KR101106616B1 - 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치 - Google Patents

형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광단백질을 발현하는 미생물을 이용하여 분리막의 오염 정도를 용이하게 정량 분석할 수 있는 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법은 형광단백질발현 미생물이 포함된 배양액을 준비하는 단계와, 상기 배양액에 분리막을 넣어 분리막에 형광단백질발현 미생물을 배양하는 단계와, 상기 분리막을 세척하는 단계 및 상기 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
형광단백질발현미생물, 분리막

Description

형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치{Method and apparatus for quantitative analysis of the extent of membrane fouling by using fluorescence microorganisms}
본 발명은 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 형광단백질을 발현하는 미생물을 이용하여 분리막의 오염 정도를 용이하게 정량 분석할 수 있는 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치에 관한 것이다.
다양한 수처리 공정에서 사용하는 분리막들의 경우, 투과유량 및 투과시간이 늘어날수록 막의 오염도가 급격히 증가하고 이에 따라 투과유량의 감소가 불가피하게 발생되므로 일정 주기로 분리막을 교체해야 한다. 분리막의 수명을 늘리기 위해 다양한 분리막 재질의 적용 및 분리막의 표면특성변화를 위한 표면개질 기법이 개발되고 있다.
일반적으로, 생물학적 수처리 공정에 적용된 분리막에 있어서 분리막 오염의 가장 큰 원인은 미생물의 부착에 의한 것이며, 분리막의 성능평가 및 비교를 위해 서는 분리막에 부착된 미생물의 정량분석이 매우 중요하다. 현재 널리 적용되고 있는 미생물의 정량분석 방법은 크게 간접 미생물 정량화 방법과 직접 미생물 정량화 방법이 있다.
간접 미생물 정량화 방법으로 대표적으로 미생물의 파쇄 후 추출되는 단백질 또는 탄수화물을 측정하는 방법이 있는데, 많은 시간이 소요되며 낮은 추출효율로 인해 정확한 미생물의 정량화에 어려움이 있다. 직접 미생물 정량화 방법으로는 오염된 분리막에 부착되어 있는 미생물의 개체수를 콜로니 형태로 계수하는 방법이 있으나, 분리막에 붙어 있는 미생물의 회수가 용이하지 않으며 개체수를 측정하기 위해 배지(media)를 사용해야 한다는 점과 배지에서의 미생물 성장에 장시간이 소요된다는 점 등의 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로서, 형광단백질을 발현하는 미생물을 이용하여 분리막의 오염 정도를 용이하게 정량분석할 수 있는 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법은 형광단백질발현 미생물이 포함된 배양액을 준비하는 단계와, 상기 배양액에 분리막을 넣어 분리막에 형광단백질발현 미생물을 배양하는 단계와, 상기 분리막을 세척하는 단계 및 상기 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 형광단백질발현 미생물은 미생물에 형광단백질 벡터가 주입된 것이며, 상기 형광단백질 벡터는 제 1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자와 제 2 선별유전자인 형광단백질 유전자를 포함한다.
또한, 상기 형광단백질 유전자를 포함하는 형광단백질은 GFP, EGFP, EYFP, mCitrine, Venus, mECFP, Cerulean, EBFP, Azurite, DsRed, mOrange, mStrawberry, mCherry 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이와 함께, 상기 형광단백질 벡터의 피주입체인 미생물은 대장균(Escherichia coli), Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida 중 어느 하나일 수 있다.
상기 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 단계는, 형광 인식 장치를 이용하여 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물을 관찰하여 개체수를 측정할 수 있다. 이 때, 상기 형광 인식 장치는 형광 현미경, 형광 스펙트로포토미터(spectrophotometer), 형광 검출기, 형광 센서 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법.
본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 장치는 형광단백질발현 미생물을 분리막에 배양시키는 배양수단과, 형광단백질발현 미생물이 배양된 분리막을 세척하는 세척수단 및 세척 후 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 형광 인식 장치를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치는 다음과 같은 효과가 있다.
종래의 직접 미생물 정량화 방법이 분리막에 부착된 미생물의 극히 일부분을 탈착시켜 그 개체수를 확인하는 방법을 택함에 반해, 본 발명은 분리막에 부착된 미생물의 개체수를 확인하는 방법을 택함에 따라, 정량분석시 정확성을 향상시킬 수 있게 된다.
또한, 종래의 경우 보조인자(cofactor), 기질(substrate) 등이 요구되고 결과 도출에 장시간이 소요되나, 본 발명은 보조인자 및 기질이 필요치 않고 단시간 내에 정확한 정량분석을 수행할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법은 분리막에 형광단백질발현 미생물을 배양시킨 다음, 분리막에 특정 조건을 가한 후 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물을 형광인식장치를 이용하여 정량분석하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 상기 특정 조건이라 함은 분리막이 실제 적용되는 환경에 상응하는 조건을 일컫는 것으로서, 일 예로 분리막의 세척, 오염물질 내에서의 분리막의 교반 등을 들 수 있다.
상기 형광단백질발현 미생물은 형광인식장치에 의해 감지될 수 있는 형광단백질을 발현하는 미생물로서, 형광단백질 벡터가 주입되어 형질 변환된 미생물을 일컫는다. 이 때, 상기 형광단백질 벡터는 제 1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자와 제 2 선별유전자인 형광단백질 유전자를 포함한다.
상기 형광단백질 유전자를 포함하는 형광단백질로는 GFP, EGFP, EYFP, mCitrine, Venus, mECFP, Cerulean, EBFP, Azurite, DsRed, mOrange, mStrawberry, mCherry 중 어느 하나 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다. 또한, 상기 형광단백질 벡터의 피주입체인 미생물로는 대장균(Escherichia coli), Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida 등이 이용될 수 있으며, 그 외에 형질전환이 가능한 제반 미생물에도 적용이 가능하다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법 및 장치를 상세히 설명하기로 한다.
<실시예>
가로, 세로 각 10mm의 크기를 갖는 서로 다른 재질의 3개의 분리막(분리막 A, 분리막 B, 분리막 C)을 준비하고, 고압 증기멸균기에서 121℃, 1 기압의 조건 하에서 15분간 멸균하였다. 한편, 형광단백질 벡터가 주입된 대장균 즉, 형광단백질발현 대장균을 멸균된 3ml의 액체 LB 배지(Luria-Bertani media)에서 성장 정지기까지 배양하였으며, 이 때 엠피실린은 100mg/ml 농도의 원액을 배양액 부피의 1000분의 1인 3㎕를 주입하였다.
그런 다음, 웰 플레이트(polyethylene 6-well plate)에 상기 멸균 건조한 분리막, 형광단백질발현 대장균이 함유된 배양액 200㎕, 액체 LB 배지 2ml를 넣고, 37℃의 배양기에서 3시간 반응시켜 분리막을 오염시켰다. 이 때, 모든 웰 플레이트(분리막 A, 분리막 B, 분리막 C가 포함된 웰 플레이트) 수용액의 pH는 7.2로 동일하게 유지하였다. 여기서, 분리막에 형광단백질발현 대장균을 배양시키는데 사용된 상술한 제반 도구를 배양수단이라 칭할 수 있다.
배양기에서의 분리막 오염 과정 후, 각각의 분리막을 꺼내어 PBS 용액을 이 용하여 세척하였다. 이 때, 세척 과정은 지름 13cm의 페트리 디쉬에 분리막을 넣고 10ml의 멸균된 PBS를 주입한 후, 수평 교반기에 페트리 디쉬를 올려놓은 다음 20rpm의 조건으로 5분간 교반하여 진행하였다. 이러한 세척 과정을 통해 분리막 표면 및 내부 기공에 강력하게 부착된 형광단백질발현 대장균만이 존재하게 되며, 이와 같이 분리막 표면 및 내부 기공에 잔존하는 미생물이 분리막 오염에 실질적인 영향을 끼치는 것이라 할 수 있다.
상기 세척 과정을 3회 실시한 후, 오염된 분리막을 유리 슬라이드 위에 놓고 커버 슬립으로 고정시킨 다음, 형광 현미경으로 분리막 표면 및 내부 기공에 부착된 형광단백질발현 대장균을 관찰하고 개체수를 측정하였다. 이 때, 개체수 측정방법은 육안으로 확인하거나 본 실험에 사용된 칼 짜이즈社의 현미경 분석 소프트웨어인 Axiovision을 이용할 수 있으며, 두 가지 방법에 의한 개체수 측정 결과는 거의 동일하게 나타났다. 또한, 상기 형광 현미경 이외에 형광 스펙트로포토미터(spectrophotometer), 형광 검출기, 형광 센서 등이 이용될 수도 있다.
한편, 본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법의 간편성 및 정확성을 비교하기 위해 종래의 직접 미생물 정량화 방법인 미생물의 개체수를 콜로니 형태로 계수하여 정량화하는 실험을 동시에 수행하였다.
종래의 직접 미생물 정량화 방법의 실험 조건은 본 발명의 실험 조건 즉, 분리막의 준비에서 세척 과정까지의 실험 조건을 동일하게 적용하였으며, 분리막으로부터의 대장균 탈착 및 개체수 측정을 위해 다음의 실험 과정을 추가적으로 진행하였다.
세척 과정 후, 분리막(분리막 a, 분리막 b, 분리막 c)을 1ml의 멸균된 PBS 용액이 담긴 마이크로 튜브에 놓고 볼텍스 믹서를 5분간 가동하여 분리막에 부착된 대장균을 탈착시켰다. 여기서, 분리막 a는 본 발명 실험의 분리막 A와 동일 재질이며, 분리막 b, 분리막 c는 각각 분리막 B, 분리막 C와 동일 재질이다.
탈착된 대장균의 개체수 측정은 10의 배수로 단계별로 희석하고, 각 단계의 시료를 고체 LB 배치에 도포한 후 37℃ 배양기에서 15시간 배양한 다음, 각 배지에서 성장한 콜로니 개수를 계수하여 산출하였다.
본 발명 및 종래 방법의 실험에 따른 결과를 살펴보면 다음과 같다.
아래의 표 1은 본 발명의 실험에 따른 분리막에 부착된 대장균의 개체수(/cm2) 및 상대오염도를 나타낸 것이다. 또한, 도 1은 본 발명의 실험 중 세척 과정 완료 후 분리막의 표면을 형광 현미경을 촬영한 것이며, 도 1의 (A), (B), (C)는 각각 분리막 A, 분리막 B, 분리막 C를 의미한다.
표 1을 참고하면, 가장 높은 분리막 오염도를 나타낸 분리막 A의 경우 1cm2 당 부착된 형광단백질발현 대장균의 개체수가 168,789개로 나타났으며, 가장 낮은 분리막 오염도를 나타낸 분리막 B의 경우 1cm2 당 부착된 형광단백질발현 대장균의 개체수가 48,225개로 나타났으며, 분리막 C의 경우 1cm2 당 91,628개의 형광단백질발현 대장균이 부착된 것으로 나타났다. 표 1에 있어서, 상대오염도란 단위면적당 형광단백질발현 대장균의 개체수가 가장 많은 분리막(분리막 A)의 오염도를 100%로 하였을 때, 분리막 A의 형광단백질발현 대장균의 개체수 대비 분리막 B, 분리막 C의 형광단백질발현 대장균의 개체수를 나타낸 것이다. 이에 근거하여, 분리막 B의 상대오염도는 28.6%, 분리막 C의 상대오염도는 54.3%로 나타났다.
<표 1> 본 발명의 실험에 따른 분리막 오염도 결과
1cm2당 부착된 대장균
개체수		 상대오염도(%)
분리막 A 168,789 100
분리막 B 48,225 28.6
분리막 C 91,628 54.3
표 2는 종래 방법의 실험에 따른 분리막 오염도 결과를 나타낸 것이다. 참고로, 본 발명의 실험 결과 즉, 표 1은 분리막에 부착된 대장균의 개체수를 정량분석함에 반해, 종래 방법의 실험 결과 즉, 표 2는 분리막으로부터 탈착된 대장균의 개체수를 정량분석한다는 점에서 차이점이 있다.
표 2를 참고하면, 가장 높은 분리막 오염도를 나타낸 분리막 a의 경우 1cm2 당 탈착된 형광단백질발현 대장균의 개체수가 1,335개로 나타났으며, 가장 낮은 분리막 오염도를 나타낸 분리막 b의 경우 1cm2 당 탈착된 형광단백질발현 대장균의 개체수가 155개로 나타났으며, 분리막 c의 경우 1cm2 당 490개의 형광단백질발현 대장균이 탈착된 것으로 나타났다. 표 2에 있어서, 상대오염도란 단위면적당 형광단백질발현 대장균의 개체수가 가장 많이 탈착된 분리막(분리막 a)의 오염도를 100%로 하였을 때, 분리막 a의 형광단백질발현 대장균의 탈착된 개체수 대비 분리막 b, 분 리막 c의 형광단백질발현 대장균의 탈착된 개체수를 나타낸 것이다. 이에 근거하여, 분리막 b의 상대오염도는 13.1%, 분리막 c의 상대오염도는 41.5%로 나타났다.
<표 1> 종래 방법의 실험에 따른 분리막 오염도 결과
1cm2당 탈착된 대장균
개체수		 상대오염도(%)
분리막 a 1,335 100
분리막 b 155 13.1
분리막 c 490 41.5
본 발명의 실험 결과와 종래 방법의 실험 결과를 대비하면, 동일 재질의 분리막(분리막 A-분리막 a, 분리막 B-분리막 b, 분리막 C-분리막 c)에 대해 각각 본 발명의 실험과 종래 방법의 실험을 진행한 결과, 분리막 B-분리막 b, 분리막 C-분리막 c, 분리막 A-분리막 a의 순서로 분리막의 오염도가 높은 이른바, 상대오염도의 경향성이 어느 정도 일치한다는 점에서 유사점이 있다.
그러나, 본 발명의 실험에 따른 1cm2의 분리막 당 부착된 형광단백질발현 대장균의 개체수와 종래 방법의 실험에 따른 1cm2의 분리막 당 탈착된 형광단백질발현 대장균의 개체수는 분리막에 따라 126∼311배의 차이를 보이고 있다. 이는 종래 방법의 실험의 경우, 분리막에 부착된 대장균 중 극히 일부분만이 탈착된 것을 반증하며, 분리막 오염도를 정량분석함에 있어서 결정적으로 신뢰도를 저하시키는 요인으로 작용한다.
따라서, 본 발명의 실험은 종래 방법의 실험에 대비하여 정량분석의 신뢰성을 향상시킬 수 있으며, 실험 과정 또한 본 발명의 실험이 종래 방법의 실험에 대비하여 간략한 바, 본 발명에 따른 형광단백질발현 미생물을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법은 간편성과 신뢰성을 동시에 담보한다.
도 1은 본 발명의 실험 중 세척 과정 완료 후 분리막의 표면을 형광 현미경을 촬영한 사진.

Claims (13)

  1. 형광단백질발현 미생물이 포함된 배양액을 준비하는 단계;
    상기 배양액에 분리막을 넣어 분리막에 형광단백질발현 미생물을 배양하는 단계;
    상기 분리막을 세척하는 단계; 및
    상기 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 단계를 포함하여 이루어지며,
    상기 형광단백질발현 미생물은 형광단백질발현 대장균이며,
    상기 형광단백질발현 대장균은 대장균에 형광단백질 벡터가 주입된 것이며,
    상기 형광단백질 벡터는 제 1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자와 제 2 선별유전자인 형광단백질 유전자를 포함하며,
    상기 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 단계는,
    형광 인식 장치를 이용하여 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물을 관찰하여 개체수를 측정하는 것을 특징으로 하는 형광단백질발현 대장균을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 인식 장치는 형광 현미경, 형광 스펙트로포토미터(spectrophotometer), 형광 검출기, 형광 센서 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광단백질발현 대장균을 이용한 분리막 오염도 정량분석 방법.
  8. 형광단백질발현 미생물을 분리막에 배양시키는 배양수단;
    형광단백질발현 미생물이 배양된 분리막을 세척하는 세척수단; 및
    세척 후 분리막에 잔존하는 형광단백질발현 미생물의 개체수를 측정하는 형광 인식 장치를 포함하여 이루어지며,
    상기 형광단백질발현 미생물은 형광단백질발현 대장균이며,
    상기 형광단백질발현 대장균은 대장균에 형광단백질 벡터가 주입된 것이며,
    상기 형광단백질 벡터는 제 1 선별유전자인 항생제 저항성 유전자와 제 2 선별유전자인 형광단백질 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광단백질발현 대장균을 이용한 분리막 오염도 정량분석 장치.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 형광 인식 장치는 형광 현미경, 형광 스펙트로포토미터(spectrophotometer), 형광 검출기, 형광 센서 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형광단백질발현 대장균을 이용한 분리막 오염도 정량분석 장치.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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