KR101115504B1 - 천문동 추출물을 유효성분으로 포함하는 발암 예방 및 치료용 항암 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 발암 예방 및 치료용 항암 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물의 순으로 계통 분획하여 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올로 분획되는 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하고, 세포괴사에 의해 암세포에 대해 세포독성을 나타내는 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 다양한 암의 예방 및 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

천문동, 발암, 세포독성, 세포사멸, 세포괴사

Description

천문동 추출물을 유효성분으로 포함하는 발암 예방 및 치료용 항암 조성물{An anti-cancer composition for the prevention and treatment of carcinogenesis containing the extracts of Asparagus cochinchinensis as an active ingredient}

본 발명은 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 발암 예방 및 치료용 항암 조성물에 관한 것이다.

암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상과 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다(WHO, 2006). 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다(Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol., 44:239-267, 2004). 이 중 만성염증과 암 발생 사이의 연관성이 최근 대두되면서 이를 입증하는 많은 자료들이 보고되고 있다. 감염과 만성 염증이 전체 암 발생 원인의 4분의 1에 해당하는 25%를 차지하며, 만성염증과 활성산소종 관련 질환을 가진 환자에서 암 발병 위험이 훨씬 높은 것으로 알려져 있다. 염증 반응을 조절하는 다양한 매개인자들 즉, 사이토카인과 자유라디칼, 성장인자 등이 종양억제유전자의 돌연변이나, DNA 메틸화, 전사후 변형 등과 같은 유전적, 후생유전적 변화를 유도함으로써, 정상적인 세포 항상성을 유지하는데 필수적인 경로를 변화시키고, 나아가 암을 발생, 진전시키는 것으로 추측된다(Hussain & Harris, Int J Cancer., 121(11):2373-2380, 2007). 암은 우리나라 사망원인 1위로서 27%를 차지하며, 이 중 간암은 폐암에 이어 두 번째로 발생빈도 및 사망률이 높은 악성종양이다. 간암은 사회적 활동력과 영향력이 높은 40-50대 남자 사망원인 1위로 사회 및 경제적으로도 매우 큰 부담요인으로 작용하고 있다. 또한 사망원인 7위인 간질환도 넓은 의미에서 간암 발달 과정의 초기 과정에 포함된다고 하겠다(2006년, 통계청). 간암의 주원인은 70%의 압도적 비율을 차지하는 B형 간염으로서, 간염보균자는 비보균자에 비해 간암발병위험이 100배 이상 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 만성염증에서 발전된 암 발생의 모델로서 간암을 대상으로 한 연구들이 수행되고 있다. 그러나 현재까지 간암의 발생 기작에 대해서는 매우 단편적인 연구가 진행되었을 뿐, 명확한 규명이 이루어지지 않아, 현실적으로 치료나 진단에 많은 어려움을 겪고 있으며, 효과적으로 간암을 예방하고 치료하기 위한 연구가 요구된다.

초기에 발견된 암일 경우 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 치료법이 있으나 그 부작용 또한 큰 문제로 대두되고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법 없이 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다. 이에 따라 암 치료를 위한 새로운 접근 방법으로, 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 효능이 뛰어난 발암 억제제나 암 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 다양한 기초 및 임상 연구에 따르면, 한방처방은 면역기능 강화 및 종양 성장억제 등에 의한 항암효과가 있으며, 화학적 요법과 방사선 치료 등에서 흔히 관찰되는 조혈, 면역기능 억제 등의 부작용이 크게 감소되는 것으로 나타났다.

한약재 천문동(天門冬, Asparagi Tuber)은 백합과(Liliaceae) 비짜루속(Asparagus)에 속하는 다년생 초본인 천문동(Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.)의 괴근으로, 자음(滋陰), 윤조(潤燥), 청폐(肺), 생진(生津) 등의 효능이 있어 호흡기질환과 피부질환에 주로 사용되고(Cooperation teaching materials compilation committee, 2005), 민속주(民俗酒)의 부원료로도 이용할 수 있는 약재이다. 원산지는 중국이며 한반도 중부 이남의 바닷가에 분포하는데, 중국 자생종의 종자가 해류에 밀려와 우리나라의 해안가에 군락을 이루는 것으로 추정되며, 분자생물학적 실험에 의해 간접적으로 입증되고 있다. 천문동은 중국에서는 한자로 '天冬'으로, 가시가 있는 외형에서 붙여진 이름인데(Chinese medicinal plants compilation committee, 1999), 이것이 민간에서 '하늘의 문을 열어주는 약초'로 와전되어 신비의 영약인 것처럼 잘못 알려지게 되었다. 현재 무분별한 채취로 인해 국내 자생지는 거의 사라지다시피하여 멸종위기에 처해 있다. 한편 한방의료기관에 서의 사용량은 비슷한 약효를 가진 맥문동(門冬)에 비해 적은 편이며, 국내 재배 실적이 없어 전량을 중국에서 수입하고 있다.

이에, 본 발명자들은 천문동 추출물로부터 수득한 분획물이 암세포에 대해 상기 천문동 추출물에 비해 유의하게 높은 세포독성을 나타내고, 세포사멸 및 세포괴사를 유도하여 암 발생을 억제하는 효능이 있으므로 본 발명의 분획물이 항암용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올의 순으로 계통 분획하여 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올로 분획되는 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로 라이드, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물의 순으로 계통 분획하여 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올로 분획되는 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물의 분획물은 간암세포주(HepG2)에 대해 현저한 세포독성을 나타내고, 세포사멸(apoptosis)에 관여하는 핵심적 효소인 caspase-3의 활성 증가 및 DNA 손상을 회복시키는 효소인 PARP[Poly(ADP-ribose) polymerase]의 분해, 세포사멸 억제단백질인 XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)의 발현을 감소시키며, 세포괴사(necrosis)의 대표적 현상인 LDH(lactate dehydrogenase) 분비 증가와 ATP(Adenosine triphosphate) 감소를 나타내므로, 암의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제 시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 암이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "세포사멸"은 세포질 수축, 염색체 응축, DNA 절단 및 세포사멸체 형성 등의 형태학적 특징을 보이면서 세포가 죽어가는 과정을 나타낸다. 또한, 용어 "세포괴사"는 세포소기관 팽창과 세포막 파괴 등의 형태학적 특징을 보이면서 세포가 죽어가는 과정을 나타낸다. 이전까지, 세포사멸은 유전적으로 보존된 관련 유전자에 의해 이루어지며, 조절할 수 있는 능동적 세포 죽음과정이고, 반면 세포괴사는 직접적으로 독성이 있거나 물리적 상해 등 갑작스런 외부환경의 변화에 의해 유발되는 통제 불가능한 수동적 과정으로 알려져 왔다. 그러나 최근 세포괴사에 대한 관심과 연구가 증가하면서, 새로운 '프로그램된 세포괴사'에 대한 개념이 알려지게 되었다. 즉, 세포괴사는 갑작스런 원인뿐 아니라, 특이적인 신호전달 다단계의 활성화에 의해서 일어날 수 있으며, 이는 세포의 항상성 유지와 발달 과정에 기여하기 위해 조절할 수 있는 형태라는 것이다. 정상적인 조직에서는 노화되거나 손상된 세포가 세포사멸에 의해 제거되면 세포분열에 의해 다시 새로운 세포가 만들어짐으로써 전체 세포의 개수가 항상 일정하게 유지될 수 있다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 발암과정이 시작되면 세포사멸과 세포분열 사이의 균형이 깨지게 된다. 사라지는 세포의 수보다 새로 만들어지는 세포수가 많아지게 되고 결국 전체 세포의 수가 증가하게 되는 것이다. 이처럼 분열하는 세포의 수가 지속적으로 증가하면서 생기는 조직 덩어리를 바로 '종양'이라고 부른다. 따라서 이러한 발암과정에서 암이 계속해서 발생, 유지되기 위해 중요한 과정은 바로 세포사멸에 대한 저항성을 만드는 것이다. 현재까지 암을 치료하기 위해 투여하는 항암제는 대부분 암세포의 세포사멸을 유발하는 약물로서, 이러한 약물을 지속적으로 투여할 경우, 위에서 설명한 원리에 의해 세포사멸에 대한 저항성이 나타나게 되어 치료효과가 감소할 수 있다. 이에, 세포괴사를 활성화함으로써 암세포를 죽일 수 있는 여러 가지 물질들이 항암 치료제로 고려되어 왔으며, 뛰어난 세포괴사 효과를 나타내는 본 발명의 분획물은 이러한 치료제 후보가 될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올의 순으로 계통 분획하여 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올로 분획되는 에틸 아세테이트 또는 n-부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 천문동 뿌리는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 천문동 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다. 천문동 뿌리를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘 및 실온에서 7일간 건조한다. 건조한 천문동 뿌리를 분쇄한 후, 추출 용기에 넣고, 추출용매로 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 상기 천문동 추출물을 수득한 후, 거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고, 현탁액을 원심분리시키고, 상층액을 감압 여과할 수 있다. 상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 70% 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 천문동 뿌리 건조 중량의 2 내지 10 배로 한다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 열수추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 50℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며 50℃ 내지 60℃ 인 것이 더욱 바람직하다. 상기 추출 시간은 1 내지 4시간이며, 바람직하게는 2시간이다.

상기 천문동 추출물의 분획물을 획득하기 위한 분획용매는 유기용매이고, 바 람직하게는 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 군에서 선택된다. 상기 분획물은 상기 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 천문동 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드(MC), 에틸아세테이트(EA) 및 n-부탄올(BuOH) 순으로 계통 분획한 후, 각 용매 분획물을 감압 농축하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 인간 간암세포주를 대상으로 상기 추출물 및 분획물을 처리하였을 때의 세포생존율을 확인한 결과, 상기 EA(IC50=72.22±0.34 ㎍/㎖), MC(IC50=112.68±9.10 ㎍/㎖) 및 BuOH(IC50=21.01±1.37 ㎍/㎖) 분획물에서 천문동 추출물에 비해 유의하게 뛰어난 세포독성 효과를 보였으며, 특히 BuOH 분획물의 세포독성이 가장 뛰어난 것으로 나타났다(도 1 참조). 또한, 상기 분획물에 대해 핵 염색을 통한 세포독성을 확인한 결과, EA 및 MC 분획물은 전형적인 세포사멸의 현상인 염색체 응축현상을 나타냈다. 그러나 BuOH 분획물은 염색체 응축이 아닌 특이 형태를 보였다(도 2 참조). 또한, 상기 분획물에 대해 세포사멸 단계를 대표할 수 있는 caspase-3 활성을 측정한 결과, EA 분획물의 caspase-3 활성이 가장 뛰어났으며, MC 분획물에서도 유의한 효과를 나타냈다. 반면 세포독성이 가장 뛰어났던 BuOH 분획물에서는 caspase-3 활성이 전혀 보이지 않았으며, 이는 BuOH 분획물이 세포사멸이 아닌 다른 경로를 통해 세포독성을 발휘하는 것임을 지시하였다(도 3 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서 Caspase-3 활성에서 효과를 나타낸 EA 및 MC 분획물의 세포사멸 유발 효과를 재확인하기 위해, 세포사멸 조절 단백질인 caspase-3, DNA 손상을 회복시키는 효소인 PARP[Poly(ADP-ribose) polymerase], 세포사멸 억제단백질인 XIAP[X-linked inhibitor of apoptosis]의 발현 및 분해 정도를 분석한 결과, Caspase-3 활성이 가장 뛰어났던 EA 분획물에서 caspase-3 및 PARP의 분해가 증가하였고, XIAP 발현이 감소하였으며, 이 결과를 통해, EA 분획물의 세포독성이 세포사멸 경로를 통해 일어나는 것임을 다시 확인하였다. 그러나 MC 분획물은 이러한 효과를 나타내지 않았다(도 4 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서 세포독성을 나타낸 EA, MC 및 BuOH 분획물에 대해, 세포괴사의 대표적 현상인 LDH(Lactate dehydrogenase) 분비 현상을 분석한 결과, 200 ㎍/㎖까지는 LDH의 분비 수준이 BuOH > EA > MC 분획물 순이었으며, 이는 세포독성 효과와 동일한 패턴이었다(도 5 참조). 따라서 EA와 MC 분획물은 세포사멸과 세포괴사가 병행하여 세포독성을 유발하며, 세포독성은 가장 뛰어났으나 세포사멸 유발효소인 caspase-3 활성은 전혀 보이지 않았던 BuOH 분획물은 전형적인 세포괴사를 통해 세포독성을 유발하는 것을 지시하였다. 또한, LDH의 분비량이 가장 높았던 BuOH 분획물은 세포괴사의 또 다른 현상인 ATP 소모량 감소 현상도 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서 BuOH 분획물이 세포괴사를 통해 세포독성을 유발하는 것을 재확인하였다.

이에, 본 발명의 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트 분획물은 세포사멸에 의해 암세포에 세포독성을 나타내므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 n-부탄올 분획물도 세포괴사에 의해 암 세포에 세포독성을 나타내므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 붕해 제, 감미제, 활택제, 향미제 및 희석제등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량 에 대하여 상기 본 발명의 분획물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 EA(IC50=72.22±0.34 ㎍/㎖), MC(IC50=112.68±9.10 ㎍/㎖) 및 BuOH(IC50=21.01±1.37 ㎍/㎖) 분획물은 천문동 추출물에 비해 유의하게 뛰어난 세포독성을 나타내었다(도 1 참조). 특히, 상기 EA 분획물은 핵 염색을 통한 세포독성을 확인한 결과, 전형적인 세포사멸의 현상인 염색체 응축현상을 나타냈고(도 2 참조), 세포사멸 단계를 대표할 수 있는 caspase-3 활성이 뛰어났으며(도 3 참조), 세포사멸 조절 단백질인 caspase-3 및 PARP의 분해가 증가하였고, XIAP 발현이 감소하였으며, 이 결과를 통해, EA 분획물의 세포독성이 세포사멸 경로를 통해 일어나는 것임을 다시 확인하였다(도 4 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서 BuOH 분획물은 염색체 응축이 아닌 특이 형태를 보였고(도 2 참조), caspase-3 활성이 전혀 보이지 않았다(도 3 참조). 그러나 세포괴사의 대표적 현상인 LDH(Lactate dehydrogenase) 분비 수준이 가장 높았으며(도 5 참조), 세포괴사의 또 다른 현상인 ATP 소모량 감소 현상도 농도 의존적 으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 6 참조). 따라서 BuOH 분획물이 세포괴사를 통해 세포독성을 유발하는 것을 재확인하였다.

이에, 본 발명의 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트 분획물은 세포사멸에 의해 암세포에 세포독성을 나타내고, n-부탄올 분획물도 세포괴사에 의해 암세포에 세포독성을 나타내므로, 상기 분획물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

상기 투여방법은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막 주사, 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 암은 간암, 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 가장 바람직하게는 간암이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 추출물 제조

전라북도 계화도에서 채집한 천문동(Asparagus cochinchinensis)의 뿌리를 건조한 후 분쇄하였다. 상기 방법으로 준비한 천문동 100 g을 1 리터의 70% 에탄올수용액(70% EtOH), 100% 에탄올(100% EtOH), 100% 메탄올(100% MeOH) 또는 물(H2O)에 침지하여 잘 교반한 다음, 열을 가해 50 내지 60℃를 유지하는 추출온도에서 2시간 동안 환류 추출하고 여과지에 여과하였다. 상기 추출액을 50 내지 55℃에서 농축기를 사용하여 감압 농축한 후, 동결 건조시켜 천문동 추출물을 수득하였다.

그 결과, 각각 70% 에탄올(15 g), 100% 에탄올(15 g), 100% 메탄올(14 g), 물(17 g)의 용매 추출물을 제조할 수 있었다.

<실시예 2> 분획물의 제조

<2-1> n-헥산 분획물

실시예 1에서 제조한 70% 에탄올 추출물 1,760 g을 5 리터의 물(H2O)에 현탁한 후, 다시 현탁액과 동량의 n-헥산(n-hexane, Hx)을 가하고 물층과 Hx층으로 분리되도록 방치하였다. 화학평형이 이루어진 후 Hx층을 분리하고 다시 새로운 동량 의 Hx를 부어서 물층과 Hx층으로 분리되도록 방치하였다. 상기 층분리 과정을 3회 반복하여 수득한 Hx층을 감압농축하여 Hx 분획물을 얻었다.

<2-2> 계통 분획물

실시예 2-1과 동일한 방법으로 다시 물층에 용매의 극성에 따라 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, dichloromethane, MC), 에틸 아세테이트(ethyl acetate, EA), n-부탄올(n-butanol, BuOH), 물(H2O) 순의 계통 분획 추출을 함으로써 총 5개의 분획물을 수득하였다.

그 결과, 각각 Hx(0.9 g), MC(3 g), EA(3 g), BuOH(29 g) 및 H2O(680 g) 분획물을 제조할 수 있었다.

<실시예 3> 세포 독성 실험

인간 간암세포주 HepG2를 American Type Culture Collection(ATCC HB-8065, USA)로부터 구입하여 열로 비활성화된 10% FBS, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 시료의 세포독성을 확인하고자 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 검사를 실시하였다. 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 CCK-8이 10% 첨가된 새 배지를 각 웰에 가하고 추가로 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 뒤, SpectaMax 340 reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 세포생존율을 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 EA(IC50=72.22±0.34 ㎍/㎖), MC(IC50=112.68±9.10 ㎍/㎖) 및 BuOH(IC50=21.01±1.37 ㎍/㎖) 분획물에서 세포독성 효과를 보였으며, 특히 BuOH 분획물의 세포독성이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 천문동 추출물은 최고농도인 400 ㎍/㎖에서 세포독성을 나타냈으며, Hx 분획물과 H2O 분획물은 세포 독성이 없음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 핵 염색을 통한 세포독성 확인

세포독성을 나타낸 EA, MC 및 BuOH 분획물의 핵 염색을 통해 세포독성의 형태적 양상을 분석하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 세포를 10% 포르말린으로 5분 동안 고정하였고, 0.1% Triton X-100을 5분 동안 처리 한 후 DAPI로 15분 동안 염색하였다. 염색된 핵은 형광현미경으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 EA 및 MC 분획물은 전형적인 세포사멸의 현상인 염색체 응축현상을 나타냈으나, BuOH 분획물은 염색체 응축이 아닌 특이 형태를 보였다.

<실시예 5> 세포사멸 유발 효소 caspase-3의 활성 분석

세포독성을 나타낸 EA, MC 및 BuOH 분획물에 대해 세포사멸 유발효과를 확인하고자 세포사멸 단계를 대표할 수 있는 caspase-3의 활성을 분석하였다. 구체적으 로, 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, Caspase-Gio 3/7 Assy(Promega, Madison, WI)로 세포 내 caspase-3의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 EA 분획물의 caspase-3 활성이 가장 뛰어났으며, MC 분획물에서도 유의한 효과를 나타냈다. 반면 세포독성이 가장 뛰어났던 BuOH 분획물에서는 caspase-3 활성이 전혀 보이지 않았으며, 이는 BuOH 분획물이 세포사멸이 아닌 다른 경로를 통해 세포독성을 발휘하는 것임을 지시하였다.

<실시예 6> 세포사멸 조절 단백질의 발현 분석

Caspase-3 활성에서 효과를 나타낸 EA 및 MC 분획물의 세포사멸 유발 효과를 재확인하기 위해 웨스턴 블랏팅을 통해 caspase-3, DNA 손상을 회복시키는 효소인 PARP[Poly(ADP-ribose) polymerase], 세포사멸 억제단백질인 XIAP[X-linked inhibitor of apoptosis]의 발현 및 분해 정도를 분석하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 용해 완충용액인 RIPA를 처리하여 단백질을 추출하였다. Bradford 시약인 Bio-Rad Protein assay kit(Hercules, CA)를 사용하여 단백질 농도를 정량한 후 각 목표 단백질 분석에 적합한 양(10-30 ㎍)을 취하였다. 단백질을 동량의 시료 완충용액(100 mM Tris-HCl, 2% sodium dodecyl sulfate, 1% 2-mercaptoethanol, 2% glycerol, 0.01% bromopenol blue, pH 7.6)과 섞은 후, 100℃에서 5분간 처리하였다. 준비된 단백질은 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, 니트로셀룰로오스 막(Scheicher & Schnell BioSMCF-GLEnce, Germany)으로 이동시켰다. 상기 막은 4℃에서 하루 밤 동안 차단 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 3% nonfat dry milk)으로 처리한 후, 항 항 Caspase-3 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA, 1:1000), 항-PARP 항체(BD bioscience, Inc., USA, CA), 1:1000) 또는 항-XIAP 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA, 1:1000) 등의 일차항체와 상온에서 2시간 동안 반응시키고 TTBS(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 10분씩 3회 세척하였다. 다시 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TTBS로 10분씩 3회 세척한 후, ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시스템을 이용하여 현상한 후, LAS-3000 Luminescent image analyzer(Fuji Photo Film, Japan)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 caspase-3 활성이 가장 뛰어났던 EA 분획물에서 caspase-3 및 PARP의 분해가 증가하였고, XIAP 발현이 감소하였으며, 이 결과를 통해, EA 분획물의 세포독성이 세포사멸 경로를 통해 일어나는 것임을 다시 확인하였다. 그러나 MC 분획물은 이러한 효과를 나타내지 않았다.

<실시예 7> LDH(Lactate dehydrogenase) 분비 분석

세포독성을 나타낸 EA, MC 및 BuOH 분획물에 대해, 세포괴사의 대표적 현상인 LDH 분비를 분석하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, Roche Applied Science의 Cytotoxicity Detection Kit(LDH)로 LDH 의 분비량을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 시료의 농도가 200 ㎍/㎖까지는 LDH의 분비 수준이 BuOH > EA > MC 분획물 순이었으며, 이는 세포독성 효과와 동일한 패턴이었다. 따라서 EA와 MC 분획물은 세포사멸과 세포괴사가 병행하여 세포독성을 유발하며, 세포독성은 가장 뛰어났으나 세포사멸 유발효소인 caspase-3 활성은 전혀 보이지 않았던 BuOH 분획물은 전형적인 세포괴사를 통해 세포독성을 유발하는 것을 지시하였다.

<1-8> ATP 소모량 분석

LDH의 분비량이 가장 높았던 BuOH 분획물에 대해 세포괴사의 또 다른 현상인 ATP 소모량 감소 여부를 분석하였다. 구체적으로, 6 웰 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HepG2 세포에 시료를 농도별(0, 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, ATP assay buffer 100 ㎕로 용해하여 -70℃에 1시간 동안 넣어두었다. 시료를 12000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 회수하여 black & clear 96 웰 플레이트에 50 ㎕를 넣고 ATP reaction Mix 50 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 호일로 감싸고 상온에서 30분간 반응시킨 후 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에서와 같이 BuOH 분획물은 농도 의존적으로 ATP 소모량을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 BuOH 분획물이 세포괴사를 통해 세포독성을 유발하는 것을 재확인하였다.

이상의 실시예의 결과로 보아, 본 발명의 천문동 추출물의 추가의 EA 분획물 및 BuOH 분획물은 암세포주에 대한 세포독성을 나타내어, 암을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

본 발명의 천문동 분획물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

본 발명의 천문동 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

본 발명의 천문동 분획물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

본 발명의 천문동 분획물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

본 발명의 천문동 분획물 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

도 1은 본 발명의 천문동 추출물과 여러 분획물들의 세포독성을 비교한 도이다.

도 2는 본 발명의 천문동 분획물들의 세포독성을 핵 염색을 통해 확인한 도이다.

도 3은 본 발명의 천문동 분획물들의 caspase-3 활성 유발 효과를 비교한 도이다.

도 4는 본 발명의 천문동 분획물들이 세포사멸 조절 단백질의 발현에 미치는 효과를 나타내는 도이다.

도 5는 본 발명의 천문동 분획물들의 LDH(lactate dehydrogenase) 분비 유발 효과를 나타내는 도이다.

도 6은 본 발명의 천문동 BuOH 분획물의 ATP 소모량 감소 효과를 확인한 도이다.

Claims (12)

1. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올의 순으로 계통 분획하여 에틸 아세테이트로 분획되는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동(Asparagus cochinchinensis) 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올의 순으로 계통 분획하여 메틸렌 클로라이드로 분획되는 메틸렌 클로라이드 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 분획물은 세포사멸에 의해 암세포에 대해 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출된 천문동 추출물을 추가로 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 n-부탄올의 순으로 계통 분획하여 n-부탄 올로 분획되는 n-부탄올 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 분획물은 세포괴사에 의해 암세포에 대해 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제 1항, 제 2항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 알코올은 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제 1항, 제 2항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 간암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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