KR101114284B1 - 신규 엔아민 유도체 화합물, 그 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부상태 개선의 효과를 나타내는 신규 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 화합물은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 가지며, 본 발명에 따르는 화합물을 함유하는 본 발명의 조성물은 젊은 피부를 유지하는데 있어 중요한 역할을 하는 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성을 증가시키고 세포외 기질 성분의 분해효소 (MMPs)의 생성을 억제함으로써, 피부의 주름 및 거칠어짐 등의 피부노화를 근본적으로 예방 및 개선할 수 있는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물 및 피부 외용제 등으로 사용할 수 있다.
세포외 기질, 콜라겐, MMP

Description

신규 엔아민 유도체 화합물, 그 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물 {NOVEL COMPOUND, METHOD FOR PREPARING THEREOF, AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME AS ACTIVE INGREDIENT}
본 발명은 피부상태 개선의 효과를 나타내는 신규 엔아민 유도체 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 피부 조직 내에서 콜라겐과 같은 세포외 간질 성분 증가 효과를 나타내는 신규 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부의 노화는 주름 증가와 탄력감소, 색소침착등의 다양한 형태로 나타난다. 그 중 가장 대표적인 노화의 현상은 바로 주름이다. 이러한 주름 생성을 포함하는 피부의 노화 원인은 여러 가지가 있지만 기원에 따라 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 인체에 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 일어나는 내인성 노화와 외적 요인 특히, 자외선에 의한 광노화가 그것이다.
피부의 구조에 기초하여 주름 발생원인을 좀 더 자세히 살펴보면, 피부는 크게 표피와 진피로 나뉜다. 표피에서의 주름 생성 원인으로는 각질형성세포의 회전 율(turn-over)의 감소로 각질층이 누적되고 이로 인해 각질층은 두꺼워지고, 두꺼원진 각질층의 수분 함유 능력이 감소되고 각질이 경화되어 주름이 발생하게 된다.
표피와 진피의 경계부위는 표피 세포 지지, 부착, 영양물질의 이동, 표피 분화의 조절 등에 관여하는데, 각종 노화 요인으로 특히, 자외선에 의해 콜라겐이 감소되어 표피, 진피 지지기능이 감소되고, 선별 투과 기능이 약화되어 해로운 성분이 쉽게 진피에 영향을 미치게 되어 주름이 생성된다 (Keene, J. Cell Biol., 103, p611).
진피는 표피의 아래에 있는 결합조직으로 이루어지는 조직으로 표피 세포인 케라티노사이트처럼 치밀하게 채워져 있지 않고 세포외 공간이 많으며 세포외 기질 (extracellular matrix:ECM)이라 불리는 거대 분자의 망상 구조에 의해 채워져 있다. 이 세포외 기질은 진피 내의 섬유아세포에서 만들어지며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유상 단백질과 히알루론산 등의 산성 뮤코 다당체라 불리는 다당류로 이루어져 있다. 이러한 세포외 기질을 생산하는 섬유아세포의 활성이 내적, 외적인 노화 요인, 특히 자외선에 의해 저하되면 콜라겐 생합성이 감소하고 변성된 엘라스틴이 증가하게 된다. 또한 매트릭스 메탈로프로티나아제 (Matrix metalloproteinases. MMP)의 증가로 콜라겐 등의 세포외 기질의 분해가 증가되고 진피내 태양열상이 발생하고 되고, 표피-진피 경계부가 파괴되어 유해 성분이 유입되고 진피 분해가 가속화된다. 특히, 콜라겐 I은 피부 진피의 주성분으로 MMP-1에 의해 분해된다. 따라서, 결국에는 피부의 탄력성이나 싱싱함, 생기를 잃게 되고, 주름, 잔주름, 피부의 거칠어짐이 발생하게 되어 피부 노화를 초래하는 하나의 원인이 된다. (Functional cosmetology, p 163; Herrmann G. et al., JID, 107 (3), p 92; Brenneisen P. et. al., Photochemistry & photobiology 64 (5) p 649)
따라서, 위와 같은 주름 생성 요인 중 가장 중요한 부분을 차지하고 있는 콜라겐 등의 세포외 기질 성분을 증가시키고 매트릭스 메탈로프로테나아제 (MMP)를 저해함으로써 생기있는 젊은 피부를 유지하기 위한 시도가 다각도로 이루어지고 있다. 콜라겐은 또한 상처 치유에 있어서도 중요한 역할을 담당하며, 따라서 손상된 피부에서 콜라겐의 합성을 증가시키면 상처를 흉터없이 신속히 회복시킬 수 있다.
콜라겐의 피부 보습 효과 및 상처 치유 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부 외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 제조되어 시판되고 있다. 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것인데, 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 보습 작용, 주름개선효과, 상처치유 효과를 기대할 수 없으므로 본질적인 피부기능 개선을 나타내지 못한다.
이와 같은 단점 때문에 콜라겐 합성 촉진 물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래에 알려진 콜라겐 합성 물질은 비타민 C, 레티노산 (Retinoic acid) 및 발암증식인자 (TGF: transforming growth factor, Cardinale G et al, Adv. Enzymol., 41 p425)등을 포함한다. 이외에도 일본특허공개공보 평8-231370호에서는 콜라겐 합성 물질로서 동물 태반 유래의 단백질을 개시하고, 일본특허공개공보 평8-208424에서는 베툴린산, 일본특허공개공보 평9-40523호 및 평10-36283호에서는 섬유아세포 증식 촉진 작용을 나태나는 클로렐라 추출물 등을 개시하고 있다. 그러나, 전술한 종래의 물질들은 모두 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량이 제한되어 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 주름개선 등의 피부 기능 개선 또는 상처 치유의 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명자들은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안전성의 문제가 적으면서도 세포외 기질의 합성을 촉진하고 MMP의 발현을 감소시킬 수 있는 방법을 강구하고자 연구를 거듭한 끝에 본 발명의 엔아민 유도체 화합물을 발명하고, 그 제조 방법 및 이를 포함하는 본 발명의 조성물의 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따르는 새로운 화합물은 생체 적용에 안전하고, 콜라겐을 포함하는 세포외 기질 형성 촉진효과와 세포외 기질 분해 효소인 MMP의 발현을 감소시키는 효능을 가지며, 용제로의 용해성과 가공성이 우수하여 다양한 제형으로 응용이 가능하다.
본 발명은 하기 화학식 I에 따르는 화합물을 제공한다.
(화학식 I)
Figure 112009060315514-pat00001
(식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
또한, 본 발명은 (a) 에틸 아세토아세테이트와 에탄올을 혼합한 후 혼합물에 1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-아민 히드로클로리드을 가하여 용매를 증발 환류하여 (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}부트-2-에노에이트를 제조하는 단계;
(b) 단계 (a)의 생성물을 다음 화학식 A:
(화학식 A)
I-R (식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
의 화합물과 반응시켜 다음 화학식 B:
(화학식 B)
Figure 112009060315514-pat00002
(식 중, R은 위에서 정의한 바와 같음)
의 화합물을 제조하는 단계; 및
(c) 화학식 B의 화합물을 디클로로메탄(DCM)에 용해시켜 트리플루오로 아세트산(TFA) 수용액과 반응시키고 중화 후 용매를 제거하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I에 따르는 화합물:
(화학식 I)
Figure 112009060315514-pat00003
의 제조 방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 화학식 I에 따르는 화합물을 포함하는 피부상태개선용 조성물을 제공한다. 상기 양태의 한 구체예에 따르면, 조성물은 피부 상처 치유의 촉진, 주름 개선, 아토피 피부염 치료, 습진 또는 건선의 치료로부터 선택되는 피부 상태개선 용도를 갖는다.
이하에서는 본 발명을 구체예를 통하여 더 상세하게 설명한다.
한 구체예에서 본 발명은 하기 화학식 I에 따르는 화합물을 제공한다.
(화학식 I)
Figure 112009060315514-pat00004
(식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
본 발명에 따르는 화학식 I의 화합물은 세포외 기질 형성에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 섬유아세포의 활성화를 통하여 세포증식을 촉진하는 한편 콜라겐을 포함하는 세포외 기질의 형성을 촉진하는 효과를 가진다. 또한, 본 발명에 따르는 화학식 I의 화합물은 세포외 기질의 분해효소인 MMP의 생성을 억제함으로써, 세포외 기질의 기능을 최적화하는 효과를 갖는다. 인체에서 콜라겐을 포함하는 세포외 기질 합성을 촉진하는 기능은 상처가 생겼을 때 그 상처 부위의 치유를 촉진하고, 피부 노화에 의한 주름을 개선시킬 수 있으며, 스테로이드의 대표적인 부작용인 피부 위축을 억제할 수 있다는 점에서 다양한 영역에서 응용이 가능하다. 따라서, 본 발명의 화합물은 세포외 기질의 최적화에 따른 효과인 주름 개선, 피부상처치료, 아토피 피부염, 습진 및 건선 증상 등의 완화, 경감 및 치료를 위한 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르는 화학식 I의 화합물은 분자구조가 단순하고 비교적 분자량이 작으며 용매 특성이 양호하여 다양한 용매에 대한 용해성과 가공성이 우수하여 다양한 제형으로 제조가 용이하다. 또한 제조 공정이 단순하여 공정 관리 및 제조가 용이하여 피부상태 개선용 각종 조성물 제조에 유리하다.
다른 구체예에서 본 발명은 하기 화학식 I 에 따르는 화합물의 제조방법을 제공한다.
(화학식 I)
Figure 112009060315514-pat00005
(식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
화학식 I에 따르는 상기 화합물은 (a) 에틸 아세토아세테이트와 에탄올을 혼합한 후 혼합물에 1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-아민 히드로클로리드을 가하여 용매를 증발 환류하여 (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}부트-2-에노에이트를 제조하는 단계;(b) 단계 (a)의 생성물을 다음 화학식 A:
(화학식 A)
I-R (식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
의 화합물과 반응시켜 다음 화학식 B:
(화학식 B)
Figure 112009060315514-pat00006
(식 중, R은 위에서 정의한 바와 같음)
의 화합물을 제조하는 단계; 및 (c) 화학식 B의 화합물을 디클로로메탄(DCM)에 용해시켜 트리플루오로 아세트산(TFA) 수용액과 반응시키고 중화 후 용매를 제거하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
전술한 바와 같은 화학식 I에 따르는 화합물의 제조 반응식은 R이 메틸인 경우 다음과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112009060315514-pat00007
당업자는 전술한 바와 같은 제조공정에 의하여 본 발명의 화학식 I에 따르는 화합물을 용이하게 제조할 수 있으나, 당업자가 생각할 수 있는 다른 방법에 의하 여도 본 발명의 화학식 I에 따르는 화합물을 제조할 수 있다는 점이 명백하다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 하기 화학식 I에 따르는 화합물을 포함하는 피부상태개선용 조성물을 제공한다.
(화학식 I)
Figure 112009060315514-pat00008
(식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
본 발명에 따르는 조성물은 상기 화학식 I에 따르는 화합물의 성질인 섬유아세포의 활성화를 통하여 세포증식을 촉진하는 한편 콜라겐을 포함하는 세포외 기질의 형성을 촉진하는 효과 및 세포외 기질의 분해효소인 MMP의 생성을 억제함으로써, 세포외 기질의 기능을 최적화하는 효과를 이용하여 피부 상처 치유의 촉진, 주름 개선, 아토피 피부염 치료, 습진 또는 건선의 치료로부터 선택되는 피부상태개선 용도를 갖는다.
본 발명의 조성물의 용도인 피부상태개선은 세포외 기질의 합성 증가 또는 세포외 기질 성분 분해효소(MMPs)의 생성 억제 또는 둘 다에 의하여 달성될 수 있다.
본 발명의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 조성물은 비경구용, 국부용, 국소용으로 제제화한다. 본 발명의 화합물 또는 그 약제학적으로 허용되는 유도체 는 전신, 국소 또는 국부 투여용으로 적당한 약제학적 담체 또는 부형제와 혼합되어 약제학적 유효량으로 제조된다. 국소 및 부분 투여되는 투여량은 전신 투여로 전달되는 양보다 일반적으로 약 5 내지 10 배 가량 많다.
본 발명에 따른 피부상태개선용 조성물에 있어서 본 발명에 따르는 화합물은 치료제 총 중량에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%로 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30.0 중량%로 포함하는 것이 목적하는 효과를 나타내는데 유리하다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 적당한 약제학적 담체 또는 부형제는 특정 모드 투여용도로 적당한 것으로 당업자에게 알려진 어떠한 것도 포함한다.
국부 및 국소 제형으로서, 본 발명의 화합물은 용액, 현탁액, 또는 에멀션 등으로 생성되어 크림, 겔, 연고, 에멀션, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 폼, 에어로졸, 스프레이 등의 국부 또는 국소 투여에 적당한 다른 형태로 제형화된다. 따라서, 부형제는 신체 표면에 적용하는 약학적 도포 또는 화장 도포 또는 부분 주입에 적합한 부형제이다.
조성물을 제형화하기 위해서 화합물을 소정의 부형제에 유효농도로 용해, 분산, 현탁시킬 수 있고 부형제와 혼합하여 통각과민 상태를 완화 또는 개선시킬 수 있다. 허용되는 부형제의 선택은 주로 사용 방식 및 처리할 조직에 따라 결정한다. 국소 적용에 적합한 약제학적 및 피부학적으로 허용되는 부형제는 로션, 크림, 용액, 겔 등에 사용되기 적당한 것을 포함하는데, 일반적으로 천연 유기 또는 수성 에멀션이다. 부형제는 약학적으로 허용되는 연화제, 피부침투증진제, 착색제, 방향 제, 유화제, 증량제, 용제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물이 피부상태 개선을 위한 미용 조성물로 제조되는 경우에는 토너, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파우더, 연고, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이, 미용액, 비누, 샴푸, 피부접착용 패치, 겔 등으로 제조될 수 있다. 또한, 상기의 화합물은 화장, 세제 및 섬유 등 피부에 접촉하는 피부접촉물질로서도 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물을 유효성분으로서 단독으로 포함하여 조성물을 제조할 수도 있으나, 다른 피부상태개선 및 피부질환 치료제 등의 유효성분과 조합하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따르는 화합물은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 가지며, 본 발명에 따르는 화합물을 함유하는 본 발명의 조성물은 젊은 피부를 유지하는데 있어 중요한 역할을 하는 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성을 증가시키고 세포외 기질 성분의 분해효소 (MMPs)의 생성을 억제함으로써, 피부의 주름 및 거칠어짐 등의 피부노화를 근본적으로 예방 및 개선할 수 있는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물 및 피부 외용제 등으로 사용할 수 있다.
<실시예>
이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절 한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.
실시예 1은 본 발명의 화합물의 한 구체예인 KEAPC-5의 합성 과정을 나타내었다. 실시예 2 내지 5는 KEAPC-5에 대한 효능 평가를 실시하였다. 상기 화합물이 정상 상태인 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 증가시키고 MMP-1을 감소시키는 것을 확인하였고, 자외선이 조사된 섬유아세포에서도 동일한 결과를 나타내었다. 실시예 5에서는 10주 동안 자외선 조사를 통해 광노화 마우스 모델을 확립하였고, 콜라겐을 증가시키는 것으로 알려진 레티놀을 양성 대조군으로 사용하여 콜라겐 합성 및 피부 장벽 기능을 확인하였다. 본 화합물은 레티놀이 가지는 피부 자극과 같은 부작용은 없으면서 레티놀과 비슷한 정도의 콜라겐 합성능을 보였다.
실시예 1: (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}부트-2-에노에이트(1)의 제조
16.71g의 에틸 아세토아세테이트(0.131 몰)을 100 ml의 에탄올(EtOH) 에 넣고 잘 섞은 다음, 46g의 1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-아민 히드로클로리드(0.109 몰)를 첨가하고 교반하였다. 반응기 온도를 가온하여 용매를 증발환류시켰다. 4 내지 5 시간 후 용매를 제거하고, 디클로로메탄(DCM)과 헥산(Hexane)으로 고화(solidification)하면 흰색 고체 생성물을 얻었다(39.0g, 70% 수득율)
실시예 2: (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}-2-메틸부트-2-에노에이트(2)의 제조
39g (0.090 mol)의 (E)-에틸3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}부트-2-에노에이트를 THF(테트라히드로푸란) 1L에 녹이고, 반응기 온도를 -20℃로 내렸다.
1M LHMDS(리튬 비스(트리메틸실일)아미드 THF 용액 198mL를 반응기 온도를 일정하게 유지하면서 천천히 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 29g의 요오도메탄을 200mL의 THF에 녹여서 반응기 온도를 일정하게 유지하면서 천천히 첨가하고, 반응기 온도를 실온으로 올려서 1일 동안 교반하였다.
반응이 끝나면 암모니아 수로 반응을 정지시키고, EA(에틸 아세테이트)를 사용하여 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.(EA:Hex=1:9) 화합물 29g (72% 수득율)을 얻을 수 있었다.
실시예 3: (E)-에틸 3-(1,3-디히드록시프로판-2-일아미노)-2-메틸부트-2-에노에이트(3)
29g의 (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}-2-메틸부트-2-에노에이트(2)(0.065 mol)을 DCM 600mL에 녹이고, TFA(트리플루오포 아세트산: trifluoro acetic acid): H2O(9:1)용액을 넣고 실온에서 1일 동안 교반하였다. 반응 후 NaHCO3로 중화한 후 DCM층을 Na2SO4로 건조하고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.(DCM:EtOH=15:1) 화합물 10g (70% 수득율)을 얻었다.
Rf :0.45 (EtOH : DCM = 1 : 10)
NMR (400MHz CDCl3) 1H : 1.255(3H, t, OCH2 CH 3 ), 1.972(3H, s, CH 3 C=CH), 3.137(2H, s, OH), 3.645(1H, m, NHCHCH2OH), 3.746(4H, m, NHCH(CH 2 OH)CH 2 OH), 4.070(2H, q, OCH 2 CH3), 4.500(1H, s, CH3C=CH), 8.716(1H, d, NH)
생성물인 KEAPC-5을 이후의 콜라겐 합성능 및 광노화 마우스 실험을 수행에 사용하였다.
실시예 4: 섬유아세포에서 콜라겐 및 MMP-1의 발현 측정
인간 섬유아세포(Human fibroblast)를 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM을 이용하여, 37℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 배양한다. 6 웰 플레이트에 1×105 세포/웰(well)로 각 웰에 넣은 후 24 시간 동안 배양한 후, 화합물을 처리하기 전에 배지를 무혈청 배지로 교환했다. 무혈청 배지에서 배양 24시간 후에 화합물을 첨가하여 24 시간 동안 반응시켰다. 화합물을 처리하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 배양한 세포군을 대조군으로 사용하였다. 상기와 같이 접촉시킨 후, 상등액을 버리고, 세포를 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 세척하였다. 반응이 끝난 후 세포를 튜브에 모았다. 세포로부터 RNA를 분리하기 위해 1 ml의 트라이졸 시약을 첨가하였다. 상온에서 15초 반응한 후 클로로포름(chloroform)을 200 ㎕ 첨가하였다. 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 다른 튜브로 옮겨 담은 후 500 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심 분 리하였다. 침전된 RNA를 70% 에탄올을 사용하여 세척하였다. 두 차례 연속하여 세척한 후 3차 증류수를 이용 RNA를 용해시켰다. RNA를 일정 비율로 희석하여 260 과 280 nm 사이에서 분석하며 정량하였다.
전술한 방법에 의하여 얻어진 RNA를 사용하여 RT-PCR 방법을 통해 cDNA를 얻었다. RT-PCR을 수행하기 위하여 2 ㎕의 MgCl2, 1 ㎕의 RT 완충액, 1 ㎕의 dNTP 믹스, 0.25 ㎕의 Rnase 저해제, 0.5 ㎕의 RTase, 0.5 ㎕의 올리고 dT(oligo dT), 3.75 ㎕의 증류수, 2 ㎍의 RNA를 튜브에 넣은 후 반응시킨다. RT-PCR 반응 조건은 45℃에서 1시간, 95℃에서 5분 수행하였다. 이렇게 얻어진 각각의 cDNA에 GAPDH, 타입 I 콜라겐 (COL1A1), MMP-1 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머는 표 1과 같다.
Figure 112009060315514-pat00009
Sybergreen 5 ㎕, 프라이머 (센스)(10μM) 1 ㎕, 프라이머 (안티센스)(10μM) 1 ㎕, cDNA 1 ㎕, 증류수 2 ㎕를 넣은 후 반응시켰다.
이 방법을 수행하여 얻은 결과물을 프로그램을 이용하여 분석하였다. 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 이러한 결과로부터, 상기 생성물은 인간 섬유아세포에서 콜라겐의 발현을 증가시키고, 콜라겐을 분해하는 MMP-1의 발현은 억제시킴을 확인하였다. [도 1]. 실시예 2을 통해 상기 생성물이 콜라겐 mRNA의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 5: 섬유아세포의 콜라겐 단백질 분비
상기 생성물이 섬유아세포에서 직접적인 콜라겐 합성에 미치는 영향을 평가하였다.
생성 화합물을 각각 100 mM, 10mM, 1mM의 농도가 되도록 DMSO에 녹여 스톡을 제조하였으며, 최종 100 μM, 10 μM, 1 μM의 농도가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 사용하였다. 화합물 처리 전 혈청이 없는 배지에 24시간 배양 한 후, 화합물을 처리하였다. 24시간 후에 상등액을 이용하여 콜라겐 합성량을 분석하였다. 콜라겐 합성량 측정은 PICP(procollagen type I C-peptide) 키트를 사용하여 합성된 콜라겐을 분석하였다. 콜라겐 측정 키트에 포함된 표준용액을 샘플 희석한 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준 농도 곡선을 작성하였다(아래 표 2 참조).
표준 농도 곡선 작성을 위한 표준용액과 샘플희석의 비율
최종농도(ng/㎖) 0 10 20 40 80 160 320 640
샘플희석 400㎕ 393.75㎕ 387.5㎕ 375㎕ 350㎕ 300㎕ 200㎕ -
표준액(640ng/㎖) - 6.25㎕ 12.5㎕ 25㎕ 50㎕ 100㎕ 200㎕ 400㎕
1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 항체 코팅된 마이크로역가-플레이트( antibody Coated Microtiter-plate)에 항체-POD 융합 용액(antibody-POD conjugate solution) 100㎕과 채취된 세포 상등액을 넣고 3 시간 동안 37℃로 배양하여 항원 항체 반응을 유도하였다. 이후 세척, 발색반응을 수행하였다. 반응색은 노란색을 띠며 반응의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타나는 원리를 이용하여 정량한다. 노란색을 띤 96 웰 플레이트를 마이크로역가 플레이트 판독기(Microtiter plate reader)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
섬유아세포에 대한 콜라겐 합성량을 평가한 결과, [도 2]에 나타낸 바와 같이 대조 무처리와 비교하여 콜라겐 합성량이 유의하게 증가됨을 확인하였다. 따라서, 본 결과는 상기의 화합물을 인체에 적용 시 콜라겐 합성을 증가시켜 상처 치료, 주름 개선 및 스테로이드 부작용 감소에 유용한 효과를 줄 수 있음을 시사한다[도 2 참조].
실시예 6: 자외선 처리된 섬유아세포에서 콜라겐 및 MMP-1의 발현량 측정
인간 섬유아세포(Human fibroblast)를 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM을 이용하여, 37℃, 5％ CO2 인큐베이터에서 배양한다. 6 웰 플레이트에 3×105 세포/웰로 각 웰에 세포를 분주한 후 24시간 동안 배양하고, 3일째 PBS로 세포 세척 후, 1ml의 신선한 PBS로 교체한 다음 UVB 20mJ을 조사하였다. UV 조사 후 무혈청 배지로 교환한 뒤 합성 화합물을 처리하였다. 양성 대조군으로 발암증식인자 (TGF:transforming growth factor)를 사용하였다. 처리 24시간 후에 세포를 회수하여 RNA를 추출하고, RT-PCR 과정을 통해 cDNA를 얻었다. 이렇게 얻어진 각각의 cDNA에 GAPDH, 타입 I 콜라겐 (COL1A1), MMP-1 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머는 표 1과 같다.
자외선이 조사된 섬유아세포는 콜라겐의 발현이 감소되고, 콜라겐 분해를 촉진하는 효소인 MMP-1의 발현은 증가되었다. 자외선이 조사된 섬유아세포에 KEAPC-5(구체 화합물명 기재 필요)를 처리하였을 때, 정상적인 섬유아세포에서와 같이 콜라겐이 증가되고, MMP-1이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. UV에 의한 콜라겐 손상을 복원시킴과 동시에 콜라겐생성을 촉진시키는 효능이 있음을 확인할 수 있었다[도 3 참조].
실시예 7: 광노화 마우스에 주름개선 효능 시험
광노화 마우스 모델을 만들기 위해 7주령의 무모생쥐 (hairless mice)를 이용하였다. 무모생쥐에 UVA (140mJ/㎠)와 UVB (60mJ/㎠)를 10주 동안 주 3회 조사하여 광노화 마우스 모델을 만든다. 제조된 광노화 모델 마우스에 10주 동안 광노화를 유발한 후, 2주 동안 UV 조사 없이 유지하였다. 그 후, 음성 대조군에는 화합물을 도포하지 않고, 각각 양성 대조군에는 레티놀, 처리군에는 시험 화합물을 도포하였다. 양성 대조군에 사용된 레티놀은 콜라겐의 발현을 증가시키는 물질로 알려져 있다.
도포 2주 후 피부의 기능적인 변화를 측정하기 위해, 경표피 수분 손실량 (TEWL)과 피부 수분량 (hydration)을 측정하였다. 측정 결과, 시험 화합물 처리군에서 음성 대조군과 비교하여 경표피 수분손실량 (TEWL), 피부 수분량 (skin hydration)은 현저한 차이를 보이지 않았다. 이에 반해, 양성대조군으로 사용된 레티놀 처리군에서는 경표피 수분손실량 (TEWL)이 유의하게 증가하고, 피부 수분량 (skin hydration)은 유의하게 감소되는 결과를 보였다[도 4a, 도 4b 참조]. 이상의 결과는, 기존 레티놀의 부작용인 경표피수분손실량 (TEWL)증가 유발 및 피부수분량(SC hydration)감소를 통한 피부자극 유발 및 부작용이 시험 화합물을 사용하는 경우에는 나타 내지 않음을 증명하는 것이다.
기능적인 변화를 측정한 후, 조직 생검을 시행하여 파라핀 블록을 만든 후 조직화학염색 등을 시행한다. 헤마톡실린-에오신 염색(H&E stain)을 통해 피부조직의 일반적인 형태를 관찰하고, 표피와 진피의 두께를 측정한다. 측정 결과, 음성 대조군과 비교하여 KEAPC-5 처리군에서 진피의 두께가 현저히 증가하였고, 양성대조군인 레티놀 도포군과 비슷한 결과를 보였다. 하지만, 양성대조군인 레티놀 도포군에서는 표피의 두께가 현저히 증가함으로써, 피부의 자극을 나타남을 확인할 수 있었다 [도 4c, 도 4d 참조].
콜라겐 섬유는 콜라겐만 선택적으로 염색되는 마송 삼색 염색 (Masson trichrom stain)을 진행하여 촬영 후 진피에서의 콜라겐 밀도를 포토샵 히스토그램으로 평가하였고, 그 결과 진피조직의 콜라겐 밀도가 본 발명의 화합물 및 양성대조군에서 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었고 [도 4e], 본 결과는 섬유아세포에서 콜라겐 생성 촉진효과와 일치하는 결과이다.
상기 실시예를 통해, 본 발명의 화합물은 양성대조군으로 사용된 레티놀의 피부자극과 같은 부작용은 나타내지 않고, 진피의 섬유아세포에 선별적으로 작용하여 콜라겐 생성촉진 및 콜라겐 손상 복원을 통해 자외선에 의한 피부 노화에 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
이상과 같은 실시예에서 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 화합물의 섬유아세포에 대한 콜라겐 합성 능력, 광노화 마우스에서 주름개선 효능을 평가함으로써 본 발명의 화합물에 의한 주름 개선, 상처치료, 아토피 피부염 및 습진, 건선 등에서 있어서 피부장벽 개선 효과를 통한 치료 효과를 확인하였다.
도 1은 섬유아세포에서 콜라겐 타입 I 발현과 MMP-1의 발현량을 mRNA 수준에서 실시간 PCR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 그래프도이다.
도 2는 섬유아세포에서 합성된 콜라겐 단백질의 양을 PICP 키트를 사용하여 정량한 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 3은 자외선 처리된 섬유아세포에서 콜라겐 타입 I 및 MMP-1의 발현량을 mRNA 수준에서 실시간 PCR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 그래프도이다.
도 4a는 광노화 마우스에서 화합물을 2주 동안 도포한 후 경표피수분손실량 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 광노화 마우스에서 화합물을 2주 동안 도포한 후 피부 수분량 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 광노화 마우스에서 화합물을 2주 동안 도포한 후 피부 표피 두께 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 광노화 마우스에서 화합물을 2주 동안 도포한 후 피부 진피 두께 측정결과를 나타내는 그래프이다.
도 4e는 광노화 마우스의 진피층 콜라겐 밀도 계산결과를 나타내는 그래프이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 I에 따르는 화합물:
    (화학식 I)
    Figure 112009060315514-pat00010
    (식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다).
  2. 제 1 항에 있어서, R은 수소 또는 C1-6의 직쇄 또는 분지형 알킬기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. (a) 에틸 아세토아세테이트와 에탄올을 혼합한 후 혼합물에 1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-아민 히드로클로리드을 가하여 용매를 증발 환류하여 (E)-에틸 3-{1,3-디(tert-부틸-디메틸실란일옥시)프로판-2-일아미노}부트-2-에노에이트를 제조하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 생성물을 다음 화학식 A:
    (화학식 A)
    I-R (식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다)
    의 화합물과 반응시켜 다음 화학식 B:
    (화학식 B)
    Figure 112009060315514-pat00011
    (식 중, R은 위에서 정의한 바와 같음)
    의 화합물을 제조하는 단계; 및
    (c) 화학식 B의 화합물을 디클로로메탄(DCM)에 용해시켜 트리플루오로 아세트산(TFA) 수용액과 반응시키고 중화 후 용매를 제거하는 단계를 포함하는 하기 화학식 I에 따르는 화합물:
    (화학식 I)
    Figure 112009060315514-pat00012
    의 제조 방법.
  4. 하기 화학식 I:
    (화학식 I)
    Figure 112011045547393-pat00013
    에 따르는 화합물을 포함하는 피부상태개선용 조성물
    (식 중, R은 수소 또는 C1-10의 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알릴기이다).
  5. 제 4 항에 있어서, 조성물은 피부 상처 치유의 촉진, 주름 개선, 아토피 피부염 치료, 습진 또는 건선의 치료로부터 선택되는 피부상태개선 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 피부상태개선용 조성물.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 피부상태개선은 세포외 기질의 합성 증가 또는 세포외 기질 성분 분해효소(MMPs)의 생성 억제 또는 둘 다에 의하여 달성되는 것을 특징으로 하는 피부상태개선용 조성물.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 국소 투여용인 것을 특징으로 하는 피부상태개선용 조성물.
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