입 Ⅲ는 암 치료요법제로서 옹코리틱 바이오테크사 (Oncolytic Biotech)에 의해 최근에 개발되었으며, 돌연변이 ras 종양 유전자를 발현하는 세포에서 향상된 복제 특성을 가지고, PKR -/- 세포에서 우선적으로 자라는 특성을 가진다 (Strong J.E. and P.W. Lee,. J. Virology, 1996. 70:612-616). 그러나, 레오바이러스는 유전적으로 조작하기에 어려우며 이의 바이러스 복제는 손쉽게 차단될 수 없다.

VSV는 상대적으로 경증인 질병과 관련이 있으며 또한 주지된 바이러스 유전자 기능을 갖는다. 국제특허공보 WO99/04026에서는 다양한 질환을 광범위하게 치료하는데 발현하기 위해 유전자 치료요법에서 사용하는 벡터로서 VSV의 용도에 대해 개시하고 있다. 그러나, VSV는 유전적으로 조작하기에 어렵고 바이러스 복제가 손쉽게 차단되지 않는, 레오바이러스와 유사한 문제점을 겪고 있다.

백신 바이러스 및 폴리오바이러스는 당업계에 개시된 다른 후보 종양살상 바이러스이지만 심각한 질병 또는 잠재적으로 치명적인 질병과 연관되어 있다.

미합중국 특허 US4,806,347에서는 인간 종양 세포에 대한 감마 인터페론 및 IFNγ 단편의 용도에 대해 개시한다. 국제특허공보 WO99/18799에서는 치료학적 유효량의 인터페론-민감성, 복제 가능 클론 바이러스를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인터페론-매개의 항바이러스 반응이 결핍된 질병에 걸린 세포를 가진 포유동물의 질병을 치료하는 방법을 개시한다. 특히 상기 특허에서는 VSV 입자가 종양 세포에 대해 독성의 활성을 가지지만, 인터페론의 존재하에서 VSV에 의한 정상 세포에서의 세포독성 완화가 일어난다고 개시한다. 또한, 국제특허공보 WO99/18799에서는 NDV-유도된 민감성이 인터페론-처리된 종양 세포에서 관찰되지만, 정상 세포에 인터페론을 첨가함으로써 이러한 세포들이 NDV에 대해 저항성을 갖게 됨을 개시한다. 이러한 방법은 인터페론 민감성 바이러스로 세포들을 감염시킴으로써 세포가 인터페론에 대해 민감하도록 만드는 것을 목적으로 한다.

발명의 요약

일 양태에 따르면, 본 발명은 유효량의 점액종 바이러스를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 억제 방법을 제공한다.

일 양태에 따르면, 본 발명은 유효량의 점액종 바이러스를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포 억제용의 유효량의 점액종 바이러스의 용도 및 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포 억제용의 약물 제조에 사용되는 점액종 바이러스의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태 치료 및 이러한 질병 상태에 있는 환자 치료에 사용하는 약물의 제조에 사용되는 유효량의 점액종 바이러스의 용도를 제공한다.

다른 양태에 따르면, 본 발명은 점액종 바이러스 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 억제하는데 사용하기 위한 용도의 그리고 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병상태의 치료에 사용하기 위한 용도의, 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 점액종 바이러스 및 인스트럭션 (instruction)을 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포 억제용 또는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상 태 치료용 킷트를 제공한다. 상기 질병 상태는 암 및 만성적 바이러스 감염을 포함한다.

또한, 본 발명은 검출 가능한 마커를 발현하도록 변형된 점액종 바이러스를 환자에 투여하는 단계; 환자에 존재하는 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포에 상기 바이러스를 감염시키는 단계; 및 환자로부터 검출가능한 마커를 발현하는 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 환자로부터 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포를 점액종 바이러스에 노출시키는 단계; 및 점액종 바이러스에 의한 세포 감염도를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 토끼 점액종 바이러스가 인간 종양 세포를 포함하여, 인터페론에 대해 비-반응성인 것을 포함하는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있다는 예기치 못한 발견에 기초한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “선천적”은, 비-항원 특이적 면역 반응을 뜻한다. 점액종 바이러스가 정상 인간 세포에서 효율적으로 복제할 수 없기 때문에, 상기 바이러스는 인터페론에 대해 비-반응성인 세포를 포함하는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포로 특징되는 다양한 질환 및 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 암에 대한 종양살상 치료법으로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 바이러스는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 확인하고, 이러한 세포를 인 비보에서 이 미지화하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태 및 특징은 첨부하는 도면과 함께 본 발명의 특정 실시예에 개시된 사항을 통해 당업자에 의해 손쉽게 도출할 수 있다. 그러나, 이들 상세한 설명 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 발명자들은 정상적으로 토끼를 감염시키며 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 인간 세포, 예를 들어 인터페론에 대해 비-반응성인 인간 세포를 포함하는 세포를 선택적으로 감염시키고 살상시킬 수 있는 점액종 바이러스를 개발하였다. 반면, 상기 점액종 바이러스는 정상 인간 세포에서는 효율적으로 복제하지 않는다. 많은 질병 또는 상태는 인터페론에 대해 반응하지 않는 세포, 예를 들어 암을 포함하는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포가 존재하는 것을 특징으로 하기 때문에, 점액종 바이러스는 정상의 건강한 세포에 대해서는 낮은 독성을 보이면서, 암을 포함하는 이러한 질병 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 점액종 바이러스는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포와 같은 만성적으로 감염된 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 많은 바이러스들은 세포의 항바이러스성, 인터페론 반응을 억제하는 기능을 하는 유전자 산물을 코딩한다. 점액종 바이러스는 이러한 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있다.

점액종 바이러스 (Myxoma Virus,“MV”)는 토끼에서 점액종증의 병원체이다. MV는 DNA 바이러스 중에 가장 큰, 폭스비리대 (foxviridae) 과의 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus) 속에 속한다. MV는 그의 천연 숙주인, 미국에 있는 실비라거스 (sylvilagus) 토끼에서 양성 (benign) 질병을 유발한다. 그러나, MV는 병독성 (virulent)이고 유럽 토끼에서 치명적 질병을 유발하는 숙주-특이적 폭스 바이러스이며, 전신 및 특히 점막 부위 근처에서 발견되는 환부 (lesion)의 특징을 갖는다 (Cameron C, Hota-Mitchell S, Chen L, Barrett J, Cao JX, Macaulay C, Willer D, Evans D, McFadden G. Virology 1999, 264(2): 298-318; Kerr P & McFadden G. Viral Immunology 2002, 15(2): 229-246).

MV는 감염된 세포의 세포질에서 복제하는, 163 kb의 이중가닥 DNA 게놈으로 이루어진, 크기가 큰 바이러스이다 (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds., Virology Lippincott Raven Press, New York, 2nd ed., 1996). MV는 숙주의 면역 반응과 염증반응을 하향조절하고 바이러스-감염된 세포의 세포사멸을 억제시키는 것과 관련이 있는 다양한 세포-연관된 단백질 및 분비된 단백질을 코딩하는 것으로 알려져 있다. MV는 모든 인간의 체세포에 의해 흡수 (take up)될 수 있다. 그러나, 만약 세포들이 정상적으로 선천적인 항-바이러스 반응을 가진다면, 토끼의 정상 체세포에 있는 것 이외의 바이러스는 생산적으로 세포를 감염시킬 수 없을 것이며, 이는 바이러스가 복제 및 세포 죽음을 유발할 수 없음을 의미한다.

인터페론 (“IFNs”)은 다양한 자극에 반응하여 분비되는 사이토카인류이다. 인터페론은 세포 표면의 수용체에 결합하여, 신호 캐스케이드 (cascade)를 활성화시킴으로써, 항-바이러스 반응 및 성장 억제 및/또는 세포사멸 신호의 유발을 포함하는 수많은 세포 반응을 유발한다. 인터페론은 타입 I 또는 타입 Ⅱ로 분류될 수 있다. 타입 I IFNs은 IFN-α, -β,-τ 및 -ω를 포함하고, 이들은 모두 모노머이며; 타입 Ⅱ IFN은 다이머인 IFN-γ이다. 12개의 다른 IFN -α아형은 14개의 유전자에 의해 생산되지만, 다른 모든 IFNs은 단일 유전자에 의한다 (Arduini et al., 1999). IFNs은 종양 유전자 발현의 조절을 통해 직접적으로 항-종양 활성을 나타낸다. 성장-촉진 종양 유전자의 과발현 또는 종양 억제 종양 유전자의 소실은 악성 전이를 유발할 수 있다. 암 발생과 관련된 일부 종양 유전자들은 p53, Rb, PC, NF1, WT1 및 DCC이다.

레오바이러스 및 VSV 등의 다른 종양살상 바이러스 뿐만 아니라 점액종 바이러스는 세포내에서 복제가능하기 위해 정상의 건강한 세포에 존재하는 항-바이러스 방어를 우회 (bypass)할 필요가 있다. MV 및 다른 종양살상 바이러스들은 인터페론의 생산을 유도하며, 일반적으로 IFN 경로의 항-바이러스 작용에 대해 민감하다. IFN 항-바이러스 반응에 의해 유도되며, 대체로 바이러스 번식에 영향을 주는 적절한 단백질들은 PKR, OAS 신테타아제 (synthetase) 및 Rnase L 뉴클레아제를 포함한다. PKR은 eIF2α를 활성화시켜, 번역을 억제하고 세포사멸을 유도하게 한다. IFN 반응 경로는 도 1에 도식적으로 표시되어 있다. 정상 세포에서, MV는 PKR 및 eIF2α에 의해 직접적으로 영향을 받는다.

항-바이러스 반응 경로는 종종 암성 (cancerous) 세포에서 파괴된다. 예를 들어, IFN에 대한 감소되거나 결핍된 반응은 전이 과정 및 종양 발생 과정 동안 유발되는 유전적 결함이다. 종양 세포주의 80% 이상은 인터페론에 대해 반응하지 않거나 약화된 반응을 나타낸다 (Stojdl et al., Cancer Cell (2003) 4: 263-275 및이에 첨부된 참조문헌; Wong et al. J Biol Chem. (1997) 272(45):28779-85; Sun et al. Blood. (1998) 91(2):570-6; Matin et al. Cancer Res. (2001) 61(5):2261-6; Balachandran et al Cancer Cell (2004) 5(1):51-65). 놀랍게도 본 발명자들은 다른 특정 이론에 의해 국한되는 바와는 달리, MV가 인간 종양 세포를 포함하는 암세포를 감염시키고 살상시킬 수 있음을 발견하였으며, MV가 이러한 세포들을 감염시킬 수 있는 것으로 믿어졌는데, 이는 상기 세포들이 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍되어 있기 때문이다.

증거에 의하면, 초기 면역 반응을 억제시키고 Th1 반응의 발생을 늦추는 것이 종양살상 치료법의 효용성에 있어서 중요하다는 점을 암시한다. 비록 점액종 바이러스가 병독성 바이러스이지만, 이는 숙주-특이적이며 매우 좁은 숙주 범위를 가지고 있고; 인간 또는 생쥐를 감염시키지 않는다. 다른 특정 이론에 의해 국한되는 바와는 달리, 점액종 바이러스가 비-인간 바이러스이기 때문에 이것은 인간에서 전-존재하는 (pre-existing) 면역 인식을 하지 않는 것으로 믿어진다. 따라서, 종양살상 바이러스로서의 잠재성은 적게 감소될 것이며, 점액종 바이러스는 천연의 인간 바이러스보다 증식허용 종양 세포에 대해 훨씬 더 강력한 감염을 제공해야 할 것이므로, 암에 대한 효율적인 종양살상 치료법을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에서는, 유효량의 점액종 바이러스를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 억제 방법을 제공한다.

특정 구현예에 따르면, 상기 세포는 포유동물의 암세포이다. 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 인간 고형 종양 세포를 포함하는 인간 암세포이다.

다른 구현예에서, 상기 세포는 바이러스에 만성적으로 감염된 세포이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포”는 바이러스에 노출되거나 바이러스에 의해 침범될 때, 바이러스 복제의 억제, 인터페론 생산, 인터페론 반응 경로의 유도 및 세포사멸을 포함하는 항-바이러스 방어 메커니즘-인터페론에 의해 매개되거나 매개되지 않음-을 유발하지 않으며, 그리하여 MV에 의해 감염가능한 세포를 의미한다. 상기 용어는 정상 세포, 예를 들어 비-감염된 세포 또는 비-암 세포와 비교했을때 바이러스에 노출되거나 감염되는 동안 선천적인 항-바이러스 반응이 감소되거나 결핍된 세포를 포함한다. 상기 용어는 인터페론에 대해 비-반응성인 세포 및 세포사멸 반응 또는 세포사멸 경로가 감소되거나 결핍된 세포를 포함한다. 이러한 결핍은 감염, 유전적 결함 또는 환경적 스트레스를 포함하는 다양한 원인에 의해 유발될 수 있다. 그러나, 전-존재하는 감염에 의해 결핍이 유발될 때에, MV에 의한 중복감염이 배제될 수 있다고 이해되며, 당업자라면 이러한 사실을 손쉽게 확인할 수 있다. 당업자는 실험을 하지 않고도 주어진 모든 세포 타입이 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍되어 있는지의 유무 및 이에 의해 점액종 바이러스에 감염가능한지에 대해서 손쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, VSV는 일반적으로 세포의 항-바이러스 반응을 측정하는데 사용된다.

주어진 세포 타입, 예를 들어 주어진 암 세포 타입이 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍되었는지를 검증하기 위해, 당업자는 특정 세포를 인 비트로에서 성장시키는 체외배양 (explant)을 선택하여 세포를 성장시킬 수 있으며 VSV 또는 점액종 바이러스에 의한 감염도를 측정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “인터페론에 대해 비-반응성인 세포”는 인터페론의 활성, 예를 들어 인터페론의 항-바이러스 또는 항-종양 활성에 반응하지 않는 세포를 의미하거나 비정상적인 인터페론 반응, 예를 들어 인터페론에 대해 감소되거나 불충분한 반응을 나타내는 세포, 또는 전사인자, 예를 들어 STAT1 등의 신호 분자를 인산화 또는 활성화시킴으로써 측정되는 비정상적 인터페론 신호를 나타내는 세포를 의미한다. 예를 들어, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 세포는 인터페론에 대해 반응성인 세포에서 이러한 반응을 유도하기에 충분한 인터페론 레벨에 노출되었을때 증식을 억제시키지 않거나 살상되지 않을 것이다. 인터페론에 대해 비-반응성인 세포는 세포내 신호 경로 또는 반응성 세포에서 정상적으로 활성화되는 경로가 결핍되어 있을 것이다. 일반적으로, VSV에 의한 감염에 대한 감수성 (susceptibility)은 인터페론에 대한 비-반응성의 표지이며, 당업자는 인터페론의 존재하에서 VSV 감염을 억제시키기 위한 세포의 능력 또는 이의 결핍에 대하여 당업계에 알려진 인터페론 활성의 다른 마커, 예를 들어 PKR, STAT, OAS 및 MX 등의 IFN 촉진된 유전자의 발현 레벨을 이용함으로써 특정 세포가 인터페론에 대해 비-반응성인지 여부를 손쉽게 측정할 수 있다.

본 명세서를 통틀어 사용된 용어 “복제-가능한 (replication-competent)”은 특정 숙주 세포내에서 바이러스가 감염 및 복제 가능함을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 “세포”는 다량의 세포 또는 세포 군집 뿐만 아니라 단일 세포도 포함한다. 제제 (agent)를 세포에 투여하는 것은 인 비트로 및 인 비보 투여를 모두 포함한다.

본원에서 사용된 용어 “유효량”은 바람직한 결과에 도달하기에 충분한 용량 및 시간 동안 효과적인 용량을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 “동물”은 인간을 포함하는 동물계의 모든 구성원을 포함한다.

용어 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 “억제시키는”은 세포가 성장하거나 분화하지 못하게 하는 것 이외에 용해 (lysis) 또는 어팝토시스 (apoptosis)에 의한 세포 사멸 또는 세포 사멸의 다른 매커니즘을 포함한다.

점액종 바이러스는 복제-가능한 폭스 바이러스의 레포리폭스바이러스 (Leporipoxvirus) 종에 속하는 어느 바이러스든지 될 수 있다. 점액종 바이러스는 점액종 바이러스의 야생형 세포주가 되거나 또는 점액종 바이러스의 유전적으로 변형된 세포주가 될 수 있다.

점액종 바이러스 게놈은 당업자에게 공지된 표준 분자 생물학 기법 및 삼브루크 등의 문헌에 개시된 실시예 (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press)를 이용함으로써 하나 이상의 치료학적 변이 유전자 (transgene)를 발현하도록 손쉽게 변형할 수 있다. 당업자라면 상기 바이러스가 여전히 생산적으로 감염 가능도록 결실될 수 있는 점액종 바이러스 게놈의 일부를 손쉽게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 결실될 수 있는 바이러스 게놈의 비-필수적 부위는 특징이 잘 밝혀진 다른 바이러스의 게놈으로 이루어진 공개된 바이러스 게놈 서열을 비교함으로써 추론 가능하다 (참조예 C. Cameron, S. Hota-Mitchell, L. Chen, J. Barrett, J.-X. Cao, C. Macaulay, D. Willer, D. Evans, and G. McFadden, Virology (1999) 264: 298-318)).

본원에서 사용된 용어 “치료학적 유전자” 또는 “치료학적 변이 유전자”는 이 유전자의 발현이 바람직한 결과, 예를 들어 항암 효과에 영향을 주는 모든 광범위한 유전자를 설명하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 상기 바이러스는 바이러스 처리의 항암 효과를 증가시킬 유전자를 전달하기 위해 변형될 것이다. 이러한 유전자는 인터페론에 대한 반응 결핍을 복구하거나 또는 박테리아 세포 표면 항원과 같이 항체 반응을 촉진하는 세포 표면 마커의 발현을 유발하는 유전자와 같이 어팝토시스을 유발하는데 관련이 있거나 면역 파괴용의 감염된 세포를 표적으로 하는데 관련이 있을 것이다. 또한, 이러한 바이러스들은 신생 (neoplastic) 세포 또는 암세포의 증식과 성장을 차단하는데 관련이 있는 유전자를 발현하기 위해 변형될 것이며, 이에 의해 세포의 분열을 억제시킨다. 뿐만 아니라, 상기 바이러스는 화학요법제의 합성과 관련된 유전자와 같은 치료요법제 유전자를 포함하도록 변형되거나, 또는 특정 종에 있는 세포에서 증가된 복제 레벨을 가지도록 변형될 수 있으며, 상기 종에 있는 억제되거나 살상되는 세포는 예를 들어 인간 세포로부터 유래된다. 특정예의 유전자는 점액종 바이러스로 삽입되어 이의 항암 활성을 증가시킬 수 있을 것이며, 이는 TRAK 단백질의 인간 유전자 또는 인간 종양 세포를 죽이는데 관련된 단백질인 E4 또는 f4 폴리펩타이드를 코딩하는 아데노바이러스 유전자를 포함한다.

바이러스 또는 치료요법제 산물의 전달에 의한 세포 용해에 의해 점액종 바이러스의 치료적 효과가 달성될 수 있음을 이해할 수 있다.

바이러스는 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 준비할 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 사용되어야 하는 점액종 바이러스 세포주를 토끼 세포에 감염시키고, 배양된 세포에서 감염된 바이러스가 복제하도록 놓아둠으로써 제조될 수 있으며, 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 세포 표면을 파괴시킴으로써 분비될 수 있으며, 이로 인해 바이러스 입자를 분비하여 수확할 수 있게 한다. 일단 수확하고 나면, 높은 밀집도의 토끼 세포를 감염시키고 플라크 분석을 수행함으로써 바이러스 역가를 측정할 수 있다 (참조, Mossman et al. (1996) Virology 215:17-30).

일 구현예에 따르면, 본 발명은 유효량의 점액종 바이러스를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태에 있는 치료를 필요로 하는 환자의 질병 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 환자는 포유동물, 인간을 포함하는 어느 동물이든지 될 수 있다.

본원에 사용된 “선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태”는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재와 연관되고, 관련되거나 이러한 특징을 갖는 모든 질병, 질환 또는 상태를 의미하며, 이러한 질병, 질환, 상태 또는 증상은 이러한 세포를 살상시킴으로써 치료될 수 있다. 예를 들어, 상기 질병 상태는 암이 될 수 있다. 또한, 이러한 질병 상태는 만성적인 바이러스 감염을 포함한다.

질병 상태의 “치료”는 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, “치료”는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, “치료”는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련이 있다. 당업자에 의해 이해된 바와 같이, 특정 질병 상태를 향상시키는 동안 치료가 치료된 환자에서 반대의 결과, 즉 치료에 의해 영향을 받는 모든 이점보다 큰 결과를 초래한다면 결과는 유익하지 않거나 바람직하지 않을 수도 있으다.

일 구현예에 따르면, 상기 질병 상태는 암이다. 암은 최소한 상기 암세포의 일부, 비록 필수적인 것은 아니지만 상기 세포 모두가 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 모든 형태의 암이 될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 암이 세포의 최소 일부가 인터페론에 대해 비-반응성임을 알 수 있다. 본원에 사용된 용어 “종양”, “종양 세포”, “암” 및 “암 세포”(혼용되어 사용됨)는 세포 증식의 조절이 상당량 소실된 특징을 갖는 비정상적으로 성장하는 세포 또는 불멸화된 (immotalize) 세포를 뜻한다. 용어 “암” 또는 “종양”은 비-전이성 뿐만 아니라 전이성 암 또는 종양을 포함한다. 본원에서 사용된 “신생 (neoplastic)” 또는 “신생물 (neoplasm)”은 정상적인 성장 억제 메커니즘이 없이 증식하는 세포 또는 세포들을 의미하고, 따라서 양성 종양을 포함하며, 추가로 증식이상 (dysplastic) 또는 과다증식 (hyperplastic) 세포 뿐만 아니라 암도 포함한다.

악성 종양의 존재를 포함하는 암은 당업계의 일반적인 기준을 이용하여 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 치료되어야 하는 종양의 타입은 백혈병 및 림프종을 포함하는 조혈 세포암, 결장암, 폐암, 신장암, 췌장암, 자궁내막암, 갑상샘암, 구강암, 난소암, 후두암, 간세포암, 쓸개관암, 편평세포암종, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 직장결장암, 흑색종 및 모든 다른 종양을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 육종 및 암종 등의 고형 종양은 섬유육종 (fibrosarcoma), 점액육종 (myxosarcoma), 지방육종 (liposarcoma), 연골육종 (chondrosarcoma), 골육종 (osteogenic sarcoma), 및 다른 육종, 윤활막종 (synovioma), 중피육종 (mesothelioma), 에윙 종양 (Ewing's tumor), 평활근육종 (leiomyosarcoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 결장 암종 (colon carcinoma), 림프암, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포암, 편평세포암종 (squamous cell carcinoma), 기저세포암종, 샘암종 (adenocarcinoma), 땀샘암종, 피지샘암종, 유두암종, 유두샘암종, 속질암종 (medullary carcinoma), 기관지유래암종 (bronchogenic carcinoma), 신장세포암종, 간암, 쓸개관암종, 융모막암종 (choriocarcinoma), 윌름즈 종양 (Wilms' tumor), 자궁경부암, 고환암, 방광암종, 및 CNS 종양 [신경아교종, 별아교세포종, 속질모세포종, 두개인두종 (craniopharyogioma), 뇌실막세포종 (ependymoma), 송과체종 (pinealoma), 혈관모세포종 (hemangioblastoma), 속귀신경집종 (acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종 (oligodendroglioma), 수막종 (meningioma), 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종 등]을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에 따르면, 상기 질병 상태는 만성적인 바이러스 감염이다.

만성적으로 감염시키는 바이러스는 연장된 기간의 긴 잠복기간 동안 병리 상태를 유발하기 위해 동물의 세포에 감염시키거나 복제시키는 모든 바이러스가 될 수 있다. 만성적으로 감염시키는 바이러스는 암 발생과 연관되거나 관련이 있는 바이러스가 될 수 있다.

바이러스를 이용한 만성적 감염은 당업계에 공지된 표준 방법을 이용해 진단할 수 있다. 예를 들어, 만성적 바이러스 감염은 환자에 있는 항-바이러스성 항체의 존재 또는 환자의 세포에 있는 바이러스 RNA 또는 DNA의 존재를 양성 테스트함으로써 검출할 수 있다.

바이러스는 표준 투여 방법을 이용해 환자에 투여할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 전신 투여된다. 다른 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 질병 부위에 주입함으로써 투여된다. 특정 구현예에 따르면, 상기 질병 상태는 종양 부위에 주입함으로써 투여되는 고형 종양 및 바이러스이다. 다양한 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며 또는 당업계에 공지된 모든 표준 방법에 의해 투여될 수 있다.

환자에게 투여될 때에, 바이러스의 유효량은 질병을 완화 (alleviate), 향상 (improve), 경감 (mitigate), 개선 (ameliorate), 안정화, 질병의 확산 억제, 질병의 진행을 늦추거나 지연, 질병을 치유하기 위해 충분한 시간 동안 요구되는 용량이다. 예를 들어, 유효량은 암성 세포 또는 신생 세포의 수를 감소시키거나 파괴 또는 바이러스로 만성적으로 감염된 세포의 수를 감소시키거나 파괴, 또는 이러한 세포의 성장 및/또는 증식을 억제시키는 효과를 달성하기에 충분한 양이 될 수 있다.

환자에게 투여되는 유효량은 바이러스의 약동학적 특성, 투여 방법, 연령, 환자의 건강상태 및 체중, 질병 상태의 특성 및 범위, 치료 횟수 및 최근의 치료 형태와 같은 수많은 인자에 의해 달라질 수 있으며, 가령 바이러스의 병독성 및 역가에 따라서도 달라질 수 있다.

당업자라면 상기 인자에 기초하여 적정량을 조절할 수 있다. 바이러스는 처음에 환자의 임상적 반응에 의존해 필요에 따라 적정량으로 투여될 수 있다. 바이러스의 유효량은 경험적으로 결정할 수 있으며 안전하게 투여될 수 있는 바이러스의 최대량 및 바람직한 결과를 유발하는 바이러스의 최소량에 따라 결정할 수 있다.

바이러스를 전신에 투여할 때, 질병 부위에 바이러스를 주입함으로써 실현되는 것과 유사한 임상적 효과를 유발하기 위해, 상당히 높은 용량의 바이러스 투여가 요구될 수 있다. 그러나, 적당한 용량 레벨은 바람직한 결과를 실현할 수 있는 최소량이 되어야 한다.

투여되는 바이러스의 농도는 투여되어야 하는 특정 점액종 바이러스 균주의 병독성 및 표적이 되는 세포의 특징에 따라 달라질 것이다. 일 구현예에 따르면, 약 10⁹ 플라그 형성 단위 (“pfu”) 미만의 양이 인간 환자에게 투여된다. 다양한 구현예에 따르면, 약 10² 내지 약 10⁹ pfu, 약 10² 내지 약 10⁷ pfu, 약 10³ 내지 약 10⁶ pfu 또는 약 10⁴ 내지 약 10⁵ pfu를 단일 용량으로 투여할 수 있다.

유효량의 바이러스는 최초 치료 요법의 효과에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일반적으로 투여는 모든 반응을 모니터링하는 동안 주기적으로 투여된다. 당업자라면 투여 스케줄 및 선택된 경로에 따라 상기 표시된 것보다 낮거나 높은 용량이 투여될 수 있음을 용이하게 파악할 수 있다.

바이러스는 단독으로 투여되거나 화학요법, 방사선 요법 또는 다른 항-바이러스 치료법을 포함하는 다른 치료법과 혼합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 수술을 통한 일차 종양의 제거 이전 또는 이후에 투여되거나 방사선요법 또는 통상적인 화학요법 약물 등의 치료 이전, 동시 또는 이후에 투여될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 바이러스는 다양한 종양 세포 타입에 대해 특이성을 나타내는 다른 종양살상 바이러스와 함께, 또는 순차적 방법으로 투여될 수 있다.

투여에 도움을 주기 위해, 상기 바이러스는 약학적 조성물 내의 성분으로서 제형화될 수 있다. 따라서, 다른 구현예에서는, 점액종 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 억제하거나 또는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태를 치료하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 통상 약학적으로 허용가능한 농축염, 완충제, 보존제 및 다양한 혼용가능한 담체를 포함할 수 있다. 모든 형태의 전달을 위해, 재조합 바이러스는 생리염 용액 내에 제형화될 수 있다.

약학적 조성물은 추가로 항암제 등의 다른 치료요법제를 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 화학요법제를 포함한다. 예를 들어, 상기 화학요법제는 실질적으로 환자의 암 세포 또는 신생 세포에 대해 종양살상 효과를 나타내고 바이러스의 종양살상 작용을 억제하거나 파괴하지 않는 모든 제제가 될 수 있다. 예를 들어, 화학요법제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아자이리딘 (aziridine), 에틸렌이민, 메틸멜라민, 질소 머스타드 (nitrogen mustard), 나이트로소유레아, 항생제, 대사길항제 (antimetabolite), 엽산 유사체 (folic acid analogue), 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신 (podophyllotoxin), 백금-포함 제제 또는 사이토카인이 될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 화학요법제는 암성 또는 신생성의 특정 세포 타입에 대해 효과적인 것으로 공지된 것이다.

약학적으로 허용가능한 희석제의 비율 및 확인 (identity)은 선택된 투여 경로, 생 바이러스와의 적합도 및 표준 약학적 실시법 (practice)에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물은 생 바이러스의 생물학적 특징을 상당량 감소시키지 않는 성분으로 제형화될 것이다.

약학적 조성물은 환자에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위해 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 이러한 유효량의 활성 성분은 약학적으로 허용가능한 매개체와 혼합물의 형태로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 적합한 매개체는 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)에 개시되어 있다. 이러한 기준에 따라, 예외적인 것을 제외하고, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 매개체 또는 희석제와 혼합하여 적합한 pH를 가진 완충용액 및 생리학적 용액을 가진 등장액에 포함된 바이러스 용액을 포함한다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이 상기 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 다양한 형태로 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 상피통과 (transepithelial), 코, 허파속 (intrapulmonary), 수막공간내 (intrathecal), 직장 (rectal) 및 국소 투여 방법을 포함한다. 비경구 투여는 선택된 기간 동안 연속적 주입에 의해 실시될 수 있다.

예를 들어, 약학적 조성물은 불활성 희석제 또는 융화가능한 담체와 함께, 또는 경피 또는 연피 젤라틴 캡슐에 포함되어, 또는 정제에 압축되어 구강 투여될 수 있다. 구강투여를 하기 위해, 상기 바이러스는 부형제와 결합될 수 있으며 복용가능한 정제, 볼 (buccal) 정제, 구내정 (troche), 캡슐, 엘릭스제 (elixir), 현탁액, 시럽, 박판 (wafer) 등의 제형에서 사용될 수 있다.

바이러스 용액은 생리학적으로 허용가능한 완충액에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 이용 조건에 따라, 이러한 제형은 미생물의 성장을 억제하기 위해 보존제를 포함하지만, 이는 생 바이러스를 불활성화시키지는 않을 것이다. 당업자라면 적합한 제형을 제조하는 방법을 알 수 있다. 예를 들어, 적합한 제형의 선별 및 제조를 위한 통상적인 방법 및 성분은 레밍턴의 약학적 과학 (Remington’s Pharmaceutical Sciences) 및 1999년에 공개된 The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)에 개시되어 있다.

다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 종양 부위와 같은 질병 부위에 직접적으로 주입함으로써 (피하, 정맥내 및 근육내, 등) 투여되거나, 경구 투여, 선택적으로는 경피 투여로 투여된다.

주입 용도로 사용하기에 적합한 약학적 조성물의 제형은 멸균된 액상 용액 또는 분산 및 멸균된 주입 용액 또는 분산의 임시 처방용 멸균 파우더를 포함하며, 상기 용어 멸균은 투여되는 생 점액종 바이러스 자체에까지는 확장되지 않는다. 모든 경우에 있어서 상기 제형은 멸균되어야 하며 손쉽게 주사가능하도록 확산되기 위해 유동액이어야 한다.

사용되는 약학적 조성물의 용량은 치료되어야 하는 특정 상태, 상태의 심각도, 그리고 연령, 신체 상태, 키와 체중, 치료기간, 동시에 사용되는 치료법의 특징 (가능하다면) 및 특별한 투여 경로를 포함하는 각 환자의 파라미터 및 건강한 실험자의 지식과 기술의 범위내에 있는 다른 유사한 인자에 따라 다르게 사용되어야 한다. 이러한 인자들은 당업계에 공지되어 있으며 최소한의 일반적인 실험을 이용해 확인할 수 있다.

또한, 점액종 바이러스 또는 점액종 바이러스를 포함하는 약학적 조성물은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 억제하기 위한 점액종 바이러스의 용도 또는 치료를 필요로 하는 환자에 있는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태를 치료하기 위한 점액종 바이러스의 용도를 포함하는 바이러스용으로 사용하기 위한 인스트럭션을 포함하는 킷트로서 제조될 수 있다. 상기 질병 상태는 암 또는 만성적 바이러스 감염일 수 있다.

또한, 본 발명은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 억제하기 위한 점액종 바이러스의 용도를 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 인터페론에 대해 비-반응성이다. 또한, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자의 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병상태를 치료하기 위한 점액종 바이러스의 용도를 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 질병 상태는 암이다. 또한, 본 발명은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 억제하거나 또는 치료를 필요로 하는 환자의 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병상태를 치료하기 위한 약물의 제조에 사용하는 점액종 바이러스의 용도를 제공한다.

자연상태의 숙주에 비해 동물에서 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 선택적으로 감염시키는 MV의 능력은 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍되고 인터페론에 대해 비-반응성인 세포를 포함하는 동물에 존재하는 세포를 검출하는데 사용되는 MV의 용도를 제공한다. 반대로 이러한 세포들은 손쉽게 검출가능하지 않는데, 예를 들면 감지할 수 있는 종양으로 아직 발전하지 못하거나 또는 동물에서 눈에 띌 정도의 증상으로 아직 유도되지 않은 암세포가 그것이다.

따라서, 일 구현예에 따르면, 본 발명은 검출가능한 마커를 발현하도록 변형된 점액종 바이러스를 환자에게 투여하는 단계; 환자에 있는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포가 감염되도록 상기 바이러스를 놓아두는 단계; 및 환자로부터 검출가능한 마커를 발현하는 세포를 검출하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 감염된 세포는 진단 이미지를 시각화하는데 사용되는 통상적인 방법을 이용함으로써 검출될 수 있다. 검출방법은 사용된 검출가능한 마커 각각에 의존할 것이다. 예를 들어, 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 점액종 바이러스로 감염된 세포는 형광 디지털 이미지 현미경을 이용하여 검출할 수 있다. 다른 방법은 컴퓨터 단층촬영 (CT), 양전자 방출 단층촬영 (PET)과 같은 몸전체 스캔, 자기공명영상 (MRI) 및 초음파촬영술을 포함한다. 숙련된 기술자라면 검출가능한 마커 각각을 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다.

검출가능한 마커는 변형된 바이러스에 의해 감염되는 세포내에서 마커를 발현 또는 합성하는 결과를 유발하기 위해, 점액종 게놈으로 삽입될 수 있는 발현용 또는 합성용 유전자에 대한 마커를 포함하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 일 구현예에 따르면, 상기 검출가능한 마커는 형광 단백질이 될 수 있다. 감염된 세포는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 모든 세포가 감염되도록 바이러스를 놓아두고, 이러한 세포에 있는 검출가능한 레벨의 마커가 검출하는 동안 유지되도록 발현시키기 위해, 변형된 바이러스를 환자에 투여하고 난뒤 적절한 간격의 시간에 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 바이러스를 환자에 투여하고 난후 2 내지 20일 사이에 어느 부위에서든지 검출할 수 있다.

검출 방법은 환자로부터 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 존재를 모니터하기 위해 환자에서 일정 간격으로 반복적으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 점액종 바이러스를 이용한 이러한 세포의 검출 방법은 환자에서 6개월, 1년 또는 2년의 간격으로 수행할 수 있으며, 필요하다면 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포의 특징 및 환자에 있는 이러한 세포의 존재의 결과로 인해 유발되는 모든 질병 상태의 특징에 의존하여 수행할 수 있다. 일정 기간 동안 상기 방법을 반복하는 것은 환자의 몸에 있는 질병 상태의 진행 또는 진정, 또는 질병의 확산을 모니터링할 수 있게 한다.

점액종 바이러스는 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있으며, 세포에 있는 이러한 결함의 표지자 (indicator)로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용함으로써 환자로부터 제거된 세포들의 선천적인 항-바이러스 반응의 결핍도를 측정할 수 있다. 이러한 측정은 다른 표지자와 혼용할 때, 환자가 특정 질병 상태, 예를 들어 암을 겪고 있는지를 표시할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 세포를 배양하는 단계, 상기 배양된 세포를 점액종 바이러스에 노출시키는 단계; 및 점액종 바이러스에 의한 세포의 감염도를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 세포는 공지된 생검 (biopsy) 방법을 이용함으로써 인간 피실험자를 포함하는 피실험자로부터 제거될 수 있다. 상기 생검 방법은 테스트되는 세포의 위치 및 형태에 따라 다를 것이다.

세포들은 공지된 배양 기법에 따라 배양되며, 생 바이러스를 배양 미디움에 첨가함으로써 MV에 노출된다. MOI (multiplicity of infection)는 MV에 노출되는 동안 감염되는 것으로 알려진 양성 대조군 세포 배양을 이용하여, 주어진 세포 타입, 밀도 및 배양 기술에 대한 최적의 MOI를 확인하는 데 있어서 달라질 수 있다.

MV에 의한 배양된 세포의 감염도는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 측정될 수 있으며, 세포의 죽음을 유발하려는 MV의 능력을 포함한다. 또한, 바이러스 발현 산물과의 효소적 또는 화학적 반응을 완성하기 위해 시약을 세포 배양에 첨가하는 것과 관련이 있을 수 있다. 바이러스 발현 산물은 MV 게놈에 삽입된 리포터 유전자로부터 발현될 수 있다.

일 구현예에 따르면, MV는 감염 상태의 검출의 용이성을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, MV는 위상전이 현미경, 형광 현미경 또는 방사능영상에 의해 손쉽게 검출될 수 있는 마커를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 상기 마커는 형광 단백질을 발현하거나 비색 반응 또는 방사능표지 반응과 관련되는 효소를 발현할 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 마커는 테스트되는 세포 각각의 기능을 방해하거나 억제시키는 유전자 산물이 될 수 있다.

본원에 개시된 모든 문헌은 인용에 의하여 본원에 삽입된다.

도면에서는 오직 실시예의 방법에 의한 것으로써 본 발명의 구현예를 예시한다.

도 1은 세포의 바이러스 감염에 의해 유도되는 인터페론 매개 항-바이러스 신호의 개념도이다;

도 2는 점액종 바이러스에 노출되고 난 뒤의 비증식허용 (nonpermissive) WT 생쥐 배아 섬유아세포 (“MEFs”)의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 중화 항체로 인터페론 α/β를 억제시키고 난 뒤에 MEFs가 증식허용 (permissive)으로 됨을 보여준다;

도 3은 점액종 바이러스 감염후의 STAT1 및 STAT2의 인산화 상태 (활성화)를 보여주는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 MEF 세포의 비증식허용 감염이 STAT1 및STAT2 활성과 관련되어 있음을 보여준다;

도 4는 점액종 바이러스 감염후의 STAT3, STAT4, STAT5 및 STAT6의 인산화 상태 (불활성화)를 보여주는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 MEF 세포의 비증식허 용 감염이 이러한 어떠한 종류도 활성화시키지 않음을 보여준다;

도 5는 점액종 바이러스로 감염하고 난 후의 IFNα/β R-/- MEFs 및 STAT1 -/- MEFs, IFNα/β R-/- MEFs 및 STAT1 -/- MEFs의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 IFN/STAT/JAK 신호의 불활성화가 점액종 바이러스가 감염하도록 세포가 증식허용 상태가 되게 함을 보여준다;

도 6은 점액종 바이러스 감염후의 비증식허용 야생형 MEFs에 있는 PKR의 인산화 상태를 나타내는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 PKR이 점액종 바이러스 감염에 의해 활성화되지 않음을 보여준다;

도 7은 모의 감염 (mock infected)되거나 또는 점액종 바이러스로 전-감염된 야생형 MEFs에 있는 PKR의 인산화 상태를 나타내는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 점액종 바이러스가 MEF 세포에서 PKR 활성화를 억제시킴을 보여준다;

도 8은 점액종 바이러스 감염 후의 야생형 MEFs에 있는 PERK의 인산화 상태를 나타내는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 점액종 바이러스가 MEF 세포에서 PERK 활성화를 억제시킴을 보여준다;

도 9는 점액종 바이러스에 노출되고 난 후의 PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/- 트리플 넉아웃의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 MEF 세포에 있는 항바이러스 상태가 별개의 경로에 의해 매개됨을 보여준다;

도 10은 점액종 바이러스에 노출되고 난 후의 PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/- 트리플 넉아웃의 위상전이 현미경 사진이다;

도 11은 IFNα/β에 대한 중화 항체로 처리하고 난 후 및 점액종 바이러스에 노출되고 난 후의 PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/- 트리플 넉아웃의 위상전이 현미경 사진이다;

도 12는 IFNα/β에 대한 중화 항체로 처리하고 난 후 및 점액종 바이러스에 노출되고 난 후 비증식허용 MEFs에서의 eIF2α 및 PKR의 인산화 레벨을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 비증식허용 세포에서의 eIF2α인산화가 PKR-의존적 경로에 의해 촉매화됨을 보여준다;

도 13은 점액종 바이러스 감염후의 PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/- 트리플 넉아웃에서의 STAT1 인산화 상태를 보여주는 웨스턴 블랏 결과이며, 여기서는 정상 IFN-유도된 신호 반응을 나타내 준다;

도 14는 감염 후 12시간째에 비증식허용 PKR-/- ＋ RNaseL-/- ＋ Mx1 -/- 세포에서의 티로신-인산화된 STAT1의 세포내 위치를 설명해주는 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 정상 IFN/STAT 신호 반응에 대한 예측과 같이 활성화된 STAT가 핵으로 이동함을 보여준다;

도 15는 모의-감염 또는 GFP를 발현하는 죽은 또는 생 점액종 바이러스로 감염된 두개내 신경아교종에 걸린 누드 생쥐 뇌의 형광 이미지이며, 여기서는 신경아교종 세포에 대한 점액종의 표적을 보여준다;

도 16은 GFP를 발현하는 점액종 바이러스로 감염된 생쥐 신경아교종의 얇은절편 사진 및 형광 이미지이며, 여기서는 점액종 바이러스가 종양 세포에 의해서만 복제됨을 보여준다;

도 17은 점액종 바이러스로 감염되고 난 후 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으 로 염색된 HT29 인간 종양 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 인간 세포에 있는 비-증식허용 감염의 예를 보여준다;

도 18은 점액종 바이러스로 감염되고 난 후의 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 HOP92 인간 종양 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 인간 세포의 증식허용 감염의 예를 보여준다;

도 19는 점액종 바이러스로 감염되고 난 후의 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 OVCAR4 인간 종양 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 인간 세포의 증식허용 감염의 예를 보여준다;

도 20은 점액종 바이러스로 감염되고 난 후의 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 SK-MEL3 인간 종양 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 인간 세포의 증식허용 감염의 예를 보여준다;

도 21은 점액종 바이러스로 감염되고 난 후의 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 SK-MEL28 인간 종양 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 인간 종양 세포의 반-증식허용 감염의 예를 보여준다;

도 22는 점액종 바이러스로 감염되고 난 후의 X-Gal 또는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 BGMK 세포의 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 전형적인 증식허용 감염의 대조군을 보여준다;

도 23은 양성 대조군 BGMK 세포 및 LacZ 단백질을 발현하는 증가 농도 (increasing concentration)의 점액종 바이러스로 감염된 인간 종양 세포주 U87, A172 및 U373을 X-Gal로 염색한 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 이러한 인간 신경아교종 세포들이 점액종 바이러스 복제를 위해 모두 증식허용적임을 보여준다;

도 24는 증가 농도의 점액종 바이러스로 감염되고 난후 72시간 째의 BGMK, U87, A172 및 U373 세포의 생존률을 나타내는 그래프이며, 여기서는 이러한 세포 모두를 살상하는 점액종 바이러스의 능력을 보여준다;

도 25는 MV GFP로 감염된 SF04 1585 별아교세포종 (astrocytoma) 세포의 위상전이 현미경 사진 및 형광 현미경 사진이며, 여기서는 일차 인간 신경아교종 (glioma) 세포에서의 감염을 보여준다;

도 26은 LacZ 단백질을 발현하는 점액종 바이러스로 감염된 U373 신경아교종 세포를 X-Gal로 염색한 위상전이 현미경 사진이며, 여기서는 이러한 인간 종양 세포의 감염을 보여준다;

도 27은 MV GFP로 감염된 SF04 1585 세포의 감염후 48시간째의 생존율을 나타내 주는 그래프이며, 여기서는 이러한 감염된 인간 종양 세포의 살상을 보여준다;

도 28은 GFP를 발현하는 점액종 바이러스로 감염된 Daoy 및 D384 속질모세포종 (medulloblastoma) 세포주의 형광 현미경 사진이며, 여기서는 이러한 인간 종양 세포의 감염을 보여준다.

바이러스 세포주

사용된 바이러스 세포주는 야생형 MV, 녹색 형광 단백질 (green fluorescence protein, “GFP”) 또는 β-갈락토시다아제 (“LacZ”)를 발현하도록 변형된 MV 및 살상된 (“dead”) MV를 포함한다. 바이러스를 준비한 뒤 표준 방법을 이용해 역가측정하였다.

세포주

야생형 생쥐 및 하기 넉아웃 생쥐로부터 유래된 생쥐 배아 섬유아세포 (mouse embryo fibroblast, “MEFs”)를 이용해 생쥐 실험을 수행하였다: IFNα/β 수용체 동종 넉아웃; STAT1 동종 넉아웃; PKR 아종 넉아웃; RNaseL 아종 넉아웃; Mx1 아종 넉아웃; PKR/RNaseL/Mx1 트리플 동종 넉아웃.

BGMK 대조군 세포 및 Stojdl 등 (Stojdl et al., Cancer Cell (2003) 4: 263-275)에 개시된 것과 같은 인간 종양 세포주 HT29, HOP92, OVCAR4, OVCAR5, SK-MEL3, SK-MEL28, M14, SKOV3, PC3, DU145, CAKI-1, 786-0, T47D, MDAMB 435, SF04, U87, A172, U373, Daoy 및 D384 상에서 인간 실험을 수행하였다.

실험방법

일반적으로, 분석 및 실험은 라라니 등 (Lalani et al. Virology (1999) 256: 233-245) 및 존스톤 등 (Johnston et al. J Virology (2003) 77(13): 7682-7688)의 문헌에 개시된 사항에 따라 수행하였다.

인 비보 생쥐 실험을 하기 위해, 누드 생쥐에 두개내 (intracranial) 인간 신경아교종 U87을 이식하였다. 이식 후 15일째에, 5×10⁶ 역가 (titre)의 생 (live) 또는 죽은 MV GFP를 생쥐의 종양내에 주입하거나 모의-감염시켰다 (mock-infected). 주입후 72시간에, 동물을 희생시킨 뒤, 뇌를 적출하여 OCT (Optimal Cutting Temperature compound)에 임베드시키고, 동결 절편을 절단하였다. 형광 현미경을 이용해 뇌전체 절편에 있는 점액종-GFP를 가시화하였다 (visualized). 그리고 난 뒤, 상기 절편들을 고정시키고 종양을 가시화하기 위해 H＆E (hemotoxylin and eosin)로 염색하였다.

인간 종양 세포 분석을 하기 위해, 수술하고 난 뒤에 상기 종양을 트립신처리하여 곧바로 플레이트에 분주하고 (plated), 그 다음날에 0.1, 1.0 또는 10 MOI의 바이러스로 감염시켰다. 감염 후 24시간 및 48시간째에 위상 현미경 및 형광 현미경을 각각 이용해 세포독성 및 바이러스 발현과 관련된 데이터를 수집하였다. 감염후 48, 72 또는 96시간에 % 세포 생존량 (생존한 모의 감염 세포의 퍼센트로서)을 측정하기 위해 노란색 테트라졸리움 (tetrazolium) 염 MTT를 이용해 분석하였다.

인간 소아 속질모세포종 (pediatric medulloblastoma) 세포주인 Daoy 및 D384에 10 M.O.I의 점액종-GFP를 감염시켰다. 감염 72시간 후에, MTT를 이용해 세포 생존도를 측정하였다.

생쥐 세포주의 감염

기존의 연구에서는 다른 클론과는 달리 케모카인 수용체로 형질전환된 생쥐 3T 세포의 일부 클론은 점액종 바이러스로 감염 가능함을 보여주었다. 다른 생쥐 세포에 있는 점액종 바이러스 친화성이 다른 특정 수용체에 의존하는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 야생형 (WT) 생쥐 및 다양한 유전자 넉아웃 생쥐로부터 일차 생쥐 배아 섬유아세포 (MEFs)를 이용하였다.

IFN이 항-바이러스 반응을 마운팅 (mounting)하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 제한적 표현형이 IFN에 의해 유발되는“항바이러스 상태”와 관련이 있을 것이라고 가설을 세웠다. IFN 시스템에서 일어나는 연쇄적인 이벤트의 붕괴, 항체를 이용한 순환 IFN의 중화 또는 IFN 수용체 음성 생쥐 또는 세포내의 신호 전달 경로에 있는 유전자가 결실된 생쥐의 생산은 일반적으로 정상 생쥐 세포를 감염시키지 않는 점액종 바이러스에 대해 숙주의 저항성을 매우 절충할 것이다.

이러한 가설을 검증하기 위해 본 발명자들은 비증식허용 세포에서의 점액종 바이러스의 비-감염도가 IFNs의 항바이러스 작용에 의해 유발되는 것인지 확인할 필요가 있었다. 세포내 IFN 신호 반응과 관련된 하나 이상의 단백질이 넉아웃된 다양한 MEF 세포 타입을 이용해 IFN 신호경로 상에서의 MV 감염의 효과를 테스트하였다.

일차 MEF 상에서 수행한 실험을 통해 야생형 (“WT”) MEFs가 점액종 바이러스에 의해 감염되지 않음을 확인하였다. MEF는 IFN 신호경로가 IFNα/β에 대한 중화 항체에 의해 차단될 때 점액종 바이러스에 의해 완전히 감염가능하다 (도 2). 그러나 IFNγ에 대한 중화 항체에 노출된 MEFs는 여전히 비증식허용적이었다. 이 실험에서는 인 비트로에서 MEF를 감염시키기 위해 점액종 바이러스에 대한 증식허용적 환경을 만드는데 있어서 IFNγ가 아닌 IFNα/β가 중요함을 약술한다. IFNα/β 및 IFNγ에 대한 차이나는 세포내 신호 경로가 본 명세서에서 확인되었다. 그러나, IFNα/β 및 IFNγ 모두는 배양된 섬유아세포와는 달리 감염된 숙주에서 중요한 역할을 하는 경향이 있다. 본 발명자들은 IFNα/β 및/또는 IFNγ 신호경로가 결핍된 인간 종양이 인 비보에서 점액종 바이러스 감염 가능성이 있을 거라고 예측하였다.

본 발명자들은 MV로 감염된 비증식허용 WT MEFs에서 STAT1 및 STAT2의 활성을 실험하였다. 도 3에 표시된 결과에서는 STAT1 및 STAT2가 활성화되었음을 나타내어 주었다. 추가 실험에서는 STAT3, STAT4 및 STAT5가 활성화되지 않음을 나타내어 주었다 (도 4).

MEFs에서 비증식허용 상태를 유지하는데 있어서 IFNα/β의 세포내 경로의 중요성을 확인하기 위해, 유전자 결실 연구를 수행함으로써 IFNα/β 수용체 및 세포내 캐스케이드의 파괴를 제공하였다. IFN 수용체 또는 JAK1 또는 STAT1 유전자를 결실시켰다. WT MEFs, IFNα/β R-/- MEFs 및 STAT1 -/- MEFs를 감염시키기 위해 MV를 사용하였다. IFNα/β R-/- MEFs 및 STAT1 -/- MEFs는 MV에 대해 증식허용이며, 이는 IFNα/β 및 STAT1 신호 캐스케이드가 MV 감염에 필수적임을 증명해준다 (도 5).

단백질 키나아제 R (Protein Kinase R, PKR)은 IFNα/β에 의해 광범위한 세 포에서 유도되는 효소이다. 이 키나아제는 이중가닥 RNA의 존재하에 자동인산화되며 그리고 난 뒤 진핵 단백질 합성 개시 인자 (eIF-2α)를 포함하는 수개의 세포 단백질을 인산화시키며, 이러한 인산화는 단백질 번역 및 어팝토시스 (apoptosis)의 억제를 유발할 수 있다. 또한, PKR은 RNaseL을 활성화시키는 것으로 나타내어 진다. 본 발명자들은 MV 감염후에 비증식허용 MEFs에서의 PKR의 활성화를 실험하였다. PKR은 항바이러스 상태가 잘 정착된 비증식허용 MEFs에서는 인산화되지 않는다 (도 6). 또한, MV 감염은 PKR 인산화를 억제시킨다 (도 7). 게다가, PERK (PRK-유사, ER 키나아제)는 점액종 바이러스 감염 후에 일차 WT MEFs에서 인산화되지 않는다 (도 8).

MV는 PKR, RNaseL 또는 Mx1의 단일 유전자 넉아웃으로 MEFs를 감염시키는데 사용되었다 (도 9). PKR, RNaseL 및 Mx1이 점액종 바이러스를 감염시키기 위한 비증식허용성을 유지하는데 있어서 필수적이지 않다는 사실을 발견하였다. 추가로, PKR, RNaseL 및 Mx1의 비필수적 역할을 확인하기 위해 MEFs에서 PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/-을 트리플 넉아웃시켰다. PKR-/-, RNase L-/- 및 Mx1-/- 트리플 넉아웃은 점액종 바이러스 감염을 지지하지 않지만 (도 10), 인터페론 α/β에 대한 중화 항체로 처리된 PKR, RNaseL 및 Mx1이 트리플 넉아웃된 MEFs는 점액종 바이러스 감염에 대해 증식허용이 가능해진다 (도 10 및 11 비교). 이 실험에서는 PKR, RNaseL 및 Mx1이 MV에 대한 MEFs의 비증식허용성을 유지시키는데 있어서 필수적이지 않음을 증명해준다.

MV 감염후에 비증식허용 야생형 MEFs 및 증식허용 IFNα/βR-/- MEFs 및 STAT1 -/-MEFs에 있는 eIF-2α및 PKR의 활성을 확인하기 위해 추가 실험을 실시하였다. MV 감염후에, PKR은 어떤 경우에 있어서도 인산화되지 않는 반면, eIF-2α는 비증식허용 및 증식허용 MEFs에서 인산화되었다 (도 12). 이 결과는 PKR 및 PERK의 관련성 없이, eIF2α 인산화를 유발하는 다른 경로에 의해 항바이러스 상태가 유발됨을 증명해 준다.

STAT1은 점액종 바이러스 감염 이후에 비증식허용 PKR, RNaseL 및 Mx1 트리플 넉아웃 MEFs에서 세린- 및 티로신-인산화된다 (도 13). 또한, 점액종 바이러스 감염 이후에 비증식허용 PKR-/- ＋ RNaseL-/- ＋ Mx1 -/- MEFs에 있는 티로신-인산화된 STAT1의 세포내 위치가 표시되어 있다 (도 14).

요약하자면, 이러한 결과들은 IFN/STAT1 관련의 평행한 PKR/PERK-의존적 항바이러스 경로가 폭스바이러스 친화성에 있어서 필수적임을 나타내어 준다. 또한, eIF2α인산화는 IFN에 의한 항바이러스 활성의 최상의 마커이다.

인간 종양 실험

본 발명자들은 인 비보 시스템에서 인간 종양 세포를 감염시키려는 MV의 능력을 연구하였다. 누드 생쥐에 인간 신경아교종 세포를 주입하였으며, 그 후 두개내 신경아교종으로 발달시켰다. 생 바이러스는 이러한 인간 종양 세포를 감염시킬 수 있지만 주변 세포는 감염시키지 않는다 (도 15). 종양에 있는 GFP로부터 나오는 형광 신호의 위치측정 결과가 도 16에 표시되어 있다.

많은 인간 종양들이 인터페론에 대해 비-반응성이라고 가정하고, 이러한 종 양 세포들이 정상 인간 세포에서 발견되는 것과 비교했을때 정상 IFN 신호 캐스케이드를 가지지 않는다고 가정하여, 인간 종양 상에서의 점액종 바이러스의 효과를 검증하기 위한 연구를 수행하였다. 이 결과들이 하기에 요약되어 있다.

처음에, 다양한 대조군 세포주 및 인간 종양 세포주: BGMK, HT29, HOP92, OVCAR4, SK-MEL3, 및 SK-MEL28 상에서의 감염력 및 세포살상 효과를 연구하기 위해 점액종 바이러스가 사용되었다. MV는 다양한 감염력 및 세포살상 결과를 나타내었다: HT29 (도 17), HOP92 (도 18), OVCAR4 (도 19), SK-MEL3 (도 20), SK-MEL28 (도 21) 및 BGMK (도 22).

추가로 종양 세포들을 테스트했으며 하기 표 1에는 비증식허용, 증식허용 또는 반-증식허용으로 테스트된 다양한 종양 타입이 분류되어 있다. 반-증식허용은 증식가능적 세포주와 비교하여 점액종 바이러스가 적절히 감염가능함을 나타내어 준다.

인간 종양 세포에 대한 점액종 바이러스 친화도

세포	타입	비증식허용	증식허용	반-증식허용
HT29	결장	X
HOP92	폐		X
M14	흑색종			X
SK-MEL3	흑색종			X
SK-MEL28	흑색종			X
OVCAR4	난소		X
OVCAR5	난소	X
SKOV3	난소			X
PC3	전립선		X
DU145	전립선	X
CAKI-1	신장		X
786-0	신장		X
T47D	유방	X
MDAMB 435	유방	X

다양한 인간 종양 세포주는 MV-LacZ의 농도가 증가함에 따라 감염에 대해 다양한 반응성을 나타내었다. 예를 들어, U373 세포는 U87의 낮은 바이러스 역가로 실현되는 세포 살상 레벨에 도달하기 위해 높은 바이러스 역가를 필요로 했다 (도 23 및 24). 점액종 바이러스는 별아교세포종 (astrocytoma) 세포 (도 25) 및 신경아교종 세포 (도 26)에서 효율적으로 감염되었다. 점액종 바이러스는 인간 별아교세포종 및 소아 속질모세포종 세포를 죽이는데 감염 후 48시간째가 효과적이었다 (도 27 및 28).

당업계의 믿음에 따르면, 본원에 개시된 예시적 실시예에 대한 많은 변형이 가능하다. 본 발명은 청구항에 의해 명시된 바와 같은 본원의 범위내에 있는 어떠한 변형도 포함한다.

본 발명은 점액종 바이러스의 치료학적 용도에 관한 것이다. 점액종 바이러스는 인터페론에 대해 비반응성인 세포를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포를 선택적으로 감염시킬 수 있으며, 이러한 세포의 존재에 의하여 특징되는 암을 포함하는 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Claims (64)

1. 유효량의 점액종 (Myxoma) 바이러스를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포인, 인간을 제외한 포유동물의 암 세포의 억제 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 암 세포는 인터페론에 대해 비-반응성인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 암 세포는 비정상적인 인터페론 신호 (signalling)를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 야생형 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 치료학적 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 6 항에 있어서, 상기 암 세포는 폐암 세포, 흑색종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 신장암 세포, 신경아교종 세포 또는 별아교세포종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 삭제
11. 유효량의 점액종 바이러스와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자의 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포인, 암 세포의 존재에 의하여 특징되는 질병 상태인, 암의 치료용 약학적 조성물.
12. 삭제
13. 제 11 항에 있어서, 상기 암은 고형 종양 (solid tumor)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
14. 제 11 항에 있어서, 상기 암은 조혈세포암 (hematopoietic cell cancer), 결장암 (colon cancer), 폐암 (lung cancer), 신장암 (kidney cancer), 췌장암 (pancreas cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 갑상샘암 (thyroid cancer), 구강암 (oral cancer), 난소암 (ovarian cancer), 후두암 (laryngeal cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 쓸개관암 (bile duct cancer), 편평세포암종 (squamous cell carcinoma), 전립선암 (prostate cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 직장결장암 (colorectal cancer) 또는 흑색종 (melanoma)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 조혈세포암은 백혈병 또는 림프종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
16. 제 11 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 신장암, 신경아교종 또는 별아교세포종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 환자는 사람인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 야생형 바이러스인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
19. 제 17 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 치료학적 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
21. 제 18 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주입 (injection)에 의해 암 부위에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
22. 제 18 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
23. 제 18 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 10² 내지 10⁹ pfu의 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
24. 삭제
25. 삭제
26. 제 11 항에 있어서, 치료요법제 (therapeutic agent)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 치료요법제는 화학요법제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
28. 점액종 바이러스 및 인스트럭션 (instruction)을 포함하는, 선천적으로 항-바이러스 반응이 결핍된 세포인, 암 세포의 억제용 킷트.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 암 세포는 인터페론에 대해 비-반응성인 것을 특징으로 하는 킷트.
30. 점액종 바이러스 및 인스트럭션을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자의 암 치료용 킷트.
31. 삭제
32. 검출 가능한 마커를 발현하도록 변형된 점액종 바이러스의 유효량을 함유하는, 환자에서의 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포인, 암 세포의 검출용 조성물.
33. 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포를 점액종 바이러스에 노출시키는 단계; 및 점액종 바이러스에 의한 세포의 감염도를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플로부터 선천적으로 항-바이러스성 반응이 결핍된 세포인, 암 세포의 검출 방법.
34. 제 11 항에 있어서, 상기 암 세포는 인터페론에 대해 비-반응성인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 암 세포는 비정상적인 인터페론 신호 (signalling)을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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