JP2000513208A

JP2000513208A - Ｉｖｆの成果についての予測アッセイ

Info

Publication number: JP2000513208A
Application number: JP09529126A
Authority: JP
Inventors: コーク，ブライアン; マイケル，アンソニー
Original assignee: ロイヤルフリーホスピタルスクールオブメディシン
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 2000-10-10
Also published as: GB9603326D0; WO1997030175A1; EP0880601A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、雌性ヒトから採取した生物学的サンプル（例えば、卵母細胞の周囲から得られる卵胞液または顆粒膜細胞）中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11β-HSD)のモジュレーターのレベルを測定することにより、体外受精(in vitro fertilisation:IVF)を用いる妊娠の成功の見込みを予測するためのアッセイ（およびキット）に関する。モジュレーター（例えば、阻害剤）の量は11β-HSD活性に及ぼすその作用により測定することができる。モジュレーター（例えば、11β-HSD阻害剤）の投与は妊娠の可能性を高め、一方、11β-HSDアゴニストは避妊薬であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】 IVF の成果についての予測アッセイ本発明は、雌における妊娠（または不妊症）の可能性を評価するのに使用可能なアッセイに関し、特に、哺乳動物（ヒトを含む）における体外受精（in vitro fertilisation；IVF）の成果を予測するものである。特に、本発明は、発生途中の（または発生した）卵母細胞の周囲から採取した組織または体液中の11β- ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HSD）のモジュレーター（例えば、阻害剤）についてのアッセイに関する。 IVFの技術は、1978年以来、不妊の問題があるヒト患者において用いられてきた。広範な研究にもかかわらず、それは依然として困難な手法であり、最良のIV Fの病院においてさえ、たった30％の成功率が一般に達成されているにすぎない IVFは、費用のかかる手法であり、患者にとって心的外傷となり得る。女性からIVFのための卵子を採取するために外科的手法が必要とされ、受精の後、受精卵を子宮に移植するためにさらなる外科手術が必要である。その後、レシピエントは、妊娠が成功したか否かが判定できるようになるまである一定期間待たなければならない。ある場合には、繰り返して試みたにもかかわらず妊娠が達成されない可能性があり、これらの場合には、金銭的および人的の両面で、患者および社会に対して相当な犠牲となり得る。したがって、IVFの成功率が改善できるまでは、処置を行う前に、成功する見込みのないレシピエントを同定できることが望ましいことであり、その結果、そのような患者は、上記のIVF法の費用および損傷を回避可能となる。副腎ステロイドホルモンであるコルチゾールは、培養下での雌の生殖細胞（卵母細胞）の成熟および卵巣細胞の発生に影響を及ぼすと考えられる^22,23。近年、卵胞液中のコルチゾールの濃度と卵母細胞の成熟度との間には関連性があることが報告されている⁷。酵素11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HSD、EC1.1.1.146）は、コルチゾールおよびコルチコステロンをそれらの不活性な形態であるコルチゾンおよび11-デヒドロコルチコステロンにそれぞれ変換する^3,5,16。該酵素は、ラット卵母細胞中に存在し³、卵巣の機能を調節すると考えられる¹²。肝臓型および腎臓型の11β-HSDの２つのイソ型が特性付けられている。両方のイソ型は卵巣組織内で発現される。本明細書では、11β-HSDの意昧は、（文脈がそれ以外の意味を要求しない限り）両方（肝臓型および腎臓型）のイソ型を含む。従来の研究は、卵母細胞の成熟度またはホルモンレベルと体外受精の成功率との関係に注目する傾向があった。しかし、驚くべきことに、一旦受精が達成され、IVF法の第２部（つまり、移植）が行われると、卵母細胞の採取時と続いて妊娠が確立した時点とでの卵母細胞の周囲における11β-HSDのレベルには強い逆の相関性があることがわかった。この相関性は、卵母細胞の成熟度または受精に影響を及ぼす可能性のある他の要因とは無関係に存在する^13,15,37。このことから、まず最初に雌性患者から採取した生物学的サンプル中の11β-HSDのレベルを測定することと、次に、この11β-HSDの測定レベルから、IVFによる該患者の妊娠の確立の可能性を予測することとを含むIVFの成果の予測方法が導かれた³⁷。次に、女性患者を、IVFプログラムに参加する適性についてスクリーニングできるであろう。今回、11β-HSD活性が同じ個体から採取した卵胞間で広範に変動し得ることが見出された。（同じ個体からの）異なる卵胞からの細胞のプールについて測定した活性は、個々の卵胞における活性を正確に反映しているとは限らず、このことは、１個以上の卵胞が、該プール全体の結果に影響を及ぼす11β-HSDモジュレーターを有していることを示唆していた。したがって、IVFの成果は、これらのモジュレーターに基づいて（それらの存在および／または活性により）予測可能であると思われる。したがって、本発明は、妊娠（または、さらに正確には、着床成功）の可能性の評価、特に雌性個体におけるIVFの成果の予測に使用可能なアッセイ方法およびアッセイ用キットに関する。さらに本発明は、IVFの成果または雌性個体のIVF 処置に対する適性を決定するための診断方法において使用するためのそのような方法およびキットに関する。本発明はヒト女性についての研究から開発されたものであるが、あらゆる哺乳動物の雌に適用可能であり、例えば、絶滅の危機に瀕している種のIVFによる捕獲繁殖(captive breeding)プログラムまたは牛やウマなどの家畜の商業的繁殖の成功率を増大させるのに使用可能である。したがって、本発明の第１の態様は、IVFの成果を予測するか、もしくはIVFの成功の可能性を評価する方法であって、（ａ）雌性個体からの１つ以上の生物学的サンプルにおける酵素11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HSD）のモジュレーターのレベルを測定する工程、そして（ｂ）測定したモジュレーターのレベルから、IVFによる該個体における妊娠確立の見込みまたは可能性を予測する工程を含んでなる上記方法を包含する。上記（または各）サンプルは、例えば卵母細胞の周囲からの体液または組織を含み得る。これは、例えば体外受精および胚移植のために卵母細胞の採取を受けている女性の卵胞から回収した顆粒膜黄体細胞または卵胞細胞ならびに他の卵巣細胞を含み得る。あるいは、該（または各）サンプルは、例えばIVFプログラムに入る前の外来患者から得た卵胞吸引液を含み得る。該サンプルは、卵母細胞の周囲から得た保存（通常は凍結した）細胞も含み得る。他のサンプルとしては、尿または血漿を含み得る。特に好適なサンプルは卵胞液を含む。したがって、上記第１の態様はさらに、上記工程（ａ）に先立って、上記雌から１以上の生物学的サンプルを採取する工程を含み得る。上記サンプルは、上記工程（ａ）での測定を行う前に処理（例えば、保存、凍結、洗浄、培養、媒体への添加など）することが可能である。 11β-HSDの「モジュレーター」とは、11β-HSD活性に影響を及ぼす（天然に存在する、もしくは存在しない）物質を意昧する。好ましくは、該モジュレーターは内因性である。これは、11β-HSD活性を増大させること（アゴニストまたは補因子）または活性を低下させること（阻害剤）、ならびに酵素の特異性または生理的特性を改変することを意味する。好適な11β-HSD阻害剤としては、グリシルリジン酸、グリシルリジン酸様因子 (GALF)、ゴッシポールおよび天然フラボノイド類、ならびにグルココルチコイドホルモンまたはそれらの類似体（11β-HSDに対してコルチゾールと競合可能であるもの）が含まれる。11β-HSD活性を調節する他の化合物には、胆汁酸塩、コレステロールおよびステロイドホルモン（プレグネノロン(pregnenolone)およびプロゲステロンの両方が阻害するもの）が含まれる。予備的研究から、ある場合には、エストラジオールが阻害剤として作用する可能性があることが示唆される。阻害活性および作用部位は変動しうる。例えば、いくつかの研究から、プレグネノロンおよびプロゲステロンは共に腎臓および卵巣の11β-HSD活性を強く阻害することが示されている。また、エストラジオールはin vivoで肝臓の11β-HSD 活性を阻害すると思われるが、in vitroでは卵巣11β-HSD活性に対して強い効果を持たないようである。 11β-HSDモジュレーターのレベルは、直接的に（例えば、該モジュレーターの量または濃度を測定することにより）、または間接的に（例えば、該モジュレーターにより影響を受けることが多い11β-HSD活性のレベルにより）測定可能である。したがって、直接的方法としてはクロマトグラフィー（TLCまたはHPLC）を挙げることができ、一方、間接的方法としては、サンプル中の任意のモジュレーターの効果を、例えば11β-HSDおよび該酵素の基質（例えば³Ｈ-コルチゾール）を添加し、該酵素の活性に及ぼす影響（もしそのような影響がある場合には）を調べることによって測定することを挙げることができる。別法として、もしくはさらに、該サンプル（例えば、卵胞液）を、別の体液、培養細胞（例えば、ヒト顆粒膜黄体細胞）または他の身体由来の物質［例えば、動物（例えばラット）のホモジナイズした器官、例えば腎臓］中に存在する11β-HSDと接触させることも可能である。並行して行われる対照アッセイを行って、該サンプル中に既に（および天然に）存在するあらゆる11β-HSDを見込んでおくことも必要であろう。本アッセイで用いられる11β-HSDは、単離された（または精製された）供給源からのものであっても、別の（ヒトまたは動物の）身体または身体由来の体液中に存在していてもよい。後者としては、例えば、（例えばヒトの）顆粒膜黄体細胞および器官（例えば腎臓）のホモジネートが含まれる。本アッセイで用いられる11β -HSDは必ずしもヒト由来のものでなくてもよく、例えば、齧歯類（例えばラット）のような動物種由来のものであり得る。このことにより、アッセイが、比較的安価で入手可能な形態（例えば、ラット腎臓ホモジネート）の11β-HSDを用いて行えるようになる。別のアッセイにおいて、アッセイされるサンプル（例えば、卵胞液）は、11β -HSD供給源（例えば、顆粒膜黄体細胞）と共に採取することができる。次いでそれらを分離し、例えば、対照として該細胞を体液の不在下で数日間培養し、次いで該体液と接触（再合体）させる。その後で、11β-HSDレベルに対する効果がアッセイできる。このタイプのアッセイは局所体液／細胞を用いるもので、サンプル（卵胞液）中のモジュレーターの存在を試験するのに使用できる。11β-HSDモジュレーターのレベルを測定するにあたって、該方法は、 (i)同一の雌性個体から採取した複数のサンプルの各々、および (ii)それらのサンプルの少なくとも２つの混合物（またはプール）について上記（ａ）における測定を繰り返すことを含み得る。次いで(i)と(ii) とにおいて見出されるレベル間での比較を行うことができる。統計学的な（または有意な）差がある場合には、(i)の中の１つのサンプルが、サンプルのプール( ii)について見出された結果に影響を及ぼすモジュレーターを含むことが示唆される。したがって、(ii)で見出されたレベルが(i)で測定された個々のサンプルの平均より低い場合には、これは該サンプルの１つに11β-HSD阻害剤が存在することを示す。したがって、この差は、サンプル中のモジュレーターのレベルの測定値として使用可能であり、方程式：［式中、Ａ_xは、ｎ個のサンプルについて(i)で測定した、サンプルｘのモジュレーターの量（11β-HSD活性により直接的または間接的に測定したもの）であり、Ａ_mは、(ii)で測定した（２〜ｎ個の）サンプルの混合物（またはプール）中のモジュレーターのレベルである。］から容易に算出される。この場合、各サンプルは、好ましくは異なる卵胞（もしくは卵母細胞の周囲）から採取し、卵胞液および／または顆粒膜細胞を含み得る。したがって、明らかに、Δの正の値は（サンプルの１つに11β-HSDの）阻害剤が存在することを示し、逆に、負の値であれはアゴニストの存在が示唆される。つまり、Δの大きさは、モジュレーターの存在量についての指標を付与し、実際に、該モジュレーターの濃度に正比例するであろう。このように、Δの正の値は、妊娠の大きな可能性を示す。したがって、本発明が、（例えば、妊娠の達成の見込みまたは可能性の予測において）11β-HSDモジュレーターの測定レベルについて言及する場合には、Δを算出すること、およびその値を予測または臨床的評価の基準として用いることを包含する。さらに、上記（ａ）における測定は、（例えば、制御された卵巣の過刺激サイクルの）異なる時期に採取して、何らかの差が認められた２つ以上の生物学的サンプルについて行うことが可能である。さらに、該生物学的サンプルは、異なるサイクルの同じ（または同じような）時期に個体から採取することも可能である。注目すべきことは、卵母細胞採取のための準備を受ける女性には月経も排卵もないので、本明細書では、制御された卵巣の過刺激サイクル(controlled ovaria n hyberstimulation cycle)について言及されていることである。したがって、Δの増加（または減少）はモジュレーターの量（または効果）の漸進的な変化を示し、IVFがうまくいくか否かについての指標を付与し得る。例えば、サンプルは毎日連続して採取することが可能であり、11β-HSD活性が次第に減少することは、（変化なし、または上昇とは反対に）妊娠のチャンスが高いことを示す。次に、11β-HSD活性のレベルはまた、直接的または間接的に測定可能である。すなわち、11β-HSDのレベルは、（タンパク質の）量として、もしくはその活性に換算して測定され得る。直接的な方法としては、11β-HSD活性のレベルを測定するための酵素アッセィが含まれる。該酵素アッセイは、サンプルを基質（例えば、³Ｈ-コルチゾール）と接触させ、酵素による該基質の（³Ｈ-コルチゾンへの）変換率を測定することを含む。³Ｈ-コルチゾールと³Ｈ-コルチゾンとは、薄層クロマトグラフィーにより分離し、次いで定量することができる。これにより、酵素活性の直接的測定値が得られ、この理由によりこのアッセイは好ましい。典型的なアッセイにおいて、約100nMの濃度の³Ｈ-コルチゾールが使用されるが、1 0nM〜1000nMまたはそれ以上の濃度範囲が使用可能である。 11β-HSD活性測定の間接的な方法には、サンプル中のコルチゾールおよびコルチゾンのレベルを測定し、酵素（またはモジュレーター）活性の間接的測定値としてそれら２つの間の比率を求めることが含まれる。そのような場合、コルチゾールに対してコルチゾンのレベルが高くなる程、該酵素の活性も高くなる（もしくは、阻害剤のレベルが低くなる）。コルチゾールおよびコルチゾンのレベルは、それら自体を公知の方法（例えば、TLC／HPLCによりコルチゾールおよびコルチゾンが分離されているイムノアッセイ法）により測定することができる。コルチゾールのアッセイのためのキットは市販されている³⁴。別法として、11β-HSDレベルは、イムノアッセイ、もしくは類似の（例えば競合的）リガンド結合法により測定できる。これは酵素の量の指標をもたらし、その指標は酵素活性と（そして、そこからモジュレーター活性と）相関する。例えば、該酵素に対する結合能を有するリガンド（または抗体）は、RIAやELISAのようなイムノアッセイ法において使用可能であろう。特定のアナライトに高い親和性で結合するリガンドを決定および取得するための方法も当業界において利用可能である³⁵。さらに、11β-HSDタンパク質またはそのｍＲＮＡのレベルはモジュレーター活性の尺度として使用できる。その理由は、幾つかのモジュレーター（例えば、エストラジオール）が、ｍＲＮＡ転写または翻訳のレベルにおいてそれらの効果を発揮するからである。 11β-HSD酵素の発現は、モノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学によっても測定できる。そのような技術からは11β-HSDの存在量の測定値が得られ、その値は酵素活性と相関し得る。 11β-HSD（およびそのモジュレーター）のレベルの測定については本明細書中で言及されているが、上記から、これも上記の間接的測定方法を含むことが理解されよう。モジュレーター（または11β-HSDの活性）のレベルが測定されたら、その結果を用いて、IVF処置を受ける女性患者における妊娠の成功の達成の可能性を予測または評価することができる。サンプル中の11β-HSD活性のレベルは、該モジュレーターにより直接影響を受ける。したがって、11β-HSD活性は、アゴニスト（またはアンタゴニスト／阻害剤）のレベルに比例（または反比例）し、かくして該モジュレーターのレベルの測定値は11β-HSD活性のレベルと再度相関し得る（つまり、該レベルの指標を与え得る）。従来の研究では、11β-HSD活性レベルは、４時間当たリタンパク質１mgにつきコルチゾンに変換されたコルチゾールの量により測定されており、酵素活性の直接的な測定値を得ていた。約10pm ol/mg/４時間未満の酵素活性を有する被験体は、胚の移植後65％を上回る妊娠率を有していた。これに対して、15〜111pmol/mg/４時間の範囲の酵素活性を有する被験体は、彼らの卵母細胞の受精が明らかにうまくいったとしても、妊娠しなかった³⁷。したがって、（11β-HSD）モジュレーターのレベルは、妊娠のチャンス（特に、IVFの際の妊娠の可能性）を予測するのに用いることができる。最近の研究では、11β-HSD活性の「カットオフ(cut-off)」レベル（このカットオフレベルより高いレベルでは、患者は妊娠せず、これより低いレベルでは、患者は著しく向上した妊娠成功の可能性を有する）が測定されたが、その値は統計学的指標であり、他の測定値および閾値が使用可能であることは、当業者であれば理解されよう。したがって、対応する11β-HSDモジュレーターの閾値レベルも、その同じ目的を達成し、同じ目的のために用い得る。本発明の実施において、アッセイの一致性を達成することが最も重要であり、そのため、個々の医師（またはIVFチーム）はそれぞれ、独自のアッセイ法を確立し、独自の「カットオフ」レベルを決定することができる。これは、まず最初に、先の患者から得られたサンプルに対して歴史的実験を行うことによって確立できるだろう。したがって、10pmol/mg/４時間の11β-HSD活性のレベル（上記のようにして測定）は、過去において適切な限界として用いられてきた尺度を表し、医師が適切であると確認した場合には、本発明の実施における閾値としても使用可能である。しかし、11β-HSD活性（またはモジュレーター）のレベルを、上記の他の方法のいずれかで測定した場合には、その結果と他の方法の結果との関係を決定するために、そして直接比較するために、通常の方法を用いて、本アッセイ法を用いた対照(control)を実施することが望ましい。モジュレーター（11β-HSD活性）のレベルが測定されたら、該レベルを用いて、患者におけるIVFによる妊娠の成功の可能性を評価することができる。例えば、本発明は、既に卵母細胞が採取され、体外受精され、移植されている患者からのサンプルに対して使用することが可能である。一般に、妊娠の達成に失敗した場合には、受精した卵子をさらに移植することができるように多数の卵子が採取され受精される。本発明の方法を行うことにより、妊娠が達成されるか否か、さらなる保存（受精）卵母細胞の移植が有効である可能性があるのか否か、を予測することが可能となる。そのような患者におけるモジュレーター（または11β -HSD活性）のレベルが、妊娠が成功する場合のレベルを著しく上回っている場合には、先に移植して、そのモジュレーター（または11β-HSD活性）のデータが利用できる卵母細胞と同時に採取および受精した保存卵母細胞の移植をさらに試みないですみ、時間や費用の節約になり、また個体のストレスを低減させるだろう。本発明の方法は、採取した卵母細胞の移植の前、受精の前、もしくはそのような卵母細胞の採取前でも行うことが可能である。そのような場合、上記の方法の結果により、医師（またはIVFクリニック）は最初の移植を試みるか否かを決定できる。したがって、本発明の第２の態様は、雌性個体におけるIVFの成果を予測する方法であって、（ａ）該個体から１つ以上の生物学的サンプルを採取もしくは取得する工程、（ｂ）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11β-HS D）のモジュレーターのレベルを測定する工程、そして（ｃ）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、該個体のIVFによる妊娠の達成の見込みまたは可能性を予測する工程を含んでなる上記方法を提供する。好適な生物学的サンプルとしては、上記第１の態様において記載したものが含まれる。上記で述べたように、２つ以上のサンプル（必ずしも同じタイプのものでなくてもよいが、通常は同じタイプのものである）を採取することができる。次いで、各サンプルおよびサンプルの混合物（またはプール）について上記（ｂ）の測定を行う。各サンプルは、好ましくは同一の雌に存在する異なる卵胞から採取する。本発明のこの実施形態は、IVFプログラムの恩恵を受けそうな個体を選別するのに使用できる。一旦個体を選択したら、IVF法の初期の間に11β-HSDモジュレーターについてのアッセイを繰り返すことにより、IVF法の際の該個体の適性を確認することが望ましい。したがって、第３の態様において、本発明は、個体におけるIVF処置の成功の可能性を確立するための方法であって、（ａ１）雌性個体から生物学的サンプルと共に１つ以上の卵母細胞を取り出す工程、（ａ２）in vitroにて卵母細胞を受精させる工程、（ｂ）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11 β-HSD）のモジュレーターのレベルを測定する工程、そして（ｃ）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、該個体におけるIV Fによる妊娠を達成する見込みまたは可能性を予測する工程を含んでなる上記方法を包含する。第４の態様において、本発明は、（ａ）雌性個体から生物学的サンプルと共に１つ以上の卵母細胞を取り出す工程、（ｂ）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（11 β-HSD）モジュレーターのレベルを測定する工程、（ｃ１）測定した11β-HSDのレベルから、該個体におけるIVFによる妊娠を達成する見込みまたは可能性を予測する工程、そして（ｃ２）11β-HSDモジュレーターレベルが予め決定した閾値よりも高いかまたは低い個体からの卵母細胞を受精させる工程を含んでなる方法に関する。場合により、本発明のこれらの実施態様は、さらに、（ｄ）該雌性個体に受精卵を移植する工程を含む。好ましい生物学的サンプルは、顆粒膜黄体細胞および／または卵胞液を含む。これらの実施態様は共に、適切なレベルの11β-HSDを卵母細胞採取に先立って既にアッセイされた個体に対して実施することが望ましいが、それらは、そのような最初のスクリーニングを受けていない患者に対して実施することも可能である。本発明は、IVFクリニックに通わされている、またはIVFクリニックに通院している潜在的IVFレシピエントの大規模なスクリーニングプログラムで使用される。この（第５の）態様において、本発明は、（ａ）IVFによる不妊治療を必要とする雌性個体の集団を、11β-HSDのモジュレーターのレベルについてスクリーニングする工程、そして（ｂ）該集団から、IVF処置のために予め決定した閾値よりも高いまたは低い11β-HSDモジュレーターレベルを有する個体を選択する工程を含んでなる。特に、卵巣の周囲、特に顆粒膜黄体細胞におけるモジュレーターレベルが予め決定した閾値よりも高い（該モジュレーターが阻害剤である場合）または低い（該モジュレーターがアゴニストである場合）患者が、IVF処置のレシピエントとして好ましい。このことは、下記表１から確認できる。したがって、モジュレーターのタイプならびにその量および／または効果は、妊娠の可能性の予測値(predictors)として用いることができ、例えば、低い11β -HSD活性を有する雌における阻害剤の存在は、IVF成功の高いチャンスを示唆する。モジュレーターのレベルが１サイクルだけで測定される場合、選択（または予測成果）は、そのサイクルの結果に基づいて可能であるに過ぎない。しかし、数サイクルにわたる測定からは、IVFの成果のさらに総合的な指標が得られる。本発明を用いることにより、IVFクリニックがレシピエント源をより効率的に割り当てることができるようになり、かくして、回収した卵母細胞の周囲に高レベルの11β-HSD阻害剤（または低レベルのアゴニスト）を有している患者（したがって、IVF処置により妊娠する可能性のない患者）は処置されない。雌性個体における11β-HSDモジュレーターのレベルを一定期間にわたってモニターして、IVFの成功に好適な変化が起こるか否かを確立することが可能である。個々の患者における卵巣11β-HSDのレベルは、連続的な制御された卵巣の過刺激サイクルの間（ならびに、同じサイクルにおける卵胞間）で変動する可能性がある。したがって、雌を本発明にしたがってモニターし、好適な（すなわち、低い）レベルの11β-HSD（例えば、高レベルの11β-HSD阻害剤または低レベルのアゴニスト）を含む環境に由来する卵母細胞を得ることができる。高レベルの11β-HSD阻害剤（または低レベルのアゴニスト）が妊娠のチャンスを増加させ得ることは明らかなので、移植の成功の可能性を向上させるために、 11β-HSDのレベルに影響を与えるような試みを行ってもよい。これを達成するために、本発明は、第６の態様において、（ａ）雌性個体から、１つ以上の生物学的サンプルを得るか採取する工程、そして（ｂ）該サンプル中の11β-HSD（存在するならば）のモジュレーターの正体(identity)を決定する工程を含んでなる同定方法を提供する。同定には、TLC、HPLC、NMR、IR、質量分析法などの当業界で周知の１つ以上の技術またはそれらの組合せが使用可能である。さらに、第７の態様において、本発明は、妊娠の可能性を高める方法であって、（ａ）雌性個体から得られた１つ以上の生物学的サンプル中の11β-HSDの阻害剤またはアゴニストの正体を決定する工程、そして（ｂ）該個体に、ある量の該阻害剤、またはある量の、該アゴニストの活性を妨害、抑制または阻害する化合物（妊娠促進性化合物）を投与する工程を含んでなる上記方法に関する。これにより、該量は、11β-HSDの活性のレベルを低減しうる。逆に、本発明の第８の態様において、本発明は、避妊（または妊娠の可能性を低減する）方法であって、（ａ）雌性個体から得られた１つ以上のサンプル中の11β-HSDの阻害剤またはアゴニストの正体を決定する工程、そして（ｂ）該個体に、ある量のアゴニスト、またはある量の、該阻害剤の活性を妨害、抑制または阻害する化合物（避妊化合物）を投与する工程を含んでなる上記方法に関する。該量は、11β-HSD活性のレベルが総合的に増加するような量である。上記（ｂ）において投与される阻害剤またはアゴニストは、上記（ａ）において同定された（単離および／または精製後の）阻害剤またはアゴニスト、もしくは別の供給源からである以外はそれらに同一の物質のいずれかであり得る。該阻害剤または該アゴニストは、無菌状態で、および／または他の物質（例えば賦形剤）と共に投与されるので、後者の物質が好ましい。好ましくは、投与する阻害剤は、市販の供給源（例えば、Sigma-Aldrich，Poole，Dorset，UK）から採取されたものである。したがって、本発明の第９の態様は、IVFにおける妊娠の可能性を高めるための薬剤を製造するための11β-HSD阻害剤または妊娠促進化合物の使用に関する。該阻害剤がプロゲステロンである場合、（この薬剤は避妊薬として経口投与されるので）プロゲステロンの生理学的レベルと同じまたはそれより低い用量で与えるべきである。本発明の第10の態様は、避妊薬の製造のための11β-HSDアゴニストまたは（上記第８の態様で定義した）避妊化合物の使用に関する。本発明の第11の態様は、可能性のある候補治療物質のスクリーニング法に関する。該方法は、妊娠促進化合物または避妊薬の同定を含み、（ａ）ある量の11β-HSDと候補物質とを接触させる工程、そして（ｂ）11β-HSD活性の調節に及ぼす該物質の効果（あるとしたら）を測定する工程を含んでなり、活性の阻害（または低下）は妊娠促進特性の可能性を示し、一方、活性の上昇は避妊活性の可能性を示す。以下で述べるように、可能性のある11β-HSD阻害剤としては、11β-HSDに特異的である（そのため、免疫中和により活性を低下させ得る）抗体（またはそれらの断片）を含む。したがって、雌は、卵母細胞を採取する前に、in vivoにて11β-HSD活性を調節またはブロックするように処置することが可能である。例えば、11β-HSDに対する抗体または阻害剤は、酵素活性を阻害する目的で、個体に投与または導入することが可能であろう。これは、抗体療法を用いた腫瘍または他の症状の治療方法に類似している。本発明の目的では、「抗体」なる用語は、そうでないと特定しない以外は、腫瘍標的抗原に対する結合活性を保持する全抗体の断片を含む。そのような断片には、Ｆｖ、Ｆ(ab')およびＦ(ab')₂断片、ならびに一本鎖の抗体が含まれる。さらに、該抗体およびそれらの断片は、当業界で公知のようなヒト化抗体であり得る³⁶。本発明で用いるための11β-HSDに対する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、慣用のハイブリドーマ法により、免疫原として該タンパク質またはそれらのペプチド断片を用いて調製可能である。ポリクローナル抗体も慣用の手段により調製可能であり、そのような手段は、宿主動物（例えば、ラットまたはウサギ）に本発明のペプチドを接種し、免疫血清を回収することを含む。 11β-HSDに対してコルチゾールと競合する他の糖質コルチコイドホルモンまたはその類似体を用いて11β-HSDの活性を阻害することも可能である。11β-HSDの好適な阻害剤は既に述べてある（４頁参照）。そのようなホルモンまたはそれらの類似体はスクリーニング法によって同定可能であり、該スクリーニング法では、候補のホルモンまたはその類似体をアッセイして、それらが11β-HSDに対して³ Ｈ-コルチゾールと競合し、そのために該酵素の活性を阻害し得るか否かを決定する。次いで、候補のホルモンまたはそれらの類似体は、有効量のホルモンまたはその類似体を、IVF処置を受けることになっている、IVF-ETの後に妊娠を達成するのに好ましくない11β-HSDレベルを有することが判明している雌被験体に投与することにより、（例えば、in vivoでの効率について）スクリーニングしてもよい。投与すべき阻害剤（ホルモンまたはその類似体）の量は、その活性および患者の症状を考慮しながら、医師により決定される必要があるだろう。これは、ホルモンについては何の困難もなく達成できる。何故ならば、そのようなホルモンは、受胎に関わるクリニックにおける臨床的プラクティスにおいてしばしば用いられているからである。実際、投与される阻害剤は、おそらくは天然に存在するものであり、レシピエントの雌に既に存在している可能性がある。その阻害剤は、任意の適切な経路で（例えば、経口で、または注射により）投与される。投与に際して、該阻害剤は、製剤学上許容可能な担体または希釈剤を用いて製剤化できる。そのようにして、医師（またはIVFチーム）自身は、IVFを受けることを希望する個体において、IVFが成功するチャンスを高めるように11β-HSD活性のレベルを調節することが可能となる。 11β-HSD阻害剤の使用により、採取した卵母細胞を受精させる前に酵素活性を低下させるように該卵母細胞をin vitroにて処置することも可能になる。これは、有効量のそのような阻害剤（例えば、上記のようなホルモンまたはその類似体）を、卵母細胞およびそれを取り巻く組織（例えば、顆粒膜黄体細胞）を含有するサンプルと接触させて、該サンプル中の11β-HSDの活性を阻害することにより達成し得る。該サンプルと該阻害剤とは、IVFのために典型的に用いられるような無菌的条件下で接触させることも可能である。 11β-HSD阻害剤の使用により、採取した卵母細胞を受精させる前に酵素活性を低下させるように該卵母細胞をin vitroにて処置することも可能になる。これは、有効量のそのような阻害剤（例えば、上記のようなホルモンまたはその類似体）を、卵母細胞およびそれを取り巻く組織（例えば、顆粒膜黄体細胞）を含有するサンプルと接触させて、該サンプル中の11β-HSDの活性を阻害することにより達成し得る。該サンプルと該阻害剤とは、IVFのために典型的に用いられるような無菌的条件下で接触させることも可能である。本発明の第12の態様において、妊娠の見込みまたは可能性を高める方法であって、（ａ）場合により、卵母細胞を雌性個体から採取する工程、そして（ｂ）採取した卵母細胞を11β-HSDの阻害剤または妊娠促進化合物を用いて処理する工程を含んでなる上記方法が提供される。好ましくは、該方法は、さらに（ｃ）上記（ｂ）での処理の前または後で、該卵母細胞を受精させる工程、そして（ｄ）受精した卵母細胞を雌性個体に移植する工程を含む。本発明は、さらに、本発明のアッセイを行うためのキットを提供する。そのようなキットは、11β-HSD活性のモジュレーターを検出するのに有用な少なくとも１つの試薬を含む。（モジュレーター濃度の直接的検出または間接的検出のための）好適な試薬には、場合により標識と結合させた11β-HSDモジュレーターに対する抗体、または他の適切なリガンド結合性試薬が含まれる。典型的な標識はイムノアッセイ法で一般に用いられるものであり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。あるいは、該キットは、コルチゾールおよび／またはコルチゾンに対する抗体、または他の適切なリガンド結合性試薬を含有し得る。このキットは、コルチゾール／コルチゾンの比率または［³Ｈ］-コルチゾールから［³Ｈ］-コルチゾンへの放射分析による変換率の測定のような（11β-HSD活性のレベルを測定するための）間接的アッセイに好適であり得る。該キットは、さらに標準物質（例えば、予め決定した量のコルチゾン、コルチゾールおよび／または11β-HSD）を含むことが可能であり、それらのいずれかまたは全部は検出可能な標識で標識化し得る。該キットは、さらに酵素補因子を含有することが可能であり、そのようなものとしては、例えば、NADHまたはNADPHにそれぞれ転換されるNADまたはNADPが挙げられる。該キットは、還元型NAD(P)Hの再酸化のための比色物質として役立つ酸化テトラゾリウム塩のような薬剤を含有し得る。指示物質の塩の（その還元型にとって）適切な波長における光学密度の変化は、NAD(P)⁺の補因子の還元速度に正比例し、ひいては、11β-HSD活性に正比例し、したがって、例えばサンプル中の11β -HSD阻害剤の濃度に反比例するであろう。あるいは、もしくはさらに、該キットは、比較のための標準物質として11β-H SDモジュレーター（例えば、グリシルレチン酸のような阻害剤）を含有し得る。これは、１つの既知の濃度（または量）で、もしくは幾つかの濃度（または量）で存在させて、比較のための検量曲線を誘導してもよい。本発明はさらに、雌性個体の診断、予測および／またはIVF処置の方法で用いるための（例えばサンプル中の）11β-HSDのモジュレーターの同定または該モジュレーターのレベルの測定のためのキットを提供する。本発明はさらに、IVFの処置またはIVFに対する適性の診断において使用するための診断キットの製造のための、上記の抗体、その断片および変異体、ならびに他の好適なリガンド結合性試薬の使用を包含するものであり、これらは場合により検出可能な標識で標識化されていてもよい。 11β-HSD活性のレベルも、得られたサンプル中に存在する11β-HSD ｍＲＮＡのレベルを分析することにより、アッセイ可能である。これを達成するために、 11β-HSD ｃＤＮＡ³⁰またはその断片をプローブとして用いて、卵母細胞の周辺での11β-HSDのレベルを測定することが可能である。そのようなプローブも、上記抗体について記載したのと類似する様式で上記キットに組み込みことが可能であり、対照の核酸を含み得る。11β-HSD遺伝子用のプローブは、例えば核酸増幅アッセイで使用するためのプローブとして使用するために設計してもよい。本発明のある態様の好ましい特性は、必要な変更を加えれば他の態様にも適用可能である。本発明を説明し添付の図面について言及するために、以下の（非限定的な）実施例を提供する。図１は、12人の異なる個体からの個々の卵胞における11β-HSD活性の変化を示す、患者番号に対する11β-HSD活性のグラフである。星印（*）は、所与の患者での卵胞間での有意な変化（ｐ＜0.05、ANOVAによる）を示す。（４時間当たりのタンパク質１mgにつき生成されたコルチゾン10pmolにおける点線は、非特異的アッセイ検出限界を示す。）図２は、個々の卵胞における卵巣11β-HSD活性と卵母細胞成熟度との関係を示す、卵母細胞の成熟度に対する11β-HSD活性のグラフである。（このデータは、９人の異なる個体からの34の卵胞に関するものである。10pmol形成コルチゾン／ mgタンパク質・４時間における点線は、非特異的アッセイ検出限界を示す。）図３は、細胞の多卵胞プールの11β-HSD活性（影を付けた垂直の棒）と、構成的(constituent)な個々の卵胞の11β-HSD活性（白丸）および３人の異なる個体からの後者の個々の値の相加平均（水平な線）との関係を示す、11β-HSD活性の棒グラフである（^*多卵胞プール値対個々の卵胞についての対応する相加平均についてはｐ＜0.05である；対応のない(unpaired)t-検定。10pmol形成コルチゾン／mgタンパク質・４時間における点線は、非特異的アッセイ検出限界を示す。）実施例１全ての吸引された卵胞からそれぞれの患者についてプールされた、ヒト顆粒膜黄体細胞中の11β-HSDによるコルチゾールからコリチゾンへの検出可能な代謝は、体外受精および胚移植により受胎することができないことと関連することが既に示されている¹³。ここに詳述される実験の目的は、（1）個々の卵胞から得られた顆粒膜黄体細胞の11β-HSD活性の変化、（2）プールされた顆粒膜黄体細胞の11β-HSD活性が所定の患者について個々の卵胞の11β-HSD活性を反映するか否かを評価することであった。更に詳しくは、卵巣11β-HSD活性とIVF-ETによる受胎の可能性との間の既知の逆の関係¹³に鑑みて、一つの目的は所定の患者の異なる個々の卵胞からの顆粒膜黄体細胞間の11β-HSD活性の変化を評価し、そして卵胞11β-HSD活性と卵母細胞成熟度スコアーとの間の関係を評価することであった。加えて、細胞の多卵胞プールの11β-HSD活性が、そのプールが由来する個々の卵胞中の活性の相加平均に等しいか否かを評価した。また、数人の患者から合わされた顆粒膜黄体細胞のプールの11β-HSD活性がそれぞれ個々の患者からの多卵胞プール中の活性の平均とは有意に異なるか否かを測定した。ヒト顆粒膜黄体細胞の調製および培養顆粒膜細胞を既に記載されたような制御された卵巣過刺激⁸後のIVF-ETによる補助受胎を受けている患者から得た。卵胞吸引液を貯蔵し（３日間まで）、４℃ で輸送し、細胞を調製した。顆粒膜細胞を60％(v/v)Percoll(Sigma Chemical Co .，Poole，Dorset，UK)で卵胞吸引液から分離し、ダルベッコ改良リン酸緩衝溶液³³(Life Technologies Ltd.，Paisley，Scotland，UK)中で繰り返して洗浄した。細胞を血球計数器によりカウントし、生存率を0.4％(v/v)トリパンブルー色素の排除により評価した。最初の一連の実験(n=12患者)では、異なる個々の卵胞からの細胞を別々のPerc oll調製物で分離し、10％(v/v)仔ウシ胎児血清、２ミリmol/l L-グルタミン、87 000IU/lペニシリン、および87mg/lストレプトマイシン(Life Technologies Ltd. ，UK)を補給した混合培地(1:1のダルベッコ改良イーグル培地：Ham's F-12、Lif e Technologies Ltd.，UK)中で50,000生存細胞/mlの密度に希釈した。次に３種の１ml容積を24ウェル培養プレートに接種して、それぞれ個々の卵胞中の11β-HSD活性について三重反復アッセイに供した。これらの12人の患者のうちの３人の場合、それぞれの卵胞11β-HSD活性の三重反復アッセイについて≧ 150,000生存細胞を配分した後、過剰の顆粒膜細胞が残った。これらの三つの場合では、それぞれ個々の卵胞からの等しい数の細胞を合わせると細胞の多卵胞プールを生じ、そのプールは50,000生存細胞/mlの密度で≧150,000生存細胞を含んでいた。次にこれらのプールされた細胞を、その多卵胞プール細胞の11β-HSD活性に関する三重反復アッセイの24ウェルプレートに、３種の各々について１ml容積ずつプレーティングした。実施例２第二の一連の実験では、所定の患者から（すなわち、数種の異なる卵胞から）吸引した全ての卵胞細胞を、単一Percoll調製物での顆粒膜細胞の分離の前に合わせた以外は、実施例１の操作に従った。その患者から得られた顆粒膜細胞の合計数をカウントし、150,000生存細胞をその多卵胞プール中の11β-HSD活性の三重反復アッセイについて配分した。次に残っている細胞を異なる患者の多卵胞プールからの細胞と合わせて単一多患者細胞プールを形成した（この場合、多患者プールは、50,000生存細胞/mlの密度で合計150,000を越える生存細胞に等しい数のそれぞれの患者からの細胞を含んでいた）。全ての実験では、細胞を空気中５％(v/v)CO₂の雰囲気で37℃で３日間培養し、培養の２日目に培地を１回交換した。 11β-HSD活性のラジオメトリック変換アッセイ血清補給培養液中で３日間の前培養を行った後に、11β-HSD活性を既に記載されたようなラジオメトリックによる変換アッセイ^12,13,15,37により測定した。簡単に言えば、細胞を培養の４日目に４時間にわたって100n mol/l［1,2,6,7-³H ］‐コルチゾール（比活性＝10μCi/n mol)(Amersham International plc，Ayle sbury，Bucks.，UK)を含む無血清培地中でインキュベートし、その後ステロイドをクロロホルムで抽出し、薄層クロマトグラフィー(TLC)により分割した。 11β-HSD活性を、基質の比活性、ウェル当たりの細胞タンパク質の量および［³H ］‐コルチゾンの非特異的生成速度について修正した［³H］‐コルチゾールから［³H］‐コルチゾンへの変換の速度として計算した（液体シンチレーション計測により定量化された）。このアッセイは100μｇのウシ血清アルブミン(BSA)（Si gma,UK）の存在下のコルチゾールの酸化の速度に等しい４時間当たりの生成された10p molのコルチゾン/mgタンパク質の有限検出限界を有することがわかった。 11β-HSD活性の全ての測定（すなわち、個々の卵胞およびプールされた細胞の両方についての測定）について、三重反復測定に関するアッセイ内の変動係数(CV) は10.87％（36の独立した評価の平均）で、アッセイ間ＣＶは12.11％（n＝12）であった。これらの条件下で、このラジオメトリック変換アッセイは、卵胞液中で典型的に測定された濃度(すなわち、200nM)に近似することが知られている濃度(100nM) のコルチゾールの存在下で培養した無傷の顆粒膜黄体細胞による［³H］‐コルチゾールから［³H］‐コルチゾンへの正味の変換の測定値を与える。^6,7このアッセイは11β-HSD酵素のイソ型のデヒドロゲナーゼ活性を区別するように設計されなかったし、またそれはコルチゾンへのコルチゾール酸化の総速度を測定しない。何となれば、生化学的反応の場合と同様、酵素触媒反応の真の速度は、相反する反応、すなわち、一種以上の11β-HSDイソ型に起因する11-ケトステロイド還元酵素(11KSR)活性により触媒されるコルチゾンからコルチゾールへの還元により低下するからである（結論を参照のこと）。卵母細胞成熟度の評価卵母細胞成熟度を、既に記載されたような解剖立体顕微鏡を使って採取時点で卵母細胞の観察により評価した⁸。卵母細胞を以下のように成熟度についてスコアーをつけた。 1.0＝未熟卵母細胞（すなわち、卵核胞崩壊(GVBD)の証拠のない濃密／緊密卵丘塊）； 2.0〜2.5＝部分成熟卵母細胞（すなわち、GVBDの証拠のある部分膨張した卵丘塊）； 3.0＝排卵前の卵母細胞（すなわち、冠のサンバースト外観およびGVBDの証拠のある膨張した卵丘塊）；および 3.5〜4.0＝後成熟／黄体化卵母細胞（すなわち、拡散／分散した卵丘細胞および卵母細胞退化の証拠）データの統計学的分析それぞれ三重反復でアッセイした異なる卵胞の11β-HSD活性を分散の一方向分析（ANOVA）にかけ、これらの値と卵母細胞成熟度の相当するスコアーの比較をS pearmanのランク相関関係分析により行った。３人の別々の患者について、細胞の多卵胞プールの11β-HSD活性を、相当する構成性の個々の卵胞の活性の相加平均と、対応のないｔ−検定により比較した。同様に、細胞の２つの多患者プールの11β-HSD活性を、構成性の多卵胞プールの活性のそれぞれの相加平均と、ｔ− 検定により比較した。個々の卵胞および多患者プールに関するデータはそれぞれの場合に正規分布に一致しなかったが、多卵胞プールおよび多患者プールの測定値をそれぞれ適当な個々の卵胞／患者値と比較しようとする決定は、それぞれの卵胞／患者からの等しい数の細胞がそれぞれの場合にプールされた細胞を誘導するために使用されたことに基いて正当化された。それ故、多卵胞／多患者のプールされた細胞に関する予想11β-HSD活性を計算したところ、後者のデータの頻度分布とは無関係な、適当な個々の値の単純な相加平均であった。全ての場合に、三重反復測定に関する変動係数(C．V.)はプールされた細胞アッセイおよび個々の卵胞／患者測定値の間で有意に異ならなかった(ANOVA、P>0.05)。更に、卵胞間および患者間の両方の11β-HSD活性の変動は相当するプールされた細胞に関する三重反復測定の変動よりも有意に大きいことが確認された(ANOVA、P<0.01)。全ての場合に、両側検定における５％未満のＰ値を統計上有意と認めた。結果体外受精および胚移植(IVF-ET)の補助受胎プロトコルのために卵母細胞回収を受けている女性の卵胞吸引液から回収した培養ヒト顆粒膜黄体細胞中の11β-HSD の活性を測定した。このような細胞中では、11β-HSD活性はコルチゾールの抗性腺刺激作用に対する感受性をモジュレートする¹²。11β-HSD活性を、その患者から吸引された卵胞の全てから誘導された顆粒膜細胞のプール中でそれぞれの患者について測定した。このような多卵胞プール中では、11β-HSD活性は異なる患者間で著しく変化することがわかり、実際には試験した患者の約40％について11β -HSDアッセイの検出限界を下回った^12,13,15。続いて、顆粒膜黄体細胞が検出可能な11β-HSD活性を発現する全ての患者は、IVF-ETにより受胎することができないことがわかったが、一方、「11β-HSD陰性」顆粒膜黄体細胞を有する患者に関する臨床妊娠率は63％であった^13,15。個々の卵胞中の11β-HSD活性所定の患者からの異なる個々の卵胞（患者当たりn=3-16卵胞）の11β-HSD活性は試験した12人の患者のそれぞれについて有意に変化することがわかった（P<0. 05、ANOVA）(図１)。しかしながら、卵母細胞成熟度スコアーが照合された９人の患者のそれぞれでは、個々の卵胞の11β-HSD活性は閉鎖された卵母細胞の成熟度と相関関係がなかったし、また９人の患者からの合計34の卵胞について卵胞11 β-HSD活性と卵母細胞成熟度スコアーの間に有意な関係がなかった(Spearmanのランク相関関係：r=-0.178、P>0.05;図２)。個々の卵胞中の11β-HSD活性と顆粒膜黄体細胞の多卵胞プールの11β-HSD活性との比較細胞数に関する制限のために、この第二の実験デザインは３人の異なる患者からの細胞（患者当たりn=8〜9卵胞）について実施することができた。それぞれの場合に、細胞の多卵胞プールの11β-HSD活性は、適当な個々の卵胞中のその活性の相当する相加平均よりも有意に低いことがわかった（図３）。実際に、これらの三つの実験のうちの二つでは、細胞の多卵胞プールの活性は、別々にアッセイされた場合に高い11β-HSD活性を有することがわかった個々の卵胞からの細胞の寄与にもかかわらず、11β-HSDアッセイの検出限界よりも下であった（図３）。細胞の個々の多卵胞プール中の11β-HSD活性と顆粒膜黄体細胞の多患者プールの11β-HSD活性との比較二つの独立した実験では、顆粒膜黄体細胞の多患者プールの11β-HSD活性はそれぞれの患者からの細胞の適当な多卵胞プール中の活性の相当する相加平均よりも有意に低かった（表２）。表２は二つの独立した実験における各患者からの細胞の構成的多卵胞プールの 11β-HSD活性に対する細胞の多患者プールの11β-HSD活性（ｐ molのコルチゾン／mgタンパク質、４時間）の関係を示す（^*多患者プール値vs個々の患者の多卵胞プールに関する相当する相加平均についてP<0.05;ｔ−検定）。表２結論 IVF用の卵母細胞の選択に関する主パラメーターは、卵丘−卵母細胞複合体(CO C)の形態学的外観に基くスコアリング系により評価したときのそれらの成熟度であった。卵巣11β-HSD活性の測定は所定の患者のIVF-ETの成果を評価するのに更に客観的なパラメーターを与え得ることが最近提案された^13,15。これらの実施例では、顆粒膜黄体細胞の11β-HSD活性が所定の患者からの異なる卵胞中で著しく変化し（検出不能から４時間当たり500p mol/mgタンパク質を越えるまで）、11β-HSD活性はそれぞれの卵胞内に含まれる卵母細胞の成熟度とは無関係であった。従来、卵巣11β-HSD活性は数種の異なる卵胞から吸引された顆粒膜黄体細胞の全てから誘導された細胞のプール中でそれぞれの患者について測定されていた。検出可能な卵巣11β-HSD活性による101サイクルのいずれもが臨床妊娠と関連しなかったが、「11β-HSD陰性」細胞による71サイクルに関する臨床妊娠率は63％であった^13,15。ここに提示された知見は、プールされた顆粒膜黄体細胞の卵巣1 1β-HSD活性が個々の卵巣卵胞中の11β-HSD活性の単なる反映ではないことを示す。プールされた細胞の酵素活性は個々の卵胞で測定された11β-HSD活性の平均よりも一貫して低かった。実際に、３人の患者のうちの２人では、プールされた細胞の活性は、高い酵素活性を有する個々の卵胞からの細胞の包含にもかかわらず、ラジオメトリック変換アッセイの検出限界以下に抑制された。それ故、ヒト顆粒膜黄体細胞のプールは、構成的卵胞の全てが「11β-HSD陽性」である場合に高い11β-HSD活性を発現することが提案される。逆に、一つ以上の卵胞が低い11 β-HSD活性を有する顆粒膜黄体細胞に寄与する場合、細胞の多卵胞プールの活性はその他の構成的卵胞中の酵素活性に関係なく、低い／検出不能であろう。低い11β-HSD活性を有する細胞の同時培養が異なる卵胞／患者からの細胞の高い酵素活性を抑制するのに必要であるか否か、または低い11β-HSD活性を有する細胞が近隣細胞の酵素活性を抑制することができる拡散可能な物質を有する、または生産し得るか否かは未だ確かめることができない。これらの知見は、低い11 β-HSD活性を有するヒト顆粒膜黄体細胞が、さもなくば適度〜高い11β-HSD活性を示す細胞において糖質コルチコイド代謝を抑制するパラクリン作用をin vitro で発揮することを単に示唆する。腎臓の11β-HSD活性の調節の研究では、肝臓11β-HSDおよび５β−還元酵素の両方の活性を抑制することができる化合物が尿中で同定されていた²⁰。これらの酵素の抑制はグリシレチン酸（それ自体でカンゾウの活性成分であるグリシルリジン酸の主代謝産物¹⁷）の特徴であるので、この尿化合物は「グリシレチン酸様活性」を有すると言われていた。これらの抑制特性の原因の一種以上の正確な尿化合物を精製し、同定する試みにもかかわらず、この物質の正体は知られていないままであり、その化合物はグリシレチン酸様因子(GALF)と称され続けている。 GALFの分子の正体はわかりにくいと判明したが、GALFの排泄は妊娠で増加することが知られており²⁰、これは妊娠関連高血圧の寄与原因であり得る²⁶。 GALFの他に、胆汁酸塩^4,25、コレステロール⁴、ラノステロール⁴および幾つかのステロイドホルモン^10,24が肝臓（低親和性、NADP⁺依存性、１型11β-HSD活性）、遠位ネフロンおよび胎盤（高親和性、NAD⁺依存性、２型11β-HSD活性）の両方で11β-HSD活性を調節することが示されていた。それ故、卵巣11β-HSD活性の低レベルはin vitroでのヒト顆粒膜黄体細胞による性ステロイド（例えば、プロゲステロンおよびエストラジオール）の増大された生産と関連している可能性があり、かつこの関係がここで報告された観察により示された卵巣11β-HSD活性のパラクリン抑制の基礎を形成する可能性がある。実際に、培養されたヒト顆粒膜黄体細胞中で、プレグネノロンおよびプロゲステロン（エストロンまたはエストラジオールではない）が11β-HSD活性を抑制することができることが実証されている³¹。卵巣11β-HSDが少なくともin vitroでパラクリン（そしておそらく自己分泌）抑制を受け易いかもしれないという徴候に鑑みて、ここに提示された知見は、IV F-ETによる受胎の増大された可能性が卵巣11β-HSD活性の低レベルと関連するだけでなく、それぞれの患者について分析されたヒト顆粒膜黄体細胞の多卵胞プール中の11β-HSD活性を抑制することができる一種以上の化合物の増大された生成と関連するという可能性を提案する。この別の仮説は妊娠中の尿GALFの増大された排泄²⁰と確かに一致するであろう。現在まで、11β-HSDの２種のイソ型が同定されており、そのうちの最も特性決定されたものは肝臓イソ型、11β-HSD1であり、これは補因子としてNADP(H)を優先的に利用し、その11β-デヒドロゲナーゼ活性について超生理学的(supraphysi ological)Ｋ_mを有し(コルチゾールに関するＫ_m=17μＭ;コルチコステロンに関するＫ_m=約２μＭ)、その代わりに生理的濃度のコルチゾンをコルチゾールに変換する11-ケトステロイド還元酵素(11KSR)として主として作用する（コルチゾンに関するＫ_m=140-272nM）^9,17,19。対照的に、遠位ネフロンでは、糖質コルチコイドがコルチゾールおよびコルチコステロンに対してかなり高い親和性（それぞれ、Ｋ_m=40nMおよび26nM）を有する11β-HSDの異なる腎臓イソ型により代謝される。11β-HSD2と称される、このイソ型は高親和性11β-デヒドロゲナーゼとして主として作用し、補因子としてNAD⁺に対する絶対的要求を示す^24,21,11,3 ^2,28 。加えて、11β-HSD2は合成糖質コルチコイド、デキサメタゾンを代謝することができ^2,29、グリシレチン酸の誘導体によるだけでなく、11β-デヒドロゲナーゼ作用の最終生成物（即ち、コルチゾンおよび11-デヒドロコルチコステロン）による抑制を受け易い^2,28。11β-HSD2は最近クローン化され、配列決定され^1,2、ヒト卵巣を含む、腎臓以外の組織中で発現されることが示された。ヒト顆粒膜黄体細胞中で発現された11β-HSDのこれらのイソ型を特性決定する初期の試みでは、11β-HSDの少なくとも２種の異なるイソ型の同時発現を示唆する生化学的証拠が得られ、そのうちの一種は11β-HSD2について報告された親和性¹⁴と同様のコルチゾールに対する高い親和性を有する。加えて、予備ノーザンブロットはヒト顆粒膜黄体細胞培養物中の11β-HSD1 ｍＲＮＡの発現を実証し¹⁴ 、ヒト顆粒膜黄体細胞中で作用する11β-HSDの一種より多いイソ型があるかもしれないという考えを支持する。それ故、これら中の11β-HSD活性のアッセイに使用される条件が卵胞液中で測定された濃度の典型的なコルチゾールの濃度(100nM )で無傷細胞によるコルチゾールからコルチゾンの不活化の正味の速度を測定するように選択されたことを知ることが重要である^6,7。コルチゾール代謝のこの正味の速度は、11β-HSDのどのイソ型が所定の培養物中で優勢であるのか、および11β-デヒドロゲナーゼと所定の培養物中で発現された11β-HSDのこれらのイソ型の11KSR活性の間の相対的バランスに明らかに依存するであろう。実際に、所定の卵胞または顆粒膜細胞のプール中の低い「11β-HSD活性」は、一種以上の 11β-HSDイソ型の11KSR活性が、11β-デヒドロゲナーゼ活性により生成されるコルチゾンが直ちにコルチゾールに逆に還元されるような程度に、優勢である細胞の存在を反映することができた。要するに、これらの実験は、個々の卵巣卵胞の11β-HSD活性が著しく変動することができ（卵母細胞の成熟度にかかわらず）、ヒト顆粒膜黄体細胞中の卵巣11 β-HSD活性のパラクリン抑制にかかわっていることを証明する。実施例３ IVFに関する卵母細胞回収を受けている婦人の卵巣卵胞から吸引された卵胞液は、in vitroで培養されたヒト顆粒膜黄体細胞に添加された時に、11β-HSD活性を抑制することができる少なくとも一種の化合物を含むことがわかった（表３）。卵胞液中に11β-HSD阻害剤が存在するか否かを試験するために、女性からのサンプルの採取後に、卵胞液を顆粒膜黄体細胞から分離し、これを別々に培養し(7 2時間)、その後卵胞液にもどして接触させた。低い卵巣11β-HSD活性を有する患者から分離された卵胞液は高い卵巣11β-HSD活性を有する患者から得られた卵胞液よりも大きな程度にコルチゾールのヒト顆粒膜細胞酸化を抑制することがわかった（また、表３を参照のこと）。これらのデータは、ヒト卵巣卵胞液が卵巣11 β-HSD活性の一種以上の内在性阻害剤を含み、かつこのような化合物の含量がこれらの液体サンプルが得られた患者中の卵巣11β-HSD活性とは逆の相関関係にあることが明らかである（すなわち、低い卵巣11β-HSD活性と関連する卵胞液は更に大きい内在性11β-HSD抑制活性を含むことが明らかである）という仮説と一致する。低い卵巣11β-HSD活性はIVF-ETによる受胎の高い可能性と関連し得るので、卵巣中の11β-HSD活性の高濃度の一種以上の内在性阻害剤は同様に受胎を予測できるかもしれない。実施例４卵巣卵胞液中に見られる実施例３に記載の化合物はまた、ホモジナイズされたラット腎臓の激しい（30分間）インキュベーションに添加された時、腎臓11β-H SD活性を抑制することができ（表４）、かつ抑制の程度が低い卵巣11β-HSD活性と関連する卵胞液中で大きいことが確認された。こうして、この実験はラット腎臓のホモジネートを使用して生物学的液体、（例えば、卵巣卵胞液）中の11β-HSDの内在性モジュレーターについてアッセイすることの実施可能性を実証する。表３無傷の顆粒膜細胞中の11β-HSDに対する10％卵胞液の効果表４腎臓11β-HSDに対する10％卵胞液の効果表３および４の脚注卵胞液が回収された特定のIVFサイクルで低いまたは高い卵巣11β-HSDを有すると既に確認された患者からプールされた10％(v/v)卵胞液（FF）サンプルでin vitroで処置された(a)培養されたヒト顆粒膜黄体細胞（表３）および(b)ラット腎臓ホモジネート（表４）に関する11β-HSD活性（それぞれ４時間および30分間にわたるコルチゾン［Ｅ］へのコルチゾール酸化の速度）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マイケル，アンソニーイギリス国エヌダブリュ３２ピーエフロンドン，ローランドヒルストリート（番地なし）ユニバーシティーオブロンドン，ロイヤルフリーホスピタルスクールオブメディシン

Claims

【特許請求の範囲】１．体外受精(IVF)の成果を予測する、またはその成功の見込みを評価する方法であって、（a）雌性個体から得られた１以上の生物学的サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11β-HSD)のモジュレーターのレベルを測定し、そして（b）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、IVFによる該個体の妊娠を達成する可能性または見込みを予測する、ことを含んでなる方法。２．雌性個体における体外受精(IVF)の成果を予測する、またはその成功の見込みを評価する方法であって、（a）雌性個体から１以上の生物学的サンプルを採取し、（b）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11β- HSD)のモジュレーターのレベルを測定し、そして（c）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、IVFによる該個体の妊娠を達成する可能性または見込みを予測する、ことを含んでなる方法。３．雌性個体におけるIVFの成功の可能性を確立する方法であって、（a1）雌性個体から１個以上の卵母細胞を生物学的サンプルと共に採取し、（a2）in vitroで該卵母細胞を受精させ、（b）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11β- HSD)のモジュレーターのレベルを測定し、そして（c）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、IVFによる該個体の妊娠を達成する可能性または見込みを予測する、ことを含んでなる方法。４．雌性個体におけるIVF処置の成功の可能性を確立する方法であって、（a）雌性個体から１個以上の卵母細胞を生物学的サンプルと共に採取し、（b）該サンプル中の11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11β- HSD)のモジュレーターのレベルを測定し、（c1）測定した11β-HSDモジュレーターのレベルから、IVFによる該個体の妊娠を達成する可能性または見込みを予測し、そして（c2）11β-HSDモジュレーター活性が予め決定された閾値レベルより高いまたは低い該個体から得られた卵母細胞を受精させる、ことを含んでなる方法。５．前記（または各）サンプルが卵母細胞の周囲からの組織、細胞および／または体液を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．前記サンプルが卵胞吸引液を含む、請求項５に記載の方法。７．前記（または各）サンプルが顆粒膜黄体細胞および／または卵胞液を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．存在するモジュレーターのレベルが11β-HSD活性のレベルを参考にすることで決定されるか、または11β-HSD活性のレベルと相関している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．11β-HSDのレベルがコルチゾールのコルチゾンへの変換速度を測定することで決定される、請求項８に記載の方法。 10．複数の生物学的サンプルが体外受精サイクルの異なる時期に提供されるか、または前記個体から採取され、各サンプルにつきモジュレーターのレベルが測定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 11．少なくとも２つのサンプルが連続した日に採取される、請求項10に記載の方法。 12．11β-HSD活性の（経時的）低下が11β-HSD活性の一定レベルまたは増加レベルより高い妊娠の可能性を示す、請求項10または11に記載の方法。 13．複数の生物学的サンプルが提供されるか、または前記個体から採取され、そしてモジュレーターのレベルの決定が、（i）少なくとも２つのサンプル中の11β-HSDのモジュレーターのレベルを測定し、そして (ii)少なくとも２つのサンプルの混合物中の11β-HSDのモジュレーターのレベルを測定する、ことを含んでなる、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。 14．Δの値を決定するための、（i）で測定された全モジュレーターレベルの平均と(ii)で測定された該レベルとの比較が、（モジュレーターが、存在する場合、11β-HSDの阻害剤であろうとアゴニストであろうと）モジュレーターの存在および／またはモジュレーターの存在量を示すことができる、請求項13に記載の方法。 15．前記モジュレーターが11β-HSDの阻害剤である、請求項１〜14のいずれか１項に記載の方法。 16．前記阻害剤がグリシリジン酸、グリシリジン酸様因子(GALF)、プレグネノロンまたはプロゲステロンである、請求項10に記載の方法。 17．雌性個体が雌性ヒトである、請求項１〜16のいずれか１項に記載の方法。 18．（d）受精した卵母細胞を雌性個体に移植する、ことをさらに含む、請求項３〜17のいずれか１項に記載の方法。 19．各サンプルが卵巣の異なる部分から採取された顆粒膜黄体細胞および／または卵胞液を含む、請求項13〜18のいずれか１項に記載の方法。 20．予め決定された閾値レベルが１時間あたりタンパク質１mgにつき³H-コルチゾールを³H-コルチゾンに変換する速度として測定される、請求項４〜19のいずれか１項に記載の方法。 21．雌性集団をIVFに対するそれらの適性についてスクリーニングする方法であって、（a）IVFによる不妊治療を希望する雌性個体の集団を、11β-HSDのモジュレーターのレベルについてスクリーニングし、そして（b）該集団から、IVF処置のために予め決定された閾値より高いかまたは低い11β-HSDモジュレーターレベルをもつ個体を選択する、ことを含んでなる方法。 22．後続の排卵周期において予め決定された閾値レベルより高い11β-HSDモジュレーターレベルをもつ個体を再スクリーニングすることをさらに含む、請求項 21に記載の方法。 23．雌性個体の受精能治療法において使用するための、11β-HSDモジュレーター検出用試薬を少なくとも１種含んでなるキット。 24．雌性個体におけるIVFによる妊娠を達成する可能性を予測するための11β- HSDモジュレーター検出用試薬の使用。 25．（a）雌性個体から１以上の生物学的サンプルを採取し、そして（b）該サンプル中に存在する11β-HSDモジュレーターの正体を同定する、ことを含んでなる同定方法。 26．妊娠の見込みまたはIVFの成功の可能性を高める方法であって、（a）任意に、雌性個体から１以上の生物学的サンプルを採取し、（b）該サンプルの１つに存在する阻害剤またはアゴニストの正体を同定し、そして（c）該雌性個体に、ある量の該阻害剤、またはある量の、該アゴニストの活性を妨害、抑制または阻止する化合物（妊娠促進化合物）を投与する、ことを含んでなる方法。 27．妊娠の可能性を高めるのに使用するための請求項26に記載の方法により同定された阻害剤。 28．IVFにおいて妊娠の可能性を高める医薬組成物を製造するための11β-HSD阻害剤の使用。 29．避妊方法であって、（a）雌性個体から採取した１以上の生物学的サンプル中の11β-HSDの阻害剤またはアゴニストの正体を同定し、そして（b）該個体に、ある量の該アゴニスト、またはある量の、該阻害剤の活性を妨害、抑制または阻止する化合物（避妊化合物）を投与する、ことを含んでなる方法。 30．避妊薬を製造するための11β-HSDアゴニストまたは（請求項29に記載の）避妊化合物の使用。 31．妊娠促進化合物または避妊化合物の同定方法であって、（a）ある量の11β-HSDと候補物質とを接触させ、そして（b）該物質が11β-HSD活性をモジュレートするのに及ぼす（もしあれば）効果を測定する、ことを含んでなり、活性の抑制（または低下）は潜在的妊娠促進作用を示し、一方、活性の増加は潜在的避妊活性を示すものである方法。 32．妊娠の可能性または見込みを高める方法であって、（a）任意に、雌性個体から卵母細胞を採取し、そして（b）採取した卵母細胞を11β-HSDの阻害剤または（請求項26に記載の）妊娠促進化合物で処理する、ことを含んでなる方法。 33．（c）(b)で処理する前または後に該卵母細胞を受精させ、そして（d）受精した卵母細胞を雌性個体に移植する、ことをさらに含む、請求項32に記載の方法。