KR101112748B1 - 소의 체외 수태능력 예측 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소의 체외 수태능력 예측방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 정자의 수정능 획득 방법을 최적화시키기 위한 헤파린 처리 조건과 투명대가 제거된 햄스터 난자를 이용하여 정자의 수정능력 차이를 최대한 넓힌 후, 정자의 난자 내 침투 후 활성상태에 따라 점수를 부여하는 수식을 고안하고, 이를 발정비재귀율 (NRR)과 비교하는 단계를 포함하는 예측방법에 관한 것으로, 기존의 소의 수태능력 예측방법에 비해서 예측률이 매우 높다.

수태능력, 발정비재귀율, 수정능 획득

Description

소의 체외 수태능력 예측 방법 {A novel method for predicting fertility in bovine}

본 발명은 소의 체외 수태능력 예측방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 적정한 농도 및 배양 시간으로 헤파린을 처리하여 정자의 수정능 획득을 최적화하고, 투명대가 제거된 햄스터 난자를 이용하여 정자의 침투능력을 최적화하여 수태능력이 높고 낮은 개체간의 차이를 크게 넓힌 후, 정자의 난자 내 침투 후 활성상태에 따라 점수를 부여하는 수식을 고안하여 이를 발정비재귀율 (NRR)과 비교하는 단계를 포함하는 예측방법에 관한 것이다.

소의 인공수정은 개량을 촉진시키기 위한 수단이며, 번식성적 향상, 경영비용 절감, 노동력 감소, 질병전파 방지의 목적을 가지며 높은 이용률을 보고하고 있다. 그러나 인공수정에 의한 씨수소는 약 50% 정도의 성공률만 보이고 있다. 하나의 씨수소 동결 정액이 수천 마리의 소를 수태시키는데 사용되어지기 때문에 높은 수정 능력을 가진 씨수소의 생산은 임신율을 증가 시키는데 매우 중요한 경제적인 가치를 가지게 된다. 여러 실험들에 의해 정자 수, 운동성, 형태학적인 면 (Bonde et al., 1998), 정자 막의 손상정도 (Thundathil et al., 1990), 자궁경부 정액이나 난모세포의 침투력 (Sharara et al., 1995) 등이 동물의 수정 능력을 결정하는 요소라고 연구되고 있으나, 상기의 요소들이 소의 수정 능력에도 영향을 미친다고 정확히 입증되지는 않았다. 더욱이, 생체 내에서는 높은 수정 능력을 가지고 있는 것으로 증명된 황소라도 시험관내에서는 그 수정 능력이 달라질 수가 있다 (Palma and Brem, 1994). 특히 소에 있어서, 수정 능력은 가축의 경제형질 중 가장 중요한 형질 중 하나이나, 이를 측정할 객관적 도구가 개발되지 못하여 우수 가축의 생산 및 이용 효율은 목표치에 크게 밑돌고 있는 실정이다.

또한 번식성적에 대한 결과의 변이가 매우 크고, 인공수정의 양적인 보급률은 급속히 증가하였으나, 효율적 이용과 개량을 위한 효과적 활용이 미흡한 실정이다.

씨수소의 생산 및 이용 효율 증진을 위해서는 수태성이 우수한 씨수소를 선발하는 방법이 개발되어야 하며, 특히 정자의 수정 능력을 객관적으로 측정할 수 있는 체외 수정능력 평가법이 개발되어야 한다. 그러나 정자의 품질을 검사하는 방법이 매우 주관적인 실정이며, 현재 소의 인공수정용 정액을 생산하는 기관에서 시행되고 있는 정자의 품질 검사는 정자의 운동성 검사이다. 정자의 운동성 검사만으로는 정확도 높은 수정능력의 예측이 어려우며, 정자의 품질을 입증할 수 있는 지표가 될 수 없다.

아울러, 수태능력을 정확히 예측할 수 있다면, 수태능력이 낮은 종모우의 조기선발로 인한 불필요한 사육에 대한 경제적 손실을 줄이고, 종모우에 기인한 낮은 수태율로 인해 임신이 안되는 손실을 줄일 수 있다. 만약에 수태율을 10% 증진시킨다면 국내 농가에서 연간 700억의 부가적인 경제적 이윤을 얻을 수 있다. 즉, 한우에서 수태율이 10% 증가시 5만원(생산비 절감/두) X 100만두(가임 암소) = 500억원 (추정 농가 이익) 뿐만 아니라, 20만원(복중산자이익/두) X 10만두(수태율 10% 증가) = 200억원의 추가적 경제이윤을 얻을 수 있으며, 한우 뿐만 아니라 육우, 유우 모두에 적용될 경우 추가적인 경제이윤이 증가할 수 있다. 또한 소고기 생산에 필요한 암소의 수를 현저히 감소시켜 이에 따른 비용손실 방지는 물론 축산분뇨 등 환경오염을 감소시킬 수 있다.

따라서 정확하고 객관적인 소의 체외 수태능력을 예측하는 기술 개발은 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 소의 체외 수태능력을 정확하고 객관적으로 예측할 수 있는 방법인 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 소의 체외 수태능력 예측방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은, 수컷 소의 정액으로부터 얻은 정자를 헤파린 처리 배지에서 배양하는 단계;

상기 배양된 정자세포를 헤파린 처리 배지에서 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양하는 단계; 및

난자당 침투한 정자의 수 및 전핵의 수를 측정하여 체외 정자 침투를 분석하고 이를 발정비재귀율과 비교하는 단계;

를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 소의 체외 수태능력 예측 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 헤파린 처리 배지는 mTALP (100 mM NaCl, 3.1mM KCl, 25mM NaHCO_3, 0.3mM NaH₂PO_4, 21.6mM 소디움 락테이트 (Sodium Lactate), 2.0mM CaCl_2, 0.4mM MgCl_2, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 (Pyruvate), 0.6 % BSA)를 사용하는 것을 포함한다.

상기 헤파린은 5 내지 15㎍/㎖의 양으로 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 배지에서 헤파린을 0, 10, 20, 50㎍/㎖ 로 처리하여 각 농도에 따른 정자의 침투율을 비교하였다. 그 결과, 배양 배지에서 헤파린의 농도를 10 ㎍/㎖로 처리하였을 때 정자의 침투율이 가장 높음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 정자를 상기 헤파린 처리 배지에서 15 내지 25분간 배양하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 헤파린 처리 배지에서 정자의 배양 시간을 각 10분, 20분, 30분으로 하였을 때, 20분간 배양하는 경우가 수정능 획득률이 가장 높았다 (실시예 2 참조).

본 발명에서의 수정능 획득 상태 분석은 듀얼 (Dual) 염색방법 (CTC/Heochst 33258 염색법)으로 수행될 수 있다.

상기 듀얼 염색방법은 (1) 정자를 H33258 용액에 첨가하고, 빛을 차단한 상태에서 배양하는 단계; (2) 과잉 염색을 제거한 후, 원심분리를 통해 펠렛을 현탁시키는 단계; (3) 상기 현탁액을 UV와 BP 필터를 사용하여 에피플루오레센스 조명 하에서 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 정자의 수정 능력의 분류는 정자 막 패턴에 따라 분류하는 것을 포함한다. 정자의 막 패턴에 따라 F (살아 있으면서 수정능 획득 능력이 없는 경우), B (살아 있으면서 수정능 획득 능력이 있는 경우), AR (살아있으면서 첨체부위가 반응을 하는 경우)로 분류할 수 있다.

본 발명의 상기 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양함에 있어서, 바람직하게는, 39℃, 5% 이산화탄소 환경 하에서 2 내지 4시간 동안 공배양 되도록 한다.

본 발명에서의 소의 체외 수태능력 예측 방법은 하기 수학식의 정자 수태성 지표 (SFI)와 발정비재귀율을 비교하여 이루어진다. 바람직하게는, 하기 수학식의 정자 수태성 지표 (SFI)가 2.8 이하일 때는 발정비재귀율이 65% 미만의 수태능력을 가진 개체를 나타내는 것임을 특징으로 한다. 또한, 정자 수태성 지표 (SFI) 가 2.8 초과일 때는 발정비재귀율이 70% 이상의 수태능력을 가진 개체를 나타내는 것임을 특징으로 한다 (표 1 참조).

-정자 수태성 지표 (SFI)

SFI = 난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)

[표 1] 정자침투력 검사를 통한 소의 수태능력을 예측한 결과

SFI (정자수태성지수)	NRR (>70%)	NRR (<65%)
SFI>2.85 (n=7)	6	1
SFI≤2.85 (n=5)	0	5
민감도 (Sensitivity)	100%
특이도 (Specificity)	83%
양성 예측치 (Positive predictive value)	86%
음성 예측치 (Negative predictive value)	100%
전체 정확도 (Overall accuracy)	91.6%

*상기 발정비재귀율 (NRR)은 인공수정 실시 후 60일에 발정재귀율을 조사하여 발정이 오지 않은 비율을 말함

본 발명에서는 민감도와 특이도가 높은 소의 체외 수태능력을 예측하는 방법을 제공함으로써, 본 발명에 의하면, 보다 정확하고 객관적으로 소의 수태능력을 예측할 수 있어 우수한 유전능력을 가진 동물의 안정적 생산을 도모하고, 불필요한 사육에 기인한 경제적 손실 및 저수태성 종모우의 사용에 따른 불임을 예방할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아니고, 당업자에 의해 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 재료 준비

1-1. 정액의 근원

NACF (National Agriculture Cooperative Federation)에서 인공수정 (AI) 단계에서 정상의 생식 능력을 가졌던 한우동결 정액을 구입하였다. 한우 동결 정액의 NRR (발정비재귀율: Non-Return rate) 수치는 각 농가의 수태 자료에서 얻었다. NRR (발정비재귀율)은 인공수정 실시 후 60일에 발정 재귀율을 조사하여 발정이 오지 않은 비율로서 결정되었다.

1-2. 배지의 준비

배지는 mTALP (100 mM NaCl, 3.1mM KCl, 25mM NaHCO_3, 0.3mM NaH₂PO_4, 21.6mM 소디움 락테이트 (Sodium Lactate), 2.0mM CaCl_2, 0.4mM MgCl_2, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 (Pyruvate), 0.6 % BSA)를 사용하였다.

<실시예 2> 정자의 헤파린 처리

정자를 20초 동안 39℃의 따뜻한 물에서 융해시키고 0.5ml TALP 로 희석시켰다. 희석된 정자를 퍼콜 덴시티 그레디언트 (percoll density gradient)로 씻었다. 30분 동안 1000Xg로 원심 분리하여 90% 농도의 퍼콜 (90% percoll gradient)로부터 정자를 얻었다.

아울러, 수태능력 예측의 민감도를 높이기 위하여, 절차의 각 단계는 최적화 되도록 하였다. 정자의 난자 침투율을 높이기 위한 최적의 헤파린 농도를 알아보기 위해 상기 정자에 헤파린을 0,10,20,50㎍/㎖로 처리하였다. 각 농도별로 정자의 난자 침투율을 측정하였다. 그 결과, 10㎍/㎖의 헤파린을 처리한 정자가 가장 높은 침투율을 보였다 (도 1 참조).

39℃, 5% 이산화탄소에서, 헤파린을 처리한 배지에서 배양함으로써 정자의 수정능 획득을 유도시켰다. 헤파린을 처리한 배지에서의 배양 시간을 10, 20, 30분으로 하여 정자의 수정능 획득률을 측정하였다. 10㎍/㎖의 헤파린 처리 배지에서, 정자를 20분간 배양하는 경우가 수정능 획득률이 가장 높았다 (도 2 참조).

<실시예 3> CTC/Heochst 33258 염색법을 이용한 정자 수정능 획득 상태 분석

수정 능력 상태는 몇 가지 물질을 첨가하여 Perez et al. (1996)에 의해 고안된 듀얼 (Dual) 염색 방법으로 결정할 수 있었다. 간단히 말해, 소 정자의 100㎕를 H33258 용액 15㎕에 첨가하고, 빛을 차단한 물통에 10분간 39℃에서 배양하였다. 과잉 염색은 PBS에서 2% 폴리 비닐피로리돈 (poly vinylpyrrolidone) 250㎕ 를 사용해 혼합물의 층분리를 통해 제거하였다. 10분 동안 1,000 Xg 에서 원심분리 한 후 상청액은 버려지고 펠렛은PBS 200μl와 200μl CTC 로 염색시켰다. CTC는 pH 7.8의 20mM 트리스 버퍼 완충용액 안의 750μM CTC, 130 mM NaCl, 5 mM 시스테인으로 구성되어 있었다.

시료들은 H33258과 CTC 각각에 대하여 UV BP 340-380/LP 425 와 BP 450-490/LP 515 excitation/emission 필터를 사용하여 에피플루오레센스 (epifluorescence) 조명하에 Nikon microphot-FXA로 관찰하였다.

표 2에 나타난 바와 같이 정자를 다음과 같이 분류하였다.

- 죽은 경우: Dead (D 타입, 정자 두부 위에 핵이 밝은 파란 형광을 띄는 경우)

- 살아 있으면서 수정능 획득 능력이 없는 경우 : live non capacitated (F 타입, 전체 정자 두부에 균등하게 밝은 녹색 형광을 띄면서 가운데 부분에 강한 형광을 띄고 있거나 띄지 않은 경우)

- 살아 있으면서 수정능 획득 능력이 있는 경우 : live capacitated (B 타입, 첨체 부위 위에 초록 형광 및 첨체 뒷부분이 어두운 경우)

- 살아 있으면서 첨체부위가 반응을 하는 경우 : live acrosome reacted (AR 타입, 정자 두부 위에 반상문의 초록형광 또는 첨체 뒷부분에만 초록 형광 또는 두부에 형광이 없는 경우)

모든 정자는 가운데 부분에 녹색 형광을 띄고 있었다. 각 샘플에 대한 두개의 슬라이드는 하나의 슬라이드당 적어도 400개의 정자가 있다고 추정되었다.

[표 2] CTC 염색에 따른 정자막 패턴의 정의

패턴	설명
F	사정된 정자가 전체로 형광을 띄는 경우: 수정능을 획득하지 못한 정자의 특징
B	밴드 형태로 발현되거나 오직 첨체부분에서만 형광을 띄는 경우: 수정능 획득한 정자의 특징
AR	전형적인 첨체 반응 정자

<실시예 4> 정자의 투명대 제거 햄스터 난자 침투 검사 (sperm penetration assay: SPA)

투명대 제거 햄스터 난자들은 발정 주기의 첫번째 날에 8주령 이상된 햄스터의 복강내로 PMSG와 hCG (각각 30 IU)를 48시간, 72시간째에 투여하고 회수하였다. 난관을 절개한 후 난구세포 덩어리들은 절개된 난관들로부터 제거되었으며, 0.1% 하이알루로니데이즈와 0.1% 트립신으로 난구세포와 투명대를 각각 제거하였다. 난자들은 효소 처리 후에 PBS로 세 번 세척하였다.

각 10개의 햄스터 난자 그룹들은 39℃, 5% 이산화탄소 환경하에서 각 처리 배지 500ul가 들어있는 4-well 멀티디쉬에서 3시간 30분 동안 정자와 공배양 되었다.

공배양 기간의 마지막 단계에서, 난자들은 슬라이드 위에 올려졌고, 에탄올:아세트산이 3:1 비율인 용액으로 최소 24시간 동안 고정되었다. 그 후에 난자들은 1% 락모이드(lacmoid)로 염색되었고, 위상차 현미경 (400배)으로 정자의 투과 증거를 검사하였다.

<실시예 5> 수소의 체외 수태능력 예측

본 발명자들은 하기 수학식의 정자 수태성 지표 (SFI)를 계산하고, 이를 발정비재귀율 (NRR)과 비교하여 수소의 체외 수태능력을 예측하였다.

<수학식>

SFI = 난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)

상기 SFI는 난자내에서 침투된 정자의 활성화에 따른 다른 수치를 나타내는 데에 무게를 두어, 확대되고, 응축되지 않는 정자 머리보다 전핵에 두 배의 점수를 부여하였다.

네 개의 중요 요소들이 검사의 질을 평가하는데 관여하는데, 그것은 민감도, 정확도, 양성 예측치, 그리고 음성 예측치이다 (Evans et al., 2002).

하기 표는 투명대를 제거한 햄스터 난자를 이용하여 정자의 난자 침투능력을 검사하여 SFI 점수 2.8을 기준으로 NRR과 비교하여 수태능력을 예측한 것이다. 민감도는 SFI 점수가 2.8 이하일 때 NRR 65% 미만의 수태능력을 가진 개체를 나타낸 것이며, 특이도는 SFI 점수가 2.8 초과일 때 NRR 70% 이상의 수태능력을 가진 개체를 나타낸 것이다.

이 방법을 통하여 SFI 점수가 2.8 이하일 때 NRR 65% 미만의 수태능력을 가진 개체의 예측률은 100% 이며, SFI 점수가 2.8 초과일 때 NRR 70% 이상의 수태능력을 가진 개체의 예측률은 86% 였다 (표 3 참조).

[표 3] 정자 침투력 검사를 통한 소의 수태능력 예측 결과

SFI (정자수태성지수)	NRR (>70%)	NRR (<65%)
SFI>2.85 (n=7)	6	1
SFI≤2.85 (n=5)	0	5
민감도 (Sensitivity)	100%
특이도 (Specificity)	83%
양성 예측치 (Positive predictive value)	86%
음성 예측치 (Negative predictive value)	100%
전체 정확도 (Overall accuracy)	91.6%

도 1은 투명대를 제거한 햄스터 난자를 이용하여 정자의 난자 침투능력을 검사함에 있어, 정자의 침투능력을 극대화 시킬 수 있는 헤파린의 첨가 농도를 결정하기 위한 실험결과를 나타낸 것이다. 10㎍/㎖의 헤파린을 처리하였을 때 정자의 침투능력이 가장 높았다.

도 2는 정자에 헤파린을 처리하여 정자의 수정능 획득을 극대화 시킬 수 있는 배양 시간을 결정하기 위한 실험 결과를 나타낸 것이다. 20분간 배양하였을 때 정자의 수정능력 획득이 극대화 되었다.

Claims (5)

1) 수컷 소의 정액으로부터 얻은 정자를, 10㎍/㎖의 헤파린을 처리한 mTALP 배지(100 mM NaCl, 3.1mM KCl, 25mM NaHCO_3, 0.3mM NaH₂PO_4, 21.6mM 소디움 락테이트 (Sodium Lactate), 2.0mM CaCl_2, 0.4mM MgCl_2, 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 (Pyruvate), 0.6 % BSA)에서 39℃, 5% 이산화탄소 환경 하에서 20분간 배양하는 단계;

2) 상기 배양된 정자세포를 헤파린 처리 배지에서 투명대 제거 햄스터 난자와 39℃, 5% 이산화탄소 환경 하에서 2 내지 4시간 동안 공배양하는 단계; 및

3) 난자당 침투한 정자의 수 및 전핵의 수를 측정하여 하기 수학식 1로 정자 수태성 지표(SFI)를 계산한 후, 정자 수태성 지표(SFI)와 발정비재귀율(NRR)을 비교하여 체외 정자 침투력을 분석하는 단계를 포함하며,

정자 수태성 지표(SFI)가 2.8 이하이면 발정비재귀율이 65% 미만의 수태능력을 가진 개체를 나타내는 것으로 예측하고, 정자 수태성 지표(SFI)가 2.8을 초과하면 발정비재귀율이 70% 이상의 수태능력을 가진 개체를 나타내는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는 소의 체외 수태능력 예측 방법.

<수학식 1>

SFI = 난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)

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