KR100962542B1 - 정액 평가에 의한 돼지의 산자 수 예측방법 - Google Patents
정액 평가에 의한 돼지의 산자 수 예측방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 정액 평가에 의한 돼지의 산자 수를 예측하는 새로운 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 체외 정자 침투 분석(SPA)을 이용하여 돼지의 산자 수를 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 절차의 각 단계를 최적화시킨 후 체외에서 정자 침투 분석을 이용하여 수컷의 체내 수정을 예측하는 새로운 방법으로서, 적은 수 또는 많은 수의 산자 수 생산에 있어 우수한 능력을 가진 개체를 보다 정확하게 예측할 수 있다.
정액 평가, 돼지 산자 수
Description
본 발명은 정액 평가에 의한 돼지의 산자 수를 예측하는 새로운 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 체외 정자 침투 분석(SPA)을 이용하여 돼지의 산자 수를 예측하는 방법에 관한 것이다.
돼지 인공수정은 양돈시장에서 개량을 촉진시키기 위한 수단이며, 번식성적 향상, 경영비용 절감, 노동력 감소, 질병전파 방지의 목적을 가지며 지난 15년간 그 이용률이 약 3배 이상 상승하였다.
그러나 이용실적에 비해 성적이 저조하며, 특히 번식성적에 대한 결과가 매우 변이가 크며, 인공수정의 양적인 보급률은 급속 증가하였으나, 효율적 이용과 개량을 위한 효과적 활용이 미흡한 실정이다.
양적인 보급률에만 치중된 발달에 의해 센터에서 판매되는 정액의 품질에 대한 불만으로 인해 농가에서는 자연종부를 시키는 빈도가 늘어나고 있다. 따라서 인 공수정의 효율적 이용과 효과적 활용을 위해 우수한 품질의 정액 확보가 시급한 문제로 대두되고 있다.
그러나 정자의 품질을 검사하는 방법이 매우 주관적인 실정이며, 인공수정센터등에서 시행되고 있는 정자의 품질 검사는 정자의 운동성 검사이다. 정자의 운동성 검사만으로는 정확도 높은 수정능력의 예측이 어려우며, 정자의 품질을 입증할 수 있는 지표가 될 수 없다. 인공 수정센터은 외국의 웅돈을 수입도 하지만 주로 국내 종돈장과의 연계로 웅돈을 확보하고 있으나 많은 인공 수정센터들의 필요 웅돈 숫자를 감안해 보면 국내 종돈장에서 생산되는 웅돈으로는 그 수가 부족한 실정이므로 산자 생산율이 높은 종돈이 불가피하며, 우수종돈 마련을 위한 외국의 정액 수입시 객관적 검사 지표 부재로 반박 자료가 없어 저질의 정액을 강매 당할수도 있다.
전국 모돈 사육두수 100만두를 기준으로 볼 때 연 2.5회의 분만한다. 기개발된 기술을 이용하여 분만 1회당 2두의 산자를 추가적으로 생산할 수 있으며 연 총 2,500억원의 이익을 예측할 수 있으며(2두X2.5회X50,000원X100만두), 인공수정센터에서 이 기술을 도입하여 산자생산능력이 높은 정액 품질의 차별화를 통해 연 20억 이상의 이윤을 추가 창출할 수 있을것으로 예측된다. 또한 산자수를 미리 예측할 수 있으므로 안정적인 돼지생산에 크게 기여할 수 있다.
한편, 종래 돼지의 배포단계 (germinal vesicle stage)에서 투명대가 온전한 난자(Martinez et al., 1993; Matas et al., 1996; Gadea et al., 1998) 또는 체외 성숙된 난자를 이용한 체외수정(Xu et al., 1996), 반투명대 결합 분석 (hemizona binding assay) (Fazeli et al., 1995), 온전한 돼지 난자 또는 저장된 돼지 난자에 대한 정자 결합(Lynham and Harrison, 1998)등을 포함한 수컷 정자의 수정 능력을 평가하는 많은 분석들이 좋은 도구로서 보여줘 왔다. 체외 수정 시스템은 돼지에서 정자의 수정 능력 예측에 유용하다고 밝혀진 방법 중의 하나이다. Xu등은 난자에 붙은 정자의 숫자와 산자 수 사이에 유용한 관계가 있는 결과를 확인했다. 온전한 투명대가 있는 돼지 난자를 이용한 동종 체외 수정 (hIVP)은 수컷의 수정 능력을 평가하는 유용한 도구 중의 하나로 보여주었다. 온전한 투명대 돼지 난자는 체외 성숙 또는 배란된 난자에서 관찰되는 난자들과 유사한 투과능 정도를 보여주었다 (Gadea and Matas, 2000). Gadea and Matas (2000)는 hIVP가 체내 수정을 예측하는데 정상역(normal range)의 하한점(cut-off value)를 75%로 결정하였다. 이방법의 정확성은 74.17%였다. 비록 Berger등은 (1996) 수정 기록들과 정자-투명대 결합 능력 사이에 관련이 없다고 보고 하였지만, 그들은 투명대가 없는 햄스터 난자의 세포질로 정자가 침투하는 능력이 임신 기록과 관련이 있음을 보여주었는 바, 상기 Gadea and Matas 가 제시한 수치는 지금까지는 매우 정확한 예측 수치에 해당한다.
또한, 정자 수정능의 예측은 인공수정이 적용될 때 동물번식에 대한 매우 중요하다 (Gadea, 2005). 전통적인 정액 분석은 정액 그 자체에 대한 양적 정보를 제공하고, 정자의 운동성, 정상 형태를 가진 정자의 비율, 그리고 농도가 단위 량으 로 관련 된다. 이런 분석들이 가치가 있는 양적 자료를 제공할지라도, 그것들은 정자의 기능적 능력에 대한 정보를 도출하지 못한다 (Chang et al., 1990; Johnson et al., 1990; Petrunkina et al., 2007).
전통적인 정액 분석의 약점을 보완하기 위하여, 정자의 기능성과 수정능을 평가하기 위한 평가들이 동물과 사람에서 경제학적으로 중요하여 개발되어 왔다. 정자의 고활력 운동성, 손상되지 않은 첨체, 수정능 획득 능력, 정상 DNA 상태, 투명대에 결합하는 능력, 난자와의 결합과 같은 복잡한 수정 과정에 관련된 현상 중 하나 혹은 몇 단계만의 정보를 제공한다. 현재 이런 평가들은 정자의 기능과 수정능을 완벽하게 반영하지는 못하고 있는 실정이다(Gadea and Matas, 2000; Johnson et al., 2000; Lewis, 2007; Rodriguez-Martinez, 2003). 그러므로 체내 수정능 (in vivo fertility)을 정확히 예측할 수 있는 새로운 정자의 분석방법이 절박히 요구되고 있다 (Petrunkina et al., 2007).
정자의 수정능을 평가하는 한가지 명확한 방법은 정자가 실제로 체외에서 동종 난자와 수정하는지를 확인하는 것이다 (Xu et al., 1996). 그러나 체외 투과능과 체내 수정능 사이에 관련성에 대하여 소 (cattle)에서 상반된 결과가 보고되고 있다 (Kruip et al., 1992). 이런 상반된 결과는 동종 체외 수정 (IVF)방법이 포유동물의 정자의 침투를 평가하는데 사용하기 전에 최적화 및 표준화 되어야 한다는 것을 의미한다(Roca et al., 1998). 투명대가 있는 미성숙 난자는 체외에서 배란되거나 성숙된 난자들에서 보이는 것과 유사한 침투능력을 보여준다. (Matas et al., 1996). 정자 수정능 분석에서 동종 미성숙 난자를 사용하므로 체외 성숙에 필요한 시간을 절약할 수 있었다 (Martinez et al., 1996). 이 방법을 이용한 결과에서 수태율과 어느 정도의 관련만이 있었다.
많은 연구자들이 정자 침투 분석 (SPA)의 변형 방법을 정자의 수정능력을평가하기 위하여 투명대가 없는 햄스터 난자를 사용하여 보고하였다. 많은 연구실에서 수정능 분석을 위해 사용하는 비교적 공통적인 방법은 사람 (Chang et al., 1990; Sofikitis et al., 2000; Wiland et al, 2002), 소 (Eaglesome and Garcia, 1990), 토끼 (Rajeev and Reddy, 2004) 정자를 투명대 제거 햄스터 난자를 이용한 이종간 정자 침투 분석이였다. 정자 침투 분석 (SPA)이 정자의 수정능 테스트로 널리 주목받는 동안, 정상 수정을 구성하는 침투 수준의 정상범위, 분석간 차이 그리고 정도관리 (quality control)의 부족이라는 바이오 분석 시스템의 본질적인 (inherent) 문제점이 있어왔다.
수정능 획득과 연속적인 첨체 반응은 체외에서 침투 분석에 있어서 필수적이다. 그러므로 체외에서 정자 수정능 분석의 정확도와 신뢰도를 개선하기 위하여 각 절차를 최적화하고, 적절한 정도관리를 포함하는 것이 필수적이다. 이에 본 발명자들은 체외에서 정자 침투 분석을 이용하여 수컷의 수태율을 예측하는 새로운 방법을 개발하고 최적화하였는바, 분석의 민감도를 증가시키기 위하여 절차의 각 단계는 최적화 되었고, 정도관리 (quality control)가 적용된 SPA를 이용하여 높은 정확도를 갖는 돼지 산자 수 예측방법을 개발하기에 이르렀다.
이러한 본 발명의 연구는 대한민국 농림부의 "Biogreen 21사업"에 의해 지원되었다.
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본 발명의 목적은 정액 평가에 의한 돼지의 산자 수 예측방법을 제공하고자 하는 데 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 목적은 절차의 각 단계를 최적화시키고, 정도관리 (quality control)가 적용되도록 한 체외에서 침투 분석을 이용하여 정자의 수태율을 예측하는 새로운 방법을 개발하고 최적화하는 데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은, 수컷 돼지로부터 채취한 정액으로부터 얻은 정자를 헤파린 처리 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 정자세포를 헤파린 처리 배지에서 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양하는 단계; 및 난자당 침투된 정자의 수 및 전핵의 수를 측정하여 체외 정자 침투를 분석하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능력 예측 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 수정능력 예측은 돼지 산자 수 (litter size)를 에측하는 것임을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 상기 돼지 산자 수의 예측은 하기 수학식 1로 나타내는 SFI가 1.2 보다 작거나 같으면 8마리 이하의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측할 수 있음을 특징으로 하고, SFI가 2.5 보다 크면, 10마리 이상의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측할 수 있음을 특징으로 한다.
<수학식 1>
SFI = {난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)}/공시된 난자의 수
더욱 바람직하게는, 동결된 소의 정액 샘플에 대하여 상기 체외 정자 투과능 분석방법을 동시에 실시하여, 돼지 정자 수정능력 예측의 대조군으로 이용함으로써 분석시 정도관리 포함함을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 헤파린 처리 배지는 불활성화 태아 소 혈청과, 소디움 피루베이트, D-글루코스, 칼슘 락테이트, 페니실린 G 및 스트렙토마이신 설페이트를 첨가한 배지에 헤파린을 처리한 것임을 특징으로 하는 것을 더 포함하며, 상기 헤파린 배지에서 정자의 배양은 39℃에서 30분간 배양됨을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양함에 있어서, 상기 정자가 2x108cells/ml의 농도로 헤파린 배지에 희석되도록 하여 배양되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 공배양은 39℃, 5% 이산화탄소 환경 하에서 2 내지 4시간 동안 공배양되도록 한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은, 매우 잘 훈련된 테크니션 의해서 각 발정 주기에 두 번의 인공수정을 실시한 경산돈을 이용함으로써 보여줄 수 있는 모든 변수들을 제거하였는 바, 테크니션, 돼지의 산차, 발정기간 동안 수정의 회수가 관련이 있는 모든 변수들을 제외하여 예측방법의 정확도를 높일 수 있도록 한 다음,
또한 본 발명에서는 정자 침투 분석법 (SPA)을 최적화하고, SPA 절차의 각 단계에서 민감도를 높이기 위해서 테스트하여, 좋고 나쁜 수정을 보여주는 수컷들 사이의 분별력을 증가시키기 위하여, 최대 정자 침투 (넓은 침투 범위)를 발생할 수 있는 조건을 확립하였다.
즉, 투명대 제거 햄스터 난자와 미성숙 돼지 난자의 최대 침투는 헤파린 처리된 정자 세포에서 도출되었고, 투명대 제거 햄스터 난자는 미성숙 돼지 난자보다 유의적으로 더 높은 침투를 보여주었으며, SCI와 SFI의 비교는 SFI가 더 넒은 범위의 침투를 보여주었다.
따라서, 본 발명은 수컷 돼지로부터 채취한 정액으로부터 얻은 정자를 헤파린 처리 배지에서 배양하는 단계; 상기 배양된 정자세포를 헤파린 처리 배지에서 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양하는 단계; 및 난자당 투과한 정자의 수 및 전핵의 수를 측정하여 체외 정자 침투를 분석하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능력 예측 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 동결된 소의 정액 샘플에 대하여 상기 체외 정자 침투 분석방법을 동시에 실시하여, 돼지 정자 수정능력 예측의 대조군으로 이용함으로써 분석시 오류를 제거하거나 확인하는 단계를 더 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 SPA가 가지고 있는 고질적인 문제점중의 하나인, 정도관리의 부재와 분석시 오류를 제거하기 위하여, 중 정도의 수정 능력이 있는 소 두 마리의 동결정액을 이용하였다. 여덟 번의 정도관리 간에 통계적으로 유의적 차이는 관찰되지 않았다. 이것은 본 발명에 사용된 SPA가 본 발명의 방법을 통하여 일정하다는 것을 보여주는 것으로서, 동결된 소의 정액은 SPA시행시 효용성있는 대조 표준정자임을 보여주었다.
또한 본 발명은 바람직하게는 상기 수정능력 예측이 돼지 산자 수 (litter size)를 에측하는 것임을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 상기 돼지 산자 수의 예측은 하기 수학식 1로 나타내는 SFI가 1.2 보다 작거나 같으면 8마리 이하의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측할 수 있음을 특징으로 하고, SFI가 2.5 보다 크면, 10마리 이상의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측할 수 있음을 특징으로 한다.
<수학식 1>
SFI = {난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)}/공시된 난자의 수
본 발명의 일 실시예에서는, SFI가 평균 산자 수 기록과 유의적으로 관련이 있다는 것을 발견하였으나, 흥미롭게도, SFI는 분만율과는 유의적이 관련이 없음을 확인할 수 있었다.
또한 다른 분석을 이용한 이전 결과들은 분만율이 아니라 수컷 투명대 결합 능력과 산자 수 사이에 관계가 있다고 보고(Braundmeier et al., 2004)한 바 있고, Xu (1998)등은 산자 수는 분만율보다 수정능력에 대한 좀 더 정확한 측정이 될 수 있다고 하였으며, Braundmeier (2004)등은 이 현상에 대해서 가능한 설명을 제안하였으나, 분만율의 측정은 단지 두 가지 가능한 결과인 임신 혹은 비-임신을 보여줄 뿐이다.
반면에 본 발명의 수정능 예측은 산자 수를 예측할 수 있도록 함으로써, 수컷의 수정능 상태에 좀 더 정확한 수치를 제공할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 최적화된 SPA에 대한 정상 범위를 결정하였는 바, 적은 수의 산자 수 (8마리 이하) 에 대해서는 SFI는 1.2, 많은 수의 산자 수(10마리 이상)에 대해서는 SFI가 2.5인 것이 하한으로 확립되었다. 분석의 전체적인 정확도는 기존의 예측확률 (75%)에 비해 현저하게 상승된 각각 92% (적은 수의 산자), 96% (많은 수의 산자)임을 확인할 수 있었다.
본 발명은 SPA에 대한 절차를 최적화하였고, 결과적으로 적은 수 그리고 많은 수의 산자 수를 생산하는 수컷을 찾아낼 수 있는 민감도를 증가시켜 돼지 산자 수를 예측할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의하여 좋고 나쁜 수정능을 가진 수컷들을 구별할 수 있으며, 많은 수 및 적은 수의 산자 수를 생산하는지 여부에 대한 등급을 부여할 수 있다. 따라서, 정자의 수정능과 침투에 대한 조건이 체내에서 매우 다를지라도, 본 발명의 방법은 수정능, 첨체 반응, 수정, 성공적 임신을 할 수 있는 정자의 능력에 관한 의미 있는 정보를 제공할 수 있을 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
<
실시예
1 재료 및 방법>
1-1 배지와
완충액의
준비
(1) 배지
Earles salts가 있는 배지 199에 10% 불활성화된(heat-inactivated) 태아 소 혈청과, 0.91 mM 소디움 피루베이트 (sodium pyruvate), 3.05 mM D-글루코스, 2.92mM 칼슘 락테이트(Calcium lactate), 50 IU/l 페니실린 G, and 30 μg/ml 스트렙토아미신 설페이트 (streptomycin sulphate)가 첨가되었다. 헤파린 (10 μg/ml) 이 헤파린 처리를 위한 기본 배지에 첨가되었다.
(2)
트리스
요크
완충액
(
Tris
yolk
buffer
(
TYB
))
증류수에 211mM TES (N-tris methyl-2-aminoethan sulfonic acid), 96mM Tris (hydroxymethylaminomethane), 11mM 덱스트로스 및 신선한 달걀 노른자 (egg yolk) (v/v) 가 첨가되었고, 최종적으로 pH는 7.4로 삼투압은 300 mOsmo/kg로 되었다.
1-2 정자 준비
(1) 최적화를 위한 정액준비
최적화된 hIVP와 SPA 정확도를 계산하고, 정상 범위를 결정하기 위하여, 상품화된 정액 샘플이 사용되었다. 듀록 수컷으로부터 전체 정액 샘플을 gloved hand technique을 이용하여 주 간격 (weekly interval)으로 수집되었고, 면 거즈(cotton gauze)을 통하여 필터를 하여 미리 25℃로 따뜻하게 된 플라스크에 모았다. 사정된 정자의 운동성은 80%이상이었다. 수컷의 정액 샘플들은 BTS 용액으로 희석되었고 17℃에서 보존되었다.
(2) 정자
투과능
분석을 위한 정액
수정능을 평가하기 위하여, 각각의 수컷으로부터 다섯 마리 이상의 산자 수를 가진 암컷의 수정능력을 평가하였다 (평균적으로, 각 수컷에 대해서 22.46회의 인공수정과 8.96의 산자 수를 보엿다).
하기 표 1의 수정능 결과들은 다비 육종 (Darby Genetics, Inc. 대한민국)로부터 받았다. 분만율과 산자수는 체내 수정능력 요소로서 사용되었다. 평균 분만율은 성공적으로 임신된 암컷의 비율으로서 각 수컷에 대해서 계산되었다. 각 수컷에 대한 평균 산자 수는 각 분만으로부터 태어난 전체 새끼돼지(살아있는 것과 죽은 것)의 숫자로서 계산되었다 (Braundmeier et al., 2004).
| 번호 | 암퇘지(sow)의 수 (sow-새끼낳은 적이 있는 암컷) | 분만율(%) | 산자수 | ||
| A | 27 | 100.00 | ±.00 | 5.50 | ±.39 |
| B | 6 | 100.00 | ±.00 | 6.38 | ±.24 |
| C | 26 | 100.00 | ±.00 | 6.80 | ±.60 |
| D | 42 | 100.00 | ±.00 | 7.50 | ±.94 |
| E | 12 | 75.44 | ±.61 | 7.69 | ±.69 |
| F | 8 | 100.00 | ±.00 | 7.70 | ±.12 |
| G | 74 | 33.78 | ±.03 | 7.81 | ±.64 |
| H | 153 | 58.17 | ±.66 | 8.19 | ±.42 |
| I | 82 | 37.80 | ±.98 | 8.58 | ±.58 |
| J | 98 | 40.82 | ±.14 | 8.75 | ±.61 |
| K | 16 | 100.00 | ±.00 | 8.98 | ±.53 |
| L | 33 | 72.89 | ±.11 | 9.00 | ±.22 |
| M | 42 | 100.00 | ±.00 | 9.20 | ±.42 |
| N | 84 | 72.62 | ±.77 | 9.23 | ±.45 |
| O | 115 | 44.35 | ±.22 | 9.41 | ±.47 |
| P | 33 | 82.00 | ±.97 | 9.50 | ±.47 |
| Q | 18 | 100.00 | ±.00 | 9.70 | ±.62 |
| R | 42 | 76.19 | ±.09 | 10.13 | ±.59 |
| S | 116 | 43.10 | ±.33 | 10.18 | ±.46 |
| T | 10 | 100.00 | ±.00 | 10.25 | ±.74 |
| U | 121 | 100.00 | ±.00 | 10.88 | ±.25 |
| V | 55 | 100.00 | ±.00 | 10.98 | ±.37 |
| W | 44 | 100.00 | ±.00 | 11.00 | ±.47 |
| X | 6 | 100.00 | ±.00 | 11.00 | ±.61 |
결과들은 평균 ± 표준오차들이며, 한 번 사정된 것을 기준으로 하였다.
암컷의 변수를 최소화하기 위하여, 연구에 사용된 암컷들은 2번 이상의 분만경력과 잘 훈련된 테크니션에 의하여 각 발정기에 2회 수정되었다. 비록 암컷의 수정회수가 적을지라도, 분만율과 산자수에 대한 표준오차는 많은 수정을 한 그룹과 비교하여 적은 수정을 한 그룹보다 더 높지 않았다. 즉, 본 발명에서는 모든 가능한 변수를 최소화한 것으로 판단된다.
최적화된 SPA의 정확도를 계산하기 위하여, 그리고 정상 범위를 결정하기 위하여, 24마리의 듀록 수컷으로부터 유래된 정액 샘플을 사용하였다. 이들 수컷의 전체 정액 샘플은 gloved hand technique으로 1 주 간격 (weekly interval)으로 채취되었고, 면 거즈 (cotton gauze)로 필터하여 25℃로 예열된 플라스크에 담았다. 모든 정액은 80%이상의 운동성을 보여주었다. 수컷의 정액 샘플은 BTS (Beltsville thawing solution)용액으로 희석되었고, 17도에서 보관되었다.
(2) 정자의 준비와 처치 (Preparation and treatment of spermatozoa)
정자 샘플은 50×g 속도로 3분간 원심분리를 통해 준비되었고, 정액 침전물은 0.4% BSA (bovine serum albumin)을 첨가된 PBS로 희석되었다. 이어서, 부유액은 1200×g로 3분간 원심분리되었고, 정자 침전물은 TYB (Tris-egg yolk buffer)와 헤파린으로 처리되었다. 그리고 나서 TYB는 미리 처치된 정자 침전물에 넣고, 이들은 4도에서 24시간 동안 배양되었고, 그리고 24도에서 30분간 배양되었다. 배양 후에, 정자는 1200×g속도로 3분간 원심분리하고, 정자 침전물은 TCM199배양액에서 2x106cells/ml 숫자로 희석되었다. 그리고 나서 정자는 미성숙 돼지 난자와 투명대가 없는 햄스터 난자와 같이 공배양 하였다.
전처치된 정자 침천물은 헤파린 배지와 섞었고, 30분 동안 39도에서 배양되었다. 배양 후에, 상층액은 1200×g 속도로 3분간 원심분리하였고, 정자 침전물은 2x106cells/ml의 숫자로 헤파린 배지에 희석되었다. 정자는 미성숙 돼지난자와 투명대 제거 햄스터 난자와 같이 공배양 하였다.
(3) 정도관리를 위한 정자의 준비와 처치 (Preparation and treatment of spermatozoa for quality control)
중 정도의 수정능을 가진 두 마리의 동결된 소의 정액 샘플을 대조 표준 정자(internal controls)로 이용되었다. 같은 시간에 동결된 개별 스트로 (straws)가 모든 실험기간 동안에 동시에 테스트 수컷 정액과 함께 분석되었다. 배양 시스템의 안정성을 평가하기 위하여, 두 마리의 동결 소 정액 샘플을 이용하였다. 정자 샘플은 1200×g 속도로 3분간 원심분리에 의해서 전 처치 되었고, 정자 침전물은 4%, BSA가 들어있는 PBS로 희석되었다. 부유액은 150×g 속도로 3분간 원심분리 되었고, 상층액은 1200×g 속도로 3분간 원심분리 되었다. 이어서, 정자 침전물은 2x106cells/ml로 TCM 199배지에 희석되었고, 39도에서 3시간동안 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양 되었다.
<실시예 2 미성숙 돼지 난자를 이용한 정자 투과능 분석 (Sperm penetration assay using immature porcine oocytes)>
돼지 난자들은 체중이 약 95kg인 암컷 (gilts: 분만경력이 없는 암컷)들은 지역도축장에서 도축된 후 신선한 난소는 100 ugl/ml, 스트렙토마이신 설페이트 ( streptomycin sulfate)가 들어있는 0.9% 생리식염수(36℃)에 담겨서 30분만에 이동되었고, 그로부터 난자가 채취되었다.
난자-난구세포 복합체 (COCs)는 18게이지 니들이 붙어 있는 10ml 주사기를 이용하여 2-7 mm 크기의 난포로부터 채취되었다. 난자-난구세포 복합체는 수컷 정자에 노출되기 전에 modified DPBS에서 세 번 세척하였다. 15개의 미성숙 난자들 그룹들은 24시간 동안 정자와 39℃, 5% 이산화탄소 환경에서 500 ul의 각 처리 배지가 들어있는 4-well 멀티디쉬에서 공배양 되었다.
공배양의 기간의 마지막 단계에서, 난자에서 난구세포와 정자는 제거되었고, 슬라이드 위에 마운트되었다. 그리고 에탄올:아세트산이 3:1 비율인 용액으로 최소 24시간 동안 고정되었다. 그 후에 난자들은 1% 락모이드(lacmoid)로 염색되었고, 위상차 현미경 (400배)으로 정자의 침투를 검사하였다.
<실시예 3 투명대 제거 햄스터 난자를 이용한 정자 침투 분석 (Sperm penetration assay using zona-free hamster oocytes)>
투명대 제거 햄스터 난자들은 발정 주기의 첫번째 날에 성숙된 골든 햄스터에 복강내로 PMSG와 hCG (각각 30 IU)를 48시간, 72시간째에 투여하고 회수하였다. 난관을 절개한후 난구세포 덩어리들은 절개된 난관들로부터 제거되었으며, 0.1% 하이알루로니데이즈와 0.1% 트립신으로 난구세포와 투명대를 각각 제거하였다. 난자들은 효소 처리 후에 PBS로 세 번 세척하였다.
각 10개의 햄스터 난자 그룹들은 39℃, 5% 이산화탄소 환경하에서 각 처리 배지 500ul가 들어있는 4-well 멀티디쉬에서 3시간 동안 정자와 공배양 되었다.
공배양 기간의 마지막 단계에서, 난자들은 슬라이드 위에 올려졌고, 에탄올:아세트산이 3:1 비율인 용액으로 최소 24시간 동안 고정되었다. 그 후에 난자들은 1% 락모이드(lacmoid)로 염색되었고, 위상차 현미경 (400배)으로 정자의 투과 증거를 검사하였다.
<실시예 4 정확도 계산 (Calculation of the accuracy)>
SPA로 얻어진 결과들은 정자 수정능 지수(SCI)로 표현되었다(Johnson et al., 1995).
SCI (Sperm Capacitation Index) = {난자당 투과한 평균 수(확대된 정자 머리수 + 응축되지 않은 정자 머리수)+ 난자당 전핵의 수}/공시된 난자의 수
또한 본 발명자들은 SFI라는 지수로 이용하여 표현을 하였다. SFI는 다음과 같이 계산된다.
SFI (Sperm Fertility Index) = {난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)}/공시된 난자의 수
상기 SFI는 난자내에서 침투된 정자의 활성화에 따른 다른 수치를 나타내는 데에 무게를 두어, 확대되고, 응축되지 않는 정자 머리보다 전핵에 두 배의 점수를 부여하였다.
네 개의 중요 요소들이 검사의 질을 평가하는데 관여하는데, 그것은 민감도, 정확도, 양성 예측치, 그리고 음성 예측치이다 (Evans et al., 2002) (도 1 참고).
민감도 (Sensitivity)는 비율을 결정하는 것이다. 그 비율은 적은 수 혹은 많은 수의 산자를 생산할 수 있는 모든 수컷을 정확하게 확인될 수 있다. 정확도 (Specificity)는 진짜 음성 수컷들의 비율이 테스트를 해서 음성으로 얼마의 비율이 나오는 가를 결정하는 것이다. 양성 테스트 결과를 가지고 있는 모든 수컷들 중에서, 적은 수 혹은 많은 수의 산자 수를 실제로 가지고 있는 비율 또한 중요한데, 이것인 양성 예측치 (positive predictive value)이다. 음성 예측치 (negative predictive value)는 실제로 적은 수 혹은 많은 수의 산자를 가지고 있는 음성 테스트 결과를 가진 수컷들의 비율을 말한다.
통계 (
Statistics
)
통계 분석은 SPSS 통계 프로그램 (버전 12.0, 미국)을 이용하여 수행되었다. 수정능 방법과 난자 출처의 비교는 one-way ANOVA를 이용하여 수행되었다. ANOVA에서 P 값인 < 0.05이면, turkeys HSD test가 수행되었다. 정도관리절차 (quality control procedure)의 모든 분석은 독립적으로 chi-squared 테스트를 이용하여 수행되었다. 피어슨 상관계수 (Pearson correlation coefficients)가 산자수, 분만율, 그리고 SFI사이의 관련성을 결정하는데 계산되었다.
결과 (
Results
)
1.
SPA
절차의 각 단계에 대한 최적화
도 1을 참고하면, 도 1은 SPA 결과에 대한 다양한 변수의 효과를 나타낸 것으로, 각 수정능 야기 방법 및 난자별로 비교하고 있는 평균 SCI/SFI (±표준오차)값을 나타내고 있다. (80에서 90개의 미성숙 돼지 난자가 각 처치 그룹에 사용되었고, 30-33개의 햄스터 난자가 세 그룹의 개별실험에서 각 처치 그룹당 사용되었다.)
아울러, SPA에 있어 분석 민감도를 높이기 위하여, 절차의 각 단계는 최적화 되도록 하였는바, 최적화의 목표는 최대 정자 투과능 (넓은 침투 범위)을 이끌어내는 조건을 확립하는 것이다.
수정능은 헤파린이 존재 혹은 부재하는 TCM 199에서 배양하고, 그리고 TEST-yolk 용액에서 4시간 혹은 24시간 동안 낮은 온도 (4℃) 수정능에 의해서 유도되었다. 본 발명자들은 투명대 제거 햄스터 난자와 돼지 미성숙 난자의 최대 투과능은 헤파린 처리된 정자 세포에서 얻어짐을 확인하였다.
투명대가 없는 햄스터 난자 (2.267 ± 0.176)는 미성숙 돼지 난자 (1.576 ± 0.122)보다 유의적으로 더 높은 침투를 보여주었다. 좋은 그리고 나쁜 수정 그룹 사이에 분별력을 증가시키기 위하여, SCI와 SFI을 이용한 계산 수치가 비교되었다. SFI는 더 넓은 범위 정도를 보여주었고, 그러므로, 본 발명자는 이후 SFI를 이용하여 모든 data를 나타냈다.
2.
정도관리
도 2를 참고하면, 도 2는 투과능 분석에 대한 품질관리 곡선을 나타낸 것으로서, 중 정도의 침투를 가진 동결된 소의 정자가 전체 실험 기간에 걸쳐서 각 SPA 분석에서 분선간 변수를 점검하는데 이용되었다. (EN: 확장된 정자, DC: 비응축된 정자, PN: 형성된 전핵, SFI: 정자 수정 지수)
즉, 도 2는 최적화된 SPA에 대한 정도관리 시스템을 개발하는데 이용하고, 매번 분석 간의 오류와 안정도를 확인하는데 이용된 중간 정도의 수정 능력을 가진 동결된 소의 정자로부터 얻어진 정도관리 곡선을 보여준다. 어떤 소의 정자에서도 모든 실험 시도 사이에서 확대된 정자, 비응축된 정자, 형성된 전핵, 그리고 SFI의 수에서는 차이는 없었다. 그러므로 동결된 소의 정액은 SPA에 대한 효용성있는 표준 대조정자임을 보여준다. 모든 대조군 결과들이 평균 수치들로부터 많이 벗어나지 않았을 때, 본 발명자는 분석이 정확하게 시행된 것으로 간주하였다.
3.
산자
수와의 관련성
도 3을 참고하면, 도 3a는 산자 수 기록에 대한 SPA의 관련성을 나타낸 것이고, 유의적인 상관계수 (r = 0.726, p<0.05)가 24마리의 수컷에 대해서 SFI와 산자 수 사이에 관찰되었다. 도 3b는 분만 율 기록에 대한 SPA의 관련성을 나타낸 것으로, 어떠한 유의적 상관계수도 (r =0.140) SFI와 분만율사이에 관찰되지 않았다.
즉, SFI는 평균 산자 수 기록과 유의적 관련성이 있을 보여주었으나(r = 0.726, p<0.05), SFI는 분만율 기록과 유의적 관련성이 없음을 보여주었다.
4. 최적화된
SPA
에 대한 정상범위의 결정
(1) 도 4를 참고하면, 도 4는 최적화된 SPA에 대한 정상 산자 수의 하한(lower limit)의 결정을 나타낸 것으로, 정상 산자 수의 하한은 8 이상으로 정의되었다.
하기 표 2는 SFI와 산자 수 사이의 관련성을 나타낸 것으로, SFI ≤ 1.2인 수컷은 적은 산자 수를 생산할 수 있는 가능성이 높음을 확인할 수 있다.
| 산자 수 < 8 | 산자 수 = 8 | |
| SFI = 1.2 (n=9) | 7 | 2 |
| SFI > 1.2 (n=15) | 0 | 15 |
| Sensitivity | 100% | |
| Specificity | 88% | |
| Positive predictive value | 78% | |
| Negative predictive value | 100% | |
| Accuracy | 92% | |
따라서, 최적화된 SPA에 대한 정상 범위를 결정하기 위하여, SFI 1.2가 도 4로부터 낮은 하한점으로 확립되었다.
상기 표 2는 SPA에서 양성 숫자 (SFI ≤ 1.2)는 더 작은 산자 수 (<8)에 대해서 매우 높게 예측되었음을 보여준다. 즉, SFI ≤1.2를 가진 수컷의 88%는 여덟 마리 보다 더 적은 수의 산자 수를 생산하였다. 반면에, SFI > 1.2인 수컷들 중에서 여덟 혹은 더 많은 산자수의 비율은 100%였다.
적은 산자 수를 가진 모든 수컷에서 민감도 (sensitivity)는 얼마의 비율이 테스트에 의해서 확인되었는지를 결정하였다. 거꾸로 말하면, 민감도는 수컷 중 얼마의 비율이 음성 테스트를 나타낼 것인지를 결정하는 것이다. 양성 테스트 결과 (SFI ≤ 1.2)를 가진 모든 수컷들 중에서, 실제로 적은 산자수 (<8)를 가진 비율을 아는 것이 중요하다. 이것이 양성 예측 값 (positive predictive value)이다. 음성 예측 값은 이와는 반대다. 음성 테스트 결과 (SFI > 1.2)을 가진 모든 수컷들 중에서 실제로 더 많은 산자수 ( ≥8 )를 가진 비율이다.
따라서 상기 표 2와 같이 8 마리 또는 더 많은 산자 수를 가진 수컷들 중에서 100%가 SFI > 1.2 라는 사실이 중요한 바, 더 적은 산자 수의 예측에 대한 전체적인 정확도는 92% 임을 확인할 수 있었다.
(2) 도 5를 참고하면, 도 5는 최적화 된 SPA에 대한 많은 산자 수의 하한 (lower limit)의 결정에 대한 것으로, 많은 산자수의 하한점은 이 경우에 10이상으로 정의 되었다.
표 3은 SFI와 산자수와의 상관성을 나타낸 것으로, SFI >2.5인 수컷들은 많은 산자 수의 가능성을 증가시켰다.
| Litter size = 10 | Litter size <10 | |
| SFI>2.5 (n=6) | 6 | 0 |
| SFI=2.5 (n=18) | 1 | 17 |
| Sensitivity | 86% | |
| Specificity | 100% | |
| Positive predictive value | 100% | |
| Negative predictive value | 94% | |
| Accuracy | 96% | |
최적화된 SPA을 이용하여 많은 산자 수에 대한 제한 범위를 결정하기 위하여, SFI 2.5는 도 5로부터 하한점으로 확립되었다.
상기 표 3은 SPA에서 양성 숫자(score) (SFI > 2.5)는 많은 산자 수 (≥10)에 대하여 높게 예측되는 것을 보여준다. SFI 숫자 (score) > 2.5를 가진 수컷 모두 10마리 또는 더 많은 자돈 (piglets: 어린돼지)을 포함한 산자 수를 생산하였다. 반대로 SFI ≤2.5를 가진 수컷들 중에서 94%는 열 마리 자돈보다 적은 산자 수를 가지고 있었다. 열 마리 또는 더 많은 자돈을 포함하는 산자 수를 생산하는 수컷의 86%가 SFI > 2.5라는 사실이 중요한 바, 많은 산자 수의 예측에 대한 전체적인 정확도는 96%임을 확인할 수 있었다.
본 발명은 SPA에 대한 절차를 최적화하고, 정도관리를 적용하여, 결과적으로 적은 수 그리고 많은 수의 산자 수를 생산하는 수컷을 찾아낼 수 있는 민감도를 증가시켜 돼지 산자 수를 예측할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의하여 좋고 나쁜 수정능을 가진 수컷들을 구별할 수 있으며, 많은 수 및 적은 수의 산자 수를 생산하는지 여부에 대한 등급을 부여할 수 있다. 따라서, 정자의 수정능과 투과능에 대한 조건이 체내에서 매우 다를지라도, 본 발명의 방법은 수정능, 첨체 반응, 수정, 성공적 임신을 할 수 있는 정자의 능력에 관한 의미 있는 정보를 제공할 수 있을 것이다. 이는 이 방법을 이용하여 농가의 생산성을 증진시킬 수 있으며 안정적인 돼지 생산에 크게 기여할 것이다.
도 1은 SPA 결과에 대한 다양한 변수의 효과를 나타낸 것으로, 수정능 야기 방법과 각 난자를 비교하였고, 결과들은 평균 SCI/SFI와 표준오차로 표시된 값이다. (80에서 90개의 미성숙 돼지 난자가 각 처치 그룹에 사용되었고, 30-33개의 햄스터 난자가 세 그룹의 개별실험에서 각 처치 그룹당 사용되었으며, 단, TCM 199=대조군, TYB-4 = 4℃에서 24시간동안 TYB 처치군, TYB-24 = 24℃에서 30분동안 TYB 처치군, Heparin = 배양배지에 헤파린 처치 군이다.)
상기 도 1에서 미성숙 돼지 난자에서 TCM 199, TYB-4, TYB-24 및 heparin 군에 대한 a, b, c SCI 값은 ANOVA에 의해서 유의적으로 다르다(p<0.05)는 것을 확인할 수 있고, 투명대 제거 햄스터 난자에서 TCM-199, TYB-4, TYB-24 및 heparin 군에 대한 A, B, C, D SCI 값은 ANOVA에 의해서 유의적으로 다르다(P < 0.05)는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 1에서 미성숙 돼지 난자에서 TCM 199, TYB-4, TYB-24 및 heparin 군에 대한 e, f SFI 수치는 ANOVA에 의해서 유의적으로 다르다(P < 0.05)는 것을 확인할 수 있으며, 투명대 제거 햄스터 난자에서 TCM-199, TYB-4, TYB-24 및 heparin 군에 대한 E, F, G, H SFI 수치는 ANOVA에 의해서 유의적으로 다르다(P < 0.05)는 것을 확인할 수 있다.
* SCI와 SFI 그룹간에는 유의적으로 다르다 (p<0.05).
도 2는 정자 침투 분석에 대한 정도관리 곡선을 나타낸 것이다. 중 정도의 침투을 가진 소 동결 정자가 전체 실험 기간에 걸쳐서 각 SPA 분석에서 분선간 변수를 점검하는데 이용되었다. (EN: 확장된 정자, DC: 비응축된 정자, PN: 형성된 전핵, SFI: 정자 수정 지수)
도 3a 는 산자 수 기록에 대한 SPA의 관련성을 나타낸 것이다. 유의적인 상관계수 (r = 0.726, p<0.05)가 24마리의 수컷에 대해서 SFI와 산자 수 사이에 관찰되었다. 도 3b는 분만 율 기록에 대한 SPA의 관련성을 나타낸 것이다. 어떠한 유의적 상관계수도 (r =0.140) SFI와 분만율 사이에 관찰되지 않았다. 즉, SFI는 평균 산자 수 기록과 유의적 관련성이 있을 보여주었으나(r = 0.726, p<0.05), SFI는 분만 율 기록과 유의적 관련성이 없음을 보여주었다.
도 4는 최적화된 SPA에 대한 정상 산자 수의 낮은 제한점의 결정에 관해 나타낸 것으로, 정상 산자 수의 낮은 하한점은 8보다 크거나 같은 것으로 정의 되었다.
도 5는 최적화된 SPA에 대한 더 많은 산자 수의 더 작은 하한점의 결정에 관한 것으로 더 많은 산자수의 더 낮은 제한점은 이 경우에 ≥ 10로 정의 되었다.
Claims (9)
- 수컷 돼지로부터 채취한 정액으로부터 얻은 정자를 헤파린 처리 배지에서 배양하는 단계;상기 배양된 정자세포를 헤파린 처리 배지에서 투명대 제거 햄스터 난자와 공배양하는 단계; 및난자당 침투한 정자의 수 및 전핵의 수를 측정하여 체외 정자 침투를 분석하는 단계;를 포함하며,하기 수학식 1로 나타내는 SFI가 1.2 보다 작거나 같으면 8마리 이하의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측하고, SFI가 2.5 보다 크면 10마리 이상의 돼지 산자 수를 갖는 수정능력을 예측하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 수정능력 예측 방법.<수학식 1>SFI = {난자당 투과한 정자 평균 수(확대된 정자 머리의 수 + 응축되지 않은 정자 머리수) + (난자당 전핵의 수 × 2)}/공시된 난자의 수
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 동결된 소 정액에 대하여 제 1 항에 따른 방법을 동시에 실시하여, 돼지 정자 수정능력 예측의 대조 표준정자로 이용함으로써 검사의 오류를 확인하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 헤파린 처리 배지는 불활성화 태아 소 혈청과, 소디움 피루베이트, D-글루코스, 칼슘 락테이트, 페니실린 G 및 스트렙토마이신 설페이트를 첨가한 배지에 헤파린을 처리한 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 정자세포의 배양은 39℃에서 30분간 배양됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 공배양은 상기 정자세포가 2x108cells/ml의 농도로 헤파린 배지에 희석되도록 하여 배양됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 공배양은 39℃, 5% 이산화탄소 환경 하에서 2 내지 4시간 동안 공배양됨을 특징으로 하는 방법.
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| KR101112748B1 (ko) * | 2009-10-22 | 2012-03-13 | 중앙대학교 산학협력단 | 소의 체외 수태능력 예측 방법 |
| KR101760467B1 (ko) * | 2014-12-01 | 2017-07-24 | 중앙대학교 산학협력단 | 수태능력 관련 단백질 마커를 이용한 동물의 산자수 예측 방법과 클로르테트라사이클린 염색법을 이용한 동물의 정액 품질 및 산자수의 예측 방법 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 논문1:한국임상수의학회지* |
| 논문2:Gamete Res. |
| 논문3:Gamete Res. |
| 논문4:J Dairy Sci. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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