KR101099666B1

KR101099666B1 - 키타사토스포라 속 ｄｇ09 균주 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101099666B1
Application number: KR1020110063137A
Authority: KR
Inventors: 이동걸; 강희철; 한상근; 이찬우
Original assignee: (주)지에프씨
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2011-12-29
Also published as: EP2727995A2; EP2727995A4; WO2013002561A3; WO2013002561A2

Abstract

본 발명은 키타사토스포라 속 DG09 균주, 이로부터 생산되는 티로시나제, 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 토양에서 분리한 키타사토스포라 속 DG09 균주, 상기 균주가 생산하는 티로시나제, 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

키타사토스포라 속 ＤＧ09 균주 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법{Kitasatospora sp. DG09 and a method for preparing 5,6-dihydroxyindole using the same}

본 발명은 키타사토스포라 속 DG09 균주, 이로부터 생산된 티로시나제, 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 토양에서 분리한 키타사토스포라 속 DG09 균주, 상기 균주가 생산하는 티로시나제, 및 이를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

모발 중 우리가 눈으로 볼 수 있는 제3의 영역인 모간(hair shaft)은 모표피(cuticle), 모피질(cortex), 모수질(medulla)로 구성되어 있다. 모수질을 감싸고 있는 모피질은 모발에서 가장 두터운 부분(80∼90%)으로서 melanin이라는 자연색소 물질인 과립(미립자)을 포함하고 있다. melanin 색소는 멜라노사이트(melanocyte) 내의 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 합성되며, 멜라노사이트의 수지강 돌기를 통하여 주위의 케라티노사이트(keratinoside)로 이행한다. 멜라닌의 합성 경로에서 티로신(tyrosine)을 산화하여 도파(DOPA)로, 다시 산화하여 도파퀴논(DOPA-quinone)이 생성되는 단계에서 티노시나제(tyrosinase)가 관여하며 그 후의 반응은 자동 산화적으로 진행되지만, 효소의 존재로서 보다 가속화되는 것도 알려져 있다. 한편, 사람의 인체나 모발에서는 자연적으로 발생하는 활성 산소나 유리기 (free radical) 등을 소거하기 위하여 또는 자외선의 투과를 막기 위해 멜라닌을 생성하는데, 멜라닌을 만드는 출발물질은 인체에 정상적으로 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이다. 티로신은 멜라닌세포 (melanocyte) 내에서 티로시나아제 (tyrosinase)에 의해 산화되어 도파 (3,4-dihydroxyphenylalanine, 이하 "DOPA"로 약칭함)로 변하고, DOPA는 더욱 산화되어 DOPA 퀴논 (quinone)으로 바뀐다. 그 후 DOPA 퀴논은 자동 산화반응이 일어나 5,6-디히드록시인돌 (5,6-dihydroxyindole)을 거치면서 인돌-5,6-퀴논이 형성되고 최종적으로 흑갈색의 멜라닌을 만들어 낸다. 인체 내에는 단백질로 구성된 다양한 자연화학 물질들이 있다. 각 화학물질인 아미노산은 각각의 역할을 하나 이중 특히 색상에 관계되는 아미노산인 tyrosine을 원료로 하여 형성되는 흑멜라닌, 적멜라닌, 혼합멜라닌등은 과립(granule)을 형성 멜라닌의 유형과 분포양에 따른 정도 등의 요인에 의해 모발의 밝기를 결정시켜 사람마다 독특한 모발색을 드러낸다. 다시 말해 멜라닌의 유형과 과립의 크기에 따른 흑색, 적색, 금발 등의 다양한 모발색상을 결정한다고 볼 수 있다. 모발의 색은 모발의 가운데층인 모피질(cortex)에 있는 두 종류의 멜라닌(melanin) 색조 알갱이인 유멜라닌(Eumelanin) 혹은 티로신(Tyrosine)은 가장 흔하고 제일 진한 색소로서 갈색과 검정 머리의 색을 만든다. 페오멜라닌(pheomelanin)은 보다 옅은 색의 색조로서 금발머리(yellow blond), 그리고 붉은 색조를 띄게 한다. 붉은 머리의 색상은 붉은 색소와 검정 색소에 의해 나타나며, 금발머리는 붉은 색소와 노랑색소의 혼합인 결과색이다. 모래빛 갈색머리는 붉은 색, 갈색, 검정색 색소의 혼합에 의해 색소가 나타나며 짙은 갈색머리는 모래빛 갈색머리보다 검정색 색소가 더 많이 들어있다. 그리고 흰머리에는 색소 알갱이가 없는 색을 나타낼 수 없는 머리색이다. 멜라닌(melanin)은 색소를 생성하는 세포에서 발견되는 특정한 효소의 조절을 받으면서 자연적으로 생성되는 단백질(protein)을 상당히 복잡하게 변형시켜 신체를 구성한다. 멜라닌(melanin) 색소의 여러 가지 다른 색들은 멜라닌 발달과정의 여러 단계를 나타내는 것이라 여겨진다. 우선 노란 색소가 형성되고 그 다음에 어떤 효소가 노란 색소를 붉은 색소로 변화시킨다. 다른 효소가 그 붉은 색소를 검정 색소로 변화시키게 된다. 모든 사람들이 멜라닌(melanin)을 이렇게 전체적인 색분광에 따라 바꿀 수 있는 능력을 갖춘 것은 아니다. 어떤 사람들은 검정 색소만을 만들어낸다. 이들은 검정색소를 얼마나 생성해 내는가에 따라 짙은 갈색이 포함된 검정머리를 지니게 된다. 또 다른 사람들은 오르지 붉은 색소나 노랑색소만을 생성할 수 있기 때문에 금발머리나 붉은 머리를 가졌다. 이러한 색소를 생성해내는 능력은 현존하는 색소에 의해 결정이 되며 또한 그 사람의 유전 정보 인자에 의해 나타난다.

멜라닌은 물에 용해되지 않는 단백질로서 두발에 색상을 부여한다. 모유두에서 생성된 아미노산인 티로신은 멜라닌의 전조제로서 방종형(장경 0.8∼1.8㎛, 단경 0.3∼0.4㎛)이다. 백모는 DOPA quinone에서 그 작용을 멈추므로 모발이 케라틴화 되어 각화 위로 올라가면서 gray hair 즉 새치로서 Tyrosinase 효소를 만들지 못하기 때문에 산화작용이 이루어지지 못한 상태이다. 백모는 특히 흑갈색계의 모발을 갖는 인종에서 더욱 명료하게 나타나며, 멜라노사이트에서 멜라닌 생성이 멈추기 때문에 일어나는 현상으로 일종의 노화현상이다.

도파퀴논은 두 가지 경로로 반응이 진행된다. 도파크롬(DOPA chrome)을 거쳐 흑갈색의 유멜라닌(eumelanin)을 생성하는 경로와 도파퀴논이 케라틴 단백질에 존재하는 시스테인(cysteine)과 결합한 후 적갈색의 페오멜라닌(pheomelanin)을 생성하는 경로가 있다. 이와 같이 모발의 산화 염색반응은 모발에서의 중합(결합)반응의 한 예이다. 이 반응에서는 방향족 아민과 페놀모노머(phenolmonoer)가 산화 중합하고, 또한 모발중의 아미노산 잔기와 결합한다. 유멜라닌은 비교적 크기가 크고 화학적으로 쉽게 파괴될 수 있는데 반하여 페오멜라닌은 비교적 크기가 작고 화학적으로 안정된 구조를 하고 있다. 시스테인 함량이 많은 모발에는 페오멜라닌이 많이 존재하며, 흑갈색의 모발을 H₂O₂로 탈색시켰을 때 색상이 약간 붉게 보이는 것은 바로 유멜라닌이 먼저 파괴되고 페오멜라닌이 남아 있기 때문이다.

본 발명자들은 기존의 염모제가 피부에 자극적이고 효율적인 염색이 되지 않는다는 것을 개선하기 위해 멜라닌 전구체 물질인 5,6-디하이드록시인돌 이라는 물질을 이용하여 염모제에 사용될 원료를 재조합 균주를 이용하여 생산하였다. 실제 지원자 모발을 대상으로 평가를 실시한 결과 염색에 상당히 효과가 있음을 확인하였으며 본 발명의 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환 된 대장균 및 이를 이용한 5,6-디하이드록시인돌 생산방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09) 균주 및 상기 균주로부터 생산된 신규한 티로시나아제(tyrosinase)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 및 상기 균주로부터 생산된 티로시나제를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 기탁번호 KCCM11178P로 수탁된 티로시나제를 생산하는 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp . DG09 JF917133) 균주를 제공한다.

본 발명은 상기 키타사토스포라 속 DG09 균주로부터 생산된 티로시나제를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 티로시나제는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

일 구체예에서, 상기 티로시나제는 서열번호 3의 핵산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 티로시나제를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 상기 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09) 균주 또는 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및

얻은 배양액으로부터 5,6-디히드록시인돌을 회수하는 단계를 포함하는 5,6-디히드록시인돌을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 티로시나제를 생산하는 신규한 균주 키타사토스포라를 제공하였다. 또한, 본 발명은 상기 균주 및 상기 균주로부터 생산된 티로시나제를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생산하는 방법을 제공하였다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 티로시나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 나타낸 것이다.

본 발명은 티로시나제를 생산하는 키타사스포라 속 DG09(Kitasatospora sp . DG09 JF917133) 균주를 제공한다.

본 발명자는 티로신으로부터 멜라닌 생성 능력이 현저하게 높아 티로시나제 생산 수율이 높은 균주를 분리하였고, 균주의 생리학적 특성을 조사하여 본 발명의 균주를 동장하였다.

본 발명자들은 상기 조건을 만족시키는 균주를 탐색하기 위하여 토양으로부터 얻은 희석액을 티로신이 함유된 LDG 배지(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl_2,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-tyrosinase 2g/L) 배지에서 배양한 결과, 멜라닌 생성능이 가장 뛰어난 균주를 선별하였다. 그런 다음, 상기 선별한 균주의 16S rRNA의 염기 서열(JF917133)을 결정하고 유전자원 은행 데이터베이스(Genebank database)를 통해 검색한 결과, 키타사토스포라 속 균주와 99%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 이에, 상기 균주는 키타사토스포라 속인 것으로 동정하였으며 '키타사토스포라 속 DG09'으로 명명하였고, genbank 로부터 JF917133 번호를 부여받았다. 또한, 선별한 균주를 국제미생물기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하였으며, 2011년 3월 2일자로 기탁번호 KCCM11178P를 받았다.

이러한 본 발명의 균주는 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 티로시나제의 생산 수율이 높고, 그 배양 조건은 LDG 배지(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl_2,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-tyrosinase 2g/L)에서 잘 자라는 것으로 확인되었다.

본 발명의 균주 배양의 일 례로서, 상기 배지는 LDG 배지(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl_2,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-tyrosinase 2g/L) 및 25℃에서 잘 자랄 수 있다.

본 발명은 상기 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp . DG09 JF917133) 균주로부터 생성된 티로시나제, 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명자는 상기 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09 JF917133) 균주로부터 티로시나제를 생성하고, 생성된 티로시나제의 클로닝을 위해 숏건 클로닝(shotgun cloning) 기법을 활용하였다. 숏건 클로닝 기법을 통하여 확인된 염기서열을 PCR로 증폭하고 티로시나제의 염기 서열을 결정하였다.

상기 티로시나제는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 티로시나제는 서열번호 3으로 기재된 염기 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 티로시나제는 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database) 검색 결과, 새로운 티로시나제로 판명되었다. 이 염기서열은 기존에 알려진 Tyrosinase(NC_003279.6) 와 다른 염기서열을 포함하고 있으며, 기존의 염기서열과 다른 숙주로부터 획득된 염기서열 이라 다른 활성을 나타내고 있다 차이점으로는 멜라닌이 생성되는 시간이 차이가 나며, 생성된 최종 멜라닌 색깔 역시 다른 차이를 나타내었다.

상기 티로시나제는 20℃∼35℃ 온도에서 활성을 나타내며, 25℃에서 최대 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 티로시나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 키타사스포라 속 DG09 균주 및 티로시나제는 서열 및 생화학적 특성이 차이가 있는 신규한 것으로서, 상기 균주로부터 분리한 티로시나제를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 밝혔으므로, 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하여 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제작할 수 있다.

본 발명은 상기 키타사스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09 JF917133) 균주 또는 상기 형질전환체를 이용하여 5,6-디히드록시인돌을 생상하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 방법은

키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09) 균주 또는 상기 형질전환체를 배양하는 단계(단계 1); 및

얻은 배양액으로부터 5,6-디히드록시인돌을 회수하는 단계(단계 2)를 포함하는 5,6-디히드록시인돌을 제조하는 방법을 포함할 수 있다.

단계 1에서, 상기 균주 및 형질전환체는 상기 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배지는 티로신을 포함하는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, LDG 배지(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl_2,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-tyrosinase 2g/L)를 사용할 수 있다. 상기 균주 또는 형질전환체를 상기 배지에서 배양하는 조건은 특별히 제한되지 않지만, 25℃-37℃에서 2일간 배양할 수 있다.

단계 2에서, 얻은 배양액으로부터 5,6-디히드록시인돌을 회수한다. 5,6-디히드록시인돌은 원심분리방법으로 회수할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예 및 도면을 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

<균주의 분리 및 선별>

토양을 채취하고 멸균 증류수에서 진탕한 후 시료액의 상등액을 취하여 희석하였다. 얻은 희석액을 티로신(tyrosine)이 함유된 배지(LDG 배지(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl_2,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-tyrosinase 2g/L))에 도말하였다. 그런 다음, (25℃-37℃에서 2일)에서 배양하여, 티로신을 산화함으로써 검은색 집락을 형성하는 단일 콜로니로 된 미생물 Kitasatospora sp. DG09 JF917133을 분리하였다. 1차 분리된 미생물을 L-DOPA를 첨가한 배지 LDG medium(Glucose 1g/L, NaCl 5g/L, 0.1 CaCl₂ _,10g Tryptone 10g/L, Casein 5g/L, L-DOPA 3g/L)에 넣고 48시간 동안 25℃에서 배양하였다. 배양 후, 검은색 집락 즉 멜라닌을 형성시키는 정도를 530nm에서 흡광도를 측정함으로써, 멜라닌 생성율이 최대인 미생물 균주를 선별하였다.

<분리된 균주의 동정>

상기 토양으로부터 분리된 최종 균주를 동정하기 위해, 16S rDNA의 염기 서열을 조사하였다. 분리된 균주의 16S rDNA 염기서열 결정을 위하여 균주의 게놈 DNA를 분리하였으며 PCR로 증폭하였다. PCR 반응물은 다음과 같은 조성으로 50 ㎕의 반응을 실시하였다. 1 ㎕의 게놈 DNA(50 ~ 100 ng/㎕)에 10배의 Tag DNA중합효소 완충액(MgCl2 첨가) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 2 ㎕, 10 pmol의 정방향 프라이머(27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 4)와 역방향 프라이머(1492r: 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 5)를 각각 1 ㎕, 1 ~ 2 단위의 Tag DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하여 최종 50 ㎕ 반응액이 되도록 증류수를 더하였다. 프라이머들은 원핵 세균의 16S rDNA 부위에 해당하는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위해 합성하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간의 변성을 수행한 후 95℃에서 30초의 변성, 52℃에서 45초의 어닐링, 72℃에서 45초의 연장을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 8분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지되었다. 그 결과, 확보된 증폭 단편의 염기 서열을 결정하여 서열번호 1의 염기 서열(JF917133)을 얻었다. 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database) 검색 결과, 키타사토스포라 속 균주와 98%의 상동성을 나타내었다. 따라서, 상기 분리균은 키타사토스포라 sp.에 속하는 것으로 동정하였으며 '키타사토스포라 sp. DG09'로 명명하였다. 상기 키타사토스포라 sp. DG09 균주는 2011년 3월 2일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호; KCCM 11178P).

<티로시나제의 분리 및 정제>

상기 균주로부터 생산된 티로시나제를 다음과 같이 순수 분리하고, 아미노산 서열 및 염기 서열을 밝혀내었다.

구체적으로, 상기 균주를 다음과 같이 분석하였다

상기 분리한 티로시나제의 아미노산 서열을 NCBI blast 프로그램으로 분석하였다. 이로부터 확인된 티로시나제는 JF917133의 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다.

상기 분리한 티로시나제의 염기 서열을 NCBI blast 프로그램으로 분석하였다. 이로부터 확인된 티로시나제는 JF917133의 염기 서열을 갖는 것으로 확인되었다.

<재조합 벡터 및 형질 전환체의 제조>

상기 키타사토스포라 sp. DG09 균주로부터 추출된 핵산을 대장균에 재조합을 실시하였다. 상기 재조합 벡터는 특별히 제한되지 않지만, pET-28a 벡터에 도입하였다.

구체적으로, 재조합에 필요한 pUC19 벡터(invitrogen USA) 및 상기 분리한 키타사토스포라 sp. DG09 로부터 추출한 핵산에 대해 제한효소 ECOR1 과 BamH1처리를 37℃ 2시간 실시하였다. 제한효소 처리가 된 핵산(약 10Kb)과 pUC19 벡터(약 2.6Kb)는 전기영동을 통해 사이즈를 확인하였고, 핵산 정제 키트를 사용하여 정제를 실시하였다. 정제된 핵산들을 T4 리가제를 사용하여 19℃에서 12시간 재조합을 실시하였다. 재조합이 완료된 핵산과 벡터는 전기영동을 통해 그 크기를 재확인 하였으며, 그 크기는 약 12Kb 정도인 것으로 확인되었다.

전기영동을 통해 확인한 재조합 pUC19 벡터를 DH5a 대장균에 Heat shock 방법을 통해 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 대장균을 LB 배지에서 약 12시간정도 배양을 실시하였다. 12시간 배양 후 선택적인 균주 선별을 통하여 흰색으로 집락을 형성한 콜로니만 따로 LB 배지에서 배양을 실시하고, 배양된 배양액으로부터 균체를 원심 분리하여 회수하였다. 균체로부터 플라스미드 분리를 실시하였다. 분리된 플라스미드를 제한효소 EcoR1 과 BamH1 을 사용하여 절단시키고, 절단된 핵산은 전기영동을 통해 크기를 확인하여 약 2kb 정도의 핵산만을 따로 분리 정제하였다. 정제된 핵산을 상기와 동일한 방법으로 PET28a 벡터에 다시 재조합을 실시하였다. 제조된 재조합 벡터의 일 례를 도 1에 나타내었다. 재조합된 PET28a 벡터를 BL21(DE3) 대장균에 삽입하여 형질전환하여 LB medium에 12시간 가량 28℃에서 배양하였다. 이때 IPTG 1mM로 인덕션시켜 유전자의 단백질이 발현되도록 유도하였다.

<5,6-디히드록시인돌의 생산>

5,6-디히드록시인돌 은 Kitasatospora sp . DG09 균주로부터 생산된 배양액을 L-DOPA 와 약 1시간 반응을 실시하였다. 이때 산소와 밀폐된 용기에서 반응을 실시하여, 이산화탄소 및 산소와 반응하여 자연산화가 일어나지 않도록 방지하였다. 반응 후 에는 물과 다른 부산물을 제거하기 위해 농축을 실시하여 제거하고, 농축된 산물에는 산화방지제인 아민계열 용액과 pH를 높이기 위해 NaOH를 사용하여 보정하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11178P

20110302

서열목록 전자파일 첨부

Claims

기탁번호 KCCM11178P로 수탁된, 티로시나제를 생산하는 키타사토스포라 속 DG09(Kitasatospora sp. DG09) 균주.
제1항의 균주로부터 생산된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 티로시나제.
삭제
제2항에 있어서, 상기 티로시나제는 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 티로시나제.
(1)제1항의 키타사토스포라 속 DG09 균주 또는 서열번호 3의 티로시나제 핵산 서열을 포함하는 형질전환체를 배양하는 단계;
(2)얻은 배양액으로부터 5,6-디히드록시인돌을 회수하는 단계를 포함하는 5,6-디히드록시인돌의 제조방법.