KR101088583B1

KR101088583B1 - 결장직장암의 예후

Info

Publication number: KR101088583B1
Application number: KR1020040022383A
Authority: KR
Inventors: 왕익신
Original assignee: 베리덱스 엘엘씨
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2011-12-05
Also published as: CA2464894A1; BRPI0403169A; US20040191782A1; AU2004201348B2; KR20040088384A; CL2004000700A1; EP1526186A2; MXPA04003044A; ES2316932T3; CN1542143A; EP1526186B1; EP1526186A3; AU2004201348A1; CA2464894C; JP4913331B2; DE602004017265D1; AR043808A1; ATE412070T1; JP2004329211A; CN100393886C

Abstract

본 발명은 일군의 유전자 발현을 분석함으로써 결장직장암의 예후를 제공하는 방법에 관한 것이다. 마이크로어레이(microarray)와 같은 다양한 매체에서의 유전자 발현 프로파일이 이들을 함유하는 키트로서 포함되어 있다.

Description

결장직장암의 예후{COLORECTAL CANCER PROGNOSTICS}

도 1은 환자의 시료(x-축) 중의 인간의 지방산 결합 단백질 유전자 1의 측정 강도(y-축)의 플롯이다. 더 큰 강도는 이들 유전자가 재발 환자에서 하향 조절(down regulation)됨을 보여주는 더 많은 유전자 발현을 나타낸다.

도 2는 환자의 시료(x-축) 중의 인간의 내장 펩티드 연관된 운반단백질 유전자의 측정 강도(y-축)의 플롯이다. 더 큰 강도는 이들 유전자가 재발 환자에서 하향 조절됨을 보여주는 더 많은 유전자 발현을 나타낸다.

도 3a는 환자의 시료(x-축) 중의 MHC II군 항원(LHA-DRB1) 유전자의 측정 강도(y-축)의 플롯이다. 더 큰 강도는 이들 유전자가 재발 환자에서 하향 조절됨을 보여주는 더 많은 유전자 발현을 나타낸다.

도 3b는 환자의 시료(x-축) 중의 면역글로불린형 전사 5 단백질 유전자의 측정 강도(y-축)의 플롯이다. 더 큰 강도는 이들 유전자가 재발 환자에서 하향 조절됨을 보여주는 더 많은 유전자 발현을 나타낸다.

도 4는 실시예에 개시된 바와 같은 연습용 세트로서 환자의 데이터로부터 구축된 표준 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯이다.

도 5는 실시예에 개시된 바와 같은 시험용 세트로서 환자의 데이터로부터 구 축된 표준 카플란-마이어 플롯이다.

도 6은 실시예에 개시된 바와 같은 환자의 데이터 모두로부터 구축된 표준 카플란-마이어 플롯이다.

도 7은 표준 ROC 곡선이다.

본 발명은 생물학적 시료의 유전자 발현 프로파일에 기초한 결장직장암의 예후 진단에 관한 것이다.

결장직장암은 그 원인이 복잡한 이종 질병이다. 일단 환자가 결장직장암에 대한 치료를 받으면 재발 가능성은 종양이 대장 벽을 투과하는 정도 및 혹의 존재 여부와 관련되어 있다. 이들 특징이 듀크(Duke)의 분류에 의해 정의된 현재의 병기(staging) 시스템의 근거가 된다. 듀크 A 질병은 결장 또는 직장의 점막하 층으로 한정된다. 듀크 B 종양은 고유근육층을 통해 침투하고, 결장이나 직장 벽을 투과할 수 있다. 듀크 C 질병은 국부적 림프절 전이된 어느 정도의 대장 벽 침투를 포함한다.

외과적 절제는 초기 단계의 결장직장암의 경우 매우 효과적이어서, 듀크 A 환자의 경우 95%의 치유율, 듀크 B 환자의 경우 75%의 치유율을 제공한다. 듀크 C 환자에서 양성 림프절이 존재하는 경우는 5년 이내에 60%의 재발 가능성이 예상된다. 듀크 C 환자를 외과수술 후 화학치료 코스에 따라 치료하면 재발율이 40 내지 50%로 감소되고, 이런 치료가 현재 듀크 C 환자에 대한 표준 치료법이다. 듀크 B 환자의 경우 재발율이 비교적 낮기 때문에 외과수술 후 화학치료의 이점을 찾아내기가 더 어려워서 이 환자의 경우는 화학치료가 아직 논쟁중이다. 그러나, 듀크 B 환자의 약 20-30%가 듀크 C 환자처럼 작용하여 5년 이내에 재발되므로, 듀크 B 분류는 불완전하다.

듀크 B 환자들을 재발하기 쉬운 이들과 질병을 극복할 이들로 선택할 기준으로 림프절의 연관성이 아닌 더 나은 예후 진단 인자를 확인할 필요가 분명히 있다.

본 발명은 결장직장암으로 진단되거나 치료되는 환자의 결장직장암의 재발 가능성을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유전자 발현 프로파일의 분석을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 유전자 발현 프로파일은 3개 이상의 유전자를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서, 유전자 발현 프로파일은 4개 이상의 유전자를 포함한다.

본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 제품 또한 본 발명의 한 양태이다. 이런 제품은 유전자 발현 프로파일, 또는 컴퓨터 판독 매체와 같은 기계로 판독가능한 매체에 고정된 이들의 표시자(representation)를 포함한다.

유전자 발현 프로파일을 확인하는데 사용된 제품은 또한 유전자 발현의 존재 유무 또는 발현 정도를 포획하고/포획하거나 나타내는 마이크로어레이와 같은 기판 또는 표면을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서는, 키트는 결장직장암 재발의 유전자 발현 분석 예후 진단을 수행하기 위한 약물들을 포함한다.

조직 시료 중에서 특정한 핵산 서열의 단순한 존재 여부가 진단 또는 예후 진단 가치를 갖는 것으로 발견된 적은 거의 없다. 한편, 다양한 단백질, 펩티드 또는 mRNA의 발현에 대한 정보는 갈수록 중요한 것으로 보인다. 단순히 게놈 내부에 단백질, 펩티드 또는 mRNA("유전자"로서 언급되는 이런 서열)을 발현할 능력을 갖는 핵산 서열이 존재한다는 것 만으로는 주어진 세포에서 단백질, 펩티드 또는 mRNA가 발현되는지 여부에 결정적이지 않다. 주어진 유전자가 단백질, 펩티드 또는 mRNA를 발현할 수 있는 지의 여부, 그리고, 발현된다면 어느 정도까지 발현되는지의 여부는 다양한 복합 인자에 의해 결정된다. 이들 인자의 이해와 평가의 곤란성과는 무관하게, 유전자 발현의 분석은 종양발생, 전이, 세포사멸(apoptosis) 및 다른 임상학적으로 연관된 현상과 같은 중요한 사건의 발생에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 유전자가 활성이거나 불활성인 정도의 상대적인 표시는 유전자 발현 프로파일에서 발견될 수 있다. 본 발명의 유전자 발현 프로파일은 결장직장암 환자의 예후 진단 및 치료를 제공하는데 유용하다.

시료 준비에는 환자 시료의 수집이 요구된다. 본 발명의 방법에 사용되는 환자 시료는 결장 시료 또는 적출 경계면로부터 취한 상피 세포와 같은 질병에 걸린 세포를 함유하는 것으로 의심되는 것들이다. 의심 시료를 수득하기 위한 한가지 유용한 기법은 레이저 캡쳐 마이크로디섹션(LCM, Laser Capture Microdisection)이다. LCM 기법은 세포 유형 이종성에 의해 야기되는 다양성을 최소화하면서 연구할 세포를 선택하는 방법을 제공한다. 결과적으로 정상적인 세포와 암 세포 사이의 유전자 발현에서의 적당하거나 작은 변화가 쉽게 검출될 수 있다. 바람직한 방법에서, 시료는 말초 혈액으로부터 추출된 순환하는 상피 세포를 포함한다. 이들은 다수의 방법에 따라 수득될 수 있지만, 가장 바람직한 방법은 본원에 참고로 인용되어 있고 이뮤니베스트 코포레이션(Immunivest Corp.)에게 양도된 미국 특허 제 6,136,182 호에 개시되어 있는 자기(magnetic) 분리 기법이다. 일단 대상 세포를 함유하고 있는 시료가 수득되면 RNA를 추출하여 증폭시키고, 적절한 포트폴리오 내의 유전자에 대한 유전자 발현 프로파일을 바람직하게는 마이크로어레이를 통해 수득한다.

유전자 발현 프로파일을 확립하기 위한 바람직한 방법은 단백질 또는 펩티드를 암호화할 수 있는 유전자가 생성하는 RNA 양의 측정을 포함한다. 이는 역전사효소 PCR(RT-PCR), 경쟁성 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차동 디스플레이 RT-PCR, 노던 블럿(Northern Blot) 분석 및 다른 연관된 시험에 의해 달성된다. 개별적인 PCR 반응을 이용하여 이들 기법을 수행하는 것도 바람직하지만, mRNA로부터 생성된 상보성 DNA(cDNA) 또는 상보성 RNA(cRNA)를 증폭하고 이를 마이크로어레이를 통해서 분석하는 것이 가장 좋다. 이들을 제조하기 위한 다양한 여러 상이한 어레이 배열 및 방법은 당 분야의 숙련된 이들에게 공지되어 있고 본원에 참고로 인용되어 있는 다음과 같은 미국 특허에 개시되어 있다: 제5,445,934호, 제5,532,128호, 제 5,556,752호, 제5,242,974호, 제5,384,261호, 제5,405,783호, 제5,412,087호, 제5,424,186호, 제5,429,807호, 제5,436,327호, 제5,472,672호, 제5,527,681호, 제5,529,756호, 제5,545,531호, 제5,554,501호, 제5,561,071호, 제5,571,639호, 제5,593,839호, 제5,599,695호, 제5,624,711호, 제5,658,734호 및 제5,700,637호.

마이크로어레이 기법으로 인해 수천 개의 유전자의 정상 상태 mRNA 수준을 동시에 측정할 수 있어서 통제되지 않는 세포 증식의 개시, 정지 또는 조절과 같은 효과를 확인하기 위한 막강한 수단이 제공된다. 현재 2개의 마이크로어레이 기법이 널리 사용되고 있다. 첫 번째는 cDNA 어레이이고 두 번째는 올리고뉴클레오티드 어레이이다. 비록 이들 칩의 구성에 차이가 존재하기는 하지만, 본질적으로 모든 다운스트림의 데이터 분석 및 아웃풋은 동일하다. 이들 분석의 결과는 전형적으로 마이크로어레이의 공지된 위치에서 핵산 서열에 하이브리드화하는 시료로부터 나온 cDNA 서열을 검출하는데 이용되는 표지된 프로브로부터 받은 신호의 강도 측정이다. 전형적으로, 신호의 강도는 시료 세포에서 발현되는 cDNA, 및 따라서 mRNA의 양에 비례한다. 많은 수의 이런 기법이 이용가능하고 유용하다. 유전자 발현을 측정하는 바람직한 방법은 린슬리(Linsley) 등의 미국 특허 제 6,271,002 호; 프렌드(Friend) 등의 제 6,218,122 호; 펙(Peck) 등의 제 6,218,114 호; 및 왕(Wang) 등의 제 6,004,755 호에서 발견되고, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.

발현 수준의 분석은 이런 강도를 비교함으로써 달성된다. 이는 시험 시료중의 유전자의 발현 강도 대 대조군 시료의 유전자의 발현 강도의 비율 행렬을 만듬으로써 가장 잘 수행된다. 예를 들면 질병에 걸린 조직에서 나온 유전자 발현 강도를 동일한 유형의 정상 조직에서 생성된 발현 강도(예를 들면 질병에 걸린 결장 시료 대 정상 결장 조직 시료)와 비교할 수 있다. 이들 발현 강도의 비는 시험 시료와 대조군 시료 사이의 유전자 발현의 배수 변화를 나타낸다.

유전자 발현 프로파일은 또한 다수의 방식으로 디스플레이될 수 있다. 가장 흔한 방법은 가공되지 않은 형광 강도 또는 비 행렬을 열이 시험 시료이고 행이 유전자를 나타내는 그래픽 덴도그램(dendogram)으로 배열하는 것이다. 유사한 발현 프로파일을 갖는 유전자가 서로 근접하도록 자료를 배열한다. 각각의 유전자에 대한 발현 비는 색으로 가시화된다. 예를 들면 1 미만의 비(하향 조절을 나타낸다)는 스펙트럼의 청색 부분에 나타날 수 있고, 1 초과의 비(상향 조절(up regulation)을 나타낸다)는 스펙트럼의 적색 부분에서 색으로 나타날 수 있다. 실리콘 제네틱스 인코포레이티드(Silicon Genetics Inc.)의 "GENESPRINT" 및 파르텍 인코포레이티드(Partek, Inc.)의 "DISCOVERY" 및 "INFER"를 비롯한 시판되는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이런 데이터를 디스플레이하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에 이용되는 조절된 유전자는 실시예에 개시되어 있다. 차등 발현되는 유전자는 재발되지 않은 환자에 대해 결장암이 재발된 환자에서는 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상향 조절 및 하향 조절은 일부 기준선에 비해 유전자의 발현 양에서 (이를 측정하기 위해 사용되는 시스템에서 잡음 기여분을 초과하는) 검출가능한 차이가 발견됨을 의미하는 상대적인 용어이다. 이 경우, 기준선은 재발되지 않은 환자의 측정된 유전자 발현이다. (재발된 환자의) 질병에 걸린 세포에서 조사 유전자는 동일한 측정 방법을 이용한 기준선 수준에 비해 상향 조절되거나 하향 조절된다. 여기서 "질병에 걸린"이란 세포의 증식이 통제되지 않았을 때 일어나는 것과 같은 신체 기능의 적절한 수행이 차단되거나 방해되거나 또는 방해될 가능성이 있는 신체 상태의 변화를 의미한다. 어떤 사람의 유전형 또는 표현형의 일부 양태가 질병의 존재와 일치하는 경우 그 사람은 질병이 있는 것으로 진단된다. 그러나, 진단 또는 예후 진단하는 행위는 재발 가능성 판단 및 치료 모니터링과 같은 질병/상태의 측정을 포함한다. 치료 모니터링에서는, 유전자 발현 프로파일이 변화되었는지 또는 정상 조직과 보다 일치하는 패턴으로 변화되었는지를 결정하기 위해 시간에 걸쳐 유전자의 발현을 비교함으로써 주어진 치료 과정의 효과에 대해 임상적으로 판단한다.

바람직하게는, 상향 조절의 수준 및 하향 조절의 수준은 하이브리드된 마이크로어레이 프로브의 강도 측정의 배수 변화에 근거하여 식별된다. 이렇게 구별하기 위해서는 2.0배 차이 또는 0.05 미만의 p 값이 바람직하다. 즉, 유전자가 정상/비-재발 세포에 대해 질병에 걸린/재발된 세포에서 차등 발현된다고 말하기 위해서는 질병에 걸린 세포가 정상 세포에 비해 최소한 2배 더 강하거나 또는 2배 더 약한 강도를 생성하는 것으로 발견되어야 한다.

배수 차이가 더 커질수록, 유전자를 진단 또는 예후 진단 수단으로서 사용하기가 더 바람직하다. 본 발명의 유전자 발현 프로파일에 대해 선택되는 유전자는 임상 실험 수단을 이용하여 배경 값을 초과하는 양으로 정상 또는 비-조절된 유전자의 신호와는 구별되는 신호를 생성하는 발현 수준을 갖는다.

통계학적 값을 사용하여 비-조절된 유전자와 잡음으로부터 조절된 유전자를 확실하게 식별할 수 있다. 통계학적 검증이 다양한 그룹의 시료 사이에서 가장 유의하게 상이한 유전자를 발견한다. 스튜던트(Student)의 t-검증은 두 개의 그룹사이에서 유의한 차이를 발견하는데 사용될 수 있는 강건한 통계학적 검증의 한 예이다. p 값이 더 낮을수록, 유전자가 서로 다른 그룹 사이에서 차이를 나타내는 증거가 더 강해진다. 그럼에도 불구하고, 마이크로어레이 측정이 한번에 하나 이상의 유전자를 측정하기 때문에 한번에 수만개의 통계학적 검증이 요구된다. 이 때문에, 단지 우연히 작은 p 값을 보기는 어렵고, 무작위화/치환 실험뿐만 아니라 시닥(Sidak) 보정을 이용하여 이를 조절할 수 있다. t-검증에 의한 0.05 미만의 p 값은 유전자가 유의하게 상이하다는 증거이다. 보다 강한 증거는 시닥 보정이 계산된 후에도 0.05 미만인 p 값이다. 각 그룹의 커다란 수의 시료의 경우, 무작위화/치환 시험 후에도 0.05 미만인 p 값이 유의한 차이의 가장 강한 증거이다.

비-조절된 유전자 또는 잡음의 신호보다 더 큰 신호를 생성하는 유전자를 선택하는데 사용할 수 있는 다른 변수는 절대적 신호 차이의 측정을 이용하는 것이다. 바람직하게는 조절된 유전자 발현에 의해 생성된 신호는 정상 또는 비-조절된 유전자(절대 기준)의 신호에 비해 20% 이상 차이가 난다. 이런 유전자가 정상 또는 비-조절된 유전자의 신호와 30% 이상 차이가 나는 발현 패턴을 나타내는 것이 보다 더 바람직하다.

유전자들을 그룹으로 묶어서 그룹의 유전자 세트에 대해 수득된 정보가 진단, 예후 진단 또는 치료법 선택과 같은 임상적으로 연관된 판단을 하기 위한 적절한 근거를 제공할 수 있다. 이들 유전자 세트가 본 발명의 포트폴리오를 구성한다. 이 경우, 포트폴리오에 의해 지지되는 판정에는 결장직장암이 포함된다. 대부분의 진단 표지에서처럼, 정확한 의학적 판단을 하기에 충분한 최소한의 수의 표지를 사용하는 것이 종종 바람직하다. 이는 시간과 자원의 부적절한 사용뿐만 아니라 추가의 분석을 기다리는 동안 치료가 지연되는 것을 방지한다.

바람직하게는, 포트폴리오의 유전자의 조합이 개별적인 유전자 또는 무작위로 선택된 유전자의 조합에 비해 개선된 민감성 및 특이성을 나타내도록 포트폴리오가 확립된다. 본 발명에서, 포트폴리오의 민감성은 정상적인 상태에 비해 질병에 걸린 상태에서 유전자의 발현이 나타내는 배수 차이에 반영될 수 있다. 특이성은 대상이 되는 질병과 유전자 발현의 신호화의 연관성의 통계학적 측정에 반영될 수 있다. 예를 들면 표준 편차는 이런 측정법으로 이용될 수 있다. 포트폴리오에 포함되기 위한 유전자 그룹을 고려할 때 발현 측정에서 더 작은 표준 편차는 더 큰 특이성과 관련된다. 상관 계수와 같은 다른 측정 변수 또한 이 능력에 사용될 수 있다.

유전자 발현 포트폴리오를 확립하는 바람직한 방법은 주식 포트폴리오를 확립하는데 광범위하게 사용되는 평균 분산 알고리듬과 같은 최적화 알고리듬을 이용한다. 이 방법은 2003년 3월 21일자로 출원된 팀 자트코에(Tim Jatkoe)의 발명의 명칭이 "포트폴리오 선택"인 특허 문헌에 자세하게 개시되어 있다. 본질적으로 이 방법은 이익의 변동을 최소화하면서 인풋 세트를 이용하여 받은 이익(예를 들면 생성된 신호)을 최적화할 인풋 세트(재무 용도에서는 주식이고, 여기서는 강도에 의해 측정되는 발현이다)의 확립을 요구한다. 많은 시판되는 소프트웨어 프로그램이 이런 조작을 수행하는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 "와그너 소프트웨어(Wagner Software)"로 언급되는 "와그너 어소시에이츠 민-배리안스 옵티미제이션 어플리케이션(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application)"이 바람직하다. 이 소프트웨어는 "와그너 어소시에이츠 민-배리안스 옵티미제이션 라이브러리(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library)"에서 나온 함수를 이용하여 효율 한계를 결정하고, 마르코비츠(Markowitz) 측면에서 최적의 포트폴리오가 바람직하다.

이 유형의 소프트웨어를 이용하기 위해서는 소프트웨어가 의도된 재무 분석 목적을 위해 사용될 때 주식의 이익 및 위험 측정이 사용되는 방식으로 인풋으로써 처리될 수 있도록 마이크로어레이 자료가 변환되어야만 한다. 예를 들면 와그너 소프트웨어가 마이크로어레이 강도 측정과 연관되어 사용되는 경우 다음과 같은 자료 전환 방법이 사용된다.

먼저 발현이 최소한 어느 정도 최소 수준의 차이를 보이는 유전자를 확인함으로써 유전자를 예비 선택한다. 바람직한 예비-선택 과정은 다음과 같이 수행된다. 기준선 등급을 선택한다. 전형적으로 이는 대상 질환을 갖지 않는 집단에서 나온 유전자를 포함할 것이다. 예를 들면, 재발 결장암을 진단하는 유전자 포트폴리오를 선택하고자 한다면, 재발되지 않은 환자로부터의 시료를 이용하여 기준선 등급을 만들 수 있다. 일단 기준선 등급이 선택되면, 기준선 등급 시료에 대한 각각의 유전자의 유전자 발현의 표식에 대한 산술 평균 및 표준 편차를 계산한다. 이 표식은 전형적으로 마이크로어레이 판독에서의 형광 강도이다. 그런 다음, 계산된 통계학적 자료를 이용하여 각각의 유전자에 대한 (X * 표준 편차 + 평균)의 기준선 값을 계산한다. 이는 모든 다른 시료가 비교되는 유전자에 대한 기준선 판독이다. X는 포트폴리오를 제조하는 사람이 선택하는 엄격도 변수이다. X 값이 높으면 낮은 경우보다 더 엄격하다. 바람직하게는 X는 0.5 내지 3의 범위이고, 2 내지 3이 보다 바람직하고, 3이 가장 바람직하다.

그런 다음, 각각의 실험 시료(대상 질환을 나타내는 이들)와 기준선 판독 사이의 비를 계산한다. 그런 다음 비를 소프트웨어에서 쉽게 자료를 다루기 위해 상용 로그 값으로 변환시킨다. 이로 인해 하향 조절되는 유전자는 와그너 소프트웨어를 이용한 마크만(Markman) 평균-분산 알고리듬에 따라 최적화하는데 필요한 음의 값을 나타낼 수 있다.

이들 전환 비를 포함한 전처리된 자료를, 재무 분석 목적으로 사용하는 경우 와그너 소프트웨어에서 통상적으로 사용되는 자산 이익 값 대신 인풋으로 사용한다.

일단 효율 경계가 만들어지면, 최적화된 포트폴리오는 경계 상의 점에 상응하는 주어진 인풋 수준(이익) 또는 분산에 대해 선택된다. 이들 인풋 또는 분산은 포트폴리오를 만드는 사람이 설정한 예비결정된 표준들이다. 달리 말하자면, 최적 의 포트폴리오를 추구하는 이가 허용가능한 인풋 수준(민감성의 지표) 또는 주어진 분산 수준(특이성의 지표)을 결정하고, 인풋 수준 또는 분산에 상응하는 효율 경계에 따라 있는 유전자들을 선택한다. 와그너 소프트웨어는 인풋 수준 또는 분산이 선택되는 경우 이런 유전자들을 선택할 수 있다. 또한 주식 포트폴리오에서 주식에 그러하듯이 포트폴리오의 각 유전자에 가중치를 부가할 수 있다.

시료가 포트폴리오가 진단하고자 하는 질환을 갖고 있는지 여부는 포트폴리오를 확립하는데 사용된 차등 발현되는 유전자의 계산된 값과 환자 시료에 대한 포트폴리오 중의 유전자의 발현을 비교함으로써 결정될 수 있다. 바람직하게는, 포트폴리오 값은 먼저 포트폴리오의 각 유전자의 강도 값과 포트폴리오 선택 과정에서 그 유전자에 할당된 가중치를 곱한 값을 합하여 만들어진다. 그런 다음, 경계 값을 (Y * 표준 편차 + 기준선 그룹에 대한 포트폴리오 값의 평균)에 의해 계산하고, 여기서 Y는 상기 정의된 X와 동일한 의미를 갖는 엄격도 값이다. 그런 다음, 기준선 계급의 포트폴리오 값보다 더 큰 포트폴리오 값을 갖는 시료를 질환을 갖는 계급으로 분류한다. 바람직한 경우, 이 과정을 신뢰성 수준을 개선시키기 위해 잘 공지된 통계학적 방법에 따라 반복 수행할 수 있다.

선택적으로는 최고의 예측 정확도가 수득될 때까지 반복할 수 있다.

미지의 포트폴리오 선택 및 특성화 과정은 다음과 같이 요약된다:

1. 기준선 계급을 선택한다.

2. 기준선 계급 시료에 대한 각각의 유전자의 평균 및 표준 편차를 계산한다.

3. 각각의 유전자에 대해 계산한다(X * 표준 편차 + 평균). 이것이 모든 다른 시료가 비교될 기준선 판독값이다. X는 엄격도 변수로서 X 값이 더 높으면 낮은 것보다 더 엄격하다.

4. 단계 3에서 계산한 기준선 판독 값에 대한 각 실험 시료의 비를 계산한다.

5. 1 미만의 비율이 음수가 되도록 비를 변환시킨다(예를 들면 상용로그 사용)(하향 조절된 유전자는 이제 MV 최적화에 필요한 음의 값을 정확하게 갖는다).

6. 이들 변환된 비를 소프트웨어 용도에서 일반적으로 사용된 자산 이익 대신 인풋으로 사용한다.

7. 소프트웨어는 효율 경계와 이익을 플롯팅하고, 포트폴리오를 효율 경계에 따른 임의의 점에서 최적화한다.

8. 효율 경계에서 바람직한 이익 또는 분산을 선택한다.

9. 각각의 유전자의 강도 값을 포트폴리오 선택 알고리듬에 의해 발생된 가중치와 곱한 값들을 합하여 각 시료에 대한 포트폴리오 값을 계산한다.

10. 기준선 그룹에 대한 평균 포트폴리오 값을 Y와 기준선 포트폴리오 값의 표준 편차의 곱에 더함으로써 경계 값을 계산한다. 이 경계 값보다 더 큰 값이 실험 계급으로 분류될 것이다.

11. 선택적으로 최상의 예측 정확성이 달성될 때까지 이 과정을 반복할 수 있다.

다르게는, 먼저 발현이 일부 최소한의 차이 수준을 보이는 유전자를 확인함으로써 유전자들을 예비선택할 수 있다. 이 다른 방법에서의 예비 선택은 바람직하게는 하기 수학식 1에 의해 주어진 문턱 값에 근거한다:

상기 식에서,

μ_t은 질병 또는 질환을 갖는 것으로 알려진 부분 집합의 평균이고,

μ_h는 정상적인 시료의 부분 집합의 평균이고,

σ_t+σ_n은 조합된 표준 편차를 나타낸다.

또한 예를 들면

와 같은 관계에 따라 자료를 예비 선택함으로써, 잡음에 대한 신호의 절사(cutoff)를 사용할 수 있다. 이는 서로 다른 조절에 근거하여 예비선택된 유전자가 임상적으로 유의한 방식으로 식별됨을 보증한다. 즉, 장치의 잡음 수준 이상이 진단 변수의 측정 과제에 사용된다. 이들 기준에 따라 미리 선택된 각각의 표지의 경우, 열이 시료를 나타내고, 행이 표지를 나타내고, 각각의 요소가 관계

(여기서, I는 강도 측정이다)에 따른 표지의 발현에 대한 정상화된 강도 측정인 행렬이 확립된다.

최적의 포트폴리오를 한정하는 추가의 경계 조건을 설정하는 것 또한 가능하다. 예를 들면 포트폴리오 크기는 표지의 고정된 범위 또는 수로 한정될 수 있다. 이는 예비 선택 기준을 보다 엄격하게 만들거나(예를 들면

대신

), 또는 포트폴리오 크기의 한정과 같은 프로그래밍 특징을 이용함으로써 행해질 수 있다. 예를 들면, 효율 경계가 가장 최적의 10개의 유전자 중에서만 선택되도록 경계 조건을 설정할 수 있다. 또한 효율 경계의 측정을 위해 예비 선택된 유전자 모두를 사용한 후, 선택되는 유전자의 수를 (예를 들면 10 이하로) 한정할 수도 있다.

포트폴리오의 선택 과정은 또한 발견적(heuristic) 규칙의 적용을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이런 규칙은 생물학과 임상적 결과를 만들어내는데 사용되는 기법의 이해에 근거하여 만들어진다. 보다 바람직하게는, 이들은 최적화 방법으로부터의 아웃풋에 적용된다. 예를 들면, 포트폴리오 선택의 평균 분산 방법은 결장직장암을 가진 환자에서 차등 발현되는 다수의 유전자에 대한 마이크로어레이 자료에 적용될 수 있다. 방법으로부터 나온 아웃풋은 질병에 걸린 조직뿐만 아니라 말초 혈액에서 발현되는 일부 유전자를 포함할 수 있는 최적화된 유전자 세트일 것이다. 만약 시험 방법에 사용된 시료가 말초 혈액에서 수득되고, 유방암의 경우 차등 발현되는 일부 유전자가 또한 말초 혈액에서도 차등 발현된다면, 말초 혈액에서 차등 발현되는 것들을 배제하는 효율 경계로부터 포트폴리오가 선택되는 발견적 규칙이 적용될 수 있다. 물론, 예를 들면 자료의 예비 선택동안 규칙을 적용함으로써 효율 경계의 형성 전에 규칙을 적용할 수 있다.

문제가 되는 생물학과 반드시 연관될 필요는 없는 다른 발견적 규칙이 적용될 수 있다. 예를 들면, 포트폴리오의 주어진 비율만이 특정한 유전자 또는 유전자들로 표현될 수 있다는 규칙을 적용할 수 있다. 와그너 소프트웨어와 같은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어는 이런 유형의 발견적 방법에 쉽게 적응된다. 예를 들면 정확도와 정밀성 이외의 인자(예를 들면 예상되는 라이센스 비용)가 하나 이상의 유전자를 포함하는 것이 바람직한 지에 대해 영향을 미치는 경우 이것이 유용할 수 있다.

본 발명의 한 방법은 예후 진단을 설명하는데 다양한 유전자(또는 포트폴리오)에 대한 유전자 발현 프로파일을 비교함을 포함한다. 포트폴리오를 구성하는 유전자 각각의 유전자 발현 포트폴리오는 컴퓨터 판독형 매체와 같은 매체에 고정된다. 이는 다수의 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 질병을 나타내는 신호(예를 들면 강도 측정)의 범위가 입력되는 표가 확립될 수 있다. 그런 다음, 실제 환자의 자료를 표에 있는 값과 비교하여 환자의 시료가 정상적인지 질병에 걸려 있는지를 결정한다. 보다 정교한 양태에서는, 발현 신호의 패턴(예를 들면 형광 강도)이 디지털 또는 그래프로 기록된다. 그런 다음, 환자 시료와 연관되어 사용되는 유전자 포트폴리오로부터의 유전자 발현 패턴을 발현 패턴과 비교한다. 그런 다음, 패턴 비교 소프트웨어를 이용하여 환자의 시료가 질병의 재발을 나타내는 패턴을 갖는 지를 결정한다. 물론, 이들 비교는 또한 환자가 질병 재발을 경험할 것 같지 않은 지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 시료의 발현 프로파일을 대조군 세포의 포트폴리오와 비교한다. 시료의 발현 패턴이 결장직장암의 재발의 발현 패턴과 일치한다면(이를 상쇄하는 의학적 고려 없이), 환자는 재발 환자를 치료하는 것처럼 치료된다. 시료의 발현 패턴이 정상/대조군 시료의 발현 패턴과 일치한다면, 환자는 결장직장암에 대해 음성으로 진단된다.

다양한 잘 공지된 패턴 인식 방법이 이용가능하다. 다음의 참고 문헌들은 일부 예를 제공한다:

가중치 부여:

문헌(Golub, TR. Slonim, DK., Tamaya, P. Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov, JP., Coller, H., Loh, L., Downing, JR., Caligiuri, MA., Bloomfield, CD., Lander, ES., Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286: 531-537, 1999)

지지 벡터 기계:

문헌(Su, AI., Welsh, JB., Sapinoso, LM., Kern, SG., Dimitrov, P., Lapp, H., Schultz, PG., Powell, SM., Moskaluk, CA., Frierson, HF. Jr., Hampton, GM., Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures, Cancer Research 61: 7388-93, 2001); 및 문헌(Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, CH., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, JP., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, ES., Gould, TR., Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98: 15149-15154, 2001)

삭제

K-최근접 이웃거리(K-nearest Neighbor):

문헌(Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, CH., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, JP., Poggic, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, ES., Gould, TR., Muticlass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 98: 15149-15154, 2001)

상관 계수:

문헌(van't Veer LJ., Dai H., van de Vijver MJ., He YD., Hart AA., Mao M., Peterse HL., van der Kooy K., Marton MJ., Witteveen AT., Schreiber GJ., Kerkhoven RM., Roberts C., Linsley PS., Bernards R., Friend SH., Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer); 및 문헌(Nature, 2002, Jan. 31: 415(6871): 530-6)

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본 발명의 유전자 발현 프로파일은 또한 암 진단, 예후 진단 또는 치료 모니터링에 유용한 다른 비-유전적 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 상황에서는, 상기 개시된 유전자 발현에 근거한 방법의 진단력을 혈청 단백질 표지(예를 들면 종양배아 항원)와 같은 통상적인 표지와 조합하는 것이 유리하다. CEA와 같은 분석물을 비롯한 일정 범위의 이런 표지가 존재한다. 한 이런 방법에서는 치료된 환자로부터 주기적으로 혈액을 채취한 후, 상기 개시된 혈청 표지 중 하나에 대해 효소 면역분석한다. 표지의 농도가 종양이 재발하거나, 치료가 실패한 것을 나타내면, 유전자 발현 분석에 맞는 시료 공급원을 취한다. 의심스러운 덩어리가 존재하는 경우, 미세한 바늘로 빨아내어서, 덩어리에서 나온 세포의 유전자 발현 프로파일을 상기 개시된 바와 같이 분석한다. 다르게는, 조직 시료를 이전에 종양이 제거된 조직과 인접한 영역으로부터 취할 수 있다. 이 방법은 다른 시험 결과가 애매한 경우 특히 유용하다.

본 발명의 제품은 질병의 치료, 진단, 예후 진단 및 다른 평가에 유용한 유전자 발현 프로파일의 표시자를 포함한다. 이 프로파일 표시자는 컴퓨터 판독 매체(자기, 광학 등)와 같은 기계에 의해 자동적으로 판독될 수 있는 매체로 환원된다. 제품은 또한 이런 매체에서 유전자 발현 프로파일을 평가하기 위한 장치를 포함한다. 예를 들면 제품은 상기 개시된 유전자의 포트폴리오의 유전자 발현 프로파일을 비교하기 위한 컴퓨터 지침서를 갖는 CD ROM을 포함할 수 있다. 제품은 또한 환자의 시료에서 나온 유전자 발현 자료와 비교할 수 있도록 디지털로 기록된 유전자 발현 프로파일을 가질 수 있다. 다르게는, 프로파일은 다른 표시자 포맷으로 기록될 수 있다. 그래픽 기록도 이런 형태 중 하나이다. 상기 언급된 파르텍 인코포레이티드의 "DISCOVERY" 및 "INFER" 소프트웨어에 들어있는 것과 같은 군집(clustering) 알고리듬이 이런 자료의 시각화를 가장 잘 돕는다.

본 발명에 따라 제조된 상이한 유형의 제품은 유전자 발현 프로파일을 드러내는데 사용되는 매체 또는 형식화된 분석법이다. 이들은 예를 들면 서열 상보체 또는 프로브가 대상 유전자를 나타내는 서열이 조합되어 있는 매트릭스에 고정되어 이들의 존재에 대한 판독가능한 결정 요소를 생성하는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 제품은 결장직장암을 검출하기 위한 대상 유전자와 하이브리드하고, 이를 증폭시키고, 이의 발현 수준을 나타내는 신호를 생성시키기 위한 시약 키트로 만들어질 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위한 공식화된 분석법을 포함한다. 이들은 시약 및 지침서와 같은 분석을 행하는데 필요한 모든 또는 일부 물질을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 하기의 비-한정적인 실시에에 의해 추가로 예시된다.

실시예

본 발명에 따라 분석되는 유전자는 전형적으로 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위해 암호화하는 전체 길이 핵산 서열과 연관되어 있다. 당분야의 숙련된 이들은 분석적인 관점에서 전체 길이 서열의 확인이 반드시 필요하지는 않다는 것을 인식할 것이다. 즉, 상응하는 유전자의 유전자 발현을 평가하기 위해 고안될 수 있는 프로브에 대해 잘 공지되어 있는 원칙에 따라 서열의 일부 또는 EST가 선택될 수 있다.

실시예 1: 시료 취급 및 LCM

결장직장 종양으로 인해 수술을 받은 환자로부터 막 냉동된 조직 시료를 수집하였다. 사용되는 시료는 표준 임상 진단 및 병리학에 따라 듀크 B 단계인 63명의 환자로부터 얻었다. 환자들의 임상학적 결과는 알려져 있다. 환자 중 36명은 3년 이상 동안 질병이 없는 상태로 남아 있었고, 27명의 환자는 3년 이내에 종양이 재발되었다.

조직을 수확한 지 20 내지 30분 이내에 액체 질소에서 가볍게 냉동시키고, 그런 다음 -80℃에서 저장하였다. 레이저 캡쳐를 위해서, 시료를 절단(6㎛)하고, 하나의 절단체를 유리 슬라이드에 올려놓고, 제 2의 절단체는 필름(P.A.L.M.)에 올려놓고, 이 필름을 유리 슬라이드(미국 펜실베니아주 메디아 소재의 VWR 사이언티픽(VWR Scientific)의 마이크로 슬라이드 컬러프로스트(Micro Slides Colorfrost))에 고정시켰다. 유리 슬라이드상에 탑재된 절단체를 찬 아세톤에서 고정시킨 후 메이어(Mayer) 하에마톡실린(Haematoxylin)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))으로 염색하였다. 병리학자가 진단을 위해 시료를 분석하고 등급을 매겼다. 수반하는 외과 병리학 및 임상 보고서로부터 임상 단계를 평가하여 듀크 등급을 확인하였다. 필름에 탑재된 절단체를 100% 에탄올에서 5분 동안 고정시킨 후, 에오신/100% 에탄올(100ml의 탈수된 에탄올중의 에오신 100㎍)중에서 1분간 역염색시키고, 100% 에탄올에서 한차례 신속하게 함침시켜 유리 염색을 제거하고, 10분간 공기 건조시켰다.

LCM에서 사용하기 전에, 막(독일 베른리드 소재의 P.A.L.M. GmbH 마이크로레이져 테크놀로지(Microlaser Technologie)의 LPC-MEMBRANE PEN FOIL 1.35㎛ No 8100) 및 슬라이드를 전처리하여 RNA 분해효소를 파괴하고 필름상에 조직 시료의 부착을 개선하였다. 간략하게, 슬라이드를 DEP H₂O로 세척하고, 필름을 RNase AWAY(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 몰레큘라 바이오프로덕츠 인코포레이티드(Molecular Bioproducts, Inc.))에서 세척하고, DEP H₂O에서 세정하였다. 필름을 유리 슬라이드 상에 부착한 다음, 슬라이드를 +120℃에서 8시간동안 굽고, TI-SAD(미국 캘리포니아주 로스 앤젤레스 소재의 디아그노스틱 프로덕츠 코포레이션(Diagnostic Products Corporation), DEP H₂O중의 1:50, 탈지면으로 여과)로 처리하고, +37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 사용하기 바로 직전에, 10㎕ 분획의 RNA 분해효소 억제제 용액(독일 만하임 소재의 프로메가 게엠베하(Promega GmbH)의 알엔에이신(Rnasin) 억제제 2500U = 33U/㎕ N211A, 400㎕의 냉동 용액중의 0.5㎕, 0.15몰의 NaCl, 10mmol의 트리스, pH 8.0, 0.25mmol의 디티오트레이톨 함유)을 조직 시료가 탑재될 필름 상에 발랐다.

필름상에 탑재되어 있는 조직 단편을 LCM을 위해 이용하였다. 약 2000개의 상피 세포/시료를 PALM 로봇-마이크로빔 기법을 이용하여 포획하고(미국 뉴욕주 쏜우드 소재의 칼 제이쓰 인코포레이티드(Carl Zeiss, Inc.)의 P.A.L.M. 마이크로레이저 테크롤로지)), 제이스 액시오버트(Zeiss Axiovert) 135 현미경(독일 제나 소재의 칼 제이쓰 제나 게엠베하(Carl Zeiss Jena GmbH))에 커플링시켰다. 정상적인 점막에서 둘러싸고 있는 기질(stroma) 및 암 시료에서 간간이 개입되어 있는 기질 성분이 포함되었다. 포획된 세포를 100% 에탄올중의 튜브에 넣고 -80℃에서 보존하였다.

실시예 2: RNA 추출 및 증폭

자이모-스핀(Zymo-Spin) 컬럼(미국 캘리포니아주 92867 오렌지 소재의 자이모 리써치(Zymo Research))을 이용하여 LCM 포획된 시료로부터 총 RNA를 추출하였다. 약 2ng의 총 RNA를 10㎕의 물에 재현탁하고 2회의 T7 RNA 중합효소 증폭을 수행하여 약 50㎍의 증폭된 RNA를 생성하였다.

실시예 3: cDNA 마이크로어레이 하이브리드화 및 정량

아피메트릭스 인코포레이티드(Affymetrix, Inc.)에서 수득하고 시판되는 humanU133a 칩을 이용함으로써 약 23,000개의 인간 cDNA 클론으로 구성된 cDNA 마이크로어레이의 세트를 이용하여 시료를 시험하였다. 상기 개시된 바와 같이 수득되고 제조된 총 RNA를 칩에 적용하고, 제조자의 프로토콜에 따라 아길렌트 바이오애널라이저(Agilent BioAnalyzer)에 의해 분석하였다. 모든 63개의 시료는 품질 제어 기준을 통과하였고, 자료를 표지 선택하는데 이용하였다.

칩 강도 자료를 아피메트릭스 인코포레이티드에서 상업적으로 이용가능한 MAS 5.0버젼 소프트웨어("MAS 5.0")를 이용하여 분석하였다. 감독되지 않는 분석을 이용하여 다음과 같은 재발되지 않는 사람들로부터 재발될 환자를 구별하는 2가지 유전자를 확인하였다. 상기 개시된 바와 같이 수득된 칩 강도 자료는 파르텍 5.1 버전 소프트웨어로서 상업적으로 이용가능한 감독되지 않은 군집 소프트웨어를 위한 인풋이었다. 이 감독되지 않은 군집 알고리듬은 높은 재발 비율을 갖는 20명의 환자의 그룹을 확인하였다(13명의 재발 환자 및 7명의 생존자). 원래의 23,000개의 유전자로부터 t-검증 분석하여 이들 환자에서 유의하게 차등 발현되는 276개의 유전자를 선택하였다. 재발되지 않는 이들로부터 재발 환자를 가장 잘 식별하는 다음과 같은 2개의 유전자를 이 그룹으로부터 선택하였다: 인간의 내장 펩티드-연관된 운송 단백질(서열 번호: 3) 및 인간의 지방산 결합 단백질 1(서열 번호: 1). 이들 2가지의 유전자는 이 환자 그룹에서의 재발된 환자에서 하향 조절된다(사실, 이들은 스위치가 꺼지거나 발현되지 않는다). 이는 환자의 시료 번호(x-축)에 대한 신호 강도(y-축)가 플롯팅되어 있는 도 1 및 도 2에 나타나 있다.

그런 다음, 나머지 43명의 환자 중에서 재발하지 않은 이들로부터 재발된 환자들을 더욱 식별하기 위해 감독되는 분석을 실시하였다. 그런 다음, 이 그룹의 환자 자료를 다음과 같은 그룹으로 나누었다: 27명의 환자는 연습용 세트로 할당되었고, 16명의 환자는 시험용 세트로 할당되었다. 이는 동일한 자료가 표지를 확인하는데 사용된 후 이들의 유용성을 평가하는 두 경우 모두에 사용되지 않도록 보증한다.

연습용 세트에서는 불규칙 분산 t-검증을 수행하였다. 유의한 보정된 p 값을 갖는 28가지의 유전자 목록에서, MHC II-DR-B를 선택하였다. 이들 유전자는 재발 환자에서 하향 조절되었다. MHC II-DR-B(서열 번호: 2)는 또한 최소의 p 값을 가졌다(도 3a).

감독되는 분석의 추가 라운드에서는, 연습용 세트에서 생존자로부터 재발 환자를 분리하기 위해 상기 설명된 파르텍 버전 5.0 소프트웨어를 이용하여 선형 식별 분석을 위한 변수 선택 과정을 실시하였다. 조사 방법은 전진 선택법(forward selection)이다. 가장 낮은 사후 오차(posterior error)를 갖는 변수는 면역글로불린형 전사 5 단백질(서열 번호: 4)이었다(도 3b). 그런 다음, 콕스(Cox)의 비례 위험 모델(인사이트풀 인코포레이티드(Insightful, Inc.)의 "S Plus" 소프트웨어를 이용함)을 유전자 선택에 이용하여 생존 시간에 대해 상기 확인된 유전자 선택을 확인하였다. 총 27 사이클의 각 사이클에서, 연습용 세트의 27명의 환자 각각을 유지하고, 나머지 26명의 환자를 불변 콕스 모델 회귀에 이용하여 환자의 생존 시간과 유전자 발현의 연관 강도를 평가하였다. 이런 연관 강도는 상응하는 추정된 표준화된 변수 추정치 및 콕스 모델 회귀로부터 나온 p 값에 의해 평가된다. 0.01의 p 값을 하나를 제외하는 유전자 선택의 각 사이클로부터 상위 유전자를 선택하기 위한 문턱 값으로 사용하였다. 각 사이클에서 선택된 상부 유전자를 비교하여 총 27회인 하나를 제외하는 유전자 선택 사이클에서 26회 이상까지 나타나는 유전자를 선택하였다. 모두 70개의 유전자가 선택되었고 MHC II-DR-B 및 면역글로불린형 전사 5 단백질이 이들 중에 있었다(또다시 하향 조절을 나타낸다).

다발성-유전자 예측변수의 구성:

MHC II-DR-B 및 면역글로불린형 전사 5 단백질이라는 2개의 유전자를 이용하여 선형 식별 분석을 이용한 예측변수를 만들었다. 투표 점수는 재발의 사후 확률로 정의된다. 환자의 점수가 0.5를 초과하면, 환자는 재발 환자로 분류되었다. 환자의 점수가 0.5 미만이면, 환자는 생존자로 분류되었다. 예측 변수를 연습용 세트에서 시험하였다(표 1). 카플란-마이어 곡선을 예측된 재발 환자와 생존자에 대해 구성하였다(도 4).

교차 타당성 입증 및 예측변수의 평가:

대부분의 분류 방법이 그 방법을 확립하기 위해 사용된 실시예에서는 잘 작용하기 때문에, 예측변수의 성능을 독립적인 자료 세트에서 결정해야만 한다. 16명의 환자 시험 세트를 이용하여 예측의 정확성을 평가하였다. 분류에 대한 절사는 ROC 곡선을 이용하여 결정되었다(도 5). 선택된 절사를 이용하여, 시험용 세트에서 재발 환자와 생존 환자에 대한 정확한 예측의 수를 결정하고, 표 2에 요약하였다. 예측된 재발 환자와 생존 환자에 대한 카플란-마이어 곡선을 구축하였다(도 6).

전반적인 예상:

63명의 듀크 B 결장암 환자의 유전자 발현 프로파일로부터 이들 환자에서 다른 발현(하향 조절 또는 스위치가 꺼짐)을 갖는 4개의 유전자를 확인하였다. 이들 유전자는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4이다. 환자중 36명은 3년 이상 질병이 없는 상태로 남아있었지만, 27명의 환자는 3년 이내에 종양이 재발하였다. 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4의 3가지 유전자 표지 포트폴리오를 이용하여 27명의 재발 환자중 22명, 그리고 36명의 질병이 없었던 환자중 27명을 정확하게 확인하였다. 이 결과는 82%의 민감성 및 75%의 특이성을 나타낸다. 양의 예상 값은 71%였고, 음의 예상 값은 84%이다(도 3). 예상된 재발 환자와 생존 환자에 대해 카플란-마이어 곡선을 구축하였다(도 6).

본 발명의 프로파일을 구성하는 유전자는 아래에 설명되어 있다.

인간의 지방산 결합 단백질 1(FABP1):

인간의 간 지방산 결합 단백질(L-FABP) 유전자는 간 cDNA에서 최초로 확인되었다(스미쓰 LC(Smith LC)의 문헌[J. Biol. Chem. 260(5), 2629-2632(1985)]). L-FABP는 127개의 아미노산 잔기를 함유한다. 지방산 결합 단백질은 장쇄 지방산 및 다른 소수성 리간드에 결합하는, 작은, 매우 보존되어 있는, 세포질 단백질의 패밀리이다. FABP의 역할은 지방산의 섭취, 이동 및 대사를 포함하는 것으로 생각된다다. 이들은 또한 세포 성장 및 증식의 조절을 담당할 수 있다. L-FABP는 결장 조직에서 특이적으로 발현되는 I-FABP와 상당한 상동성을 공유한다.

인간의 내장 펩티드-연관된 운반단백질 HPT-1 mRNA:

이 유전자는 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company)의 과학자 그룹에 의해 확인되었다. 이 논문은 문헌[Science 1994, Apr 15; 264(5157), 403-3]에 발표되었다. 이 유전자는 약 98킬로달튼의 막 단백질을 암호화하며, 아미노산 서열은 이 운반과 연관된 단백질이 칼슘 의존성, 세포-세포 접착 단백질의 카드헤린 슈퍼패밀리(cadherin superfamily)와 여러 부분에서 보존된 특성을 공유하고 있음을 나타낸다.

인간의 MHC II군 항체(HLA-DRB1) mRNA:

이 유전자는 1997년 스페인 아기에서 처음 발견되었고, 문헌[Tissue Antigens 1997 Jun; 49(6): 658-61]에 발표되었다. 이름이 의미하는 것처럼 이는 MHC II군 항체의 슈퍼패밀리에 속한다. 이 유전자는 267개의 아미노산의 단백질 생성물이다.

인간의 클론 6 면역글로불린형 전사 5 단백질 mRNA:

이 유전자의 단백질 생성물은 NK 및 T 세포뿐만 아니라, B 세포, 단핵세포, 거식세포, 수상 세포에 의해서도 발현되는 면역글로불린-슈퍼패밀리의 억제성 MHC I군 수용체이다. 이 분자는 194개의 아미노산을 함유한다. 서열은 문헌[J. Exp. Med, 1997, Dec 1, 186(11): 1809-18]에 발표되었다. 이 수용체는 MHC I군 분자를 결합하고, B세포 항원 수용체 및 인간 조직적합성 백혈구 항체(HLA)-DR을 통해 유발되는 미엘로모노사이트 세포 및 B 세포에서의 Ca²⁺ 집결뿐만 아니라 NK 세포 및 T 세포에 의한 파괴를 억제하는 부정적인 신호를 전달한다.

인간의 하이드록시메틸빌란 합성효소(이는 또한 포르포빌노겐 데아미나제로도 불린 다; PBGD):

이 유전자는 대조군 유전자로서 사용된다. 이는 고형 암 및 정상 조직사이에서 가장 변화가 적은 유전자중 하나이다. 이의 서열은 문헌[Nucleic Acid Res, 14(15), 5955-5968(1986)]에 처음 발표되었다.

본 발명의 방법을 이용하면 듀크 B 환자들을 재발하기 쉬운 이들과 질병을 극복할 이들로 용이하게 분류할 수 있다.

<110> VERIDEX LLC <120> COLORECTAL CANCER PROGNOSTICS <150> US 10/403,449 <151> 2003-03-31 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 489 <212> DNA <213> human <400> 1 agagccgcag gtcagtcgtg aagagggagc tctattgcca ccatgagttt ctccggcaag 60 taccaactgc agagccagga aaactttgaa gccttcatga aggcaatcgg tctgccggaa 120 gagctcatcc agaaggggaa ggatatcaag ggggtgtcgg aaatcgtgca gaatgggaag 180 cacttcaagt tcaccatcac cgctgggtcc aaagtgatcc aaaacgaatt cacggtgggg 240 gaggaatgtg agctggagac aatgacaggg gagaaagtca agacagtggt tcagttggaa 300 ggtgacaata aactggtgac aactttcaaa aacatcaagt ctgtgaccga actcaacggc 360 gacataatca ccaataccat gacattgggt gacattgtct tcaagagaat cagcaagaga 420 atttaaacaa gtctgcattt catattattt tagtgtgtaa aattaatgta ataaagtgaa 480 ctttgtttt 489 <210> 2 <211> 853 <212> DNA <213> HUMAN <400> 2 gcctgctgct ctggcccctg gtcctgtcct gttctccagc atggtgtgtc tgaggctccc 60 tggaggctcc tgcatggcag ttctgacagt gacactgatg gtgctgagct ccccactggc 120 tttggctggg gacaccagac cacgtttctt ggagtactct acgtctgagt gtcatttctt 180 caatgggacg gagcgggtgc ggtacctgga cagatacttc cataaccagg aggagaacgt 240 gcgcttcgac agcgacgtgg gggagttccg ggcggtgacg gagctggggc ggcctgctgc 300 ggagcactgg aacagccaga aggacctcct ggagcagaag cggggccggg tggacaacta 360 ctgcagacac aactacgggg ttgtggagag cttcacagtg cagcggcgag tccatcctaa 420 ggtgactgtg tatccttcaa agacccagcc cctgcagcac cataacctcc tggtctgttt 480 tgtgagtggt ttctatccag gcagcattga agtcaggtgg ttccggaatg gccaggaaga 540 gaagactggg gtggtgtcca caggcctgat ccacaatgga gactggacct tccagaccct 600 ggtgatgctg gaaacagttc ctcggagtgg agaggtttac acctgccaag tggagcaccc 660 aagcgtgaca agccctctca cagtggaatg gagagcacgg tctgaatctg cacagagcaa 720 gatgctgagt ggagtcgggg gctttgtgct gggcctgctc ttccttgggg ccgggctgtt 780 catctacttc aggaatcaga aaggacactc tggacttcag ccaagaggat tcctgagctg 840 aagtgcagat gac 853 <210> 3 <211> 3345 <212> DNA <213> HUMAN <400> 3 gaattccgtc tcgaccactg aatggaagaa aaggactttt aaccaccatt ttgtgactta 60 cagaaaggaa tttgaataaa gaaaactatg atacttcagg cccatcttca ctccctgtgt 120 cttcttatgc tttatttggc aactggatat ggccaagagg ggaagtttag tggacccctg 180 aaacccatga cattttctat ttatgaaggc caagaaccga gtcaaattat attccagttt 240 aaggccaatc ctcctgctgt gacttttgaa ctaactgggg agacagacaa catatttgtg 300 atagaacggg agggacttct gtattacaac agagccttgg acagggaaac aagatctact 360 cacaatctcc aggttgcagc cctggacgct aatggaatta tagtggaggg tccagtccct 420 atcaccatag aagtgaagga catcaacgac aatcgaccca cgtttctcca gtcaaagtac 480 gaaggctcag taaggcagaa ctctcgccca ggaaagccct tcttgtatgt caatgccaca 540 gacctggatg atccggccac tcccaatggc cagctttatt accagattgt catccagctt 600 cccatgatca acaatgtcat gtactttcag atcaacaaca aaacgggagc catctctctt 660 acccgagagg gatctcagga attgaatcct gctaagaatc cttcctataa tctggtgatc 720 tcagtgaagg acatgggagg ccagagtgag aattccttca gtgataccac atctgtggat 780 atcatagtga cagagaatat ttggaaagca ccaaaacctg tggagatggt ggaaaactca 840 actgatcctc accccatcaa aatcactcag gtgcggtgga atgatcccgg tgcacaatat 900 tccttagttg acaaagagaa gctgccaaga ttcccatttt caattgacca ggaaggagat 960 atttacgtga ctcagccctt ggaccgagaa gaaaaggatg catatgtttt ttatgcagtt 1020 gcaaaggatg agtacggaaa accactttca tatccgctgg aaattcatgt aaaagttaaa 1080 gatattaatg ataatccacc tacatgtccg tcaccagtaa ccgtatttga ggtccaggag 1140 aatgaacgac tgggtaacag tatcgggacc cttactgcac atgacaggga tgaagaaaat 1200 actgccaaca gttttctaaa ctacaggatt gtggagcaaa ctcccaaact tcccatggat 1260 ggactcttcc taatccaaac ctatgctgga atgttacagt tagctaaaca gtccttgaag 1320 aagcaagata ctcctcagta caacttaacg atagaggtgt ctgacaaaga tttcaagacc 1380 ctttgttttg tgcaaatcaa cgttattgat atcaatgatc agatccccat ctttgaaaaa 1440 tcagattatg gaaacctgac tcttgctgaa gacacaaaca ttgggtccac catcttaacc 1500 atccaggcca ctgatgctga tgagccattt actgggagtt ctaaaattct gtatcatatc 1560 ataaagggag acagtgaggg acgcctgggg gttgacacag atccccatac caacaccgga 1620 tatgtcataa ttaaaaagcc tcttgatttt gaaacagcag ctgtttccaa cattgtgttc 1680 aaagcagaaa atcctgagcc tctagtgttt ggtgtgaagt acaatgcaag ttcttttgcc 1740 aagttcacgc ttattgtgac agatgtgaat gaagcacctc aattttccca acacgtattc 1800 caagcgaaag tcagtgagga tgtagctata ggcactaaag tgggcaatgt gactgccaag 1860 gatccagaag gtctggacat aagctattca ctgaggggag acacaagagg ttggcttaaa 1920 attgaccacg tgactggtga gatctttagt gtggctccat tggacagaga agccggaagt 1980 ccatatcggg tacaagtggt ggccacagaa gtaggggggt cttccttaag ctctgtgtca 2040 gagttccacc tgatccttat ggatgtgaat gacaaccctc ccaggctagc caaggactac 2100 acgggcttgt tcttctgcca tcccctcagt gcacctggaa gtctcatttt cgaggctact 2160 gatgatgatc agcacttatt tcggggtccc cattttacat tttccctcgg cagtggaagc 2220 ttacaaaacg actgggaagt ttccaaaatc aatggtactc atgcccgact gtctaccagg 2280 cacacagact ttgaggagag ggcgtatgtc gtcttgatcc gcatcaatga tgggggtcgg 2340 ccacccttgg aaggcattgt ttctttacca gttacattct gcagttgtgt ggaaggaagt 2400 tgtttccggc cagcaggtca ccagactggg atacccactg tgggcatggc agttggtata 2460 ctgctgacca cccttctggt gattggtata attttagcag ttgtgtttat ccgcataaag 2520 aaggataaag gcaaagataa tgttgaaagt gctcaagcat ctgaagtcaa acctctgaga 2580 agctgaattt gaaaaggaat gtttgaattt atatagcaag tgctatttca gcaacaacca 2640 tctcatccta ttacttttca tctaacgtgc attataattt tttaaacaga tattccctct 2700 tgtcctttaa tatttgctaa atatttcttt tttgaggtgg agtcttgctc tgtcgcccag 2760 gctggagtac agtggtgtga tcccagctca ctgcaacctc cgcctcctgg gttcacatga 2820 ttctcctgcc tcagcttcct aagtagctgg gtttacaggc acccaccacc atgcccagct 2880 aatttttgta tttttaatag agacggggtt tcgccatttg gccaggctgg tcttgaactc 2940 ctgacgtcaa gtgatctgcc tgccttggtc tcccaataca ggcatgaacc actgcaccca 3000 cctacttaga tatttcatgt gctatagaca ttagagagat ttttcatttt tccatgacat 3060 ttttcctctc tgcaaatggc ttagctactt gtgtttttcc cttttggggc aagacagact 3120 cattaaatat tctgtacatt ttttctttat caaggagata tatcagtgtt gtctcataga 3180 actgcctgga ttccatttat gttttttctg attccatcct gtgtcccctt catccttgac 3240 tcctttggta tttcactgaa tttcaaacat ttgtcagaga agaaaaaagt gaggactcag 3300 gaaaaataaa taaataaaag aacagccttt tgcggccgcg aattc 3345 <210> 4 <211> 1924 <212> DNA <213> HUMAN <400> 4 ccatgacgcc cgccctcaca gccctgctct gccttgggct gagtctgggc cccaggaccc 60 gcatgcaggc agggcccttc cccaaaccca ccctctgggc tgagccaggc tctgtgatca 120 gctgggggag ccccgtgacc atctggtgtc aggggagcct ggaggcccag gagtaccaac 180 tggataaaga gggaagccca gagccctggg acagaaataa cccactggaa cccaagaaca 240 aggccagatt ctccatccca tccatgacac agcaccatgc agggagatac cgctgccact 300 attacagctc tgcaggctgg tcagagccca gcgaccccct ggagctggtg atgacaggat 360 tctacaacaa acccaccctc tcagccctgc ccagccctgt ggtggcctca ggggggaata 420 tgaccctccg atgtggctca cagaagggat atcaccattt tgttctgatg aaggaaggag 480 aacaccagct cccccggacc ctggactcac agcagctcca cagtgggggg ttccaggccc 540 tgttccctgt gggccccgtg acccccagcc acaggcgtgt ttaggaagcc ctccctcctg 600 accctgcagg gccctgtcct ggcccctggg cagagcctga ccctccagtg tggctctgat 660 gtcggctacg acagatttgt tctgtataag gagggggaac gtgacttcct ccagcgccct 720 ggccagcagc cccaggctgg gctctcccag gccaacttca ccctgggccc tgtgagccgc 780 tcctacgggg gccagtacag gtgctatggt gcacacaacc tctcctccga gtggtcggcc 840 cccagtgacc ccctggacat cctgatcaca ggacagatct atgacaccgt ctccctgtca 900 gcacagccgg gccccacagt ggcctcagga gagaacatga ccctgctgtg tcagtcacgg 960 gggtattttg acactttcct tctgaccaaa gaaggggcag cccatccccc actgcgtctg 1020 agatcaatgt acggagctca taagtaccag gctgaattcc ccatgagtcc tgtgacctca 1080 gcccacgcgg ggacctacag gtgctacggc tcacgcagct ccaaccccca cctgctgtct 1140 ttccccagtg agcccctgga actcatggtc tcaggacact ctggaggctc cagcctccca 1200 cccacagggc cgccctccac acctggtctg ggaagatacc tggaggtttt gattggggtc 1260 tcggtggcct tcgtcctgct gctcttcctc ctcctcttcc tcctcctccg acgtcagcgt 1320 cacagcaaac acaggacatc tgaccagaga aagactgatt tccagcgtcc tgcaggggct 1380 gcggagacag agcccaagga caggggcctg ctgaggaggt ccagcccagc tgctgacgtc 1440 caggaagaaa acctctagcc cacacgatga agacccccag gcagtgacgt atgccccggt 1500 gaaacactcc agtcctagga gagaaatggc ctctcctccc tcctcactgt ctggggaatt 1560 cctggacaca aaggacagac aggtggaaga ggacaggcag atggacactg aggctgctgc 1620 atctgaagcc tcccaggatg tgacctacgc ccagctgcac agcttgaccc ttagacggaa 1680 ggcaactgag cctcctccat cccaggaagg ggaacctcca gctgagccca gcatctacgc 1740 cactctggcc atccactagc ccggggggta cgcagacccc acactcagca gaaggagact 1800 caggactgct gaaggcacgg gagctgcccc cagtggacac cagtgaaccc cagtcagcct 1860 ggacccctaa cacagaccat gaggagacgc tgggaacttg tgggactcac ctgactcaaa 1920 gatg 1924 <210> 5 <211> 1536 <212> DNA <213> HUMAN <400> 5 gtgacgcgag gctctgcgga gaccaggagt cagactgtag gacgacctcg ggtcccacgt 60 gtccccggta ctcgccggcc ggagcccccg gcttcccggg gccgggggac cttagcggca 120 cccacacaca gcctactttc caagcggagc catgtctggt aacggcaatg cggctgcaac 180 ggcggaagaa aacagcccaa agatgagagt gattcgcgtg ggtacccgca agagccagct 240 tgctcgcata cagacggaca gtgtggtggc aacattgaaa gcctcgtacc ctggcctgca 300 gtttgaaatc attgctatgt ccaccacagg ggacaagatt cttgatactg cactctctaa 360 gattggagag aaaagcctgt ttaccaagga gcttgaacat gccctggaga agaatgaagt 420 ggacctggtt gttcactcct tgaaggacct gcccactgtg cttcctcctg gcttcaccat 480 cggagccatc tgcaagcggg aaaaccctca tgatgctgtt gtctttcacc caaaatttgt 540 tgggaagacc ctagaaaccc tgccagagaa gagtgtggtg ggaaccagct ccctgcgaag 600 agcagcccag ctgcagagaa agttcccgca tctggagttc aggagtattc ggggaaacct 660 caacacccgg cttcggaagc tggacgagca gcaggagttc agtgccatca tcctggcaac 720 agctggcctg cagcgcatgg gctggcacaa ccgggtgggg cagatcctgc accctgagga 780 atgcatgtat gctgtgggcc agggggcctt gggcgtggaa gtgcgagcca aggaccagga 840 catcttggat ctggtgggtg tgctgcacga tcccgagact ctgcttcgct gcatcgctga 900 aagggccttc ctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgtg ccagtagccg tgcatacagc 960 tatgaaggat gggcaactgt acctgactgg aggagtctgg agtctagacg gctcagatag 1020 catacaagag accatgcagg ctaccatcca tgtccctgcc cagcatgaag atggccctga 1080 ggatgaccca cagttggtag gcatcactgc tcgtaacatt ccacgagggc cccagttggc 1140 tgcccagaac ttgggcatca gcctggccaa cttgttgctg agcaaaggag ccaaaaacat 1200 cctggatgtt gcacggcagc ttaacgatgc ccattaactg gtttgtgggg cacagatgcc 1260 tgggttgctg ctgtccagtg cctacatccc gggcctcagt gccccattct cactgctatc 1320 tggggagtga ttaccccggg agactgaact gcagggttca agccttccag ggatttgcct 1380 caccttgggg ccttgatgac tgccttgcct cctcagtatg tgggggcttc atctctttag 1440 agaagtccaa gcaacagcct ttgaatgtaa ccaatcctac taataaacca gttctgaagg 1500 taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1536

Claims

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서열 번호: 2, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4로 구성된 유전자 조합의 단리된 핵산 서열 또는 이의 상보체를 검출하기 위한 물질을 포함하는, 결장직장암 환자의 예후진단용 키트.
제 7 항에 있어서,

유전자 조합이 서열 번호: 1을 추가로 포함하는 키트.
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제 7 항에 있어서,

(i) 시험 시료에서 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4로 구성된 유전자 조합의 유전자 각각의 발현 강도와 대조군 시료에서의 동일한 유전자의 발현 강도 사이에 2배 이상의 차이가 존재하는지, 또는 (ii) 이러한 발현 강도들의 p-값이 0.05 미만인지를 확인하기 위해, 시험 시료에서의 유전자 발현 강도 대 대조군 시료에서의 유전자 발현 강도의 비율 행렬을 생성함으로써, 상기 핵산 서열 또는 이의 상보체의 발현 강도를 분석하는 키트.
제 10 항에 있어서,

비율 행렬이 마이크로어레이(microarray)에서 생성되는 키트.
제 11 항에 있어서,

마이크로어레이가 cDNA 마이크로어레이인 키트.
제 11 항에 있어서,

마이크로어레이가 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이인 키트.
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제 7 항에 있어서,

마이크로어레이 분석을 수행하기 위한 시약을 포함하는 키트.
제 7 항에 있어서,

핵산 서열 또는 이의 상보체가 분석되는 매체를 추가로 포함하는 키트.
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서열 번호: 2, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4로 구성된 유전자 조합의 핵산 서열 또는 이의 상보체를 확인하기 위한 물질을 포함하는, 결장직장암의 상태를 평가하기 위한 제품.
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